Microscopia

MICROSCOPIA MICROSCOPIA, PELOS Y FIBRAS M.C. MARÍA DEL REFUGIO TORRES PÉREZ

Propósito ANALIZAR LOS ANTECEDENTES HISTÓRICOS DE LA MICROSCOPÍA EXAMINANDO EL SURGIMIENTO, EVOLUCIÓN Y CARACTERÍSTICAS DEL MICROSCOPIO

PARA COMPRENDER SU PROGRESO.

Microscopio óptico

“Actividades en clase/tarea”

1. Evolución del microscopio (15 puntos determinantes en el proceso) libro: Lo malo y lo feo de los microbios 2. Partes del microscopio y función de cada una de ellas. 3. Limpieza y entrega del microscopio después de usarlo en el laboratorio 4. Servicio y mantenimiento del microscopio 5. Diferenciar el sistema óptico, el sistema mecánico y el sistema eléctrico 6. Calibración del microscopio óptico.

MICROSCOPÍA

CONJUNTO DE MÉTODOS QUE SE UTILIZAN PARA PODER VISUALIZAR OBJETOS MUY PEQUEÑOS QUE ESTÁN FUERA DEL ALCANCE DE RESOLUCIÓN DEL OJO HUMANO. LA MICROSCOPÍA UTILIZA INSTRUMENTOS ESPECIALES COMO LA LUPA Y EL MICROSCOPIO (DEL GRIEGO MIKROS = PEQUEÑO, SKOPEIN = OBSERVAR), QUE PERMITEN MAGNIFICAR EL TAMAÑO DE ESTRUCTURAS IMPERCEPTIBLES

Medidas de longitud utilizadas en microscopia

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Espectro electromagnético

Tipos de microscopios Microscopios según el sistema de iluminación

1) Microscopio óptico 2) Microscopio electrónico 3) Microscopio de luz ultravioleta 4) Microscopio de luz polarizada 5) Microscopio de fluorescencia

Tipos de microscopios Microscopios según el número de lentes

1) Microscopio simple (lupa) 2) Microscopio compuesto (ocular-objetivo)

Microscopios según la transmisión de la luz 1) Microscopio de luz transmitida 2) Microscopio de luz reflejada

Tipos de microscopios Microscopios según el número de oculares 1) Microscopio monocular 2) Microscopio binocular 3) Microscopio trinocular Microscopios según la configuración de los elementos Microscopios digitales Microscopio estereoscópico (fundamento) tarea

Tipos de microscopios Otros tipos de microscopios

1) Microscopio confocal 2) Microscopio de campo oscuro 3) Microscopio de contraste de fases

Potencia de un microscopio 1. Poder de magnificación (número de aumentos) Ocular x objetivo

2. Resolución (capacidad de discernir claramente dos puntos del objeto) 3. Poder de penetración de la luz (luz transmitida o luz reflejada)

¿Cuántas veces se aumenta el tamaño real de un objeto en un microscopio óptico del laboratorio de Criminalística? ¿Cuál es la capacidad de resolución de un microscopio óptico del laboratorio de Criminalística?

El objetivo es el elemento más importante y complejo del número de aumento y su apertura numérica microscopio óptico En el objetivo se produce la mayor parte del aumento aportado por el microscopio. Su complejidad radica en el hecho de que para cumplir con su función necesita distintas lentes de alta calidad y precisión.

La imagen obtenida una vez los rayos de luz han atravesado el objetivo se denomina imagen real. Estos rayos de luz atraviesan a continuación el ocular, dando lugar a una imagen virtual que es observada por el usuario del microscopio.

Cuando la imagen se forma del lado contrario a la ubicación del objeto se denomina real.

Refracción de la luz

Cuando la imagen se forma del mismo lado del objeto se denomina virtual.

La distancia focal de una lente es la distancia entre el centro óptico de la lente y el foco. La inversa de la distancia focal de una lente es la potencia, y se mide en dioptrías.

La apertura numérica de un objetivo Este parámetro se puede entender como el tamaño del cono a través del cual llega luz al objetivo. Los objetivos con una apertura numérica baja tienen un cono de entrada de luz más pequeño que los objetivos con una apertura numérica alta.

A mayor apertura numérica mayor resolución

Diferencia entre objetivos secos y objetivos de inmersión Los objetivos secos tienen una apertura numérica baja, no es posible fabricar un objetivo seco con una apertura numérica superior a 0.95. Con la ayuda de los aceites de inmersión es posible alcanzar una apertura numérica alrededor de 1.4. Esto supone una mejora sustancial en términos de resolución obtenida. Los máximos aumentos se obtienen mediante objetivos de inmersión.

