Criobiologia Del Semen

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1ra Edición, Julio 2009 Impreso en Perú – Hvca

© CRIOBIOLOGIA DEL SEMEN (EN ANIMALES DOMESTICOS Y AVANCES EN ALPACAS)

Autores: Ing. Brian J. Ordoñez Mulato [email protected] Obra compilada, editada y publicada en la Universidad Nacional de Huancavelica – E.A.P. de Zootecnia.

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PREÁMBULO La presente publicación nace con toda la intención de hacer una difusión e incentivar tanto a estudiantes, docentes universitarios u otros investigadores, interesados en sumergirse al campo de la criopreservación de gametos de alpaca. La mayor parte del contenido del presente posee fundamentos teóricos compilados sobre criobiología, explicaciones y efectos en las células reproductivas masculinas. En la segunda parte se mencionan los materiales, métodos y procedimientos que se tomaron en cuenta para realizar un estudio en alpacas, así también se muestran resultados, que dan luces para poder concretar esta biotecnología, desde luego sabemos que su importancia radica para emplearse en las comunidades alpaqueras, mediante la inseminación artificial u otra biotecnología similar; Así para muchos que desconocíamos, podemos entender que la razón por la cual no se efectúa la inseminación artificial en esta especie es no poseer semen criopreservado, de ahí nace la investigación y la presente publicación.

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AGRADECIMIENTOS Es necesario agradecer a personas que por sus diversos aportes muy importantes fue posible concluir este estudio: Álvaro López, Teodosio Huanca M. y Mario L. Gonzáles C, INCAGRO – Wilfredo Huanca.

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CONTENIDO ÍNDICE PREAMBULO INTRODUCCIÓN 1.1 ASPECTOS GENERALES. 1.2 Criobiología del semen. 1.3 Factores que afectan la viabilidad espermática durante el proceso de criopreservación. 1.3.1 Cambios de volumen. 1.3.2 Shock de frío. 1.3.3 El crioprotector y el estrés celular. 1.3.4 Estrés osmótico. 1.4 Alteraciones a los espermatozoides durante el proceso de Criopreservación. 1.5 Efecto de la criopreservación sobre el espermatozoide. 1.5.1 Crio daño sobre la bicapa lipídica. 1.5.2 Crio daño sobre la integridad mitocondrial. 1.6 Procesamiento para el congelado del semen. 1.6.1 Los diluyentes o dilutores. 1.6.2 Refrigeración. 1.6.3 Adición del crioprotector. 1.6.4 Envasado o empacado del semen. 1.6.5 Congelamiento de semen. 1.6.6 Descongelamiento de semen y evaluación post congelación. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Del lugar. 2.2 Materiales y equipos. 2.2.1 Materiales. 2.2.2 Reactivos o material químico. 2.2.3 Equipos. 2.4 Metodología. 2.4.1 Preparación seminal pre congelamiento 2.4.1.1 Obtención de la muestra de semen. 2.4.1.2 Evaluación macroscópica y microscópica del semen. 2.4.1.3 Preparación del dilutor. 2.4.2 Preparación y proceso del congelamiento seminal. 2.4.2.1 Proceso de refrigeración y agregado del crioprotector. 2.4.2.2 Proceso de congelamiento. 2.4.3 Evaluación post congelamiento. 2.4.4 Análisis estadístico.

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RESULTADOS Y DISCUSIONES 8

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3.1 Evaluación seminal post congelamiento. 3.1.1 Resultado de motilidad del espermatozoide post congelamiento. 3.1.2 Resultado de mortalidad del espermatozoide post congelamiento. 3.1.3 Prueba de contrastes ortogonales para motilidad y mortalidad espermática post congelamiento.

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CONCLUSIONES RECOMENDACIONES COMENTARIO REFERENCIAS

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INTRODUCCIÓN Para mejorar la calidad de fibra de las alpacas (Vicugna pacos), en este momento se cuenta con un moderno medio de mejoramiento genético que actualmente nos brinda el uso de la biotecnología reproductiva como es la inseminación artificial con semen fresco diluido (INIA, 2004), el cual tiene la ventaja de efectuar con un solo eyaculado la posibilidad de inseminar un gran número de hembras pero, sin embargo se tiene el limitante de que el donador de semen tiene que estar en el lugar de obtención; De lograr un protocolo de congelamiento seminal ideal en alpacas mediante un conservador o crioprotector viable, el semen congelado de esta especie podría ser considerado al presente una alternativa seria para fines de mejoramiento genético, pues brindaría una mayor rapidez al progreso genético a nivel de los rebaños de nuestro país, así mismo ayudaría a obtener ejemplares de alto valor genético; Pero las investigaciones realizadas concernientes a este tema son muy pocas por lo que hasta ahora no se cuenta con protocolo definido. En el Perú la producción de alpacas es la fuente de vida de miles de familias que directa e indirectamente se benefician económicamente, así mismo contribuye al país aportando el 2% del PBI, su demanda es importante debido a que actualmente se aprecia en el extranjero como una fibra exótica y sus características textiles de calidad hacen que tenga un precio mayor frente a la lana de ovino en el mercado mundial. Dado el valor económico actual y su demanda en el mercado exterior de la fibra hace que su producción sea preponderantemente valiosa, es por ello que recién en los últimos años se esta dando el interés respectivo acerca de la finura de la fibra, pues según estudios realizados en nuestro país se cuenta con una alta producción de fibra gruesa. En nuestros días se cuenta con el 87% de la población a nivel mundial, ventaja que debe ser aprovechada por ahora, no solo el Perú es el único interesado en el desarrollo de alguna biotecnología reproductiva como la inseminación artificial, congelación de semen, transferencia de embriones, entre otros, que funcionan muy bien en otras especies, uno de los más grandes interesados es Australia, que ya para el 2005 contaba con 60,814 alpacas según (Reyna, 2005) y últimamente está invirtiendo mayores recursos económicos en investigación de este tipo, además, están EEUU, Gran Bretaña, Nueva Zelanda y Alemania, y los países hermanos de Sudamérica el caso de Chile principalmente. En ese sentido la presente investigación tiene como objetivo evaluar el efecto crioprotector que brindan el glicerol y el etilen glicol sobre la motilidad y mortalidad del espermatozoide de alpaca al post congelamiento. Los autores 10

