Coliformes

INGENIERÍA HIDRÁULICA Y AMBIENTAL , VOL. XXIV, No. 3, 2003

Determinación de coliformes totales y E.coli en aguas utilizando el Fluorocult LMX (MERCK) I: Comparación con los medios de cultivo tradicionales INTRODUCCIÓN En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas basadas en la utilización de sustratos cromogénicos y fluorogénicos que detectan actividades enzimáticas muy específicas. Con la utilización de estos medios de cultivo se eleva la sensibilidad y la rapidez de detección de los microorganismos en aguas.1 La detección y cuantificación de coliformes totales y E.coli como microorganismos indicadores de contaminación fecal tiene gran importancia en el control microbiológico de la calidad sanitaria de las aguas. El análisis bacteriológico de las aguas es llevado a cabo por tres métodos diferentes, estos son: filtración a través de membranas, el test de presencia-ausencia y el método de los números más probables o tubos múltiples de fermentación, todos se basan en la capacidad que tienen los organismos coliformes de producir ácido y gas a partir de la lactosa. 2 Durante las últimas décadas se han venido desarrollando nuevos medios de cultivo para la detección directa de coliformes totales y E.coli. Estos medios contienen sustratos que son utilizados por enzimas específicas del grupo coliformes y E.coli respectivamente. Los sustratos se unen a algún compuesto que al ocurrir la reacción enzimática se libere al medio, produciendo un cambio de color o el desarrollo de fluorescencia. Por esta razón se conocen como compuestos cromogénicos y fluorógenicos. Estos métodos son altamente específicos y sensibles, además brindan la posibilidad de ofrecer los resultados en solo 24 h. Este trabajo tiene como objetivo establecer una comparación de la técnica de tubos múltiples de fermentación utilizando los medios establecidos

Resumen / Abstract El presente trabajo tiene como objetivo comparar los medios de cultivo tradicionales para la detección de organismos indicadores de contaminación en aguas (Caldo Lactosado, Caldo Bilis Verde Brillante y EC) y el nuevo medio de cultivo Fluorocult LMX (Merck), el cual detecta simultáneamente coliformes totales y E.coli. El análisis estadístico de los valores obtenidos de coliformes totales demuestran que sí existen diferencias estadísticamente significativas entre los medios de cultivo. Los resultados obtenidos cuando se emplea el nuevo medio son superiores a los obtenidos cuando se emplean los medios de cultivos convencionales (CL-CBVB). Para el caso de la determinación de E.coli, no existen diferencias estadísticamente significativas, aunque los resultados obtenidos son ligeramente superiores cuando se emplea el Caldo Fluorocult LMX. Palabras clave: E.coli, fluorogénicos y cromogénicos, detección rápida. The objective of the present work is to compare the traditional culture mediums for the detection of organisms indicators of contamination (Lactose Broth, Brilliant Green Bile Broth, and EC Broth) and the new medium Fluorocult LMX (Merck) which detect at the same time total coliforms and E.coli. The statistical analysis of the obtained results of total coliforms shows that is differences statistically significative among the mediums. The results obtained when Fluorocult LMX is used are superior than those obtained when the conventional mediums (LB-BGBB) are used. In the case of the detection of E.coli, there are not differences statistically significative, even though the obtained results are lightly superior when the Fluorocult LMX is used.

Key words: E.coli, fluorogenic, Cromogenic, rapid detection.

