Anatomie Pathologique111

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I. Objectifs: place de l ’ACP dans la médecine actuelle II. Matériel et méthodes de l ’anatomie et cytologie pathologiques • - Etude des tissus = histopathologie • - Etude des cellules = cytopathologie

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III. Techniques histo-pathologiques: Notions générales

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I. Objectifs: place de l ’ACP dans la médecine actuelle

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L'anatomo-cytopathologie (ou pathologie) est une discipline médicale qui étudie les lésions provoquées par les maladies ou associées à cellesci, sur les organes, tissus ou cellules, en utilisant des techniques principalement basées sur la morphologie macroscopique et microscopique..

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Lésions = Les lésions sont des altérations morphologiques des organes, décelables par tout moyen d'observation. Les lésions sont des signes des maladies, au même titre que les symptômes cliniques.

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Objectifs ACP - 2 Causes des lésions variées: infectieuses, agents physiques ou chimiques, anomalies génétiques, immunitaires, circulatoires, nutritionnelles, sénescence…. Mais des lésions ne sont pas connues dans toutes les maladies. Ex: certaines maladies neuro-psychiatriques (mécanismes en coursd'élucidation: modifications d'amines cérébrales...) Notions d’affections"fonctionnelles" = sans lésion morpho connue affections "organiques" = lésions visibles connues

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2 types d ’objectifs de l ’ACP 1. Diagnostic interprétation des lésions+ confrontation données cliniques, biologiques et d ’imagerie = « corrélation anatomo-clinique » ++++ synthèse diagnostique: Dg certain, probable ou incertain +/- évaluation du pronostic (ex: cancer) recherche de cibles thérapeutiques évaluation effet des thérapeutiques (biopsies répétées au cours d ’un traitement).

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2. Objectif plus théorique: observer, comprendre les lésions, leurs mécanismes et leurs conséquences à la base de la « classification anatomoclinique » des maladies, possible même lorsque la cause n ’est pas connue.

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Ainsi, il existe 3 niveaux d'interprétation : 1. niveau sémeiologique: observation signes cliniques, biologiques macro/ Microscopiques…. 2. niveau diagnostique: interprétation, classement, prévision d'une évolution, conséquences thérapeutiques 3. niveau théorique: "concept" théorique, tenant compte des connaissances scientifiques actuelles

∃ PLUSIEURS NIVEAUX D'OBSERVATION des lésions: • macroscopie = observation à l'oeil nu (pièces opératoires, autopsie...) • microscopie optique (tissus, cellules, substances intercellulaires). électronique "ultrastructure" (cellule, organites cell ) Profonde évolution de l'anatomie pathologique depuis 20 ans: avec l'introduction de techniques immunologiques, puis de la biologie moléculaire importants progrès compréhension Physiopathologique des maladies

NIVEAU D ’OBSERVATION DES LÉSIONS/ 2: • immunohistochimie: mise en évidence Ag cell ou extracell Ac spécifiques, sur coupes tissulaires ou cytologie détermination phénotype immunologique in situ (visualisation du siège exact de l'expression de l'Ag) CD20 • biologie moléculaire: détermination génotype .

LES 2 BRANCHES DE L'ANATOMIE PATHOLOGIQUE: • anatomie pathologique spéciale: étudie les lésions dans chaque organe ou système Ex: pathologie digestive, gynécologique, hématologique, rénale, neuropathologie ... intégrée dans l ’enseignement des modules 

• anatomie pathologique générale: étudie les grands processus lésionnels, indépendt de leur localisation . Au programme: . les lésions élémentaires de la cellule et des tissus . l'inflammation . les troubles vasculaires . les maladies de surcharge . les tumeurs . (les maladies dûes à des désordres immunitaires) . (les malformations congénitales) . (la senescence)

Matériel étudié de 2 types: . tissus: histopathologie . cellules: cytologie ou cytopathologie techniques de prélèvement techniques anatomopathologiques différentes.

