Pcr

Decisiones

Detección

Diagnóstico

Investigación Terapia

TECNICAS DE ESTUDIO MOLECULAR

PCR Mg. Luis Carlos Lizárraga Vargas

¿Que es genotipificacion? • Genoma: “es la totalidad de la información genética que posee un

organismo en particular y que codifica para él.. En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas” • Alelo: “Diferentes formas o variantes de una gen” • Genotipo: “Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por un individuo”

Genotipificación

Determinación del genotipo de una persona

PCR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Replicación de ADN SIMILAR

•Amplificación enzimática de un fragmento de DNA •(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

Eventos en la Replicación del DNA: •

Apertura de las cadenas (origen de replicación)

•

Colocación de los iniciadores (primers de RNA) ( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)

•

Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)

•

Eliminación de los iniciadores de RNA.

•

Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA

ligasa)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • Componentes – Desoxinucleotidos (dNTPs)  dATP, dTTP, dGTP, dCTP

– Enzima  Taq (Thermus aquaticus) – Iniciadores (Primers)  Complementarios a la cadena de ADN – ADN molde  Concentracion de 20ng

PCR: Ciclador térmico

Desoxinucleotidos (dNTPs)

Bases Nitrogenadas del ADN Union por puentes de hidrogeno Adenina-Timina Guanina-Citocina

ADN polimerasa

Estable a altas temperaturas Thermus aquaticus

Thermococcus litoralis

Enzima de 95kd. Actividad Exonucleasa: 5’—3’

Actuaaltas temperaturas

PRIMERS (Iniciadores, Cebadores) Dos oligonucleótidos que son complementarios a cada una de las dos hebras del ADN.

Únicos: Asegura alta especificidad:

5’ 3’

5’

3’

5’

3’ 5’

3’

3’ CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES

Únicos Tamaño Dimeros de primers

5’ La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento

Tamaño • Efectos en: – Carácter de único • Mas tamaño (15pb) • Temperaturas (ºTm) – La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)

Par de“primers” específicos

ADN templado Buffer p/ ADN Pol.

MgCl2

dCTP dATP

dTTP dGTP

dH2O estéril

PCR Mezcla de Reacción

Desoxinucleótidos

Etapas de la PCR 1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena 2. Alineamiento: Anillaje de primers 3. Extensión: Generación de la nueva cadena

Temperatura

25-30 ciclos 100

Desnaturación

Desnaturación 94 oC

Extension 72 oC

50

50-60oC Anillaje

0

Tiempo

94 oC

Temperatura

100

Desnaturación

PCR

94 oC

50

0

Tiempo

DNA de cadena doble

3’

5’

5’

3’

Temperatura

100

Desnaturación

PCR

94 oC

50

0

Tiempo 3’

DNA de cadena simple

5’

Calor

5’

3’

Temperatura

100

Desnaturación

94 oC

50

PCR

Desnaturación

Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC

94 oC

0

Tiempo 3’

5’ 5’

Hibridación de primers

5’ 5’

3’

Temperatura

PCR 100

Desnaturación

94 oC

50

Annealing Extension oC 72 Primers 50 oC

94 oC

0

Tiempo 3’

5’

Calor 5’

5’

Calor 5’ 5’

3’

30 ciclos

Temperatura

PCR 100

Desnaturación

94 oC

50

Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC

94 oC

0

Tiempo 3’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’ 5’

3’

30ciclos

Temperatura

PCR 100

50

Desnaturación

94 oC

Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC

0 3’

5’

5’

Tiempo 5’

5’ 5’

3’

Calor 5’

5’

Calor 5’

94 oC

30ciclos

Temperatura

100

50

PCR 94 oC

Desnaturación

Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC

0 3’

5’

5’

5’

5’ 5’

Tiempo 5’

3’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

94 oC

30ciclos

Temperatura

PCR 100

Desnaturación

94 oC

50

Annealing Extension 72 oC Primers 50 oC

0 3’

5’

5’

5’

5’ 5’

Tiempo 5’

3’

Fragmentos de tamaño definido

5’

5’

5’

5’

5’

5’

94 oC

30ciclos

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR. Numero de copias 1 2 4

0 1 # ciclos

2

8

16

32

64

3

4

5

6

PCR animation

Eectroforesis de productos de PCR

Electroforesis Revelado Separación de moléculas en un campo eléctrico Electrodo (+)

Cámara de electroforesis Camas para preparación del gel de agarosa Fuente de poder

Electrodo (-)

Agarosa y su preparación Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en función del peso molecular

Agarosa

Mezclar agarosa con una solución tampón como el TAE (tris-ac. Acetico-EDTA)

Calentar

Tinción con Bromuro de etidio Agente intercalante Bromuro de Etidio Molécula fluorescente que se intercala entre la s bases de la molécula de DNA Absorción a 330 nm (UV)emisión en luz visible

