Microbiologia De La Leche Evaporada

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

MICROBIOLOGIA DE LA LECHE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA

MICROBIOLOGIA APLICADA

BACTERIAS PRESENTES EN LA LECHE EVAPORADA La leche constituye uno de los alimentos básicos del ser humano desde que nace y durante su proceso de desarrollo y crecimiento, por las aportaciones de nutrientes que esta brinda.

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MICROBIOLOGIA DE LA LECHE

BACTERIAS PRESENTES EN LA LECHE EVAPORADA 2 INDUSTRIA DE LA LECHE

La industrialización de la leche en el Perú está destinada principalmente para la producción de leche evaporada y pas En el 2005 en existían 850,000 Unidades Agropecuarias con ganado vacuno constituyéndose una actividad fu I.el Perú INTRODUCCION

La leche constituye uno de los alimentos básicos del ser humano desde que nace y durante su proceso de desarrollo y crecimiento, por las aportaciones de nutrientes que esta brinda. La leche evaporada y la leche en polvo, comúnmente empleadas, contienen componentes que han sido cuestionadas en el proceso de caries dental. Algunos componentes de la leche evaporada y de la leche en polvo, como los carbohidratos, lactosa y sacarosa, han llevado a discrepancias sobre su probable poder cariogenico. Estos componentes constituyen sustratos de importancia, ya que constituyen medios favorables para el metabolismo de bacterias sacaroloticos y acidofilas de importancia en el desarrollo de caries dental como el Streptococus del grupo mutans y su presencia podría favorecer el desarrollo y proliferación de bacterias, como la antes mencionada. La falta de estudios que permite esclarecer este hecho, como las relacionadas al tipo de leche empleada en nuestro medio, han llevado al presente estudio, cuya finalidad pretende esclarecer si la leche evaporada o la leche en polvo influye en el aumento de Streptococcus del grupo mutans en saliva. La industria láctea es una de las industrias alimentarias más importantes en Perú. La leche más consumida es la de origen bovino, en el año 2010, la producción fue de 10,711,65 millones de litros y tuvo un crecimiento de 1,54% con respecto al año 2009. En el mercado existen una gran variedad de productos lácteos, algunos son para consumo inmediato, mientras que los otros son productos que se elaboran para alargar su vida útil. Un ejemplo de estos últimos son las leches concentradas, las cuales tienen características peculiares y son la base para la elaboración de otros productos lácteos como la leche condensada azucarara, la leche evaporada y la leche en polvo y productos de panadería y repostería. La leche azucarada y la leche evaporada son obtenidas mediante la reducción del contenido de agua por medio del proceso de evaporación y, en el caso de la leche condensada azucarada, la adición de sacarosa. Si bien los procesos de elaboración de la leche condensada azucarada y la leche evaporada son similares, algunas características son diferentes, tales como acidez, actividad de agua, pH viscosidad y humedad, entre otros. II.  

OBJETVOS Determinar la cantidad de UFC en un ml de muestra de leche Aislar bacterias presentes en la leche.

III.

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FUNDAMENTO

1. La Leche Evaporada La leche evaporada o leche doblemente concentrada, es un producto esterilizado, de color claro y de apariencia cremosa. Este tipo de leche es utilizado en muchos lugares donde no tienen acceso a la leche materna (con la adición de vitamina D). El contenido es diluido en agua antes del consumo para asemejarse a la leche normal. Sin embargo, en la actualidad, se usan más los productos alternativos, como la leche entera en polvo o la leche recombinada. Se han desarrollado nuevas alternativas de uso de leches concentradas, así mismo, su proceso de empacado ha sido modificado. Es por esto que el consumo de leches concentradas ha disminuido notablemente. Actualmente es utilizado para cocinar o como crema para café. Es elaborado con leche entera, leche desnatada o una combinación de leche desnatada o una combinación de leche desnatada con leche en polvo, grasa de leche anhidra y agua como principales ingredientes. Este producto lácteo contiene la misma cantidad de solidos que la leche, pero en un menor volumen de agua. Se caracteriza porque comparando con otros productos lácteos tiene un largo periodo de anaquel a temperatura ambiente (hasta un año), lo cual facilita el manejo y la distribución de esta leche. La preservación de la leche evaporada se debe a que pesar por una esterilización o por ultra pasteurización (UAT) y es empacada en recipiente estéril. 1.1.