Matériel étudié selon la technique de prélèvement: . biopsie: échantillon pour diagnostic . pièce opératoire: bilan des lésions après acte thérapeutique . autopsie: bilan des lésions et diagnostic définitif.

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prélèvements de petits fragments d'organes, pratiqués chez un sujet vivant dans le but de faire un diagnostic. Avec des pinces, trocard, bistouri. - sous contrôle de la vue: . direct: peau, muqueuses (col utérin...) . endoscopie: tube digestif, bronches ... . chirurgical: ganglion, muscle, artère, nerf, sein ... - "à l'aveugle" ou dirigées (sous échograhie, scanner) « ponction-biopsies » foie, moëlle osseuse, os, rein, tumeur profonde, encéphale...

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ex: coloscopie: 1: iléon, 2: colon droit, 2: colon transverse, 4: colon gauche, 5: sigmoide, 6: rectum. • le plus souvent, pour la technique

histologique standard (inclusion et coupes en paraffine) : placées immédiatement dans un liquide fixateur (formol > liquide de Bouin...) dans un flacon comportant une étiquette avec l'identité du patient et le siège des biopsies

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• accompagnées d'un bon d'envoi, comportant: +++ . identité du malade: nom, prénom, sexe, âge . identité du médecin ou service . raisons de ces biopsies: signes cliniques, biologiques, . . antécédents du malade: cliniques, biopsies antérieures… . aspect macroscopique ou endoscopique . siège exact des biopsies (numérotation des flacons)

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Souvent, interprétation anatomopathologique d'une biopsie diagnostic

choix thérapeutique. Importance +++ de la qualité de la biopsie et de la collaboration anatomo-clinique étroite

des biopsies non fixées sont nécessaires pour certaines techniques particulières: • Examen extemporané • microscopie électronique • histo-enzymologie • immunohisto(cyto)chimie • biologie moléculaire • cytogénétique Elles doivent être adressées au laboratoire: • immédiatement à l ’état frais • dans certains cas, congelées dans l’azote liquide ou à -80°C

Techniques particulières (1) • Examen extemporané: Réalisé lorsqu'il est nécessaire de connaitre la nature d'une lésion pendant l'intervention chirurgicale,pour guider le geste thérapeutique: diagnostic susceptible de modifier l ’acte chirurgical Ex: tumeurs du sein, de la thyroide... recherche de métastases ganglionnaires • examen macroscopique immédiat à l'état frais • coupes à la main et au microtome à congélation, pour un diagnostic microscopique rapide (10 à 20 mn) (Dg pas toujours possible: artefacts de congélation….) • Dg toujours vérifié par les techniques classiques, après fixation

Techniques particulières (2) • Microscopie électronique rarement utile pour le diagnostic, sauf pour certaines maladies musculaires, rénales ou de surcharge fixation très rapide dans des fixateurs spéciaux (glutaraldéhyde...).sur des fragments de très petite taille (1 mm3) •

Histo-chimie et histo-enzymologie: détection de certains constituants cellulaires (lipides, enzymes ...) possible seulement sur tissus congelés Tissu frais, non fixé, adressé immédiatement au laboratoire spécialisé. NB: Mais, la plupart des techniques histochimiques sont réalisées sur tissu fixé.

Techniques particulières (3) • Immuno-histo(cyto)chimie: mise en évidence Ag cell ou extracell / Ac spécifiques couplés à un marqueur fluorescent IF: immunofluorescence . une enzyme qui est révélée, en présence de son substrat méthodes immuno-enzymatique

Techniques particulières (4) Immuno-histochimie-2 - Certains Ag dénaturés par fixation et/ou inclusion en paraffine congélation dans l'azote liquide d'un fragment de la biopsie et étude immunohistochimique sur coupes en congélation. Autre technique possible: suspension cellulaire obtenue à partir de la biopsie étude immunologique ( hématopathologie) Comptage et tri cellulaire possible en cryométrie en flux (faisceau laser) - Mais de nbx AC utilisables sur tissus fixés ont été produits:

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Techniques particulières (5) Immuno-histochimie-3 Intérêt Dg, pronostique et thérapeutique+++ + • Diagnostic: classification des tumeurs/ Ag de différenciation…. • Pronostic: prolifération cellulaire marqueurs pronostiques (produits d ’oncogènes) … • Thérapeutique: expression de cibles thérapeutiques (récepteurs hormonaux, immunothérapie)

Acides nucléiques dénaturés par certains fixateurs, en particulier liquide de Bouin, longtemps utilisé . Le formol tamponné préserve l'ADN ( sensibilité PCR) mal les ARN. Nécessité de tissus congelés, éventuellement après transport dans liquide spécial (RNA-later). obligation de cryopréservation des tissus: Tissuthèque tumorothèque Centre de ressources biologiques

Objectifs: diagnostic recherche: étude de séries (collections…) NB: Nouveaux fixateurs à l ’étude Objectifs: préservation acides nucléiques toxicité < formol bonne morphologie +++

Techniques particulières (7) • Cytogénétique - conventionnelle (caryotype): mise en culture de tissu frais, pour l ’obtention de métaphases étude des chromosomes, après coloration spécifique en bandes - anomalies de nombre: monosomie, trisomie... - anomalies de structure: translocation, délétion, inversion... 􀃎 labo de cytogénétique (hématologie, sarcomes...) - moléculaire: hybridation in situ

FISH: fluorescent in situ hybridation possible sur chromosomes ou sur noyaux interphasiques (sur appositions ou culots cellulaires ou coupes tissulaires ) hybridation avec des « sondes » = séquences nucléotidiques mono-brin complémentaires spécifiques d ’une séquence d ’acides nucléiques donnée (ADN et ARN) En développement en anatomie pathologique sondes fluorescentes ou marquées avec un chromogène = CISH

2/. Pièces opératoires: organes ou segments d'organes enlevés, à titre thérapeutique, au cours d'une intervention chirurgicale. L'examen anapath doit confirmer ou préciser le diagnostic faire le bilan des lésions. Toutes les techniques spéciales (ME, histochimie, immunohistochimie, bio mol...) peuvent être réalisées sur des prélèvements faits sur des pièces opératoires, si les conditions nécessaires sont respectées (congélation ou fixation particulière).

Pièces opératoires- 2 Les organes sont pesés, mesurés, disséqués +/- photographiés (ou schéma) prélèvements pour congélation (tumeur et tissu sain) puis fixés dans le formol, dans des conditions optimales (volume, durée, fonction de la taille de la pièce opératoire)

Description macroscopique (dans le compte rendu, avant la microscopie): • type de pièce opératoire (taille, poids) • aspect, taille (ou poids), extension des lésions, lésions associées • distance des limites de résection, • recherche des ganglions lymphatiques (cancer) ... Des prélèvements repérés et numérotés (lésion, ganglions, limites....) sont réalisés pour l ’inclusion en paraffine et l ’étude au microscope NB: importance des renseignements fournis par le chirurgien et des repères, en

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3/ L'autopsie: acte médical bilan complet des lésions et diagnostic définitif. • connaissance dossier clinique, pour orienter la recherche des lésions. • dissection de tous les viscères • prélèvements pour étude microscopique au niveau des lésions 2 types d ’autopsie: • autopsie hospitalière • autopsie médico-légale

L'autopsie - 2 • Autopsie hospitalière = vérification anatomique 

Réalisée par un pathologiste A la demande du chef de service hospitalier, avec l'autorisation administrative du Directeur de l'hôpital. Délai légal > 3 h après le décès Parfois non autorisée: opposition de la famille, "mort violente", certaines religions... contrôle de la qualité des soins: Dg cliniques exacts ou non. épidémiologie: études des causes de mortalité. • Autopsie médico-légale: N'est pas pratiquée par un anatomopathologiste, mais par un médecin légiste, sur réquisition du Procureur de la République, en cas de "mort violente": crime, suicide, accident ...