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ASPECTOS GENERALES. El uso de la inseminación artificial es considerado como un medio para acelerar el mejoramiento genético de los rebaños, haciendo factible que unos cuantos machos seleccionados de buena calidad puedan donar semen para inseminar artificialmente a cientos de hembras dentro de su vida reproductiva y así lograr mejores generaciones. La inseminación artificial es la técnica individual más importante creada para el mejoramiento genético de animales y actualmente se práctica en vacunos, porcinos, ovinos y otras especies (Hafez, 1993). En las alpacas la mejora genética es lenta en comparación a otro ganado, debido a su fisiología reproductiva que limita la aplicación de alguna biotecnología reproductiva la misma que funciona muy bien en otras especies, una de estas limitantes es el largo periodo de gestación, otra restricción es que los animales machos inician la pubertad al primer año de edad y tienen problemas en la liberación completa del pene que les impide realizar una copula normal y recién a los 3 años el 100% de animales se encuentran libres de la adherencia peneprepucial, por tal razón sugieren trabajar con animales mayores (Reyna, 2005). También hay otro problema importante pero ya casi superado acerca de la obtención de semen de buena calidad, pues se ha intentando diversos métodos por muchos años, el empleo del maniquí y una vagina artificial modificada que en la actualidad viene a ser el mejor método utilizado, con este procedimiento la copula es similar a la monta natural durando en promedio 20 minutos según Tibary et al, (1999), como se sabe la monta natural es prolongada sosteniendo aproximadamente 25 minutos (Bustinza 2001). Acerca de las características seminales se indica que los eyaculados colectados de 3 o 4 días tienen un mejor volumen y concentración. El volumen de semen varía de acuerdo a la técnica de obtención utilizada, a la individualidad y entre una colección a otra, tal es así que oscila de 0.8 ml a 1.0 ml y excepcionalmente se ha reportado 12 ml (Bustinza, 2001). Con respecto a la concentración hay una variación extensa desde 22.5 a 875 millones/ml (Vaughan et al, 2003). Así también según Sumar y Leyva, (1981) indica que en el semen de alpaca no hay motilidad masal por la baja concentración relativa de espermatozoides y porque se ha observado una motilidad progresiva individual, esta última observación obedece a que el plasma seminal es altamente viscoso por lo que el movimiento de los espermatozoides es lento en cuanto a su desplazamiento comparado con el ovino y bovino. A ello se agrega que la cuantificación promedio de la motilidad individual en semen fresco es de 85% con rangos de 69% a 91% (Bustinza, 2001). CRIOBIOLOGÍA DEL SEMEN. La criopreservación y su empleo para la inseminación artificial han causado un gran impacto sobre la reproducción animal. Innumerables crías de diferentes especies han nacido a partir del uso del semen congelado. Sin embargo constantemente se modifican los protocolos de congelación a fin de obtener mejores resultados en relación a la supervivencia y fertilidad del semen congelado. Múltiples 12

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factores afectan la sobrevivencia de los espermatozoides al descongelamiento como la concentración espermática en el diluyente, el envasado, la composición del diluyente empleado, el shock de frío entre otros (Stornelli et al, 2005). Durante el proceso de congelación y descongelación se pierde aproximadamente el 50% de la población inicial de espermatozoides debido a los efectos de criopreservación sobre las membranas celulares, el citoesqueleto, aparato locomotor y núcleo del espermatozoide. Se considera que el principal sitio de daño asociado a los cambios de temperatura son las membranas espermáticas, considerándose a esta causa como la más asociada a la reducción de la fertilidad del semen congelado durante los procesos de refrigeración, congelación y descongelación. (Watson, 1995). La optimización del protocolo de congelación debe contemplar no solo la obtención de un alto número de espermatozoides sobrevivientes sino también la habilidad funcional de esta población (Stornelli et al, 2005). La eficiencia para la congelación del semen varía entre las especies y entre machos individuales de una misma especie. Estas variaciones se relacionan con las características biofísicas y bioquímicas de las membranas espermáticas (Hafez, 2002). FACTORES QUE AFECTAN AL ESPERMATOZOIDE DURANTE EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN. Para obtener buenos resultados de supervivencia espermática y fertilidad de los espermatozoides es necesario comprender a que tipo de estrés se ven sometidos los espermatozoides durante los procesos de congelación y descongelación así como la manera en que las células responden a las agresiones físico-químicas y medioambientales (Stornelli et al, 2005). CAMBIOS DE VOLUMEN. Cuando los espermatozoides son congelados y descongelados se ven sometidos a varios ciclos de deshidratación e hidratación lo que resulta en cambios significativos de volumen. El primer cambio de volumen ocurre cuando la célula es colocada dentro de un diluyente, el cual contiene sustancias crioprotectoras como glicerol, y posteriormente cuando la solución es congelada. Mas tarde ocurren cambios de volumen cuando la solución es descongelada. Estos cambios de volumen están asociados a cambios de la concentración de iones y electrolitos en las soluciones intra y extra celulares. La forma en que ocurren estas modificaciones determinan la mayor o menor capacidad de la célula para soportar el daño a la que se ve sometida. El cambio de volumen es solo uno de los factores de estrés a los que la célula se ve sometida durante el proceso de criopreservación (Leivo y Dradey, 1999). SHOCK DE FRÍO. Es bien conocido que el enfriamiento rápido del semen entre 30 ºC y 0 °C induce un estrés letal en algunas células, el cual es proporcional a la tasa de enfriamiento. Es así que el enfriamiento en este rango de temperatura debe ser realizado cuidadosamente (Watson, 1981). Este fenómeno es 13

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conocido como shock de frío y puede apreciarse durante el enfriamiento de espermatozoides de cualquier especie. En el porcino este fenómeno se manifiesta inmediatamente después de la eyaculación haciéndose la célula cada vez más sensible al mismo en las horas siguientes (Pursel et al, 1978). El estrés de la membrana puede continuar por debajo de 0 °C sin que el cambio de fase sea completo, sin embargo es bien conocidoque los cambios de fase ocurren, en su mayoría, entre los 5 °C y 15°C (Dobrins et al, 1993). En un estudio sobre la función de permeabilidad de la membrana del espermatozoide al criopreservar semen de verraco, se ha demostrado la importancia de la composición lipídica del medio ambiente donde se encuentra la membrana plasmática durante el enfriamiento, esto relaciona al componente lipídico en la participación del paso de moléculas en la membrana e interviene en el mecanismo del daño celular (Pettit y Bhur, 1998). El agregado de preparaciones lipídicas purificadas a los espermatozoides reduce significativamente el shock de frío y el daño producido por la congelación – descongelación (Graham, 1987), por lo que usualmente se incluye yema de huevo en la preparación de los diluyentes debido a que los fosfolípidos y las lipoproteínas de baja densidad poseen un efecto protector contra el shock del frío (Quinn et al, 1980). EL CRIOPROTECTOR Y EL ESTRÉS CELULAR. El crioprotector permite mantener una mayor proporción de agua líquida intracelular a bajas temperaturas y en consecuencia una menor concentración de electrolitos posibilitando la supervivencia celular durante el proceso de criopreservación. Sin embargo, estos compuestos y los diluyentes producen un estrés transitorio pero importante sobre la membrana plasmática de los espermatozoides (Stornelli et al, 2005). La magnitud de este hecho esta íntimamente relacionado con la capacidad penetrante de los crioprotectores (Gao et al, 1993). El crioprotector de elección es comúnmente el glicerol, el cual produce una alteración osmótica. A la vez se ha observado que la hiperosmolaridad producida por este compuesto posee un efecto estimulador para la reacción del acrosoma (Aitken et al, 1983). Además del glicerol existen otros compuestos que poseen propiedades crioprotectoras como por ejemplo el etilen glicol, propilenglicol, dimetil sulfóxido o metanol (Navarro et al, 2004). ESTRÉS OSMÓTICO. El estrés, inducido por la formación de cristales de hielo está asociado a los cambios en la presión osmótica de la fracción no congelada (Watson, 1988). Cuando una solución es enfriada por debajo del punto de congelación los cristales de hielo se integran y el agua pura se cristaliza formando hielo. Los solutos permanecen disueltos en la fracción de agua líquida y por lo tanto la presión osmótica de la solución aumenta. La 14

