Elisa

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLINICA ELISA Alaniz Salinas Michel Andrea Barrera Velázquez Gerardo Chávez Betancourt Adriana Cortez Galindo Dennis Mendoza Román Mayda

ELISA (Ensayo de Inmunoadsorcion Ligada a Enzima)

Se basa en dos fenómenos biológicos 1.- La elevada afinidad de los Ab 2.- La alta actividad de algunas enzimas usadas, que permiten la amplificación de la señal generada por la muestra

Clasificación de Enzimoinmunoanalisis

a. Homogéneo b. Heterogéneos

Homogéneos 

Se realizan exclusivamente en fase liquida

Heterogéneos 

Se emplea un soporte solido para inmovilizar a uno de los inmunoreactantes

 Sencillez y aplicabilidad .

☺Amplificación:

(No competitivo) Se emplea un gran exceso de inmunoreactante con el objetivo de obtener una señal máxima debida a la presencia del compuesto a ser usado

“Un exceso de inmunoreactante permite detectar niveles bajos de analito que se requiere determinar”

☺ Modulación:

(competitivo)

Se modula la actividad del conjugado enzimático por competición con el analito “Menores cantidades del conjugado enzimático permiten obtener una deTectibilidad mayor, ya que pequeñas cantidades del competidor tienen gran impacto sobre la actividad enzimática determinada en la fase solida”

Inmunoensayos en fase solida Independientemente de la estrategia utilizada se distinguen 3 etapas a) Inmovilización del inmunoreactante (Ab o Ag) en fase solida b) Incubación con la muestra de modo que esta reaccione con el inmunoreactante inmovilizado c) Amplificación o modulación por medio de la utilización de un conjugado enzimático.

Fundamento ELISA

• Fosfatasa alcalina • Peroxidaza de rabano picante • Galactosa β

Una enzima conjugada con un Ab reacciona con un sustrato incoloro para generar un producto con reacción de color Cromogeno

Basada en la detección de un Ag inmovilizado sobre una fase sólida mediante Ac que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, puede ser medido espectofotométricamente.

Enzimas empleadas y criterio de selección

Enzimas y sustratos cromogénicos deben reunir ciertos requisitos Tiempo de incubación con sustratos; 10-30 minutos Reacciones enzima-sustrato se detienen por agregado de bases o ácidos

Características que deben reunir enzimas

    

Estables durante su almacenamiento Fácil preparación, elevada pureza y bajo costo Actividad enzimática alta y detectable Compatibles con condiciones del ensayo Fácilmente conjugables con anticuerpo

Peroxidasa: Hemoproteinas que transfieren desde un donante (DH) al H2O2  HRP o «horseradish peroxidase»  En etapa de revelado se utilizan donantes de H, para que el cromógeno o producto formado sea soluble y cuantificable por espectrofotometría 

2,2’-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)6-sulfonato de diamonio (ABTS) Producto oxidado, máx. Abs= 414nm

 .

Fosfatasa alcalina:

- Aislada del intestino bovino o de E. coli  Hidroliza esteres de fosfato  Tienen pH alcalino  Requieren de Mg y Zn como cofactores  Sustrato: para-nitrofenilfosfato (pNPP) p-nitrofenol ( producto de hidrolisis) absorbe a 450nm

.

Ureasa:

Empleada para establecer el punto final en una titulación por determinación visual  La reacción catalizada por la enzima es la hidrolisis de la urea con formación de CO2 y NH3 

Ureasa + purpura de coloración bromocresol purpura .

PRINCIPIO DE INMUNO ENSAYO ABSORBENTE EN FASE SÓLIDA DIRECTO 

POCILLO DE MICROTITULACIÓN



PARTICULAS

Medios en fase solida para la técnica de ELISA         

POLIESTIRENO CLORURO DE PILIVINILO (PVC) NYLON POLIPROPILENO NOTROCELULOSA CELULOSA GOMA DE SILICONA VIDRIO SPIA

TIPOS DE ELISA. 

Directo.



Indirecto.