Annarella Rodríguez Isaac, Licenciada en Microbiología, Aspirante a Investigador, OEE Andrés González Lines e-mail: [email protected] María del Carmen Novoa Deaño, Licenciada en Bioquímica, Investigadora Agregada, Oficina de Regulación Ambiental y Seguridad e-mail: [email protected] María Antonieta Mieres Villa, Licenciada en Microbiología, Centro de Hidrología y Calidad del Agua, CENHICA, Ciudad de La Habana e-mail: [email protected] Coautores: Rolando Herrera Maspoch, Licenciado en Microbiología, CENHICA, Yamilka González de Armas, Licenciada en Bioquímica, Investigadora Agregada, CENHICA

Determinación de coliformes totales y E.coli en aguas utilizando el Fluorocult LMX (MERCK) I. Comparación con los medios de cultivo tradicionales

tradicionalmente (Caldo Lactosado, Caldo Bilis Verde Brillante y Caldo EC) y el nuevo medio de cultivo Caldo Fluorocult LMX, tanto en aguas subterráneas, como superficiales. MATERIALES Y MÉTODOS Para comparar la Técnica de Tubos Múltiples de Fermentación1 con la sustitución de los medios de cultivo tradicionales (CL-CBVB-EC) por el medio de cultivo Caldo Fluorocult LMX en aguas subterráneas y superficiales se tomaron muestras de las siguientes fuentes. • Agua subterránea: Pozo de Abasto del Centro de Hidrología y Calidad del Agua. • Agua superficial: Laguna Artificial del Zoológico Nacional. Se colectaron y analizaron un total de 40 muestras de aguas, 20 de agua subterránea y 20 de agua superficial. Las mismas fueron colectadas siguiendo la metodología para el muestro de aguas descrita en los Métodos Estándares para el Análisis de Aguas y Aguas Residuales,1 se utilizaron frascos de cristal con tapa esmerilada de 250 mL esterilizados en autoclave por 30 min a 121 oC. La siembra se efectuó 30 min después del muestro. METODOLOGÍA PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS • Aguas subterráneas Se sembraron volúmenes de 10, 1 y, 0,1 mL de muestra. • Aguas superficiales Se realizaron diluciones de la muestra (10-1,10-2 y -3 10 ), de la cuales se sembró 1 mL de cada una. Cada una de las muestras fue sembrada paralelamente mediante la Técnica de Tubos Múltiples de Fermentación empleando los medios de cultivo tradicionales (CL-CBVBEC) y con la sustitución de estos por el medio de cultivo Caldo Fluorocult LMX. Se siguió el procedimiento establecido para la técnica de tubos múltiple de fermentación. Medios de cultivo empleados3 • Caldo Lactosado (MERCK). • Caldo Bilis Verde Brillante (MERCK). • Caldo EC (MERCK). • Caldo Fluorocult LMX (MERCK). Expresión de los resultados La densidad de coliformes se expresa como el Número Más Probable de coliformes (NMP) en 100 mL de aguas. • Aguas subterráneas El NMP se busca en tablas estadísticas de acuerdo con un código formado por la combinación de los tubos positivos y negativos obtenidos.

16

• Aguas superficiales

A partir del código obtenido en las tablas estadísticas 1 se calcula el NMP de coliformes por cada 100 mL de muestra empleando la siguiente fórmula:

NMP = CÓDIGO ⋅

10 DI

donde: DI: Dilución inicial en la que todos los tubos resultaron positivos. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó en el Departamento de Estadística del Instituto de Cibernética, Matemática y Física (ICIMAF) del CITMA. Se empleó una transformación de los datos en sus correspondientes logaritmos para que se cumpliera una distribución normal. Se determinó la media geométrica, aritmética, la desviación estándar y la t de student para muestras apareadas dependientes de dos colas. Para ello se utilizaron los paquetes de programas STATISTICA (Versión 5.0) y Microsoft Excel (1997). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Como puede observarse en la tabla 1 los coliformes totales presentaron una media geométrica mucho mayor cuando se utiliza el Caldo Fluorocult LMX que cuando se emplean los medios tradicionales, lo cual indica la superioridad de este medio en el recobrado de estas bacterias con respecto a los medios tradicionales. En el caso de E.coli no se observan grandes diferencias en las medias geométricas obtenidas por ambos métodos. En la tabla 2, los resultados obtenidos en el análisis de coliformes totales y E.coli en las aguas superficiales de la laguna artificial del Zoológico Nacional mantienen el mismo comportamiento que para el análisis de aguas subterráneas, existe un mayor recobrado de bacterias con el Caldo Fluorocult LMX. La media geométrica del NMP de coliformes, cuando se emplea este medio, es mucho mayor que la obtenida cuando se emplean en el análisis los medios de cultivo tradicionales (CL-CBVB-EC). No obstante, en el caso de E.coli la diferencia que se observa en las medias geométricas no es tan grande como la obtenida para coliformes totales. Estos resultados se deben a que la detección y cuantificación de los coliformes mediante los medios tradicionales se realiza de manera indirecta, a través de un subproducto de la reacción de fermentación de la Lactosa, el gas, y según Ciebin y colaboradores 4 los métodos tradicionales basados en la capacidad de fermentar la lactosa con producción de gas como factor diferencial, proporcionan resultados falsos, negativos, ya que el 10 % de las cepas de E.coli aisladas por ellos no son capaces de producir ácido ni gas a partir de la lactosa.

