PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFI KERTAS Pande Putu Indira Prima Dewi 1603051016 Program Studi Analisis Kimia, Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, UNDIKSHA Jalan Udayana, Singaraja-Bali Email :
[email protected]
ABSTRAK Asam amino memiliki sifat yang khas dan berbeda dengan yang lain akibat adanya rantai samping asam amino. Hal ini menyebabkan asam amino dapat dipisahkan dan diidentifikasi keberadaannya menggunakan metode pemisahan yaitu kromatografi kertas. Pemisahan secara kromatografi prinsipnya adalah pemisahan campuran karena perbedaan distribusi komponen dalam dua fase yaitu fase gerak dan fase diam. Dalam kromatografi kertas yang merupakan fase gerak adalah pelarut yang digunakan sedangkan fase diamnya adalah air, kertas berfungsi sebagai absorben tempat melekatnya fase diam. Jarak yang ditempuh oleh setiap asam amino dari garis dasar relatif terhadap jarak tempuh pelarut/eluen didefinisikan sebagai Rf. Setiap komponen asam amino memiliki harga Rf tertentu. Besaran Rf ini menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam.Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari setiap asam amino terutama glisin, leusin, alanin, dan triptofan melalui kromatografi kertas dengan teknik ascending. Praktikum yang dilaksanakan di laboratorium D3 Analisis Kimia Undiksha pada tanggal 21 September 2018 ini menggunakan 2 buah eluen yaitu fenol : aquades (20 mL : 8 mL) dan n-butanol : aquades : asam asetat glasial (100 mL : 100 mL : 24 mL). Hasil pengujian terhadap sampel diketahui bahwa masing-masing asam amino memiliki harga Rf yang berbeda. Untuk eluen pertama sampel asam amino leusin memiliki nilai Rf yang paling besar. Sedangkan untuk eluen kedualeusin juga menunjukkan nilai Rf yang paling besar. Kata Kunci : kromatografi kertas, eluen, derajat retensi. ABSTRACT Amino acidshaveuniquecharacteristicsand are differentfromothersduetothepresenceof amino acidsidechains. Thiscausesthe amino acidstobeseparatedandtheirpresenceidentifiedusingtheseparationmethod, namelypaperchromatography. The chromatographicseparationprincipleistheseparationofthemixturebecauseofdiffere nces in thedistributionofcomponents in twophases, namelythemobilephaseandthestationaryphase. In paperchromatographywhichisthemobilephaseisthesolventusedwhilethestationaryp haseiswater, thepaperfunctions as anabsorbentwherethestationaryphaseisattached. The distancetraveledbyeach amino acidfromthebaselinerelativetothesolvent / eluentmileageisdefined as Rf.
Eachcomponentof amino acids has a certainRfprice. ThisRfmagnituderepresentsthedegreeofretentionof a component in thestationaryphase. Thispracticumaimstodeterminetheratioofthedistributioncoefficient (Rf) ofeach amino acid, especiallyglycine, leucine, alanine, andtryptophanthroughpaperchromatographywithascendingtechniques. The practicumcarriedout in the D3 laboratoryofUndiksha Chemical Analysison September 21, 2018 used 2 eluentsnamelyphenol: aquades (20 mL: 8 mL) and nbutanol: aquades: glacialaceticacid (100 mL: 100 mL: 24 mL) . The testresultsonthesamplenotethateach amino acid has a differentRfprice. For thefirsteluentsamplethe amino acidleucine has thelargestRfvalue. As forthesecondeluentleucinealsoshowsthegreatestRfvalue. Keywords: Paper chromatography, eluent, degreeofretention.
