Equipo 7 Practica Rx Aglutinacion.ppt

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Equipo 7: •Alvarado Bustos Angélica •Gil Álvarez Manuel Ángel •Guzmán Nieto Ilse Irene •Osorio Ibañez Suheil •Sánchez Mendoza Luis Leonel

 Son reacciones que se llevan a cabo por la interacción de un antígeno particulado con su anticuerpo correspondiente.  Directa: intervienen antígenos o anticuerpos que forman parte de manera natural de una partícula de mayor tamaño, ej. Eritrocitos.  Indirecta: los antígenos o los anticuerpos se adsorben de forma artificial a una particula. Ej. Látex

Factores que afectan:  Temperatura.  Relación Ag / Ac.  Exposición del antígeno.  pH (6.5 ±7.5).

 Tiempo.  Fuerza iónica del medio.

Es una reacción inmunológica entre anticuerpos séricos y el antígeno correspondiente produciendo una reacción de aglutinación macroscópica.

REACCIONES FÉBRILES.

• Es una reacción de aglutinación DIRECTA entre los antígenos de: Salmonella, Brucella y Proteus. • Anticuerpos contra estos antígenos presentes

en el suero del paciente. • La infección por estos microorganismos

induce a una respuesta inmune con la producción de anticuerpos.

Reacción de Widal: Salmonella tiphy, S.enteritis, S. paratyphi. • Demuestra la presencia de

anticuerpos aglutinantes contra los antígenos H (flagelar) u O (somático).

• Anticuerpos vs antigeno O

aparecen de 6 a 8 días iniciada la enfermedad.

• Anticuerpos vs antígeno H

aparecen de 8 a 12 días.

Reacciones de Huddleson.  Método serológico que detecta anticuerpos contra:

Brucella abortus, Brucella melitensis Brucella suis.  Empleado para el diagnóstico de brucelosis.

Reacción de Weil-Felix  Se lleva a cabo para la determinación de anticuerpos de Proteus OX-19.  Existe una reacción cruzada con bacterias del género Rickettsia.  El aislamiento de Rickettsia sp es complicado y riesgoso.

Método en placa. • Depositar en sitios diferentes de la placa cantidades distintas de suero a probar. •Añadir 30 µL de la suspensión de antígeno a las cantidades de suero utilizadas. •Mezclar.

•Observar aglutinación a luz directa.

Método en tubo.  Mezclar antígeno y realizar una dilución 1:20 en solución salina.  Colocar 7 tubos de 13x100.  Añadir al tubo 1; 0.9 mL de solución salina y

0.5 mL a

Titulación en tubo. 1

2

3

4

5

6

7 C(-)

Solución Salina

0.9 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

Suero

0.1 mL

<- 05.mL <- 05.mL <- 05.mL <- 05.mL <- 05.mL ****

Antígeno 1:20

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL

•Diluir el antigeno en solución salina 1:20.

•*** Eliminar 5 mL de la dilución.. •Incubar a 37º para antígenos: tifico “H”, Brucella abortus y Proteus OX-19. •48-50º para antígenos: tifico “O” y S. paratyphi A y B

0.5 mL

Interpretación de resultados. Aglutinación

Tubo

4+

Organismos: 100% sedimentados. Sobrenadante: totalmente claro.

3+

Organismos: 75% sedimentados. Sobrenadante: ligeramente turbio.

2+

Organismos: 50% sedimentados. Sobrenadante: moderadamente turbio.

1+

Organismos: 25% sedimentados. Sobrenadante: completamente turbio.

Negativo

No se observa aglutinación y la suspensión es turbia.

Consideraciones.  Se deben tomar dos muestras con intervalos de 7 días, si en a segunda muestra se encuentra un titulo más elevado que en la

primera, indicará una infección activa.  De manera contraria, indica que el paciente

está en recuperación y los anticuerpos detectados son de memoria.

Metodología Colocar 0.08 mL del suero problema en cada una de las 6 divisiones de la placa de vidrio.

Inicie depositando los siguientes volúmenes de suero y agregue una gota del antígeno positivo, calcular el titulo de acuerdo a el siguiente cuadro de equivalencias.

Adicionar una gota de cada antígeno, mezcle con un aplicador y gire la placa con movimientos oscilatorios de 2 a 3 minutos.

Las muestras positivas serán las que presenten aglutinación. Comparar con los testigos positivo y negativo.

Muestra de sueros

Título

0.08 mL equivalen a una dln

1:20

0.04 mL “ “

1:40

0.02 mL “ “

1:80

0.01 mL “ “

1:160

0.005 mL “ “

1:320

Título: es la mayor dilución del suero problema que da una reacción positiva de aglutinación

HEMAGLUTINACION Se refiere a la aglutinación de los glóbulos rojos. Se debe a la presencia de Ag en los eritrocitos.