Proceso de fabricación

El primer paso del proceso es la estandarización del contenido graso y de sólidos. Posteriormente se realiza un precalentamiento, el cual sirve para mejorar la estabilidad térmica, inactivar enzimas y microorganismos. Generalmente se realizan periodos, largos de tratamiento térmico (20 min) a temperaturas menores de 100 o, aunque la temperatura de calentamiento y el tiempo son parámetros definidos por la estabilidad térmica de la leche. Después de realizado el tratamiento térmico se procede a la concentración en un evaporador a vacío. Para estandarizar la concentración, a la cual se quiere llegar, es necesario conocer la densidad de la leche, ya que si se concentra demasiado puede causar un bajo rendimiento y una pobre estabilidad térmica. Después de la concentración, el proceso para esterilizar varia, ya sea esterilización en lata o esterilización por medio de ultra pasteurización. Para el proceso de esterilización en lata una vez evaporada la leche se procede a la homogenización (65 o a 22 y 5 MPa), la cual sirve para prevenir la formación de nata y la coalescencia, sin embargo, esta homogenización no debe ser brusca, por la baja estabilidad de este producto. Una vez homogenizada se enfría a 10 oC para proceder a la estabilización, en la que se realizan pruebas para asegurarse que la leche no coagule durante la esterilización y para saber si es necesario que se le agregue algún estabilizante (fosfato disodico o trisodico).

Por último, se precede al empacado en latas, la placa de estaño de estas se recubre con un polímero para evitar que el hierro y el estaño se disuelvan en el producto. La esterilización se realiza una vez que el producto está en las latas, esta puede ser aplicada por lotes, en una autoclave, a temperaturas entre los 115 0C y 1210C por 15 o 20 minutos, seguido de un enfriamiento de 15 minutos a 25 0C-300C.

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Para la esterilización por ultra pasteurización, primero se estabiliza con fosfato disodico o trisodico, posteriormente se esteriliza por 15 segundos a 140 0C, usando calentamiento directo o indirecto, y se enfría a 60 0C. Casi siempre se presenta coagulación por el calor, por lo que la homogenización sirve para reducir el tamaño de los agregados de proteínas formadas; esta se lleva a cabo a 45 MPa, después se enfría la leche evaporada a 10 0C. El empacado del producto es en latas asépticas, para evitar contaminación del producto. Una de las ventajas que tiene con este tipo de esterilización es que inactiva las esporas bacterianas más efectivamente que la esterilización en lata. Durante la evaporación de este producto se presentan una serie de cambios, como son la disminución de la aw, el incremento de la higroscopicidad, cambios en el equilibrio de las sales en la leche, generalmente se realizan con un aumento en la actividad de iones Ca2+ provocando que el fosfato de calcio no se disuelva, y también hay cambios conformacionales en las proteínas junto con un incremento en la asociación y compactación de estas. 1.2.

Defectos en la leche evaporada

Al igual que la leche condensada azucarada, si no se maneja adecuadamente o con parámetros mal definidos durante el proceso de elaboración, se pueden presentar defectos en el producto final. Los más importantes son cambio de sabor, coagulación, gelacion o engrosamiento, separación de grasa, falta de esterilización, endurecimiento y separación de los minerales. Durante el proceso de esterilización, los componentes termosensibles de la leche evaporada se ven sometidos a varios cambios que pueden ocasionar una pérdida de color y cambiar el producto a un color marrón; así mismo, se puede presentar un cambio de sabor, generando sabor a cocido. El color marrón es el resultado de la reacción de Maillard, lo cual ocurre entre los aminoácidos y la lactosa, azúcar reductor presente en la leche. Las altas temperaturas en la esterilización catalizan la reacción entre los aminoácidos y la lactosa para producir melanoidinas, que son los pigmentos de color marrón que se encuentra presentes en el producto final. Comparando con otros productos alimentarios, la leche es muy estable al calor y puede soportar condiciones altas de procesamiento térmico, pero en ciertas condiciones puede ser inestable a los tratamientos térmicos debido a que se puede presentar una coagulación por el calor y más aún en productos concentrados, como la leche evaporada y la leche condensada azucarada. La caseína no coagula con el calor, a menos que se someta por un largo periodo a altas temperaturas, sin embargo, en la leche evaporada puede coagular por la temperatura a la cual se esteriliza.