PENDAHULUAN
Terdapat
Pada umumnya asam amino
dua
puluh
asam
amino alami yang lazim. Kedua
larut dalam air dan tidak larut dalam
puluh asam amino alami
pelarut organik non polar seperti eter,
lazim, memiliki rangka yang terdiri
aseton, dan kloroform. Kelarutan
dari gugus asam karboksilat dan
asam amino ini berbeda
dengan
gugus yang terikat secara kovalen
asam karboksilat dan amina. Asam
pada atom pusat (karbon alfa). Dua
amino mempunyai titik lebur yang
gugus lainnya pada
tinggi bila dibandingkan dengan
ialah hidrogen dan gugus R yang
asam karboksilat dan amina. Hal ini
merupakan rantai samping asam
menunjukkan bahwa asam amino
amino. Sifat kimia gugus rantai
cenderung mempunyai struktur yang
sampinglah
bermuatan dan mempunyai polaritas
perbedaan
tinggi dan bukan sekedar senyawa
(Fessenden dan Fessenden, 1997).
yang mempunyai
gugus –COOH
yang sifat
karbon
yang
alfa
menyebabkan asam
amino
Asam amino penyusun protein
dan gugus –NH2. Hal ini tampak pula
dapat
pada sifat asam amino sebagai
berbagai
elektrolit (Poedjiadi, 1994).
komposisi kimia gugus R, asam
digolongkan
berdasarkan
kategori.
Berdasarkan
amino dapat digolongkan menjadi
asam amino alifatik (glisin, alanin,
fenilalanin, treonin, triptofan dan
valin, leusin, isoleusin), asam amino
valin) (Toha dan Hamid, 2001).
hidroksil (serin, treonin), asam amino sulfur
(sistein,
metionin),
asam
amino aromatik (fenilalanin, tirosin, triptofan), asam amino asam (asam aspartat, asparagin, asam glutamat, glutamin),
asam
amino
basa
(arginin, histidin, lisin) dan asam amino imino (prolin). Sedangkan pembagian asam amino berdasarkan polaritas molekulnya, yaitu asam amino polar dengan gugus R polar (C-O, C-N, O-H) seperti glisin, sistein, asam glutamat, serin, tirosin, treonin, asam aspartat, glutamin, histidin, arginin, asparagin lisin. Sedangkan
golongan
dan asam
amino nonpolar dengan gugus R nonpolar (C-C, C-H) seperti valin, alanin,
leusin,
metionin,
isoleusin, fenilalanin Asam-asam
amino
digolongkan
prolin,
dan
tirosin.
juga dapat berdasarkan
kemampuan
sintesis
manusia dan
hewan
tubuh
yaitu
asam
amino non-esensial (alanin, prolin, glisin,
serin,
sistein,
tirosin,
asparagin, glutamin, asam aspartat dan asam glutamat) dan amino
esensial (arginin,
isoleusin,
asam histidin,
leusin, lisin,metionin,
Asam
amino
merupakan
satuan monomer penyusun protein. Hidrolisis lengkap terhadap suatu protein akan menghasilkan 20 jenis asam amino berbeda yang menyusun protein (Redhana, 2010). Semua jenis asam amino tersebut memiliki perbedaan sifat karena perbedaan rantai samping dari asam amino. Perbedaan sifat asam amino tersebut misalnya perbedaan interaksi asam amino
terhadap
tertentu.
suatu
Perbedaan
pelarut
sifat
yang
dimiliki oleh asam amino merupakan sifat yang khas dan berbeda dengan asam amino yang lain. Hal ini menyebabkan asam amino dapat dipisahkan
dan
diidentifikasi
keberadaannya menggunakan metode pemisahan
secara
kromatografi
kertas. Pemisahan kromatografi pemisahan perbedaan
secara
prinsipnya campuran distribusi
adalah karena
komponen
dalam dua fase yaitu fase gerak dan fase diam (Yoshito Takeuchi, 2009). Dalam kromatografi kertas yang merupakan fase gerak adalah pelarut yang
digunakan
sedangkan
fase
diamnya adalah air, kertas berfungsi
kromatografi. Sampel kemudian akan
sebagai absorben tempat melekatnya
bergerak dalam eluen (fase gerak)
fase diam. Pemisahan campuran
yang ditambahkan dan akan terjadi
dengan kromatografi kertas terjadi
pemisahan.
karena
kecenderungan
pemisahan campuran asam amino
komponen.
misalnya eluen fenol yang jenuh.
terdapat
perbedaan
sifat
Kecenderungan tersebut adalah:
kertas.