. CYTOPATHOLOGIE Examen microscopique cellules isolées déposées sur 1 lame de verre. Techniques de prélèvement: • raclage (spatule, brosse...): col utérin, peau, bronche, oesophage... • ponction à l'aiguille: • à l'aveugle: ganglion, moëlle osseuse • dirigée (échographie, scanner): sein, thyroide, foie; pancréas, poumon, rein .... • apposition de biopsies, sur lames de verre: ganglion, moëlle osseuse, rate….. • centrifugation d'un liquide pathologique (pleural ,ascite) culot cellulaire, étalé sur lames 

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Cytopathologie- 2

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Les lames peuvent être: • soit séchées à l'air: prélèvements hémato (ganglions, moëlle, rate) ponctions d'organes 􀃎 coloration de May Grunwald Giemsa • soit fixées (mélange alcool/éther ou laque):col utérin...

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coloration de Papanicolaou +++ Nom du malade inscrit sur chaque lame. Bon d'envoi avec mêmes renseigments cliniques que pour biopsies. + Nouvelle technique: cellules en monocouche (couche mince) le prélèvement cellulaire est adressé au laboratoire dans un liquide conservateur cell remises en suspension, concentrées cellules en couche mince sur une lame (pastille) permet la conservation des cellules la réalisation de techniques complémentaires: immunocytochimie, biologie moléculaire (ex: HPV)

Intérêt de la cytopathologie- 3 • analyse fine détails cellulaires, mais montre mal l'organisation tissulaire. • méthode facile, non traumatisante rapide •de dépistage (frottis vaginaux), •de diagnostic, isolément ou en complément de l'histologie: - hématologie +++ - cancérologie: lésions difficilement accessibles à la biopsie.

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2-Techniques d'étude morphologique des prélèvements cellulaires et tissulaires :   

a) Enregistrement : numéro d’identification retranscription du numéro sur les blocs et les lames chaque prélèvement doit être accompagné d'une fiche de renseignements remplie par le médecin prescripteur qui doit mentionner : l'identité du patient : nom, prénom,

date de naissance, sexe.  le siège, la date et la nature du prélèvement (biopsie ou exérèse).

• les circonstances cliniques et para

cliniques qui ont motivé le prélèvement, éventuellement les hypothèses diagnostiques. • L'aspect macroscopique ou endoscopique des lésions  • les antécédents pathologiques du patient • le nom et coordonnées du médecin prescripteur et du préleveur

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b)Techniques d’étude des cellules :  Etalement des cellules sur des lames de verre : l'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes, des frottis, écouvillonage, brossages ou appositions La fixation des étalements se fait : ¤ soit par simple séchage à l'air pour la coloration de May-Grunwald-Giemsa ¤ soit par immersion dans l'alcool-ether ou par application d'un aérosol de laque fixante pour les colorations de Harris-Schorr ou de Papanicolaou (frottis cervicoutérins…)

Frottis cervico-utérin : présence de koïlocytes témoignant d'un condylome viral. coloration de Papanicolaou

c) Techniques d’étude des tissus : 

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Etude macroscopique : L'examen macroscopique détaillé est une partie essentielle de l'étude d'une pièce opératoire : la pièce est examinée, mesurée, pesée, palpée puis disséquée

Une pièce d’oesogastrectomie pour cancer du bas œsophage (flèche). A- pièce fraîche. B- pièce après fixation dans une solution de formol

Examen macroscopique d’une pièce opératoire d' oesogastrectomie pour cancer du bas œsophage : repérage des dimensions de la pièce

Examen macroscopique d’une pièce opératoire : dissection d'une pièce d'oesogastrectomie et sélection des prélèvements destinés à l’étude microscopique

Pièce d’exérèse de prostate et de vésicules séminales : A- surface tatouée à l’encre de chine, B- Tranche de section de la prostate : l’encre ne pénètre pas en profondeur