Factores que afectan la velocidad de migración 1. TAMAÑO DEL FRAGMENTO la velocidad de migración del fragmento es inversamente proporcional al log del nº de pares de bases

2. CONFORMACION DE LA MOLECULA ADN circular

ADN Lineal

3. VOLTAJE APLICADO La velocidad de migración es proporcional al voltaje aplicado

4. CONCENTRACIÓN AGAROSA Inversamente proporcional a velocidad de corrido 2% 1.5%

1% 0.5%

Interpretación de electroforesis Marcador de peso molecular 1.Permite identificar tamaño de fragmentos

25pb

50pb

100pb

Ejemplos de corridos de electroforesis Con marcador de 100pb Con marcador de 50pb M

1

2

3

4

5

6

M

1

2

3

4

7

300pb 400pb 250pb

150pb 100pb 400pb 350pb 300pb 250pb

M

Bandas Inespecíficas

Corrido de electroforesis con bandas inespecíficas

Bandas definidas con diferentes pesos moleculares

Interpretación de electroforesis Calidad del ADN BUENA CALIDAD DE ADN 1

2

3

4

5

CP: Control Positivo CN: Control Negativo 1-6: Pacientes

6

CP CN

DIFERENTES CALIDADES DE ADN 1

2

3

4

CP

CN

CP: Control Positivo CN: Control Negativo Pozo 2  No ADN Pozos 3 y 4  Bajas concentraciones

PCR Multiplex • Amplificación de varias secuencias de forma simultanea • Diferentes set de primers • Ojo Tamaño del amplicon

APLICACIONES Ensayos de deleciones Amplifica exones Ensayos forenses Biomarcadores polimórficos Ensayos microbiológicos Cepas y especies

PCR en tiempo real (RT-PCR)  La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de los productos en un solo tubo.  “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generando  Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes UTILIDADES - Genotipificación - Cuantificación de carga viral - Cuantificación del numero de copias de un gen - Expresión génica (RNA)  Retrotranscripción

Componentes RT-PCR Target DNA Polimerasa

Primer

Nucleótidos Solución Buffer Sonda Termociclador

Segmento de ADN que se ha seleccionado para amplificar. Es el molde (Muestra). Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde una hebra simple de ADN (produce una hebra complementaria). Segmentos cortos de ADN de cadena simple específico para un segmento de DNA. Los primers son usados como punto inicial de la actividad de la DNA polimerasa. Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto biológico (A, T, C, G). Solución que reúne las condiciones necesarias para que la reacción de amplificación se de. Segmento corto de ADN complementario al target (marcadores fluorescentes) Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de detectar sondas)

PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real

PCR tradicional Preparación de la Muestra

Amplificación

Detección

PCR en Tiempo Real

Preparación de la Muestra

Amplificación y Detección

Sistemas de Detección Uso de moléculas fluorescentes No-Específico SYBR Green I  Molecular fluorescente que se unen a ADN  Emisión a 520nm

DESVENTAJAS

Inespecífico

Sistema de Detección Específico TaqMan Uso de “secuencia especifica de oligonucleotidos” - Reportero 5’: Emite fluorescencia - Quencher 3’: Bloquea emisión de fluorescencia

Actividad 5’ nucleasa Separación reportero-quencher

Sistema de Detección Específico Molecular Beacon Probes

Secuencia de la sonda

Stem

Quencher Fluoroforo

Molecular Beacon Probes

Cinética de la PCR  Exponencial: Duplicación exacta del producto  se acumula en cada ciclo.  Lineal: Componentes consumidos, productos empiezan a degradarse.  Plateau: Reacción se

consume y no se generan más productos.

Fluorescencia

Plateau

Fase logarítmica

UMBRAL

CT (CP)

Número de ciclos

• Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR Green y Sondas de Hibridación (determinado automáticamente por el instrumento).

• CT (CP): Número de ciclo en donde la fluorescencia supera el umbral.

…El CT depende de la concentración inicial de ADN!

1. 2. 3. 4. 5.

10 ng = CT 18 1 ng = CT 21 100 pg = CT 25 10 pg = CT 28 Blanco

1 2

3 4 5

RT-PCR (Retro-transcripción) Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

mRNA Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa Primers: - Hexameros al azar - Oligo dT

cDNA

PCR

Enzima Taq polimerasa

Métodos moleculares PCR Ventajas

• • • •

Método “Gold standard” Alta sensibilidad y especificidad Se pueden utilizar sondas Se puede utilizar en muestras no invasivas

Desventajas: • Se necesita cierta información de la secuencia en estudio para poder diseñar los primers.

• Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar • Errores de la replicación. • Contaminación (se reduce considerablemente tomando las precauciones necesarias y en manos experimentadas).

Conclusiones • Aunque en biología molecular existen muchas técnicas para detección de cambios tanto a nivel del ADN como a nivel cromosómico, el secreto esta en seleccionar la mas adecuada dependiendo de los requerimientos y la disponibilidad