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proporción de agua cristalizada como hielo y la presión osmótica de la solución restante depende de la temperatura, velocidad de descenso de la misma y el volumen de la fracción no congelada (Stornelli et al, 2005). Por tal sentido la duración de la exposición a estos eventos debería minimizarse para lograr una óptima sobrevivencia, implicando entonces que el enfriamiento celular debería ser rápido. Sin embargo la tasa de enfriamiento debe ser suficientemente lenta como para permitir la salida de agua, y prevenir la formación de cristales de hielo intracelular, lo cual es letal para la célula (Holt y North, 1991). Así también refieren que el porcentaje de células que sobrevive a un proceso de congelación esta determinado por la sensibilidad al estrés osmótico durante la adición y remoción de crioprotectores durante el enfriamiento y el recalentamiento (Stornelli et al, 2005). Las células espermáticas poseen mayor permeabilidad al agua que otros tipos celulares (Noiles et al, 1993). Si bien puede haber diferencias entre especies en la sensibilidad del espermatozoide a la criopreservación, el eyaculado es heterogéneo habiendo una resistencia variable al estrés osmótico entre las células espermáticas (Katkov et al, 1998). Los signos de estrés manifestado por los espermatozoides luego de la descongelación no se relacionan solo con el estrés osmótico sufrido en el descongelado sino también con el estrés sufrido durante el congelado (Holt y North, 1991). Es por eso que cada tipo celular posee una velocidad óptima de congelación que garantiza su supervivencia luego de la criopreservación. Si la velocidad de congelación es demasiado rápida o demasiado lenta el estrés producido por el proceso de criopreservación aumenta. Mazur, (1984) hizo un calculo empírico acerca del congelamiento de las células espermáticas estimando un rango de 15 a 60 °C/minuto como la velocidad optima de congelación que permite mayor probabilidad de obtener una mejor tasa de sobrevivencia celular.

ALTERACIONES A LOS ESPERMATOZOIDES DURANTE EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN. Uno de los efectos comprobados producidos durante el proceso de criopreservación es la disminución de la motilidad del espermatozoide (Hafez, 2002; Stornelli et al, 2005). En tanto que una pequeña parte de la población celular exhibe un movimiento progresivo vigoroso, la mayoría de las células muestran variables grados de alteración de la motilidad post congelado en comparación con la motilidad del semen fresco. Este hecho puede estar íntimamente relacionado con la pobre capacidad fecundante del semen congelado. En un estudio con semen criopreservado realizado en humanos se encontró que tanto la motilidad progresiva como el vigor del movimiento celular eran factores relacionados estrechamente con la fertilidad (Kelly et al, 1997). 15

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Si bien, estudios de fertilización in vitro han demostrado que los espermatozoides criopreservados son capaces de fertilizar, solo algunos acceden al proceso pero muchos otros estan estructuralmente afectados y son incapaces de fertilizar (Ellinton et al, 1999). EFECTO DE LA CRIOPRESERVACIÓN SOBRE EL ESPERMATOZOIDE. Una vez que los crioprotectores ingresan al citoplasma a favor del gradiente de concentración, el fluido intracelular puede ser enfriado a temperaturas entre -5 y 15, sin que ocurra la formación de cristales hielo, debido a que estas sustancias disminuyen el punto de congelación por medio de la interacción entre las moléculas de agua, a estos rangos de temperatura los cristales de hielo comienzan a formarse en el medio externo. Cuando las temperaturas descienden por debajo de estos rangos, se inicia la formación de cristales de hielo intracelular (Vincent et al, 1998). La temperatura a la cual deben ser incorporados los crioprotectores a la solución de semen y el tiempo de exposición celular, dependen del grado perjudicial del crioprotector principalmente en volúmenes excesivos y de su velocidad de difusión a través de la membrana plasmática. Esta difusión puede verse afectada por el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso la membrana celular aumenta la proporción de colesterol con el propósito de lograr mayor estabilidad mecánica; sin embargo, este aumento del colesterol también disminuye la permeabilidad de la membrana a pequeñas moléculas, pudiendo afectar la penetración del crioprotector en la célula de una manera efectiva (Spinel, 2002). Los mecanismos de acción especifica de los agentes crioprotectores a nivel celular no están bien explicados, al parecer la interacción ocurre en el ámbito de la bicapa lipídica específicamente en la interacción con los fosfolipidos, a lo indicado, no solo es importante establecer como interactúa el crioprotector, sino que es necesario y mas imprescindible determinar el efecto perjudicial de estos para poder tomar el control celular (Medina et al, 2005). 1.5.1

CRIO DAÑO SOBRE LA BICAPA LIPÍDICA Las propiedades de la membrana están dadas por la proporción lipídica de un 70% de fosfolipidos, 25% de lípidos neutros (principalmente colesterol), y 5% glicolípidos (Muller et al, 1994). Los fosfolipidos al formar la mayor parte de la membrana, pueden conferir gran fluidez, pero también mayor inestabilidad, que es contrarrestada por las cantidades variables de colesterol (Holt, 2000). Se ha sugerido que el estrés térmico sobre la membrana plasmática durante el enfriamiento resulta en la transición de la fase líquida a una fase de gel en los fosfolipidos de la membrana, como resultado de esta transición, las proteínas integrales de la membrana pueden ser excluidas de los dominios de los lípidos de la fase de gel y son agrupadas, algunas veces de forma irreversible. La actividad de muchas enzimas asociada a las membranas se reduce, así como la tasa de difusión de proteínas por lateralización dentro del plano de la bicapa, reduciendo de este modo la eficiencia de los procesos relacionados con la difusión (Labbé et al, 1997). 16

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Durante la exposición al frío se ha observado la reducción en la proporción de ácidos grasos saturados e incremento en la proporción de ácidos grasos insaturados. Cuando aumenta la temperatura, la relación de los fosfolipidos y los contenidos de colesterol se correlacionan positivamente; estos cambios originan una reorganización de la membrana, lo que ayuda a la célula a sobrevivir a las nuevas temperaturas (Labbé et al, 1997). Se ha demostrado que un largo periodo de aclimatación térmica induce a algunas modificaciones en los patrones de ácidos grasos de los fosfolipidos de la membrana plasmática de los espermatozoides. Sin embargo, esto podría ser el resultado del cambio fisiológico que sufren los animales para mantener la fluidez de la membrana, donde la composición de los ácidos grasos y la proporción de moléculas de colesterol se modifica en función de la temperatura del ambiente. Se observó una mejor resistencia a la criopreservación, los espermatozoides que se mantuvieron bajos en contenidos de colesterol en la membrana plasmática, esta baja cantidad de colesterol se correlacionó con una mejor capacidad de fertilización de los espermatozoides después de la criopreservación (Spinel, 2002). 1.5.2