Hemaglutinación directa  La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la hemoaglutinación producida cuando se

añade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antígenos.  Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh

 A la sangre heparinizada se le añaden los

antisueros correspondientes: anti-A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos).

Hemaglutinación indirecta o pasiva  Se basa en el principio de la inhibición de la hemaglutinación.  Se precisan glóbulos rojos a los cuales se les ha

unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar

 Aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia a

estudiar, y aglutinación (-) indica presencia de la misma

Microtitulacion  Se utilizan diluciones seriadas de Ab  Se mantiene constante el Ag  Titulo de aglutinación: La dilución más alta a

la que se sigue aglutinando el Ag  Utilidad: conocer la concentración de Ab específicos en suero

Metodología Colocar una gota de 50 µL de PBS en cada uno de los pozos de la placa de microtitulación.

Con el dilutor de 50µL tomar el suero y mezclar bien girando 10 veces empezando con el pozo 1 y hasta el pozo 11; el pozo 12 será el testigo negativo

Agregar 50 µL de una suspensión de GRC al 1% mezclando bien .

Reporte el titulo como la inversa de la dilución

Incubar a 37°C por 1 h y leer el titulo de aglutinación

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE SÍFILIS

Treponema pallidium pallidium

CARACTERÍSTICA

Forma, agrupamiento Bacilos aislados, largos y delgados en forma de espiral Gram (-) Cultivo

No se han cultivado en medios artificiales.

Características antigénicas

Antígeno no muy bien definido. Induce la producción de reagina. Tiene más de 100 antígenos protéicos.

Reservorio

Hombre

Mecanismo de transmisión

Contacto sexual, transplacentario, contacto con sangre infectada en piel o mucosas lesionadas.

Periodo de incubación

Variable

PRIMARIA

SECUNDARIA

TERCIARIA

• Aparición de chancro duro en el sitio de inoculación • Periodo: 3-6 semanas.

• Erupciones cutáneas predominantemente en el pecho, espalda , manos y pies. • Síndrome tipo gripal • Periodo: 2-10 semanas.

• Úlceras y daño óseo • Neurosífilis (demencia), neuritis óptica. • Periodo: después de 5 años o más

Campo oscuro Observación del treponema

Tinción argéntica

Diagnóstico Inespecíficas Pruebas serológicas Específicas

VDRL RPR FTA-ABS TPHA

Tienen una sensibilidad del 70-99%. Son afectadas por el tratamiento antitreponémico. No pueden utilizarse para el diagnóstico de la sífilis primaria o la tardía. Prueba tamiz, barata y fácil de realizar.

Infección treponémica

Floculación

Anticuerpos reagínicos

Reacción con cardiolipinas

Reactivos.  Antígeno en suspensión estabilizado  Control positivo  Control negativo

Material y Equipo  Placa cóncava  Agitador mecánico  Microscopio

Obtener 3mL de sangre , centrifugar y separar el suero.

1er anillo

2do anillo

Depositar 0.05mL de suero problema

Gota de control negativo

Agitar placa a 180 rpm por 4 minutos.

Añadir una gota de antígeno.

Observar al microscopio a 10X

3er anillo

Gota de control positivo

FALSOS NEGATIVOS

FALSOS POSITIVOS  Error técnico.

 En sífilis tardía o primaria.

 Pacientes que tienen otras infecciones treponémicas.

Seleccionar el suero positivo obtenido de la prueba cualitativa

Colocar en una gradilla 6 tubos de 12 x 75 mm y numerarlos

Depositar 0.5mL de suero al tubo uno y mezclar.

Agregar a cada uno 0.5 mL de solución salina.

Depositar 0.5mL de cada una de las disoluciones en los anillos de la placa

Añadir una gota de antígeno

Leer al microscopio a 10X

Agitar a 180rpm por 4 minutos

Prueba

Resultado

VDRL

reactivo a cualquier disolución

reactivo a títulos bajos No reactivo

FTA-ABS

reactivo

No reactivo

Interpretación

Afirma treponematosis actual o pasada

Reacción falsa positiva Treponematosis pasada y curada

reactivo

PROTEÍNA C RECATIVA (PCR)

La Proteína C reactiva (PCR ó CRP por sus siglas en inglés) es una alfa globulina anormal. Fue descubierta originalmente por Tillett y Francis en 1930.

 La PCR es miembro de la clase de reactivos de

fase aguda "proteína de fase aguda”

 El nivel de la PCR aumenta en casi todas las

infecciones bacterianas agudas.  Algunos tumores .  Diversos tipos de destrucción de tejidos (infarto al miocardio).

