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Decisiones
Detección
Diagnóstico
Investigación Terapia
TECNICAS DE ESTUDIO MOLECULAR
PCR Mg. Luis Carlos Lizárraga Vargas
¿Que es genotipificacion? • Genoma: “es la totalidad de la información genética que posee un
organismo en particular y que codifica para él.. En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas” • Alelo: “Diferentes formas o variantes de una gen” • Genotipo: “Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por un individuo”
Genotipificación
Determinación del genotipo de una persona
PCR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Replicación de ADN SIMILAR
•Amplificación enzimática de un fragmento de DNA •(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Eventos en la Replicación del DNA: •
Apertura de las cadenas (origen de replicación)
•
Colocación de los iniciadores (primers de RNA) ( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
•
Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
•
Eliminación de los iniciadores de RNA.
•
Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • Componentes – Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP, dCTP
– Enzima Taq (Thermus aquaticus) – Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena de ADN – ADN molde Concentracion de 20ng
PCR: Ciclador térmico
Desoxinucleotidos (dNTPs)
Bases Nitrogenadas del ADN Union por puentes de hidrogeno Adenina-Timina Guanina-Citocina
ADN polimerasa
Estable a altas temperaturas Thermus aquaticus
Thermococcus litoralis
Enzima de 95kd. Actividad Exonucleasa: 5’—3’
Actuaaltas temperaturas
PRIMERS (Iniciadores, Cebadores) Dos oligonucleótidos que son complementarios a cada una de las dos hebras del ADN.
Únicos: Asegura alta especificidad:
5’ 3’
5’
3’
5’
3’ 5’
3’
3’ CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES
Únicos Tamaño Dimeros de primers
5’ La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento
Tamaño • Efectos en: – Carácter de único • Mas tamaño (15pb) • Temperaturas (ºTm) – La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)
Par de“primers” específicos
ADN templado Buffer p/ ADN Pol.
MgCl2
dCTP dATP
dTTP dGTP
dH2O estéril
PCR Mezcla de Reacción
Desoxinucleótidos
Etapas de la PCR 1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena 2. Alineamiento: Anillaje de primers 3. Extensión: Generación de la nueva cadena
Temperatura
25-30 ciclos 100
Desnaturación
Desnaturación 94 oC
Extension 72 oC
50
50-60oC Anillaje
0
Tiempo
94 oC
Temperatura
100
Desnaturación
PCR
94 oC
50
0
Tiempo
DNA de cadena doble
3’
5’
5’
3’
Temperatura
100
Desnaturación
PCR
94 oC
50
0
Tiempo 3’
DNA de cadena simple
5’
Calor
5’
3’
Temperatura
100
Desnaturación
94 oC
50
PCR
Desnaturación
Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC
94 oC
0
Tiempo 3’
5’ 5’
Hibridación de primers
5’ 5’
3’
Temperatura
PCR 100
Desnaturación
94 oC
50
Annealing Extension oC 72 Primers 50 oC
94 oC
0
Tiempo 3’
5’
Calor 5’
5’
Calor 5’ 5’
3’
30 ciclos
Temperatura
PCR 100
Desnaturación
94 oC
50
Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC
94 oC
0
Tiempo 3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’ 5’
3’
30ciclos
Temperatura
PCR 100
50
Desnaturación
94 oC
Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC
0 3’
5’
5’
Tiempo 5’
5’ 5’
3’
Calor 5’
5’
Calor 5’
94 oC
30ciclos
Temperatura
100
50
PCR 94 oC
Desnaturación
Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC
0 3’
5’
5’
5’
5’ 5’
Tiempo 5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
94 oC
30ciclos
Temperatura
PCR 100
Desnaturación
94 oC
50
Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC
0 3’
5’
5’
5’
5’ 5’
Tiempo 5’
3’
Fragmentos de tamaño definido
5’
5’
5’
5’
5’
5’
94 oC
30ciclos
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR. Numero de copias 1 2 4
0 1 # ciclos
2
8
16
32
64
3
4
5
6
PCR animation
Eectroforesis de productos de PCR
Electroforesis Revelado Separación de moléculas en un campo eléctrico Electrodo (+)
Cámara de electroforesis Camas para preparación del gel de agarosa Fuente de poder
Electrodo (-)
Agarosa y su preparación Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en función del peso molecular
Agarosa
Mezclar agarosa con una solución tampón como el TAE (tris-ac. Acetico-EDTA)
Calentar
Tinción con Bromuro de etidio Agente intercalante Bromuro de Etidio Molécula fluorescente que se intercala entre la s bases de la molécula de DNA Absorción a 330 nm (UV)emisión en luz visible
Factores que afectan la velocidad de migración 1. TAMAÑO DEL FRAGMENTO la velocidad de migración del fragmento es inversamente proporcional al log del nº de pares de bases