CRIO DAÑO SOBRE LA INTEGRIDAD MITOCONDRIAL La integridad mitocondrial juega un papel importante. Los procedimientos de congelación y descongelación inducen una disminución en la producción de ATP, la cual varía con el crioprotector utilizado. Esta disminución puede resultar del estrés osmótico durante la adición del crioprotector o el congelamiento del agua externa. Las diferencias entonces, en la capacidad entre el glicerol y el metanol para prevenir la disminución en la síntesis de ATP, pueden ser parcialmente explicadas por el hecho de que el medio de congelación con glicerol permite los más altos valores de osmolaridad y con el metanol los más bajos (Ogier et al, 1997). Los cambios morfológicos determinados por microscopia electrónica, revelan daños en la pieza media del espermatozoide en la fase de post descongelación, conllevando a la formación de protuberancias o ensanchamientos de la membrana en esta zona como resultado de la perdida de la envoltura densa de las mitocondrias. La formación de protuberancias también ha sido determinada en el flagelo y la cabeza del espermatozoide, con pérdida de cromatina nuclear, dándose una pérdida de la funcionalidad mitocondrial y una disminución de las reservas de energía necesarias para el movimiento flagelar del espermatozoide, comprometiendo la osmoregulación celular (Yao et al, 2000). Aparentemente la toxicidad de los crioprotectores está dirigida sobre el estado bioenergético del espermatozoide, interfiriendo con el balance entre síntesis y utilización de ATP, ya que frente a una deficiencia de ATP, durante la congelación, el control metabólico sobre los procesos celulares dependientes de iones podría verse afectado, ocasionando una inapropiada 17

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activación de fosfolipasas y proteasas afectando un daño celular irreversible (Holt, 2000). 1.6

PROCESAMIENTO PARA EL CONGELADO DEL SEMEN. 1.6.1 LOS DILUYENTES O DILUTORES. Este medio debe realizar la función de aporte de nutrimentos como una fuente de energía, proteger contra el efecto nocivo del enfriamiento rápido, ser amortiguador de tal manera que impidan los cambios perjudiciales de pH, mantener la presión osmótica apropiada y el balance electrolítico, inhibir la proliferación electrolítica, incrementar el volumen del semen y proteger a las células durante el congelamiento (Hafez, 2002), generalmente a este primer medio de solución se denomina diluyente A. Prácticamente, todos los diluyentes para semen líquido o congelado tienen yema de huevo o leche descremada o una combinación de estas dos, como componentes básicos. Es posible que el suero sanguíneo al igual que la yema de huevo ofrezca una protección a la membrana del espermatozoide al congelamiento, que consistiría en una interacción de la superficie celular más con los lípidos que con las proteínas, señalando que el suero posee una inclusión proteínica de 7 gr/ml (Palacios y Zarco, 1995). A continuación se mencionan varios ejemplos del empleo de dilutores en diferentes especies. En semen de carnero Angulo et al, (1999) utilizaron un dilutor conformado por tris 36.05 gr, ácido cítrico 20.2 gr, fructuosa 14.88 gr, agua bidestilada 100 ml y 20% de yema de huevo. En el caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) empleó un dilutor compuesto de 74 partes de citrato de sodio, 25 partes de yema de huevo, 1 parte de glucosa, 1000 UI/cc de penicilina y 500 mg/cc de estreptomicina. Por otro lado Cueto et al, (2003) en una dilución de semen de caprino emplearon 10% de leche descremada en polvo (50 ml de agua bidestilada y 5 gr de leche), glucosa 1% (0.5 gr de glucosa), 1 gr de penicilina y estreptomicina (1000 UI) por mililitro de diluyente, en caso del caprino antes de unir al dilutor, se debe proceder a lavar el semen, es decir separar del plasma seminal mediante centrifugación a 2000 rpm/10 minutos. En otro estudio con fines de congelación se utilizaron dilutores para semen de cerdo compuesto a base yema de huevo y lactosa, previo a esta se mantuvieron a 15 °C/24 horas y se centrífugo (250gr) a 1500 rpm/10 minutos (Gosálvez et al, 2003). Antes de la dilución debe mantenerse a 30°C para evitar el shock térmico, se extrae una porción de semen para su evaluación y el resto puede mezclarse con tres o más partes de diluyente a 30°C, en toros el semen no congelado puede diluirse en una proporción de 200 a 300 veces (Hafez, 2002). Bravo, (1998) indica que en camélidos, se viene aún investigando dilutores adecuados para trabajos de congelamiento. Los dilutores que mantuvieron mayor número de espermatozoides vivos, en orden de importancia según Vaughan et al, (2003), son: tris tamponado 70%; tryladil 65%; yema de huevo, glucosa y citrato 8%. 18

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Así también Aller et al, (2003) utilizaron citrato sódico, yema de huevo, glucosa, penicilina, sulfato de estreptomicina para emplearlo en semen de llama. 1.6.2

REFRIGERACIÓN. Luego de la mezcla realizada se enfría gradualmente hasta 5°C en todas las especies excepto en el verraco que suele mantenerse a 15°C. El enfriamiento debe ser lento, tomando por lo menos 1 hora, este proceso suele realizarse protegiéndose con un recipiente en una camisa de agua para amortiguar el shock térmico (Hafez, 2002). El enfriamiento se realiza a razón de 2°C cada 3 minutos y permanece a 5°C durante 45 a 60 minutos antes de proceder al agregado del diluyente B que contiene el crioprotector (Cueto et al, 2003). Similarmente Angulo et al, (1999), sometieron el semen de carnero en un recipiente de 22°C e introdujeron a refrigeración a 0°C durante 2 horas, tiempo suficiente que paulatinamente alcanza 5°C, afirma que no sufre choque térmico con este procedimiento. Del mismo modo Medrano et al (2004), refrigeraron pajillas con semen de caprino hasta 5 ºC por dos horas. El procedimiento no tiene diferencia entre pajuelas, pellets u otro, en cuanto a refrigeración.