Objetivo seco

Objetivo de inmersión

Medios de inmersión

En el caso de los objetivos de inmersión existe un código de colores para indicar el medio de inmersión que debe utilizarse.

Datos de un objetivo

•Objetivos del microscopio https://www.youtube.com/watch?v=zWlz7SJFQz8

•Manejo y uso del microscopio https://www.youtube.com/watch?v=kNPucKW5m8o

Nombre del fabricante: Zeiss, Olympus, Leica, Nikon, etc. Correcciones ópticas: Indicaciones acerca del tipo de lentes utilizadas en el objetivo para corregir las aberraciones ópticas. Existe una gran variedad de opciones en este punto, la nomenclatura específica puede variar en función del fabricante. Aumento: Capacidad de aumento del objetivo, es decir, relación entre los tamaños de la imagen real y el objeto real. Apertura numérica: Indicación del tamaño del cono de luz incidente al objetivo. Longitud del tubo: Este número indica la distancia en milímetros que debe haber entre el objetivo y el ocular para que la imagen se forme correctamente. El símbolo infinito se utiliza para indicar que los rayos son completamente paralelos al salir del objetivo. Espesor del cubreobjetos: Este número indica el espesor en milímetros del cubreobjetos que debe utilizarse para minimizar las aberraciones ópticas. Código de color: Mediante un código de colores suele indicarse el aumento proporcionado por el objetivo. La mayoría de los fabricantes siguen el estándar incluido en la siguiente sección de este artículo. Adicionalmente, en el caso de los objetivos de inmersión, un segundo color indica el medio de inmersión que debe utilizarse.

La máxima apertura numérica de los objetivos Está limitada a valores de aproximadamente 1.50 (utilizando objetivos de inmersión). Por este motivo, el máximo aumento útil que se puede obtener con un microscopio óptico es 1500 (1.50 x 1000). Este es un dato importante porque existen microscopios que se anuncian con un aumento de 2000 x. Hay que tener en cuenta que cualquier valor de aumento superior a 1500 se refiere a aumento vacío y es por lo tanto inútil en cuanto a la información que aporta.

POTENCIA DE UN MICROSCOPIO PODER DE MAGNIFICACIÓN

PODER DE RESOLUCIÓN

El aumento del microscopio está determinado por el producto del aumento del objetivo y el aumento del ocular.

El poder de resolución de un microscopio esta en función de la apertura numérica. Esta depende del semi-angulo de apertura de la lente y del índice de refracción.

(10 x) (4 x) = 40 x (10 x) (100 x) = 1000 x

El índice de refracción puede aumentarse colocando una capa de aceite de inmersión (aceite de cedro). El uso de luz monocromática de menor longitud de onda (violeta, azul, UV) produce un aumento del poder de resolución.

¿Cómo mejorar la resolución de un microscopio? APERTURA NUMÉRICA En un objetivo del microscopio se define como la medida de su capacidad para colectar la luz y poder examinar los detalles del espécimen.

Con el fin de aumentar la apertura adecuada y el poder de resolución del microscopio, el condensador genera un rayo cónico de iluminación en el lado de la muestra, permitiendo que el objetivo pueda colectar los rayos de luz, resultando amplios ángulos de difracción en el aumento de la resolución del sistema de microscopio.

1) Microscopio óptico En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz visible. Esto significa que existe un foco de luz apuntando hacia la muestra. Esa misma luz es conducida a través del objetivo y del ocular hasta llegar a formar la imagen en el ojo del observador. Este es el tipo de microscopio más habitual pero su resolución está limitada por la difracción de la luz. El aumento máximo que se puede obtener con este tipo de microscopio alcanza alrededor de 1500x.

2) Microscopio electrónico En el microscopio electrónico la muestra no es iluminada con luz sino que se utilizan electrones. Los electrones impactan contra la muestra dentro de una cámara de vacío. Existen diferentes tipos de microscopio electrónico pero su principio de funcionamiento se basa siempre en capturar los electrones dispersados u omitidos por la muestra y así poder reconstruir una imagen.

Aumento del microscopio electrónico Debido a la difracción de la luz, los microscopios ópticos están limitados a un aumento máximo de 1500x. En términos físicos esta limitación es una consecuencia de la longitud de onda de la luz. En el caso de los microscopios electrónicos, la muestra no es iluminada con luz sino con electrones. Este permite iluminar la muestra con longitudes de onda 100000 veces más pequeñas que en el caso del microscopio óptico. Esto se traduce en unos aumentos muy superiores que pueden llegar a 10,000,000x.