 Es sintetizada por el hígado y por los adipocitos.  Es miembro de la familia de las pentraxinas.  La Proteína C reactiva está relacionada con la

fosfocolina, iniciando el reconocimiento y la fagocitosis de las células dañadas.

 El gen PCR se encuentra en el primer

cromosoma (1q21-q23).  Es una proteína de 224 aminoácidos.  La proteína tiene forma de un disco pentamérico anular  Masa molecular de 251.060 Da.

 Su utilidad más frecuente es para registrar actividad en pacientes con fiebre reumática y artritis reumatoide  Indicio de inflamación  Determinar la efectividad de un tratamiento o conocer lo avanzada que está una enfermedad.

 El FR se encuentra en suero y líquido sinovial.

 Algunos factores reumatoideos se pueden comportar como crioglobulinas.

Resultado PCR

FACTOR REUMATOIDE  Son anticuerpos dirigidos contra el fragmento Fc

de Ig.G.  Los anticuerpos son de tipo Ig.M, pero también pueden ser Ig.A o Ig.G.

 La producción de FR puede ser regulada con

anticuerpos anti-idiotipo, que son anticuerpos IgG dirigidos contra sitios específicos sobre el fragmento Fab.

FR-Waalter-Rose (hemaglutinación) EL FR detectado es únicamente de tipo IgM.  Se basa en la capacidad del FR para la aglutinación de GR de oveja previamente sensibilizados con suero de conejo.  El IgM (pentámero) se une a los fragmentos Fc de las IgG del suero de conejo que se han unido a los GR de oveja provocando la aglutinación.  Especifico para Artritis Reumatoide  Costosa

FR Singer Plotz (látex)  El FR reacciona con las partículas de látex

recubiertas con IgG humana produciendo una aglutinación  Menos especifica  Mas barato

 Altas concentraciones de RF (>300 IU/ml) son

encontradas en la artritis reumatoidea y en el síndrome de Sjôgren.

PIE (Prueba inmunológica de embarazo) Embarazo características: Ausencia de menstruación Dolor en glándulas mamarias La presencia de náusea matutina o vómitos ocasionales, cansancio y sueño.

GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA  Glucoproteína.  Placenta  36.5 Kd  Tiempo de vida media 24h.

GONADOTROPINA CORIÓNICA HUMANA Niveles de hCG sérica en embarazadas normales durante el primer trimestre. Edad Gestacional (semanas)

hCG mUI/ml)

3-4

9-130

4-5

75-2600

5-6

850-20800

7-12

4000-100200

13-16

18300-137000

INMUNOENSAYOS PARA DETECCIÓN DE HCG  Inhibición de la hemaglutinación.

 Inhibición de partículas de látex.

Inhibición hemaglutinación

EXISTEN DOS TIPOS BÁSICOS PARA EL INMUNOENSAYO EN PARTÍCULAS DE LÁTEX: a) Aglutinación directa de partículas de látex

b) Inhibición de la aglutinación de partículas de látex

AGLUTINACIÓN DIRECTA Utiliza anti-HCG directamente absorbido en las partículas de látex. Estas partículas se colocan junto con la muestra que contiene HCG. a)POSITIVA: La aglutinación indica la presencia de HCG b)NEGATIVA: Cuando no hay aglutinación, por ausencia de HCG.

INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN EN PARTICULAS DE LATEX Se mezcla brevemente suero antiHGC con orina del paciente (HGC) y se añaden partículas de látex recubiertas de HCG a)POSITIVA: Si existe la HCG ésta neutralizara al antisuero anti-HCG y no habrá aglutinación de las partículas de látex recubiertas de HCG b)NEGATIVA: En caso contrario, el antisuero anti-HCG (en ausencia de HCG) quedara libre (no resulta afectado) y provocará una aglutinación visible de las partículas de látex recubiertas de HCG

antisuero

Antigeno

antisuero

Latex c/antigeno

Latex c/antigeno

Referencias.  Rojas-Espinosa O. Inmunología de memoria. 3a ed. México: 

   

Editorial Medica Panamericana, 2006 Freeema, Bob A. Microbiología de Barrows. 22ºed; Interamericana Mc Graw Hill:2008. Kokuina E, Chico A, Estevez M, Argüelles A, Casas N, Pérez D et al. Autoanticuerpos diagnósticos en enfermedades autoinmunes sistémicas y específicas de órgano. Rev Cubana Med. 2006;45 Goldby, Richard. Inmunologia. 5ºEd; Mc Graw Hill: 2006. BAch, Jean F. Inmunología. Editt Limusa: 1984 Colectivo de Autores. Inmunología Celular y Molecular. En: Sistema del Complemento. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2006 .p.370.