La esterilización se debe llevar a cabo para que el producto tenga una mayor duración a temperatura ambiente, sin embargo, hay bacterias termoduricas y termófilas formadoras de esporas (son las causantes más comunes de deterioro de las leches evaporadas) que pudieran crecer a temperaturas de 45 0C. Se puede presentar un deterioro en el producto final si no se enfría a una temperatura adecuada o se almacena a alta temperatura, esto ocasiona que microorganismos como Bacillus stearothermophilus se pueden desarrollar.

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1.3.

Propiedades fisicoquímicas y reologicas

1.3.1.Propiedades fisicoquímicas Las propiedades de los productos lácteos son variedades de los productos lácteos son variadas y abundantes, y deben ser controladas y determinadas para conocer su calidad. Algunas propiedades físicas de la leche y productos lácteos como la densidad, viscosidad y tensión superficial dependen de sus constituyentes, mientras que otros como el índice de refracción y el punto crioscopico, dependen de las sustancias en solución. El pH y la conductividad, dependen únicamente de los iones o de los electrones, como también es el caso del potencial de óxido-reducción. L densidad de la leche no tienen un valor constante, puede estar determinada por dos factores opuestos y variables. El primero es la concentración de los elementos disueltos y en suspensión (solidos no grasos), la variación se da de manera proporcional. EWl segundo es la proporción de materia grasa, la densidad total de la leche varia inversamente al contenido graso, la densidad a 20 0C es de 1029 kg/m3. La actividad de agua de la leche concentrada se puede medir porque es igual a la humedad relativa del aire en equilibrio con la leche concentrada. Se puede determinar estableciendo la humedad relativa a la que el producto no absorbe o libera agua. L actividad de agua de la leche evaporada es de 0.987 mientras que la de la leche condensada azucarada es de 0.830. La actividad de agua no depende del contenido de grasa. El Ph tiene una influencia significativa en las propiedades reologicas por la pérdida de repulsión electrostática cerca de los puntos isoeléctricos de la caseína y la sueroproteina. Cuando el contenido de sólidos en la leche es de 45%, el pH disminuye y la fuerza ionica aumenta conforme se va eliminando el contenido de agua. La acidez es un parámetro importante para que la leche resista fuertes tratamientos térmicos, por eso la acidez de la leche debe ser a+baja, porque un cambio pequeño en la acidez (0,05%) tiene un efecto significativo en la estabilidad térmica y en la tendencia al espesamiento por almacenamiento prolongado. Las propiedades o cara teristicas de la leche varían conforme al porcentaje de humedad. Entre mayor sea el porcentaje de humedad. Entre mayor sea el porcentaje de humedad los valores como grasa y proteínas disminuyen. Al reducir el porcentaje de agua que hay en los productos lácteos, por medio de la evaporación, los sólidos totales se concentran, obteniendo así la misma cantidad de solidos totales, pero en un menor

contenido de agua. La composición química detallada de la leche entera, las leches condensadas azucaradas y las leches evaporadas se presenta en la Tabla III.

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1.3.2.Propiedades reologicas Existen varias razones por las cuales es necesario conocer la reologia de la leche y de los productos derivados, por ejemplo, contribuye al conocimiento de su estructura, sirven para efectuar el control del proceso, para diseñar el equipo y los parámetros de proceso que se van a utilizar y ayuda al mejoramiento y caracterización de los atributos organolépticos del producto final. Las propiedades reologicas de muchos alimentos líquidos concentrados tienen cambios durante el almacenamiento causados por la temperatura y la concentración, tal es el caso del jugo de naranja, purés de frutas, jugos de frutas clarificados y extracto de café. Los cambios reologicos durante el almacenamiento de la leche condensada azucarada y la leche evaporada han sido estudiados por muchos investigadores. Las propiedades reologicas de un alimento líquido, como lo son la leche evaporada, son atributos de calidad que pueden afectar la preferencia del consumidor, ya que hay una estrecha relación entre las propiedades reologicas y sensoriales de un alimento. Se menciona que la viscosidad de los productos lácteos crea la impresión de riqueza para el consumidor y que, desde el punto de vista organoléptico, la viscosidad contribuye a la sensación de satisfacción en la boca y la liberación de sabor. A concentraciones elevadas de solidos totales, por encima del 40%, pequeños cambios en la concentración crean un incremento muy grande en la viscosidad de las leches concentradas, pasando así de tener un comportamiento newtoniano a uno no newtoniano conforme lo solidos totales se incrementan. Esto ocasiona cambios significativos, como una reducción en la viscosidad de flujo, disminución de turbulencia, entre otros factores.

2. Contaminación De La Leche 2.1.

En La Industria

La leche, una vez ordeñada, se filtra, se enfría, se homogeneiza y envasa. Tales operaciones pueden, en ocasiones, aumentar la riqueza microbiana de la leche. Por lo que conviene realizar su estudio, aunque desde luego dichas prácticas más bien favorece la condición higiénica de dicho producto. La leche ya fuera del tambo puede sufrir nuevas contaminaciones que se realizan, como es natural, en la industria, en el curso de los tratamientos a los que se somete para mejorar su conservación, pero muchas veces, por producirse en forma inadecuada, tiene efectos contrarios a aquello que se desea conseguir. Así, por ejemplo, la filtración, es una de las prácticas, que con mayor frecuencia se efectúa en la lechería, grande o pequeño, e incluso, a veces, hasta en el tambo, y con el fin de privar a la leche de las impurezas y microbios que lo han contaminado en la vaquería. Sin embargo, la filtración, de ordinario, en vez de limpiar la leche no suele servir más que para impurificarla.

También en la refrigeración, el embotellado, y el de los trasiegos a que se somete la leche en la industria pueden verificarse algunas contaminaciones microbianas, generalmente de menor importancia que las que se efectúan durante la filtración, pero que en ciertas cosas son bastantes considerables, y se deben a que dichas operaciones no se hacen en condiciones higiénicas adecuadas.

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A) Filtración: La filtración, aunque contribuye a separar las impurezas gruesas de la leche, en la práctica muchas veces ocasiona más perjuicio que beneficio. B) Refrigeración: Puede contaminar la leche, pero su grado de contaminación es muy bajo, sobre todo cuando dicha operación se realiza en locales limpios. C) Trasiegos: Al atravesar la leche de un recipiente hacia otro el grado de contaminación de la leche es minúsculo. Los investigadores alemanes de muestran que, durante los trasiegos, la contaminación de la leche puede ser importante, sobre todo en el acto del envasado, porque las botellas son, de todos los recipientes de la industria, los más difíciles de esterilizar. D) Homogeneizadores: Son difíciles de desinfectar, se deberá examinar bacteriológicamente la leche antes y después de atravesarlos. En caso de que se demuestre la influencia de contaminación se procederá con el mayor rigor de desinfección de los homogeneizadores. E) Llenadoras: Son máquinas mediante las cuales, se distribuirá la leche en botellas, que deberán ser limpiados constantemente, porque será comprobado anteriormente que durante el llenado se incrementa la contaminación de la leche. F) Botellas y Tapones: Gran cantidad de investigadores señalaron la imperiosa necesidad de que las botellas se laven y se desinfecten a la mayor perfección posible. El objeto de probarla de los gérmenes que contienen, e incluso recomiendan esterilizarlos cuando eso sea posible. G) Recipiente de cartón parafinado: Generalmente son estériles o contienen pocos gérmenes; esto depende de la temperatura del parafinado, a mayor temperatura mayor será el poder esterilizante en dicha operación. H) Bombas y depósitos: Éstos se lavan y se desinfectan perfectamente, porque si se mantienen cerrados una vez aseados puede conseguirse que su papel contaminado quede reducido al mínimo. En cambio, es muy difícil evitar que la leche se infecte al pasar por las bombas y conducciones. Por esto debe vigilarse y proceder a lavarlos con frecuencia, hacinado circular por ellas soluciones retorsivas y antisépticas capaces de destruir los microbios que pueden anidar en las bombas y conducciones.

2.2.

