Pcr A Tiempo Real

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) A TIEMPO REAL DOCENTE: Mg. Clever Arias Caycho INTEGRANTES:

 Chacón Carbajal Maria  Condori Chahua Roxana

La PCR a tiempo real La PCR a tiempo real combinada con nuevos sistemas automáticos para la purificación de ácidos nucleicos, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico.

Reseña histórica:  En 1983: Reacción de Cadena de la Polimerasa (PCR), técnica desarrollada por Kary Mullis. PCR: Polymerase Chain Reaction  En 1985: Primera Publicación de PCR por Cetus Corporation aparece en Science.  En 1985: Cetus se asoció con Perkin-Elmer e introdujo el termociclador.  En 1986: Científicos de Cetus Corporation aislaron la polimerasa Taq de Thermus aquaticus.

Reseña histórica:  En 1989: Science declara a la polimerasa Taq como “Molécula del Año”  En 1991: Hoffmann-La Roche Inc. adquiere derechos y patentes mundiales de la PCR.  Entre 1992-1993: Higuchi y cols. realizaron la primera reacción de PCR en Tiempo Real utilizando (BrEt) como marcador fluorescente.  En 1993: Premio Nobel de Química para Kary Mullis por su trabajo en PCR.  En 1997: Surgen primeros equipos comerciales PCR en Tiempo Real, producido por Applied Biosystems.

Dr. Russ

¿Qué es la PCR?  Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclo repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.  La reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células.

Etapas de la PCR  Cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: 1. Desnaturalización: 95°C DNA se denatura, se separan las dos cadenas por ruptura de enlaces de hidrógeno. 2. Alineamiento o Hibridación: 55°C ~ 70°C Hibridación de primers, se baja la temperatura y se facilita unión de primers a las cadenas. 3. Extensión o Elongación: 72°C ADN polimerasa, inserta diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le indica la cadena molde.

¿Qué es la PCR a tiempo real?  La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa (q-PCR) es una variante de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) que se utiliza para amplificar y cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN.

La PCR a tiempo real Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

La PCR a tiempo real Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos:  Agentes Intercalantes  Sondas específicas marcadas con fluorocromos

La PCR a tiempo real Agentes Intercalantes: Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I . El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida. Este Sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy fácil y además, es más barato que las sondas específicas.

La PCR a tiempo real Sondas de hibridación específicas: Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más utilizadas son: 1. Las sondas de hidrólisis (sondas TaqMan) 2. Las sondas molecular beacons 3. Las sondas FRET

La PCR a tiempo real 1. Las sondas de hidrólisis: (sondas TaqMan)  Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador (reporter) en el extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor (quencher) en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. A: Sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por aceptor. B: Se produce liberación de fluorocromo donador por desplazamiento de Taq polimerasa. C: Donador y aceptor están espacialmente alejados, fluorescencia emitida por donador es captada por el lector.

La PCR a tiempo real 2. Molecular beacons:  Son sondas parecidas a las anteriores.  Tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el extremo 3’ y presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana.  En esta conformación la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.

La PCR a tiempo real 3. Sondas FRET:  El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del ADN diana.  Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo 5’.  Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo.

Principales moléculas fluorescentes empleadas como marcadores en la PCR a tiempo real

SYBR-Green I: Fluorocromo

PCR Convencional vs. PCR a Tiempo Real PCR CONVENCIONAL

PCR A TIEMPO REAL

 Detección en la Fase Final.

 Detección en Tiempo Real.

 Utiliza el Gel de Agarosa.

 Utiliza fluorocromos.

 Procesamiento Post-PCR.

 Análisis y cuantificación en fase exponencial.

 Resultado cualitativo.  Menor precisión y sensibilidad.

 Resultado cuantitativo.  Mayor precisión y sensibilidad.

Equipos para PCR a tiempo real ABI PRISM 7000 Sequence Detection.

Applied Biosystems  Roche Diagnostics 

Equipos para PCR a tiempo real

Equipos para PCR a tiempo real

Instrumento

Fabricante

Sistema térmico

Tiempo de reacción

Capacidad

Serie Gene Amp Serie AbiPrisn

Aplled Biosystems

Convencional

2h

96

Lcyler IQ

BioRaf

Convencional

2h

96-384

LightCyler

Roche Diagnostics

Aire

20-60min

32

SmartCycler

Cephelp

Placa ceramica

40-60min

16-96

MX400

stratagene

Convencional

90min

96

Rotor Gene

Cobett Research

Aire

50min

32

Opciones de los equipos de PCR a tiempo real    

Amplificación y detección de DNA o ARN diana en la muestra. PCR múltiple Cuantificación del DNA o ARN diana en la muestra . Análisis de curvas de disociación

Ventajas     

Su rapidez Automatización y disminución del tiempo de análisis No hay contaminación (sistemas cerrados ) Ciclos de amplificación rápidos Determinación de mutaciones puntuales (medicamentos antimicrobianos)

Desventajas 



Requiere equipamiento y reactivos muy costosos. Debido a su alta sensibilidad, se necesita un correcto diseño experimental y técnicas de normalización para obtener resultados precisos.

APLICACIONES DIAGNOSTICO CLINICO  Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos:  Virales

(carga viral, carga pro-viral)  Bacterianos  Protozoarios  Hongos  Diagnóstico temprano (pacientes asintomáticos)  Detección de genes de resistencia – mejor elección de terapia  Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recaída)  Detección de marcadores tumorales  Estado del desarrollo / progresión de la enfermedad

Aplicaciones de la PCR a tiempo real en la microbiología o

Diagnóstico de la Sepsis Neonatal  LightCycler® SeptiFast Test MGRADE - Resultado en 6 horas - 1.5 ml de sangre - Sin incubación previa

Conclusiones 

La baja probabilidad de contaminación, la exactitud de los resultados y la sencillez, rapidez y automatización del método, hacen de la PCRrt una técnica cada vez más utilizada en todos los laboratorios.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN