Pcr

PCR La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Fundamento e importancia Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).

Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi

todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecían de este sistema, solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Reactivos Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 μL. Para realizar la técnica se necesitan: 2  

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Los 4 desoxirribonucleósidostrifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes, como el potasio. Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq). ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un c

Temperaturas y tiempos de los ciclos Como hemos explicado anteriormente la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos podemos optimizar la reacción. Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los tubos de un baño María a otro de diferente temperatura (la Tª de desnaturalización, la de hibridación y la de elongación). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difícil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarrolló el termociclador que lo hacía de manera automática. A continuación describiremos de forma más detallada el tiempo y la temperatura de cada una de las etapas de un ciclo.

1.- Desnaturalización

Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto Tiene alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo o la temperatura. Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación. En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC.

2.- Hibridación En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los oligonucleótidos: la composición de bases, el tamaño y la concentración.

En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y 65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde.

3.- Elongación En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC. Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC. El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una última elongación de 5´a 72ºC.

Número de ciclos También adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el número de ciclos que se utilizan. Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera empírica). Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no específicas. Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización.

Contaminación en la PCR La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989). Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:   

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Lugar físico exclusivo para realizar la PCR Uso de instrumental exclusivo para la PCR Utilización de reactivos y tubos estériles

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· Uso de guantes por el manipulador · Realización de controles de blanco (se añade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificación).

Optimización de la PCR En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas: 

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La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias, así que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminación con ADN extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de detección genética, se suele hacer una división para la preparación de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen también de cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos son también muy recurridos para esta limpieza extensiva Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son: o Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. o La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas. o Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos. Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.

Tipos de PCR PCR anidada Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. Este tipo de PCR es de alta sensibilidad y especificidad, aunque no nos permite cuantificar la muestra. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. PCR in situ La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación. PCR múltiplex PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de base de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:   

1er paso: retrotranscripción a partir del ARN. 2º paso: aplificación a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) Artículo principal: PCR en tiempo real

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature). Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas. En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen. La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

Variaciones de la PCR básica

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PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs).

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PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.

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PCR asimétrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra.

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PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rápidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.

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Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalización-extensión.

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PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la PCR: mientras que la máquina alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95º) puede que ocurra la unión de los cebadores y se produzca amplificación, ya que en el camino para alcanzar estos 95º se pasa por la temperatura de anillamiento (que es más baja). Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reacción comience cuando la máquina ya esté a 95º, debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias técnicas: - Añadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento - Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reacción. La cera se funde al alcanzar los 95º y es entonces cuando los componentes entran en contacto - Anticuerpos anti-polimerasa que estén bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los 95º estos anticuerpos se inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar

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PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella genética única de longitudes de fragmento amplificadas.

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PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos.

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PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores hibridando estos linkers.

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PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genómico.

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Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex.

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PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo real).

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PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.

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PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo del progreso de la PCR.

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PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en células vivas.

Aplicaciones La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como herramienta de detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico. Investigación La PCR convencional se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de interés.

Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que contienen una secuencia apta para la recombinación dirigida con un plásmido.

Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interacción posterior con otra complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos cebadores, de modo que, y si ésta no existía previamente en el fragmento y es única en el vector, pueda efectuarse una ligación mediante la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de restricción apropiada de ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es el empleo de la recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinación dirigida con un vector dado.4 Medicina En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006): 

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Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión que permitan identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad. 5 La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante. El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.