A. Rodríguez, M. del C. Novoa, M. A. Mieres,

Tabla 1 Resultados del análisis de coliformes totales y E.coli, en aguas subterráneas,

Tabla 2 Resultados del análisis de coliformes totales y E.coli, en aguas superficiales

Aguas subterráneas Aguas subrterráneas

Muestras

Aguas superficiales

Coliformes totales

E.coli

(NMP/100 mL)

(NMP/100 mL)

CL-CBVB

Fluorocult CL-EC LMX

Muestras

Fluorocult LMX

Coliformes totales

E.coli

(NMP/100 mL)

(NMP/100 mL)

CL-CBVB

Fluorocult LMX

CL-EC

Fluorocult LMX

1

23

80

≤2

≤2

1

3 400

14 000

1 300

1 300

2

27

30

≤2

≤2

2

2 300

3 000

1 300

2 300

3

13

80

≤2

≤2

3

8 000

18 000

2 300

2 300

4

9

80

≤2

≤2

4

3 000

14 000

1 300

3 000

5

17

80

≤2

≤2

5

2 300

14 000

2 300

2 300

6

4

130

≤2

≤2

6

3 000

8 000

2 300

1 300

7

8

80

≤2

≤2

7

5 000

14 000

3 000

2 300

8

8

50

≤2

≤2

8

5 000

11 000

2 300

2 300

9

170

220

≤2

≤2

9

8 000

14 000

2 300

3 000

10

170

300

≤2

≤2

10

2 300

13 000

2 300

2 300

11

110

130

≤2

≤2

11

5 000

13 000

800

2 300

12

140

130

≤2

≤2

12

3 000

8 000

400

1 300

13

170

170

≤2

≤2

13

1 300

5 000

800

1 300

14

140

280

≤2

≤2

14

2 300

5 000

1 300

1 300

15

110

220

≤2

≤2

15

3 000

8 000

700

800

16

4

11

≤2

≤2

16

3 000

13 000

3 000

1 300

17

8

70

≤2

6

17

3 000

8 000

5 000

5 000

18

≤£2 2

8

≤2

9

18

2 300

3 000

2 300

11 000

19

34

33

26

29

19

3 000

5 000

1 300

11 000

20

90

140

26

27

20

6 000

13 000

5 000

5 000

27,73

82,48

2,58

2,97

3 340,09

9 064,20

1 719,36

2 386,11

Media geométrica

Media geométrica

17

Determinación de coliformes totales y E.coli en aguas utilizando el Fluorocult LMX (MERCK) I. Comparación con los medios de cultivo tradicionales

