Obtencion De Glucogeno

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS QUIMICO BACTERIOLOGO PARASITOLOGO “OBTENCION DE HIGADO DE RATA APARTIR DE HIGADO DE RATA Y SU CARACTERIZACION QUIMICA” INTRODUCCIÓN El glucógeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hígado y en el músculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso húmedo, respectivamente. Está formado por unidades de glucosa unidas por enlaces α(1-4) y ramificaciones α(1-6).

1.una 1.- Sacrificar Sacrificar una rata rata con con eter eter (procurando (procurando no no excitarla) excitarla)

OBJETIVOS  

9.- Se centrifuga de nuevo por la misma razón explicada en el paso 6. 10.- Se decanta el sobrenadante para juntarlo con el sobrenadante inicial para poder obtener la mayor cantidad de glucógeno posible. 11.-Se le agrega etanol para que se separe el glucógeno del sobrenadante y se precipite.

11.- Añadir volumenes 11.Añadir 2 2 volumenes

12.12.- Centrifugar Centrifugar a a

12.- Se centrifuga para que el glucógeno quede2000 rpm de 2000 rpm de etanol etanol por por volumen volumen de de precipitado. durante 5 min. sobrenadante. agitar esta

sobrenadante. agitar esta mezcla dejar en en reposo reposo mezcla yy dejar DIAGRAMA FLUJO hasta que glucogeno hasta que el el glucogeno flocule flocule

Se realizará el aislamiento y purificación del glucógeno a partir del hígado de 2.un organismo Extraer 2.- Extraer vivo. rapidamente el rapidamente Se identificará la composición de los productosel higado y lavarlo higado y lavarlo al por medio de hidrólisis ácida y enzimática por al de chorro de agua agua medio de reacciones químicaschorro características.

PROCEDIMIENTO 1.- La rata no debe excitarse puesto que si esto sucede esta empezara a segregar glucógeno lo que ocasionara que obtengamos menos de lo estimado.

10.el liquido liquido 10.- Decatar Decatar el sobrenadante sobrenadante yy reunirlo reunirlo con con el el obteido obteido en el el paso paso 7. 7. en

3.3.- pesar pesar yy cortar cortar rapidamente el rapidamente el higado higado 2.- El Hígado debe extraerse de manera rápida puesto en pequeños en pedazos pedazos pequeños que entre más nos tardemos se producirán enzimas que degraden el glucógeno esta se tiene que lavar para quitar la sangre pues esta es una impureza para nuestra extracción de glucógeno. 3.- Se debe pesar el hígado pues necesitamos este dato 4.los para el cálculo de rendimiento, se cortara en pedazos 4.- colocar colocar los pedazon pedazon es pequeños para que sea más sencillo triturarlo. es un un mortero mortero

9.dejar reposar 9.- dejar reposar por min yy por 5 5 min centrifugar a a centrifugar 2000 rpm. 2000 rpm.

durante 5 min.

13.Desechar el el 13.- Desechar sobrenadante sobrenadante yy resuspender resuspender el el precipitado 5 ml ml de precipitado con con 5 de agua agua destilada destilada

14.14.- Volver Volver a a precipitar con precipitar con 2 2 volumenes de volumenes de etanol. etanol.

previamete sumergido previamete sumergido

en 4 y 5.- El tratamiento posterior con ácido tricloroacético en hielo. hielo. (TCA) hace que precipiten las proteínas y ácidos nucleicos de la mezcla.

6.-Se centrifuga para que todos los componentes que no necesitas queden en el precipitado que se formara como proteínas, mezcla de células y la arena que se utilizóacido 5.5.- Añadir Añadir acido para triturar. tricloroacetico (TCA) tricloroacetico (TCA) 7.- Se decanta el sobrenadante obtengamos el glucógeno, y de encontraran en esta agua y TCA.

al al 10% de 10% en en proporcion proporcion de para que en elhepatico, 1ml/g de tejido tejido 1ml/g de hepatico, igual manera se hasta triturar el higado triturar el higado hasta formar formar una una pasta pasta homogenea. homogenea.

8.8.- Lavar Lavar el el mortero mortero yy pisilo 10 ml ml de de TCA TCA pisilo con con 10 al 5% yy en en este este liquido al 5% liquido reuspender el reuspender en en el precipitado de precipitado de centrifugacion centrifugacion aterior aterior

8.- Se lava el mortero y el pistilo con el TCA para que recolectemos la pasta homogénea que quedo en ellos.

