Izolarea Adn

IZOLAREA ADN GENOMIC Izolarea ADN genomic este o procedură folosită în vederea obţinerii materialului genetic al diverselor tipuri de organisme, în scopul utilizării acestuia în analizele moleculare ulterioare. Orice protocol de extracţie a ADN genomic are 4 etape principale: 1. Distrugerea (liza) celulelor, pentru ca moleculele de ADN să fie expuse tratamentelor ulterioare. În general, liza celulelor se obţine prin mojararea sau sonicarea probei, precum şi prin tratamentul cu soluţii tampon specifice, în funcţie de peretele celular/membrana celulară în cauză. 2. Îndepărtarea membranelor lipidice folosind detergenţi. 3. Îndepărtarea proteinelor cu ajutorul anumitor enzime numite proteaze (ex: Proteinaza K), opţional. 4. Precipitarea ADN folosind alcooli (etanol, izopropanol etc.). În funcţie de tipul celulelor din care se urmăreşte izolarea ADN, se impune includerea unor etape adiţionale celor sus-amintite. Unele celule conţin perete celular, al cărui conţinut poate să difere de la un organism la altul. De asemenea, mediul în care se găsesc celulele din care se doreşte izolarea ADN poate să îngreuneze urmarea paşilor necesari (ex: izolarea ADN genomic al unor bacterii aflate în sol). În unele situaţii numărul de celule disponibile pentru extracţia ADN este foarte mic, motiv pentru care se impun anumite tehnici în vederea unei izolări foarte eficiente. Alteori celulele secretă substanţe mucilaginoase care fac foarte dificilă centrifugarea (unele bacterii, cianobacterii etc.), caz în care este necesară folosirea adiţională a unor soluţii-tampon. După extracţie, se impune estimarea calitatăţii ADN genomic. Această estimare se poate efectua: •

spectrofotometric, prin măsurarea extincţiei probei la 260 nm (maximul de absorbţie pentru ADN), sau prin raportul extincţiilor 260/280 nm (280 nm – maximul de absorbţie în cazul proteinelor).

•

Electroforetic, prin migrarea ADN genomic în gel de agaroză.

ELECTROFOREZA ADN Este o tehnică folosită pentru separarea şi vizualizarea fragmentelor de ADN în funcţie de mărimea acestora. Moleculele de ADN de dimensiuni diferite sunt încărcate într-un mediu vâscos (gel de agaroză), la un capăt al căruia se aplică un curent electric. Întrucât ADN are sarcină generală negativă (-), moleculele acestuia vor migra prin gel, înspre anod (+). Separarea fragmentelor se realizează pe baza migrării pe distanţe diferite a acestora, din cauza dimensiunilor diferite. Astfel, moleculele de ADN mai mari (mai lungi) vor migra mai puţin prin porii gelului, în timp ce fragmentele mai scurte vor migra mai mult. După o perioadă de timp, care variază în funcţie de mărimea şi concentraţia gelului, curentul electric aplicat este oprit, iar gelul este „colorat” cu o substanţă fluorescentă (bromură de etidiu*). Bromura de etidiu poate fi adăugată şi în timpul preparării gelului, înainte de polimerizarea acestuia. Mărimea moleculelor de ADN de interes este estimată prin compararea cu poziţia în gel a benzilor de ADN ale unor markeri de greutate moleculară (fig 1). Bromura de etidiu poate fi înlocuită cu alte substanţe fluorescente, non-mutagene şi noncancerigene (Ex. RedSafe, produsă de INTRON).

Fig. 1 Electroforegrama obţinută în urma migrării în gel de agaroză a genei pentru ARNr 18S, la 2 tulpini ale algei verzi Botryococcus braunii şi la 2 specii aparţinînd genului Allium. În stânga se observă markerul de greutate moleculară, cu 4 benzi vizibile: 5000 pb, 2000 pb, 850 pb şi 400 pb.

* Bromura de etidiu este un agent de intercalare, fixându-se între cele două catene ale ADN, motiv pentru care este considerată o substanţă mutagenă. De asemenea, unele studii au relevat posibile efecte cancerigene. De aceea, este obligatorie manipularea cu mare grijă a acesteia, folosirea mănuşilor de laborator fiind obligatorie.