Microscopio electrónico de barrido (MEB):

TIPOS Microscopio electrónico de transmisión (MET): Se encarga de proyectar electrones a través de una fina capa de material o tejido a observar reflejando una imagen sobre una pantalla fosforescente.

Produce una imagen que da una impresión de ser en tres dimensiones. Utiliza tres o dos puntos donde llegan los electrones de la muestra que escanean la superficie del espécimen a observar.

El microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM910 opera a 80kV. Está equipado con una cámara digital Slow Scan CCDCamera for TEM, 1024×1024, TRS.

3) Microscopio de luz ultravioleta Iluminan la muestra, con luz UV 200 nm por lo tanto puede alcanzar una resolución de 100 nm. Sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. Sirve para detectar ácidos nucleicos y proteínas mediante longitudes de ondas específicas. Los elementos ópticos de estos microscopios están hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos iluminados.

4) Microscopio de luz polarizada También conocido como microscopio petrográfico. Este microscopio es en realidad un tipo de microscopio óptico al que se la han añadido dos polarizadores. Esto significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar estructuras cristalinas de rocas y minerales.

Microscopio de fluorescencia Utiliza las propiedades de fluorescencia para generar una imagen de la muestra. Este microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia cuando son iluminadas con una longitud de onda determinada. Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una lámpara xenón o con una lámpara de vapor de mercurio. Estos microscopios incorporan además filtros de luz para aislar la luz correspondiente a la muestra.

Microscopios según la transmisión de la luz Dos tipos básicos de microscopio óptico según el camino seguido por la luz hasta llegar el objetivo: microscopios de luz transmitida y los microscopios de luz reflejada. Luz transmitida:

Luz reflejada:

Luz que pasa a través de un cuerpo semiopaco. Se da cuando el foco lumínico se sitúa en la cara del objeto opuesta al observador.

La luz que incide en un objeto se difunde en él y finalmente nuestros ojos y cerebro elaboran la imagen del objeto.

1) Microscopio de luz transmitida En este tipo de microscopio la luz atraviesa la muestra. Para esta clase de microscopios es necesario preparar la muestra cortándola en láminas muy finas. La muestra se ilumina desde debajo la platina. La preparación de la muestra hace que esta sea semitransparente y parte de la luz pueda atravesarla y llegar al objetivo para ser observada posteriormente a través del ocular. En general este es el sistema de iluminación más utilizado entre los microscopios ópticos.

2) Microscopio de luz reflejada En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y dirigida al objetivo. De este modo es necesario iluminar la muestra desde la parte superior de la platina.

Este tipo de microscopía es utilizada para examinar materiales opacos como pueden ser estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc.

Los microscopios estereoscópicos (permiten observar la muestra en tres dimensiones) son siempre de luz reflejada.

Tienen objetivos de 2 o 4 aumentos, combinados con lentes oculares de entre 5 y 20 aumentos. En consecuencia, el aumento total está comprendido entre 10 y 80 aumentos

Tarea: Explica el fundamento del microscopio estereoscópico.

Microscopio confocal Astro glía

Microscopio de fluorescencia. En lugar de iluminar la muestra de forma global se ilumina punto a punto de forma sucesiva y se reconstruye la imagen al final del proceso. Este proceso de escaneado de la muestra es similar al que se produce en los microscopios electrónicos de barrido. Este tipo de microscopio fue inventado por Marvin Minsky en 1957.

Microscopio confocal: Zeiss LSM800 con Airyscan

Unión neuromuscular

Microscopio de campo oscuro Esta técnica de microscopía consiste en iluminar la muestra oblicuamente. De este modo los rayos de luz que llegan al objetivo no provienen directamente del foco de luz sino que han sido dispersados primero por la muestra. Permite ver muestras que de otro modo no serían visibles debido a su transparencia. También tiene la ventaja que no requiere teñir la muestra para aumentar su contraste y poder observarla.

Microscopio de contraste de fases La luz viaja a distintas velocidades dependiendo del medio de propagación. Esta propiedad es utilizada en el microscopio de contraste de fases ya que la luz atraviesa la muestra con distintas velocidades en distintas secciones. Este efecto es amplificado para generar la imagen de la muestra. Mediante esta técnica no hace falta utilizar tintes y, por lo tanto, pueden observarse células vivas. El microscopio de contraste de fases fue inventado por Frits Zernike en 1932 y recibió por ello el premio Nobel de física en 1953.

Bibliografía 1. Schuchner, E. y Pérez Lloret, A. (1984). CITOHISTOLOGÍA BÁSICA. CITOBIOLOGIA. Argentina: Panamericana.

2. Bruno P. Kremer MANUAL DE MICROSCOPIA Edit Omega 2012.