Laporan Induksi Kalus

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TANAMAN INDUKSI KALUS EMBRIOGENIK DAUN Carica papaya

Disusun Oleh : Puji Hanani

4411413023

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2016

1. Judul : Induksi Kalus Embrionik Daun Carica papaya 2. Tujuan : Melatih keterampilan mahasiswa dalam menentukan jenis dan konsentrasi ZPT serta pencahayaan yang optimal untuk induksi kalus dari jaringan daun Carica papaya. 3. Landasan Teori : Kalus embriogenik merupakan kumpulan sel yang belum sepenuhnya mengalami diferensiasi dan potensial berkembang menjadi embrio somatik. Kalus dapat diinduksi dari berbagai jenis organ dalam media dengan penambahan ZPT dan dalam kodisi fisik (cahaya, suhu) tertentu. Jenis organ, jenis dan konsentrasi ZPT serta kondisi fisik yang optimal berbeda-beda antar spesies (Rahayu, 2016). Kalus atau Callus biasanya didefinisikan sebagai jaringan padat yang tidak terorganisasi tumbuh pada media padat yang berasal dari bagian tertentu dari tanaman. Kalus secara alamiah merupakan suatu bentu pertahanan dari tumbuhan terhadap luka dan stress (Bottino, 1981). Kalus mempunyai peran yang penting dalam kultur jaringan tumbuhan terutama mengambil bagian penting pada tahapan multifikasi sel. Karena kalus merupakan sel yang tidak terkontrol dan akan terus membelah maka kalus dapat dijadikan sebagai sumber sel untuk kultur jaringan tumbuhan yang kemudian dapat dilanjutkan dengan mikropropagasi untuk mendapatkan tumbuhan yang seragam dalam jumlah yang besar. Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau belum terdiferensiasi) yang terjadi dari sel – sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus secara in vitro atau di dalam tabung dan tidak terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagai massa sel yang bentuknya tidak teratur. Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman seperti akar, batang, dan daun. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983). Secara in vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada bekas – bekas luka akibat serangan infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat stress (George & Sherrington, 1984). Kalus yang diakibatkan oleh hasil dari infeksi bakteri Agrobacterium tumefaciens disebut tumor.

Kalus

adalah

jaringan

meristematik

yang

merupakan

wujud

dari

dediferensiasi. Dalam kultur jaringan menginduksi terbentuknya kalus merupakan langkah yang penting. Setelah terbentuknya kalus baru diberikan perlakuan / rangsangan untuk berdiferensiasi membentuk akar atau tunas. Secara histologi, kalus berasal dari pembelahan berkali – kali sel – sel parenkim di sekitar berkas pengangkut dan beberapa elemen penyusun berkas pengangkut kecuali xilem. Dalam teknik kultur jaringan (in vitro), kalus dapat diinduksi dengan menambahkan zat pengatur tumbuh yang sesuai pada media kultur, misalnya auksin dan sitokinin yang disesuaikan. Jika konsentrasi auksin lebih besar daripada sitokinin maka kalus akan terbentuk, sedangkan jika konsentrasi sitokinin yang lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi auksin maka yang terbentuk bukanlah kalus, melainkan tunas. Selain zat pengatur tumbuh atau hormon pertumbuhan, penambahan vitamin dan protein juga diperlukan untuk pertumbuhan kalus. Induksi kalus dalam teknik kultur jaringan tanaman diperlukan untuk memunculkan keragaman sel somatik di dalam kultur in vitro dan meregenerasikan sel tersebut menjadi embrio somatic. Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus. Selain itu, tujuan kultur kalus adalah: 

Perbanyak klon tanaman melalui pembentukan organ dan embrio.



Regenerasi varian – varian genetika.



Mendapatkan tanaman bebas virus.



Sebagai sumber untuk produksi protoplas.



Sebagai bahan awal untuk kreopreservasi.



Produksi metabolit sekunder.



Biotransformasi

Sel – sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan

kadang – kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah – pisah menjadi fragmen – fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam – macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning – kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga – jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel). Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas selsel parenkim jarang dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel – sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kalus. Anyaman kecil dari pembelahan sel – sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid. Jika suatu eksplan ditanam pada medium yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu (tergantung spesiesnya), akan terbentuk massa kalus yaitu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel – sel jaringan induk. Kalus dapat disubkultur dengan cara mengambil sebagian kalus dan memindahkannya pada medium baru. Dengan sistem induksi yang tepat, kalus dapat berkembang menjadi tanaman yang utuh (plantlet). Kultur kalus dapat dikembangkan dengan menggunakan eksplan yang berasal dari berbagai sumber, misalnya tunas muda, daun, ujung akar, buah, dan bagian bunga. Kalus dihasilkan dari lapisan luar sel – sel korteks pada eksplan melalui pembelahan sel – sel berulang. Kultur kalus tumbuh berkembang lebih lambat dibanding kultur yang berasal dari suspensi sel.

Kalus terbentuk melalui tiga tahapan, yaitu induksi, pembelahan sel, dan diferensiasi. Pembentukan kalus ditentukan sumber eksplan, komposisi nutrisi pada medium dan faktor lingkungan.eksplan yang berasal dari jaringan meristem berkembang lebih cepat dibanding jaringan dari sel – sel berdinding tipis dan mengandung lignin. Untuk memelihara kalus, maka perlu dilakukan subkultur secara berkala, misalnya setiap 30 hari. Sel yang berasal dari tanaman apapun dapat dibiakkan atau dikulturkan secara aseptic pada atau dalam medium hara. Kultur biasanya dimulai dengan menanamkan satu iris jaringan steril pada medium hara yang dipadatkan dengan agar. Dalam waktu 2 – 3 minggu akan berbentuk kalus. Kalus semacam ini dapat disubkulturkan dengan memindahkan potongan kecil pada medium agar segar. Proses terbentuknya kalus sampai terjadi diferensiasi berbeda-beda tergantung macam dan bagian tanaman yang dipakai untuk eksplan, bahan kimia atau hormon yang terkandung pada media kultur. Dalam perbanyakan mikro, produksi kalus biasanya dihindari karena dapat menimbulkan

variasi

dan,

terutama

pada

zona

perakaran,

mengakibatkan

diskontinyuitas dengan sitem berkas pengangkut utama. Kadang – kadang eksplan menghasilkan kalus, bukan tunas baru, khususnya jika diberikan hormon dengan konsentrasi tinggi pada media. Dalam hal lain, kalus sengaja diinduksi karena potensinya untuk produksi massal plantlet baru. Faktor pembatasnya adalah sulitnya menginduksi inisiasi tunas baru, terutama pada tanaman berkayu dan tingginya kejadian mutasi somatik. Potensi terbesar penggunaan kultur kalus adalah dimana sel – sel kalus dapat dipisahkan dan diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi embrio somatic. Secara morphologi, embryo ini mirip dengan yang ada pada biji, tapi tidak seperti embrio biji, mereka secara genetik bersifat identik dengan tanaman tetua, jadi, segregasi seksual materi genetik tidak terjadi. Karena 1 milimeter kalus berisi ribuan sel, masing–masing memiliki kemampuan untuk membentuk embrio, sehingga kecepatan multiplikasi sangat tinggi. Kultur kalus dapat dilakukan pada media cair dan embrio berkembang sebagai individu

terpisah,

sehingga

penanganan

kultur

relatif

mudah.

Kultur kalus bermanfaat untuk mempelajari beberapa aspek dalam metabolisme tumbuhan dan diferensiasinya, misalnya:

1. Mempelajari aspek nutrisi tanaman 2. Dalam beberapa hal, perlu fase pertumbuhan kalus sebelum regenerasi via somatic embryogenesis atau organogenesis. Embrio aseksual atau embrio somatik (somatic embryo) adalah embrio yang terbentuk bukan dari penyatuan sel – sel gamet jantan dan betina atau dengan kata lain embrio yang terbentuk dari jaringan vegetative / somatik. Embrio ini dapat terbentuk dari jaringan tanaman yang dikulturkan tanpa melalui proses yang dikenal dengan nama somatic embryogenesis. Jika proses ini terbentuk langsung pada eksplan tanpa melalui proses pembentukan kalus terlebih dahulu, maka prosesnya disebut somatic embryogenesis langsung (direct somatic embryogenesis). 3. Untuk menghasilkan varian somaklonal (genetic atau epigenetic). 4. Sebagai bahan awal kultur protoplast dan kultur suspensi. 5. Untuk produksi metabolit sekunder dan regulasinya. 6. Transformasi genetik menggunakan teknik biolistik. 7. Digunakan untuk seleksi in-vitro. Sel – sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel – sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah – pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning – kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga – jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).

Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah. Berdasarkan kebutuhan akan Zat Pengatur Tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok: 1. Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garamgaram mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke. 2. Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam–garam mineral. 3. Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam–garam mineral seperti jaringan kambium. 4. Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam–garam mineral seperti parenkim dan xylem akar turnip. Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari: 1. Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi 2. Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi 3. Bagian tanaman yang dipakai 4. Jenis tanaman Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae,

pakis dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus. Pada perbanyakan tanaman hortikultura, dianjurkan melalui tunas aksilair, karena dapat menghasilkan bibit yang true-to-type (sesuai dengan sifat induknya). Tunas adventif, terutama yang melalui fase kalus, tidak dianjurkan dalam perbanyakan tanaman hortikultura, kecuali untuk tujuan seleksi dan variasi. Tunas adventif langsung, juga menunjukkan kemungkinan variasi, hanya dalam taraf lebih rendah daripada regenerasi melalui fase kalus. Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktor – faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah: 1. Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi 2. Keluarnya gas CO2 3. Kesediaan hara yang lebih banyak 4. Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap 5. Cahaya