2. CONFORMACION DE LA MOLECULA ADN circular
ADN Lineal
3. VOLTAJE APLICADO La velocidad de migración es proporcional al voltaje aplicado
4. CONCENTRACIÓN AGAROSA Inversamente proporcional a velocidad de corrido 2% 1.5%
1% 0.5%
Interpretación de electroforesis Marcador de peso molecular 1.Permite identificar tamaño de fragmentos
25pb
50pb
100pb
Ejemplos de corridos de electroforesis Con marcador de 100pb Con marcador de 50pb M
1
2
3
4
5
6
M
1
2
3
4
7
300pb 400pb 250pb
150pb 100pb 400pb 350pb 300pb 250pb
M
Bandas Inespecíficas
Corrido de electroforesis con bandas inespecíficas
Bandas definidas con diferentes pesos moleculares
Interpretación de electroforesis Calidad del ADN BUENA CALIDAD DE ADN 1
2
3
4
5
CP: Control Positivo CN: Control Negativo 1-6: Pacientes
6
CP CN
DIFERENTES CALIDADES DE ADN 1
2
3
4
CP
CN
CP: Control Positivo CN: Control Negativo Pozo 2 No ADN Pozos 3 y 4 Bajas concentraciones
PCR Multiplex • Amplificación de varias secuencias de forma simultanea • Diferentes set de primers • Ojo Tamaño del amplicon
APLICACIONES Ensayos de deleciones Amplifica exones Ensayos forenses Biomarcadores polimórficos Ensayos microbiológicos Cepas y especies
PCR en tiempo real (RT-PCR) La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de los productos en un solo tubo. “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generando Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes UTILIDADES - Genotipificación - Cuantificación de carga viral - Cuantificación del numero de copias de un gen - Expresión génica (RNA) Retrotranscripción
Componentes RT-PCR Target DNA Polimerasa
Primer
Nucleótidos Solución Buffer Sonda Termociclador
Segmento de ADN que se ha seleccionado para amplificar. Es el molde (Muestra). Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde una hebra simple de ADN (produce una hebra complementaria). Segmentos cortos de ADN de cadena simple específico para un segmento de DNA. Los primers son usados como punto inicial de la actividad de la DNA polimerasa. Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto biológico (A, T, C, G). Solución que reúne las condiciones necesarias para que la reacción de amplificación se de. Segmento corto de ADN complementario al target (marcadores fluorescentes) Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de detectar sondas)
PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real
PCR tradicional Preparación de la Muestra
Amplificación
Detección
PCR en Tiempo Real
Preparación de la Muestra
Amplificación y Detección
Sistemas de Detección Uso de moléculas fluorescentes No-Específico SYBR Green I Molecular fluorescente que se unen a ADN Emisión a 520nm
DESVENTAJAS
Inespecífico
Sistema de Detección Específico TaqMan Uso de “secuencia especifica de oligonucleotidos” - Reportero 5’: Emite fluorescencia - Quencher 3’: Bloquea emisión de fluorescencia
Actividad 5’ nucleasa Separación reportero-quencher
Sistema de Detección Específico Molecular Beacon Probes
Secuencia de la sonda
Stem
Quencher Fluoroforo
Molecular Beacon Probes
Cinética de la PCR Exponencial: Duplicación exacta del producto se acumula en cada ciclo. Lineal: Componentes consumidos, productos empiezan a degradarse. Plateau: Reacción se
consume y no se generan más productos.
Fluorescencia
Plateau
Fase logarítmica
UMBRAL
CT (CP)
Número de ciclos
• Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR Green y Sondas de Hibridación (determinado automáticamente por el instrumento).
• CT (CP): Número de ciclo en donde la fluorescencia supera el umbral.
…El CT depende de la concentración inicial de ADN!
1. 2. 3. 4. 5.
10 ng = CT 18 1 ng = CT 21 100 pg = CT 25 10 pg = CT 28 Blanco
1 2
3 4 5
RT-PCR (Retro-transcripción) Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
mRNA Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa Primers: - Hexameros al azar - Oligo dT
cDNA
PCR
Enzima Taq polimerasa
Métodos moleculares PCR Ventajas
• • • •
Método “Gold standard” Alta sensibilidad y especificidad Se pueden utilizar sondas Se puede utilizar en muestras no invasivas
Desventajas: • Se necesita cierta información de la secuencia en estudio para poder diseñar los primers.
• Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar • Errores de la replicación. • Contaminación (se reduce considerablemente tomando las precauciones necesarias y en manos experimentadas).
Conclusiones • Aunque en biología molecular existen muchas técnicas para detección de cambios tanto a nivel del ADN como a nivel cromosómico, el secreto esta en seleccionar la mas adecuada dependiendo de los requerimientos y la disponibilidad