1.6.3

ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR. Por lo general se añade el crioprotector al semen después de enfriarlo y esta incorporación debe ser por etapas lo que permite una mayor proporción de espermatozoides sobrevivientes (Gao et al, 1993). La cantidad final del crioprotector en las diferentes especies puede variar desde 5% en medios de yema de huevo o azúcar a 10% en leche. En caso del verraco se utiliza 2% de glicerol (Hafez, 2002). Para el caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) emplearon 14% de glicerol en la fracción B a base de yema y citrato, es decir quedando una concentración final de 7% de glicerol, este proceso es general en la criopreservación de semen, y para el periodo de estabilización un tiempo entre 3 a 6 horas. Angulo et al, (1999) mencionan, que para poder congelar semen de carnero debe utilizarse 5% de glicerol más un dilutor a base de tris, yema de huevo y ácido cítrico. Otro estudio en semen de cerdo fue realizado por Gosálvez et al, (2003) quienes utilizaron 4% de glicerol mas yema de huevo y lactosa, dejando una proporción final de 2% del crioprotector, que por lo general la concentración de glicerol es baja en esta especie. Cueto et al, (2003) trabajando con semen de caprino usó 6% de glicerol, agregado que fue en tres partes cada 10 minutos, teniendo en cuenta un pH entre 6.8 y 7.2. Hafez, (2002) afirma que la mezcla del semen y el diluyente en cualquier especie se debe dejar reposar durante varias horas antes de 19

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congelarla, para permitir que las células espermáticas se equilibren con el diluyente, 4 a 6 horas como óptimo dependiendo del medio utilizado. Mientras Medrano et al, (2004) emplearon solo 2 horas antes de someter a congelamiento.

1.6.4

ENVASADO O EMPACADO DEL SEMEN Se pueden realizar de 3 formas; a) En pajillas de 0.25 a 0.5 ml de semen diluido. b) En ampolletas de vidrio de 0.5 a 1 ml que son recipientes estériles que se pueden rotular, llenar y sellar de manera automática y c) Por píldoras o pellets de 0.1 a 0.2 ml, que requieren poco espacio cuando se almacena masivamente y es una forma económica, su principal desventaja es la dificultad para identificar cada píldora (Hafez, 2002). Por otro lado, en un estudio con semen de carneros se demostró que en pajillas de 0.25 ml puede envasarse el semen con 300 x 106 espermatozoides motiles (Angulo et al, 1999).

1.6.5

CONGELAMIENTO DEL SEMEN. Olivares y Urdaneta, (1985) precisaron, que posterior al periodo de equilibrio con el crioprotector debe procederse a precongelar las pajuelas de semen, en vapores de nitrógeno a –120 °C por 10 minutos y luego introducir a –196 °C. Para realizar el congelamiento de semen de carnero Angulo et al, (1999) sometieron a 4.5 cm sobre el nivel superior del nitrógeno durante 10 minutos. Hafez, (2002) menciona que en caso de las pajillas suelen congelarse en vapores de nitrógeno y almacenados a –196°C, a menudo las ampolletas se congelan a razón de 3°C/minuto hasta –15 y este desciende hasta llegar a –150 °C, es ahí entonces donde se depositan a –196°C. Para el método de píldoras se colocan gotas en un volumen aproximado de 0.1 ml, en huecos de forma hemisférica hechos en bloques de hielo seco (-78 º C), este procedimiento muestra buena supervivencia al descongelado. En otra investigación con semen de caprino se demostró que es posible el congelamiento en vapores de nitrógeno en pajillas o en pastillas (pellets) en hielo seco en volúmenes de 0.2 ml por un tiempo de 1 a 2 minutos, por cualquiera de estos métodos se conservan en termo de nitrógeno líquido (Cueto et al, 2003).

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Fig. Nº 01 : Espermatozoides en criopreservación. 1.6.6

DESCONGELAMIENTO DEL SEMEN Y EVALUACIÓN POST CONGELACIÓN. Después de congelarse, los espermatozoides no resisten un segundo congelamiento, pues no sobreviven como los que han sido congelados en una primera oportunidad por ello es necesario asegurarse la utilización del semen congelado (Stornelli et al, 2005). La motilidad espermática es la primera característica de evaluación y una de las principales que se realiza, pues es un importante indicador de vida del espermatozoide que se realiza antes y después de la criopreservación (Hafez, 2002). Se estima que entre el 40% y 50% de la población de espermatozoides sobreviven al proceso de congelación–descongelación. Así bien, parte de la población de espermatozoides que sobreviven han sufrido daños que les convierte en incapaces de fecundar (Watson, 2000). Cuando el semen criopreservado se descongela, se transfiere del tanque de nitrógeno a 37°C durante 3 a 5 minutos o a una unidad de descongelamiento automático (Hafez, 2002). Cueto et al, (2003) por otro lado afirma que la evaluación de un 10% de las dosis congeladas en semen de caprino es importante, lo cual debe ser sometida a varias observaciones y poseer una motilidad masal al descongelamiento superior al 30% y un vigor del movimiento igual o superior a 2.5 según escala (1 - 5) enunciada por Hafez, (2002). Se han descongelado pajillas de semen de vacuno a 37°C con buenos resultados, mientras que las píldoras se descongelan mejor en un medio líquido a 40°C, en condiciones prácticas de campo (Hafez, 2002). Se obtuvieron buenos resultados al descongelar semen de cerdo a 42 °C/20 seg, obteniendo una motilidad de 28.8% y manteniendo 36.2% de células con acrosomas normales (Gosálvez et al, 2003).

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Otro resultado al descongelar semen de carnero a 38 °C por 8 segundos se obtuvo una motilidad progresiva de 51.2%, para ello se consideró que el semen fresco debía tener mayor a 60% de motilidad (Angulo et al, 1999). Para congelar el semen en camélidos sudamericanos (caso de la llama) se utilizó yema de huevo, glicerol y tris a lo cual se hallo una motilidad de 10% al descongelamiento (McEvoy et al, 1992). Se ha indicado que el dilutor PBS más 40% de suero sanguíneo, 5% de yema de huevo y 5% de glicerina logra conservar al post congelamiento una motilidad de 34% a partir de un promedio inicial de 69% en semen de alpacas (Bustinza, 2001). Al congelar semen de llama y utilizando el dilutor a base de citrato sódico, yema de huevo, glucosa mas los crioprotectores el DMSO (dimetil sulfóxido) a 6% y glicerol a 8% se alcanzó una motilidad individual de 20.4 % y una viabilidad de 32,4 % al descongelado (Aller et al, 2003). Para la congelación de semen de alpaca se sirvieron del dilutor comercial Biladyl A y B mostrando buenos resultados frente a otros dilutores comerciales empleados en otras especies, encontrando un rango de motilidad entre 10 y 40% con un promedio de 21.3%, los cuales fueron congelaron en pajillas de 0.5 ml, los resultados en pellets (pastillas) mostraron 10% menor actividad motil (Vaughan J. et al. 2003). Para someter a congelamiento el semen de alpaca y llama procedentes del conducto deferente, se utilizaron como componentes del dilutor: TRIS buffer, ácido cítrico monohidratado, fructuosa y yema de huevo, como crioprotector el glicerol a 7.5 %, se obtuvo un promedio general de 41.0 % de motilidad individual progresiva y 43.0% de motilidad a 5% de glicerol en llamas, el procedimiento de descongelamiento fue a 37 °C por 30 seg (Pérez et al, 2004).