Sin embargo, el uso de la temperatura como factor diferencial para el caso de E.coli parece ser un factor determinante, pues las diferencias entre las medias de los NMP por los medios tradicionales y el Fluorocult LMX no es tan marcada como en el caso de los coliformes totales. Eckner5 en un estudio realizado en Suecia obtuvo resultados similares empleando los métodos tradicionales y el sistema Colilert. Este sistema al igual que el Fluorocult LMX está diseñado para la detección simultánea de coliformes y E.coli en aguas mediante sustratos cromogénicos y fluorogénicos, solamente difiere de este último en el compuesto fluorogénico o cromogénico que se une al sustrato de las enzimas. Grant, en 1997, obtuvo resultados similares empleando el medio de cultivo m-ColiBlue24. Este medio detecta y cuantifica simultáneamente coliformes totales y E.coli. Este autor encontró que ese medio era superior a otros, en términos de especificidad, sensibilidad y errores de falsos positivos. Resultados similares a los de Grant fueron obtenidos en este estudio. Las figuras 1, 2, 3 y 4 ilustran, de forma gráfica, los resultados una vez transformados los valores obtenidos en sus correspondientes logaritmos. Como bien se puede apreciar, los resultados obtenidos al emplear el nuevo medio de cultivo son muy superiores para el caso de los coliformes totales. Para el caso de E.coli son iguales o ligeramente superiores. CL-CBVB-EC

Estos resultados son razonables ya que la detección y cuantificación de los coliformes totales se realiza de manera indirecta a través de un subproducto de la reacción de fermentación como es la producción de gas; y como ya se ha planteado, existen cepas que no son capaces de producir gas. Por el contrario, la detección de E.coli se realiza utilizando un factor mucho más selectivo como es la temperatura. Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los obtenidos por Grant (1997) al comparar el m-ColiBlue24 con los medios de cultivo tradicionales; y con los que obtuvieron Brenner y colaboradores (1996) al comparar el Agar MI con el m-Endo Agar. Estos investigadores concluyeron que los nuevos medios de cultivo brindan recobrados significativamente superiores, tanto de organismos coliformes como E.coli. La tabla 3 muestra los resultados obtenidos en el análisis de t-student dependiente de dos colas, para muestras pareadas. De esta forma se comparan los resultados obtenidos, tanto para coliformes totales como para E.coli cuando se emplean los medios de cultivo tradicionales (CL-CBVB-EC) y el Caldo Fluorocult LMX para aguas subterráneas. En la tabla 4, se dan los resultados del análisis estadístico de coliformes totales y E. coli para muestras apareadas en aguas superficiales.

FLUOROCULT LMX

3

Log N

2

1

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Número de muestras

CL-CBVB-EC

FIG. 1 Resultados del análisis de E.coli en aguas subterráneas.

FLUOROCULT LMX.

1.5

Log N

1

0.5

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Número de muestras.

18

13

14

15

16

17

18

19

20

FIG. 2 Resultados del análisis de coliformes totales en aguas subterráneas.

A. Rodríguez, M. del C. Novoa, M. A. Mieres, CL-CBVB-EC

FLUOROCULT LMX

4.5

4

3.5

2.5

2

1.5

1

0.5

FIG. 3 Resultados del análisis de coliformes totales en aguas superficiales.

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Número de muestras.

CL-CBVB-EC

FLUOROCULT LMX

5

4

3 Log N

Log N

3

2

1

FIG. 4 Resultados del análisis de E. coli en aguas superficiales.

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Número de muestras.

Tabla 3 Resultados del análisis estadístico de coliformes totales y E.coli, para muestras apareadas, en aguas subterráneas Coliformes totales Estadígrafo

(CL-CBVB)/Fluorocult LMX

E.coli (CL-EC)/Fluorocult LMX

t-student (tabla)

2,09

2,09

t-student (calculada)

-4,97

*

* El análisis estadístico no se justifica porque en la mayoría de los casos los resultados obtenidos por ambos métodos dan negativos.