Tipo “sandwich” antígenos.



Competitivo.

o

captura

de

ELISA DIRECTO. 

ENSAYO CAPAS:



Las placas se recubren los pocillos con las soluciones problema de Ag. Incubar con Ac marcados. Es necesario incluir controles negativos (muestras con ausencia del Ag). Se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el Ag buscado, o bien añadido).

  

ELISA

SIMPLE

DE

DOS

ELISA INDIRECTO.      

Las placas se preparan de forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos. El sistema de detección emplea dos Ac : primario contra el antígeno. secundario marcado contra el primario. Mayor sensibilidad por amplificación de señal (por unión de 2 ó más Ac secundarios por cada primario).



(1) El antígeno se pega a la placa.



(2) Añadir el suero problema.



(3) posteriormente, el conjugado.



(4) por último, el sustrato.

ELISA SANDWICH.  

ENSAYO DE CAPTURA DE ANTÍGENO Y DETECCIÓN MEDIANTE INMUNOCOMPLEJOS: Se recubre el pocillo con un primer Ac anti-Ag o Ag antiAc



Aplicar la muestra problema en la que se encuentra elAg (será retenido al ser reconocido por el 1er Ac.



Se aplica una solución con un 2° Ac anti-Ag marcado.



Así pues un Ag + un Ac + un2° Ac al menos, que lo marca.



(1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-Ag unido a la placa.



(2) se incubar con la muestra problema.



(3) se añadir conjugado.

el



(4) por sustrato.

el



Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

añadir

ELISA COMPETITIVO. 

En este sistema se parte de un Ac (monoclonal o policlonal), frente a un Ag conocido, previamente ha sido inmovilizado en la placa.



Se denomina de competición ya que el suero problema es incubado previamente con el Ag, antes de incubarlo con el anti-suero fijado en la placa, y por tanto compite con él.



(1) Se incuba el suero problema con el antígeno.



(2) Depositar la mezcla anterior sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un suero antiantígeno.



(3) se añade el conjugado.



(4) después,  el sustrato.



En este caso la ausencia de color sería positivo

Aplicaciones clínicas

Aplicaciones clínicas

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TECNICA DE ELISA MÉTODO  VENTAJAS  Se utilizan pequeñas cantidades de reactivos.  Incrementa la tasa de reacción dependiendo del medio utilizado.  Estable cuando se almacena y manipula adecuadamente.  Puede almacenarse a 4°C por más de 6 meses.  Hay variedad de sustratos a utilizar amplia variedad de substratos comerciales disponibles

Desventajas  

 

Es costoso. En algunos casos hay impedimento estérico( fosfatasa alcalina) a diferencia de la peroxidasa. Se inactivan por agentes quelantes. Es un proceso largo.

Método   



Detección de ELISA se divide en dos sesiones. 1. preparación del antígeno 2.titulación de conjugado de peroxidasa unido a un Ac de chivo anti cadenas y humanas.

a A

B

C

D E

F

G

Método

Tubo A 3mL-solucion de IgG DE 128 µg/mL-realizar diluciones de 1.5 mL-disuelta en amortiguador de recubrimiento B-G(3.0 mL)

desechar y lavar 4 veces con PBS-tween

Eliminar sobrenadan te, bloquear con albumina sérica bovina 1%

Método

Colocar en cada pozo 100µL

Enumerar del 1-11-realizar diluciones al doble PBS del conjugado de peroxidasa anti –IgG humana-comenzar dilución 1.500, usar vol. 1 mL

Leer 490 nm

REFERENCIAS 





Díaz J. Fernández M. Paredes F. aspectos básicos de bioquímica clínica. Ed Díaz de Santos. España. 1996. Ochoa R. técnicas inmunoenzimaticas para ensayos clínicos de vacunas y estudios inmunoepidemiológicos. Ed. Serie monográfica. Cuba. 2012. Fuentes X. Castiñeiras M. Queralto J. Bioquímica clínica y patología molecular. Vol. 1. 2da. Edición. Ed. Reverté, S.A. España. 1998.