1 6.6.- centrifugar centrifugar el el homogenizado homogenizado durante a durante 5 5 min min a 2000 2000 rpm. rpm.

7.-Decantar 7.-Decantar el el .un .un vaso de 250 250 ml vaso de ml yy mantenerlo mantenerlo en en hielo. hielo.

15.15.- centrifugar centrifugar a a 2000 rpm durante durante 3 2000 rpm 3 min. min.

16.16.- Decantar Decantar yy suspender con con la suspender la menor menor cantidad cantidad posible posible de de alcohol alcohol absoluto pasarlo a absoluto yy pasarlo a un un vidrio vidrio reloj reloj para para que que seque seque yy cristalice cristalice

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS QUIMICO BACTERIOLOGO PARASITOLOGO “OBTENCION DE HIGADO DE RATA APARTIR DE HIGADO DE RATA Y SU CARACTERIZACION QUIMICA” RESULTADOS CARACTERIZACION QUIMICA

Caracterización química del glucógeno.

Acida Hidrolisis

a) Preparar 15mL de una solución de glucógeno de 5mg/ml. TUBO

1

Glucógeno (ml) HCl 1N (ml)

2 2

HCl 2N (ml)

1 N

2 N

4 N

Fehling + Lugol Seliwanoff + 2 3 4 5

+ +

+ +

2

2

2

2

6

Testigo Glucóge no sin hidrolizar + -

2

2

Amilasa con. (ml)

2

Amilasa 1:2 (ml)

2

NaCl al 5%

1gota

Agua dest.

1gota

2

Incubar 30min

92°C

37°C

% GLUCOGENO EN HIGADO DE RATA

Biuret

Molish

1:2

Agua

+ -

+ -

-

+

+

-

DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Prueba de lugol.- Dio positivo en el tubo testigo del glucógeno, debido a que al no ser hidrolizado el glucógeno es capaz de atrapar al lugol por ser un polisacárido lineal, formando caltratos.

Charola= 1.3905g Charola con Glucógeno= 1.8979g Glucógeno= (1.8979g-1.3905g)= 0.5074g peso seco Peso de Hígado= 13.7g 100% Peso de hígado X % de glucógeno 13.7g 100% 0.5074g X X= 3.7036% de glucógeno presente en el hígado de nuestra rata.

Ninhidrina

Conc.

Prueba de Seliwanoff.- Los resultados fueron positivos para 5 tubos, el tubo testigo del glucógeno dio negativo debido a que no se hidrolizo. En esta prueba podemos diferenciar aldosas de cetosas, las cetosas dan rápido y las aldosas lento, por lo tanto podemos decir que el azúcar presente es una aldosa (glucosa).

b) Preparar una serie de tubos según la tabla.

Prueba

Blanco

Prueba de Fehling.-En la hidrólisis ácida como en la hidrólisis enzimática se obtuvieron resultados positivos en los tubos hidrolizados, esta prueba se realiza para identificar los carbonilos potencialmente libres que estén involucrados en enlaces glucosidicos (azucares reductores) gracias a esto podemos decir que en nuestra muestra probablemente hay presencia de glucosa, maltosa o fructosa. En el tubo testigo del glucógeno sin hidrolizar dio negativo, debido a que sus grupos están bloqueados debido a los enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6; no posee iones libres par que se lleve a cabo la reacción.

2

HCl 4N (ml)

Enzimática

CONCLUSIONES Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva como es el caso del glucógeno en los animales.

Observaciones Negativo. Nos indica que nuestro problema no hay aminoácidos, ya que es una reacción característica para grupos amino libres.

El glucógeno contiene unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6. Se caracterizó al problema por reacciones químicas, dando como resultado la identificación del glucógeno.

Negativo. En nuestro problema no hay presencia de proteínas debido a q la reacción es para identificar proteínas y péptidos de cadena menor a 3 unidades.

BIBLIOGRAFÍA 

Positivo. Se identificó que nuestro problema es un carbohidrato. La reacción de Molish es general para carbohidratos.



2

Lenhinger AL, Nelson DL. Principios de Bioquimica. 5ª Ed.Barcelona: Ediciones Omega; 2005. Piña Garza, Eduardo Laguna, Jose. Bioquimica De Laguna 7a Ed. México Editorial: El Manual Moderno; 2013.