Tabla 4 Resulados del análisis estadístico de coliformes totales y E. Coli, para muestras apareadas, en aguas superficiales Coliformes totales Estadígrafo t-student (tabla) t-student (calculada)

(CL-CBVB)/Fluorocult LMX

E.coli (CL-EC)/Fluorocult LMX

2,9

2,9

-10,14

-2,04

19

Determinación de coliformes totales y E.coli en aguas utilizando el Fluorocult LMX (MERCK) I. Comparación con los medios de cultivo tradicionales

Los resultados demuestran que en el análisis de coliformes totales existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos métodos. Esta mayor sensibilidad del Caldo Fluorocult LMX radica en que el principio de detección y cuantificación se basa directamente en una reacción enzimática, la cual es altamente específica. Por lo tanto, la reacción solamente se llevará a cabo si está presente la enzima (bacterias coliformes) y así se liberará al medio el compuesto cromogénico y/o fluorogénico. En el caso de la determinación de E.coli no existen diferencias estadísticamente significativas, ni en el agua superficial ni en la subterránea. La tabla 5 muestra los resultados obtenidos al sembrar 10 réplicas de una misma muestra de agua en el Caldo Fluorocult LMX. Si se analizan los valores de desviación estándar y coeficiente de variación obtenidos tanto para

Tabla 5 Resultados del análisis de reproducibilidad para el nuevo medio de cultivo Caldo Fluorocult LMX en la detección y cuantificación de coliformes totales y E.coli en aguas superficiales Muestras

Coliformes totales (NMP/100 Ml)

E.coli (NMP/100 mL)

1

24 000

3 000

2

13 000

2 700

3

24 000

3 000

4

13 000

2 700

5

30 000

3 000

6

24 000

1 300

7

24000

3 000

8

22 000

3 000

9

22 000

3 000

10

24 000

1 300

Media geométrica

21 335

2 485

Media aritmética

22 000

2 600

DS

5 228

696

24

27

C. Variación

20

coliformes totales como para E.coli, se aprecia que su dispersión es pequeña (valor del coeficiente de variación); si tenemos en cuenta que se trata de agua superficial la cual por su naturaleza presenta altos valores de organismos coliformes y una alta dispersión en los resultados, por lo que se puede concluir que la técnica es altamente reproducible cuando se emplea este nuevo medio de cultivo. CONCLUSIONES 1. El análisis estadístico de los valores obtenidos en la detección y cuantificación de coliformes totales muestra que existen diferencias estadísticamente significativas entre los medios de cultivo tradicionales y el Fluorocult LMX. El recobrado de coliformes totales y E.coli es superior cuando se emplea el Fluorocult LMX tanto en aguas subterráneas como en aguas superficiales. 2. Para la detección y cuantificación de E.coli, no existen diferencias estadísticamente significativas; aunque los resultados obtenidos son ligeramente superiores cuando se emplea el Fluorocult LMX. 3. El medio Fluorocult LMX muestra mayor sensibilidad, rapidez y reproducibilidad en la detección y cuantificación de coliforme totales y E.coli que los medios de cultivo tradicionales. REFERENCIAS 1. APHA: Standard Methods For The Examination Of Water And Wastewater, 20 Edition, Washington DC, 1998. 2· MANAFI, M.: "Rapid Detection Of Total Coliforms And E.coli In Water Using Fluorocult LMX Broth", Microbiol. 55, 320, 1994. 3· MERCK: Manual de medios de cultivo, RFA, 1997. 4· CIEBIN, B.W. Y OTROS: "Comparative Evaluation Of Modified M-Fc And M-Tec Media For Filter Enumeration Of Escherichia coli" in Water. J. Appl. Env. Microbiol, 61: 11, 1995. 5· ECKNER, K.F.: "Comparison Of Membrane Filtration And Multiple Tube Fermentation By Colilert And Enterolert Methods For detection Of Waterborne Coliform Bacteria, Escherichia coli And Enterococci Use Drinking And Bathing Water Quality Monitoring" In Southern Sweden. Appl. Env. Microbiol. 64, 1998.

Recibido: junio del 2003 Aprobado: julio del 2003