Pièce d’exérèse de prostate tatouée à l’encre de chine : Lors de l’examen microscopique, l ’encre permet de repérer exactement les limites de la résection chirurgicale (limite noire à gauche)

L'examen macroscopique :  donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment taille et localisation d’un cancer)  permet de sélectionner les territoires à prélever pour l'étude microscopique :  _ zones lésées,  _zones d'aspect macroscopique sain et limites d'exérèse

Exemple de prélèvement destiné à l’étude microscopique : jonction entre la paroi oesophagienne d’aspect sain (A) et la tumeur (B)

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Après le choix des prélèvements destinés à l'analyse microscopique, les restes de la pièce opératoire sont conservés pendant quelques jours ou semaines afin de pouvoir en cas de nécessité effectuer des prélèvements complémentaires.

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Fixation :

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Indispensable pour conserver la morphologie cellulaire Doit être immédiate ou au moins très rapidement débutée après l'obtention du prélèvement. Toute fixation défectueuse rend l'étude anatomopathologique difficile voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu) Le volume du fixateur : doit être 10 fois le volume de la pièce. Le récipient doit être de taille suffisamment grande pour prévenir les déformations des pièces opératoires volumineuses.

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La durée de la fixation: au minimum 2 à 5 heures pour une biopsie et 48 heures pour une pièce opératoire. Nature du fixateur : le fixateur le plus habituellement utilisé est le formol à 10% tamponné

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Imprégnation et inclusion :

Tissus déshydratés imprégnés de paraffine, avant l’inclusion

Inclusion manuelle du tissu dans un moule de paraffine

Coupes et colorations : • Le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé grâce à un microtome • les coupes de 3 à 5 microns d'épaisseur sont étalées sur des lames 

Technique histologique : étapes manuelles. A : refroidissement des blocs de paraffine ; B : coupe au microtome ; C : étalement

automate à coloration

A. Tissu dans le bloc de paraffine après la coupe. B Coupe du tissu étalé sur lame et coloré

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La coloration usuelle associe un colorant basique nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant acide cytoplasmique (éosine, érythrosine, ou phloxine) ; on y ajoute souvent du safran qui se fixe sur le collagène . La coupe colorée est protégée par une lamelle de verre collée ou par un film plastique transparent. Elle est analysée au microscope par un médecin anatomo-pathologiste qui établit un compterendu. Les blocs et les lames sont ensuite archivés

Coloration hématoxyline-éosine-safran sur une lame intéressant la jonction entre la paroi oesophagienne saine (A) et une tumeur (BC). A : muqueuse malpighienne saine de l'oesophage. B : adénocarcinome à moyen grossissement. C :adénocarcinome à fort grossissement                              

Plateau de lecture : Les lames colorées accompagnées des renseignements cliniques sont préparées pour le médecin pathologiste qui les observe au microscope : détection et interprétation des lésions pour établir un diagnostic                  

Archivage des lames et des blocs

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 Examen histologique extemporané :

Il s'agit d'un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un Diagnostic susceptible de modifier le déroulement de l’acte chirurgical. La technique utilise la macroscopie et, le plus souvent, des coupes au microtome à congélation et une coloration rapide, ce qui permet un résultat en moins de 30 minutes .

B-Application des technique de biologie moleculaire en anatomie pathologie :  1-Immunohistochimie :  d’un • Identification ou localisation constituant tissulaire in-situ • Réaction immunologique de type ANTIGENE-ANTICORPS ANTIGENE : Substance à détecter ANTICORPS: immunoglobuline spécifique de la cible recherchée • Réaction Ag-Ac non visible au MO • Lier l’Ac à un marqueur qui révélera le complexe Ag-Ac • Grâce à l’émission d’un signal

Modèles de marquage Nucléaire

Nucléaire et cytoplasmique

Cytoplasmique

Membranaire

Golgien

Extra-cellulaire

Marquage TTF-1: Thyroïde Transcription Factor nucléaire