Durante El Consumo

Para que la leche se consuma en las mejores condiciones higiénicas, no basta, aunque ello sea con mucho lo más importante que se distribuya perfectamente pasteurizada y en envases bien tapados. Naturalmente, en ésta circunstancia hay un 95% de

probabilidades de que dicho líquido nutricio se ingiera sin producir trastornos a las personas. Sin embargo, no debe olvidarse, que si el consumidor saca la leche de la botella y la trasvasa a un recipiente sucio en donde lo guarda en varias horas, es muy probable que aquel líquido se estropee y hasta que pueda transformarse en caldo de cultivo pernicioso para la salud. Si el consumidor recibe la leche perfectamente pasteurizada y embotellada, lo mejor que puede hacer es servírsela directamente de la botella o en todo caso trasvasarla a otro recipiente bien lavado y jabonado. En ciertos casos puede ocurrir que, habiendo salido la botella de leche en perfectas condiciones de la central pasteurizada, en el despacho a donde fue a parar para ser expedida se ensucie por fuera. Debe tenerse en cuenta ésta circunstancia, porque cuando eso ocurre el consumidor, al verter la leche en otro recipiente con el líquido puede arrastrar los gérmenes que existen en la superficie externa de la superficie del envase, los cuales se encontrarán en magníficas condiciones para multiplicarse e incluso alterar la leche.

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3. Agar Nutritivo Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes. Fórmula (en gramos por litro) 

Pluripeptona



Extracto de carne 3.0



Cloruro de sodio 8.0



Agar



pH final: 7.3 ± 0.2

Instrucciones

5.0

15.0

Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

9 

Siembra: En superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que se destine.



Incubación: En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

4. Disolución Para Conteo Bacteriano Fundamento En general los recuentos bacterianos bajos están asociados con alimentos seguros. La mayoría de los alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los productos fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. Algunos microbiólogos han estimado el recuento bacteriano como uno de los mejores indicadores del grado de alteración de los alimentos.

5. Unidades Formadoras De Colonias - UFC Fundamento La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico”.

IV. 

MATERIALES Muestra: leche Marca Gloria.



1  0

Agar nutritivo. Tipo de siembra: en superficie en placa de Petri con medio de cultivo.



Tres Tubos de pruebas de 10 x 100 con tapa de algodón estériles.



Agua destilada estéril 200 ml.



Tres placas de Petri estériles y servidas con medio de cultivo.



Pipeta estéril de 10ml y 1ml.



Ansa cromada estéril para siembra de microbios.

V.

MÉTODOS

Primer Día Procedimiento a. Tener a disposición tres tubos de prueba con 9 ml de agua estéril.

b. Tener a disposición unos 500 ml de leche cruda, y de esa tomar de forma aséptica 1ml con una pipeta de 1 ml y depositarlo en el primer tubo, teniendo así una dilución de 10-1, c. Del tubo anterior tomar 1 ml y trabajarlo al segundo tubo, mezclar y homogenizar (Dilución de 10-2)

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d. De anterior tubo tomar también 1 ml y trabajarlo al tercer tubo (dilución de 10 -3)

e. Siembra de la muestra diluida: tener a disposición 3 placas de Petri con el medio de cultivo, cargar la leche o agar nutritivo y marcarlas con la dilución respectiva.

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f.

De la dilución 10-1 coger en forma estéril 0.1 ml y depositarlo en la superficie del medio de cultivo, mediante un ansa estéril, esparcir la muestra por toda la superficie del medio de cultivo.

g. El procedimiento anterior se debe realizar con las otras diluciones (10 -2 y 10-3).

h. Incubación de las placas sembradas: Después de haber sembrado en las placas respectivas, estas se invierten y se introducen en una estufa o incubadora a una temperatura de 37 ºC por un tiempo de 24 horas. i.

Lectura de las placas incubadas: Después de haber transcurrido las 24 horas de la incubación se inicia la lectura de las placas donde hayan crecido las colonias bacterianas, para lo cual se tomará en cuenta las siguientes consideraciones:

Solo se deben contar las colonias entre 30- 300 colonias Rango de: 30 – 300 colonias Formula: utilizar la siguiente fórmula para determinar el UFC/ml de muestra. UFC=� �/ [(�1+0.1 (�2)]�

Donde:

1 �C= Sumatoria 3 colonias.

de

n1= Placas en la primera dilución.

VI.

n2= Placas en segunda dilución. 0.1= Alícuota muestra.

la

d= Dilución pertinente de la primera dilució

de

RESULTADOS

Segundo día  Placa con abundantes colonias en una disolución de 10 -1, 00 col.  Placa con abundantes colonias en una disolución de 10 -2, 00 col.  Placa con abundantes colonias en una disolución de 10 -3, 00 col.

No se observó crecimiento bacteriano en ninguna placa con las diluciones correspondientes, ante esto no se puedo realizar la la tinción gram, su observación ni el aislamiento.