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Criobiología del semen

MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 DEL LUGAR Se realizó en el Banco de Germoplasma de Camélidos Sudamericanos Domésticos del C. I. P. Quimsachata, en el INIA-Puno que se encuentra a 15° 04’ 00” de Latitud Sur y a 70° 18’ 00” Longitud Oeste a una altitud 4200 m.s.n.m. cuenta con una área 6,282.50 has. El acceso es por trocha carrozable a 12 km del Distrito Santa Lucia, Provincia de Lampa y Región de Puno. 2.2

MATERIALES Y EQUIPOS. 2.2.1 MATERIALES. Se utilizaron los siguientes materiales:  Maniquí de madera cubierto por piel de alpaca hembra.  Vagina artificial de PVC de 2 pulgadas de diámetro.  Funda recta de látex de uso en vacunos.  Funda cónica de polietileno.  Tubo colector falcón graduado de 15 ml.  Termos de capacidad de 2 litros.  Jeringas descartables de 1, 5 y 10 ml.  Cubre objetos de 0.8 x 0.8 cm.  Porta objetos de 3.5 x 1.0 cm.  Pipetas de 1 ml y 10 ml.  Gradilla.  Algodón.  Cinta adhesiva masking type.  Rotulador.  Vasos de precipitación de 500 ml.  Guantes quirúrgicos descartables.  Tubos de ensayo.  Viales de 2 ml.  Mechero.  Pinza.

         

Detergente. Caja térmica de tecnopor. Superficie plana de acrílico (8 x 15 cm). Inflador. Esponjas pequeñas. Ligas de sujeción. Toallas. Baldes. Lavador. Cocina a gas.

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Criobiología del semen

2.2.2 MATERIAL QUÍMICO. Dilutor: TRIS (hidroximethyl) aminomethan AR 99.5%, laboratorio GMBH. Penicilina - Streptomicina 1000 UI, laboratorio Gibco. Glucosa, laboratorio Merck. Ácido cítrico, laboratorio Mallenckodt. Yema de huevo fresco (no mayor a tres (03) días). Crioprotectores: Glicerol 99.5% pureza. Laboratorio SIGMA - ALDRICH Etilen glicol 99.5% pureza. Laboratorio Malunckrodt. Otros: Alcohol. Desinfectante. Nitrógeno líquido. Combustible (gasolina de 84 oct.) 2.2.3 EQUIPOS. Microscopio de contraste de fases con 4 objetivos, marca Micros. Termómetro digital marca Checktemp 1, con una escala de –50 a 150 °C. Balanza de precisión, capacidad 0.01 gr a 200 gr, marca Ohaus. Frazadilla eléctrica de 110V, fabricado en México. Tanque de nitrógeno de 18 litros, GM. Selladora, marca Impulse Sealer. Cámara fotográfica marca Olympus de 3.5 megapixeles. Generador de luz de 220 voltios, marca Honda 650. Refrigeradora marca National de 14 pies, a gas propano. 2.3

ANIMALES DONADORES DE SEMEN. Se utilizaron los siguientes animales: Cuadro N° 01: Alpacas donadoras de semen. Nº ARETE RAZA COLOR EDAD 01

103298

Huacaya

Café

Adulto

02

13145

Suri

Blanco

Adulto

03

EEI-021

Suri

Gris

Adulto

04

EEI-022

Huacaya

Café

Adulto

05

EEI-005

Huacaya

Blanco

Adulto

06

289298

Huacaya

Lf

Adulto

07

2170294

Huacaya

Api

Adulto 24

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08

1299M

Huacaya

Lf

Adulto

09

040299

Huacaya

Lf

Adulto

10

14803

Huacaya

Blanco

Adulto

Fuente: Elaboración propia.

2.4

METODOLOGÍA. 2.4.1

PREPARACIÓN SEMINAL PRE CONGELAMIENTO. 2.4.1.1 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SEMEN. En este proceso se utilizaron 10 alpacas machos adultos preparados como donadores de semen, además se contó un maniquí que estuvo incorporado en su interior con una vagina artificial acondicionado con una frazadilla eléctrica con la finalidad de mantener la temperatura constante a 38 °C durante el tiempo de cópula, este procedimiento se repitió a intervalos de 3 días por cada animal para poder obtener muestras de calidad, una vez que se cuenta con una buena muestra de semen se sometió a baño maría a una temperatura promedio de 36°C según INIA, (2004) enseguida se realizó el análisis macroscópico y microscópico, es en esta evaluación donde se determina si las muestras procederán con la investigación.

Fig. Nº 02: Animales empleados.

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Criobiología del semen

Fig. Nº 03: Muestra de semen una vez obtenida. 2.4.1.2 EVALUACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DEL SEMEN. Para la evaluación macroscópica se tomó en cuenta un volumen mínimo de 0.5 ml. Para la evaluación microscópica se evaluaron la motilidad y mortalidad. Para la evaluación de la motilidad y mortalidad se realizaron observaciones objetivas empleando para ello un microscopio de contraste de fases, analizando las muestras en un mínimo de 10 observaciones por muestra en distintos campos para una mayor precisión, las muestras fueron observadas a aumentos de 40X para semen fresco y 100X para análisis de viabilidad, los resultados se expresaron en porcentajes. 2.4.1.3 PREPARACIÓN DEL DILUTOR. Para la preparación del dilutor A se mezclaron los siguientes agentes químicos TRIS (0.36 gr), ácido cítrico (0.19 gr), que similarmente usaron en ovinos y vacunos Angulo et al, (1999), Olivares y Urdaneta, (1985); Adicionalmente se empleó glucosa (0.05 gr), agua bidestilada estéril (8.5 ml), antibiótico (0.1 gr de penicilina -streptomicina 1000 UI), utilizado también en ovinos por Cueto et al, (2003), y como último componente se utilizó yema de huevo (1.4 ml) que representa el 14%. Para la preparación del dilutor B, primero se incorpora el dilutor A más la adición de los crioprotectores en 8 %, 10 % de glicerol y etilen glicol respectivamente.

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Fig. Nº 04: Dilutor congelado, nótese la coloración amarilla brindada por la yema de huevo. 2.4.2

PREPARACIÓN Y PROCESO DEL CONGELAMIENTO SEMINAL. 2.4.2.1 PROCESO DE REFRIGERACIÓN Y AGREGADO DEL CRIOPROTECTOR. En primer lugar se realizó la dilución del semen en el dilutor A en una proporción 1:1 (mezcla A) a 36 ºC, para mantener dicha temperatura se sometió a baño maría, enseguida la mencionada mezcla A es sometida a refrigeración por espacio de 2 horas y 30 minutos aproximadamente hasta llegar a una temperatura de 5 ºC, tiempo adecuado para poder estabilizar la muestra a dicha temperatura (Angulo et al, 1999; Hafez, 2002; Cueto et al, 2003; Medrano et al, 2004).

