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ELISA: FUNDAMENTOS TIPOS Y APLICACIONES GUSTAVO PANANA ACUÑA DIRECTOR TÉCNICO CENTRO DE DIAGNOSTICO CANTELLA
POR QUE ELISA?
ELISA CONCEPTOS Y FORMATOS DE ENSAYO • El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. • Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
ELISA HOMOGÉNEO ELISA HETEROGÉNEO ELISA DIRECTO ELISA DE CAPTURA ELISA COMPETITIVO ELISA NO COMPETITIVO
METODOLOGÍA DE ELISA Diferentes ELISA Detección de anticuerpos específicos:
ELISA indirecto ELISA doble sandwich
Detección de antígenos:
ELISA directo competitivo ELISA sandwich
PASOS GENERALES DE UN ELISA
Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo
Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
PASOS GENERALES DE UN ELISA
Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
Adición del substrato
Desarrollo del color
Unión del substrato a la enzima
QUE DETECTA?
Detección de Proteínas o un organismo
Detección de una Molécula pequeña
ELEMENTOS DE UN ELISA Pocillos
Microplacas de poliestireno Volumen de 350 uL Área interna de 2.5 cm2 Formato de 96 pocillos
Adsorción de Antígenos o Anticuerpos
Dilución del antígeno o anticuerpo en buffer carbonato (pH 9.6) e incubación 3h 37°C Tratamiento a 40-50°C con PBS hasta desecación
ELEMENTOS DE UN ELISA Solución de Lavado
Cloruro de Sodio Tween 20 Agua Destilada PBS
Conjugados
ß-galactosidasa Fosfatasa Alcalina Peroxidasa
SENSIBILIDAD Depende exclusivamente del valor K (constante de equilibrio
entre la interacción antígeno-anticuerpo) Con K = 1012M-1 y 1% CV, la detección más baja posible es de 10-14 M Como Incrementamos la sensibilidad? Reducir ruido de fondo, optimizando la union antígeno al pocillo y sesiones de lavado La baja calidad de los pocillos suele dar señales bajas o bajo nivel de unión con el antígeno Incorporando técnicas indirectas de marcado Aumentando los tiempos de incubación hasta el punto de equilibrio de la reacción.
TÉCNICA: MEIA
APLICACIONES Enfermedades producidas por parásitos Babesias y tripanosomas Toxocara canis Toxoplasmosis Triquinosis Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias Mycobacterium tuberculosis Brucelas Enterotoxinas Vibrio cholerae Estreptococos Salmonelas Enfermedades producidas por virus Enfermedad de Aujeszky Enfermedad de Newcstle Fiebre aftosa Leucemia felina Peste porcina africana Peste porcina clásica Rinotraqueitis infecciosa Rotavirus Artritis vírica
Hormonas Gonadotropina coriónica Progesterona Testosterona Hormonas tiroideas Cuantificación de inmunoglobulinas IgG IgE IgA Anticuerpos Anti-DNA Factor reumatoide Inmunocomplejos circulantes
EQUIPOS REQUERIDOS
FASES QUE DEBIÓ PASAR EL KIT ANTES DE PODER SER COMERCIALIZADO O EMPLEADO EN EL LABORATORIO DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO
VALIDACIÓN ANALÍTICA
VALIDACIÓN CLÍNICA
VALIDACIÓN DE ELISA En el desarrollo de un nuevo kit estos ensayos incluyen: Estudios de estabilidad
De las placas, látex etc. sensibilizadas De los conjugados De los sustratos.
Análisis de muestras
En paneles caracterizados En poblaciones al azar Establecer efecto de la matriz e interferencias
no específicas.