Pcr

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de ciencias Biológicas UDA: Métodos moleculares Polymerase Chain Reaction (PCR)

Amarantha Serrato

01 de Marzo de 2019, CMDX

¿Qué es la PCR? • La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de ADN.

Fig. Kary Mullis, inventor de la PCR

Requerimientos Reactivos

DNA templado

Concentración final 0.1 mg/ml (máximo 500 ng; de bacteria de 1 a 10 ng y si es plásmido de 0.1 a 1 ng)

dNTP´s

0.2-1.0 mM

DNA polimerasa

0.5-2.5 mM

Mg ++

1.5 mM

Buffer Oligo forward Oligo reward

1X 0.01 mM 0.01 mM

Taq polimersa o Vent, ambas obtenidas de bacterias termófilas

Deben tener 15-10 nt de longitud con 55% de G-C

Fases de la PCR Desnaturalización (96°C): Aumenta la temperatura para desnaturalizar cadenas de DNA. Lo que genera las cadenas molde de cadena sencilla para el siguiente paso. Templado (55 - 65°C): la reacción se enfría para que los primer puedan unirse a sus secuencias complementarias. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taqpolimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

Análisis del resultado Gel del agarosa al 1.2-2.0 %

Azul Bromofenol

Bomuro de Etidio

UV

Aplicaciones Identificación de drogas o fármacos

Mutaciones dirigidas

Identificación de patógenos

Identificación de especies

Introducción Las esporas de las bacterias pueden encontrarse ranto en la colmena como en la miel. Se analiza la técnica de PCR como un posible diágnostico de la presencia de la espora bacteriana en la miel Figura. Colmena infectada con Paenibacillus larvae

Material y métodos Cultivo bacteriano

Restos lasvarios-1ml de agua destilada-80°C/15 min

Presencia de esporas

PCR Secuenciación

Resultados

Discusión Las esporas fueron detectadas por medio de PCR, pero únicamente reduciendo el número de ciclos al fue sometida la secuenciacón Para mejor eficiencia en la detección de las especies implicada se plantea desarrollar un mejor diseño de los cebradores

Se evita la inhibición de la reacción cuando los extractos de ADN de esos materiales se diluyeron antes de la PCR.

Conclusión Se concluye que las esporas de larvas son una técnica alternativa para un diagnóstico rápido y confiable de AFB en muestras de miel y larvas, sin necesidad de cultivo bacteriano en un medio de crecimiento.

Referencias • Anderson, M. (1990) Perfecting the polymerase chain reaction. Laboratory Equipment Digets. 1:30-31 • Cao, Y., Kollow K. y Liu. G.Y. (2000) In-situ inmuno-PCR to detect antigens. The Lancet. 356:1002-3 • Chesters, J.K. (1996) Polymerase chain reaction. Proc Nutr Soc. 55 (1B):599604. Review. • Piccini, C., D'alessandro, B., Antunez, K., & Zunino, P. (2002). Detection of Paenibacillus larvae subspecies larvae spores in naturally infected bee larvae and artificially contaminated honey by PCR. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 18(8), 761-765.