Fig. Nº 05: Muestras de semen y dilutor sometidas a baño maría. 27

Criobiología del semen

Una vez alcanzada los 5 ºC se procedió a agregar el dilutor B a la mezcla A, lo cual se añadió en 3 partes cada 15 minutos, todo ello en igual proporción 1:1 formando la mezcla B (dilutor B y mezcla A) enseguida se deja en un periodo de tiempo de 2 horas para permitir el equilibrio con el crioprotector. 2.4.2.2 PROCESO DE CONGELAMIENTO. Concluida el tiempo de equilibrio, se procede a preparar una caja térmica con las siguientes dimensiones (24 x 13 x 15 cm), en dicha caja se deposito el nitrógeno líquido (NL) hasta una altura de 3 cm, enseguida se sumergió una superficie plana de acrílico con las medidas (20 x 10 x 0.3 cm), por un lapso de 10 segundos hasta que el NL cese de ebullir, e inmediatamente después se eleva la mencionada superficie en posición horizontal quedando ubicado a 2 cm sobre el nivel del NL y expuestos sobre los vapores del mismo; quedando listo para depositar la muestras que estuvieron a 5 ºC, para ello con la ayuda de una jeringa de 1 ml se ubican sobre la superficie en un volumen que varía desde 0.10 ml a 0.15 ml por un espacio de 2 minutos (precongelación), luego las muestras en precongelación junto a la superficie de acrílico se sumergen al nitrógeno líquido (196°C) para alcanzar la congelación, es en este medio que se separan por si solos los pellets de la superficie acrílica para luego proceder a depositar y envasar en viales de 2 ml debidamente identificados, para su posterior análisis post congelamiento.

Fig. Nº 06: Obtención de las muestras para su congelación.

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Fig. Nº 07: Precongelación en vapores de nitrógeno. Tapa externa

Pellets o pastillas en pre congelacion

5 cm 4 cm 3 cm 2 cm 1 cm

Superficie solida

Nitrógeno líquido (-196 C)

Fig. Nº 08: Vista lateral del procedimiento realizado. Tapa externa

5 cm 4 cm 3 cm 2 cm 1 cm Superficie solida

Fig. Nº 09: Nótese los pellets sumergidos a NL . 29

Criobiología del semen

2.4.3

EVALUACIÓN POST CONGELAMIENTO. Las muestras se obtienen del tanque de nitrógeno y se procede a someter al baño preparado a 38 ºC por un espacio de 90 segundos, enseguida se deposita una alícuota entre una lámina porta y cubre objeto que previamente fue temperada a 37º para su observación, los resultados de motilidad fueron expresados en porcentajes, para ello se efectuó varias observaciones por muestra analizada. La evaluación de la motilidad se ejecutó con la misma metodología mencionada en el item de evaluación macroscópica y microscópica del semen.

2.4.4

ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Para la presente investigación se evaluaron cuatro tratamientos: T1 = 8% glicerol, T2 = 10% glicerol, T3 = 8% etilen glicol y T4 = 10% etilen glicol, con 10 repeticiones cada una, haciendo un total de 40 muestras. Para el análisis estadístico se empleó un diseño completamente al azar (DCA), para la comparación de grupos se utilizó la prueba de media de contrastes ortogonales. El modelo aditivo lineal que se utilizó fue: Y ij = µ + Ci + Eij Donde: Yij = Es el efecto del crioprotector en la criopreservación del espermatozoide de alpaca después del congelamiento. µ = Efecto de la media general Ci = Efecto del i-ésimo crioprotector: i1 = Glicerol 8% i2 = Glicerol 10% i3 = Etilen glicol 8% i4 = Etilen glicol 10% jr = 1,2,3…r (r = 10 repeticiones) Eij = Error experimental.

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3. RESULTADOS Y DISCUSIONES EVALUACIÓN SEMINAL POST CONGELAMIENTO. RESULTADO DE MOTILIDAD DEL ESPERMATOZOIDE POST CONGELAMIENTO.

Los resultados que se muestra en el cuadro Nº 02, evidencian principalmente que la mejor motilidad que se halló al descongelado fue con el tratamiento a 8% de glicerol, obteniendo 31.93% en promedio de motilidad individual, y el siguiente mejor resultado fue 24.04% a 10% de glicerol, los dos siguientes tratamientos a 8 y 10% de etilen glicol mostraron valores inferiores por lo que se puede formular que no ejercen igual capacidad crioprotectora a los espermatozoides. Al ejecutar el análisis de varianza a los datos mencionados post congelamiento, se pudo determinar que existen diferencias altamente significativas entre los tratamientos evaluados en su motilidad por lo que se demuestra estadísticamente al menos uno de los tratamiento en cada caso es diferente frente a los otros. RESULTADO DE MORTALIDAD DEL ESPERMATOZOIDE POST CONGELAMIENTO.

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Los resultados que se muestra en el cuadro Nº 03, demuestran principalmente una elevada mortalidad con el empleo de 8% y 10% de etilen glicol, en el siguiente caso de las muestras de glicerol mostraron menor mortalidad con respecto al etilen glicol. Al ejecutar la desviación estándar en el cuadro de mortalidad post congelamiento, se pudo determinar que las muestras de glicerol tienen menor grado de dispersión frente a las de etilen glicol. Para determinar en forma específica que tratamiento es diferente se efectuó la prueba de contrastes ortogonales que se muestra en el siguiente cuadro Nº 04.

Fig. Nº 10: Espermatozoide observados.

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PRUEBA DE CONTRASTES ORTOGONALES PARA MOTILIDAD Y MORTALIDAD ESPERMÁTICA POST CONGELAMIENTO.

En el cuadro Nº 04 al realizar las comparaciones de glicerol y etilen glicol se determina que hay diferencias altamente significativas (P<0.01) aseverando que el glicerol es superior en capacidad crioprotectora frente al etilen glicol a iguales concentraciones. Así mismo se halló diferencias significativas (P<0.01) entre las concentraciones de glicerol al 8% y 10% donde resulto mejor la proporción de 8% demostrando un mejor perfil crioprotector. Y al efectuar el análisis entre los dos diferentes porcentajes de etilen glicol (8% y 10%) no existe ninguna diferencia significativa (P>0.01), afirmando que son similares y que estas concentraciones no ejercen un buen efecto crioprotector.

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El presente cuadro destaca cuando se observa el resultado de contraste entre 8% y 10% de glicerol donde resulta no significativo (n.s.) debido a su similitud o semejanza entre los promedios y el grado de dispersión que muestran las unidades muéstrales. De igual manera los resultados restantes se mantienen igual al cuadro Nº 04 en su grado de significación. El mejor resultado en la presente investigación fue empleando glicerol a 8% logrando una motilidad promedio de 31.93%, alcanzando niveles máximos de 46%, trascendiendo mejor que varios estudios realizados en camélidos domésticos hasta la fecha. Investigaciones anteriores que mostraron resultados inferiores a la presente investigación podemos mencionar los siguientes: como el caso de McEvoy et al, (1992) quienes intentaron criopreservar semen de llama encontrando motilidades desde 5 a 10%, así también Huanta et al, (1999) en otra oportunidad obtuvo una motilidad de 20% y 25% con glicerol y etilen glicol respectivamente; en otra ocasión Huanca y Sapana, (2000) congelaron semen de alpaca y obtuvieron 5.22% de motilidad, mientras Aller et al, (2003) obtuvieron en llamas resultados semejantes al presente estudio, encontrando 20.4% de motilidad utilizando los crioprotectores DMSO (dimetil sulfóxido) y glicerol.

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Criobiología del semen

Sin embargo equivalentes resultados a la presente investigación encontraron Vaughan et al, (2003) pero con un rango mas amplio desde 10 a 40% y un promedio general de 21.3% de actividad motil; concluyendo estas referencias varios investigadores atribuyeron estos resultados poco alentadores a las características seminales de la alpaca. En ese sentido se plantearon otras alternativas de obtención de semen y que también alcanzaron resultados similares y ligeramente superiores, uno de estos intentos fue efectuado por Pérez et al, (2004) que obtuvo semen procedentes del conducto deferente y usando como medio de dilución yema de huevo, tris, ácido cítrico y glicerol encontró un rango de motilidad a la descongelación de 24.4% a 43.0% en distintas proporciones de yema de huevo y glicerol. Similar resultado encontró Canorio et al, (2006) al congelar semen epididimario hallando resultados de 34% de motilidad progresiva usando dimetil acetamina como crioprotector. En la presente investigación se obtuvo semen casi en las mismas condiciones naturales y características propias de una copula normal, en los casos anteriores las muestras de semen fueron obtenidas de lugares no comunes del aparato reproductor del macho. Con estos resultados se confirmó lo mencionado por Watson, (1995) que durante el proceso de congelación – descongelación se pierde aproximadamente el 50% de la población inicial. Al respecto Katkov et al, (1998) indicaron que a pesar de que optimicemos el proceso de criopreservación y minimicemos el riesgo de muerte celular, una parte de la población celular no es capaz de sobrevivir; y aun así algunas células sobrevivientes se convierten en incapaces de fecundar afirmaron Stornelli et al, (2001); por lo que es necesario concentrarse en la funcionalidad de la población sobreviviente sugieren Katkov et al, (1998). Sin duda los mejores resultados en cuanto a criopreservación de semen de la alpaca están alrededor de 7.5 y 8.0% de glicerol después del presente estudio podemos concluir que no debe estar lejos la concentración mas adecuada para su criopreservación y su empleo en la inseminación artificial. Los ultimo estudios han reportado el empleo del glicerol a concentraciones que oscilan desde 2% a 10% en las diferentes especies domesticas como ovinos, vacunos, porcinos y otros según Medrano et al, (2004); Cabrera, (2007) y Batista et al, (2007). El grado de concentración de los crioprotectores es variable debido a las características seminales que varia entre especies, por ello no es posible generalizar y adecuar a cualquier especie un protocolo de congelación que funciona en otra, y por lo que es necesario realizar algunos cambios y experimentar otros agentes crioprotectores o nuevas metodologías. 35

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Para hacer algunas comparaciones de motilidad con otras especies a los resultados obtenidos hay una serie de investigaciones en otras especies como lo efectuado en semen de toros donde obtuvieron resultados mayor al 50% de motilidad al descongelado (Cabrera, 2007). En carneros ya se ha encontrado motilidades de 58.3% y 56.7% en razas de costa y sierra respectivamente Flores y Mellisho, (2004). En otro estudio por Flores et al, (2004) en ovinos hallo 48.2% desde 80.9% de motilidad inicial en semen fresco. En caprinos Ceiro et al, (2006) al evaluar la respuesta a la criopreservación de semen pudo hallar una motilidad de 24.61%. En cerdos la mayoría de los casos, la motilidad es menor a 50% menciona Watson, (1996), no obstante se ha registrado una motilidad espermática de 40 a 50% en pellets y de 20 al 40% en pajillas según publicaron Pursel y Jonhson, (1975). Otro estudio en cerdos halló una motilidad de 28.8% de motilidad post congelamiento investigación que fue efectuado por Gosálvez et al, (2003) sin embargo mejor resultado a lo enunciado por Gosálvez encontró Córdova et al, (2004) con 47.14% de motilidad post congelamiento a partir de una motilidad inicial de 80%. Sánchez et al, (1999) al investigar semen de canino encontró resultados al descongelado de 47.4%, a partir de una motilidad inicial de 83.8% de motilidad progresiva. Por todo lo mencionado antes, por los diversos investigadores en cuanto a los resultados de congelamiento de semen podemos afirmar que varios protocolos son sensibles a cambios, pues los resultados post congelamiento en mejor de los casos están alrededor de 40% a 50% empleándose así en la inseminación artificial, fertilización in vitro y otros, desde luego dependiendo de la especie. Por estos resultados con que actualmente se cuenta se viene investigando el nivel de eficiencia con el uso de semen congelado en la inseminación artificial en diferentes especies, a pesar de estas características de motilidad.

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CONCLUSIONES El crioprotector que brindó mejor motilidad individual fue el tratamiento de 8% de glicerol. En cuanto al etilen glicol la concentración que mostró mejor motilidad individual fue al 10%, pero muy inferior al glicerol. El 8% de glicerol produjo menor mortalidad, confirmando la mejor concentración de crioprotector en la presente investigación. La mayor mortalidad hallada al descongelado fue empleando con 8% de etilen glicol. RECOMENDACIONES Para seguir avanzando con este trabajo y tomando como base lo efectuado se sugiere los siguientes. Experimentar proporciones mas finas de glicerol de preferencia entre el rango 7.5, 7.6, 7.7 … hasta aproximadamente 8.4, 8.5% de concentración final, para poder determinar lo mas óptimo. Investigar otras distancias (alturas) menor o mayor a 2 cm sobre el nivel superior del nitrógeno líquido, al cual se estudio en el presente. Realizar pruebas de criopreservación en pajillas de 0.25 ml. Como investigación secuencial a la presente, se debe ejecutar pruebas espermáticas para determinar la condición de la membrana celular como la integridad del acrosoma, pruebas hipoosmóticas entre otros y finalmente la fertilidad de estas células. COMENTARIO Este estudio como se menciona antes se efectuó en pellets, al parecer los resultados positivos pudo haber sido influido por la forma de la pastilla, pues en el proceso de congelación a nivel de la lamina sólida fue posible notar que tiene unas 03 etapas antes de la solidificación total, que se recreara mas adelante en un grafico, pero esto es simplemente una hipótesis que necesita ser tomada o desechada, en este sentido podemos concluir que talvez hay una proporción útil de la pastilla optima y otra 02 posiblemente con menor calidad de células vivas. De todas maneras en todo lo mencionado antes nos podemos dar cuenta que hay diversas partes en la metodología que requieren ser afinados.

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