untuk
melarut dalam cairan b. Kecenderungan molekul-molekul pada padatan
halus (adsorpsi) c. Kecenderungan
relatif
terhadap
jarak
tempuh
Rf. Setiap komponen asam amino memiliki harga Rf tertentu. Besaran Rf ini menyatakan derajat retensi Oleh karena itu, harga Rf juga
untuk
bereaksi secara kimia (pertukaran
setiap asam amino dari garis dasar
suatu komponen dalam fase diam.
molekul-molekul komponen
Jarak yang ditempuh oleh
pelarut/eluen didefinisikan sebagai
untuk
melekat permukaan
dalam
air yang terserap pada pori-pori
molekul-molekul
komponen
gerak
Sebagai fase diam, pada umumnya
a. Kecenderungan komponen
Fase
disebut dengan faktor referensi atau faktor refensi( Tika, 2010) Rf
ion)
(Tika, 2010) Dalam melakukan pemisahan asam amino dengan kromatografi kertas, fase gerak akan mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen (asam amino yang akan dipisahkan) dari campuran (Jim Clark, 2007). Untuk melakukan pemisahan campuran asam amino hanya dibutuhkan sedikit sampel yang akan ditotolkan pada kertas
jarak yang ditempuh sampel dari garis d jarak yang ditempuh pelarut dari garis
Nilai Rf dari suatu senyawa pada
sistem
kromatografi
kertas
bergantung pada banyaknya variabel, diantaranya
sistem
pelarut,
temperatur, lamanya elusi, dan jenis kertas. Oleh karena itu, nilai Rf suatu senyawa
yang
dijadikan
sebagai
telah
diketahui
standar
untuk
menentukan nilai Rf dari senyawa lainnya, begitu pula apabila senyawa
yang akan dipisahkan adalah asam
zona. Nilai Rf harus sama baik pada
amino.
descending maupun ascending. Nilai Harga-harga
untuk
Rf akan menunjukkan identitas suatu
dapat
zat yang dicari, contohnya asam
dengan harga-harga
amino dan intensitas zona itu dapat
senyawa-senyawa dibandingkan
Rf murni
standar. Senyawa standar biasanya
digunakan
memiliki sifat-sifat kimia yang mirip
konsentrasi dengan membandingkan
dengan senyawa yang dipisahkan
dengan noda-noda standar.
pada kromatogram. Adapun faktor-
sebagai
Proses
ukuran
pengeluaran
asam
faktor yang mempengaruhi harga Rf
mineral dari kertas desalting. Larutan
senyawa sebagai berikut : (Day dan
ditempatkan pada kertas dengan
Underwood,2002).
menggunakan mikropipet pada jarak
1. Struktur senyawa
kimia yang
dari sedang
dipisahkan 2. Sifat dari penyerapan dan derajat aktifitasnya 3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap 4. Pelarut (dan
derajat
uap dalam mana bejana yang
digunakan 6. Teknik percobaan 7. Jumlah cuplikan
itu
bentuk
horizontal.
Setelah
garis kertas
dikeringkan, ia diletakan didalam ruangan
yang
sudah
sesuai.
Terdapat
dijenuhkan
tiga
tehnik
pelaksanaan analisis. Pada tehnik ascending; pelarut bergerak keatas dengan gaya kapiler. Sedangkan ketiga dikenal dengan cara radial
yang
Kromatografi
kertas
adalah
salah satu cara analisa yang ampuh dan dilakukan
sering
penelitian
digunakan
suatu
pemberangkatan
membandingkan
zona
dalam
komponen-komponen
dengan mengukur jarak dari titik (pusat
coretan
atau kromatografi kertas sirkuler.
digunakan 8. Suhu 9. Kesetimbangan Pengukuran
dalam
dengan air atau dengan pelarut yang
kemurniannya) fase gerak 5. Derajat kejenuhan dari pengembangan
2–3 cm dari salah satu ujung kertas
campuran.
Dengan
pemindahan
zat
campuran awal) ke garis depan
diselidiki dengan pemindahan zat-zat
pengembang dan pusat rapatan tiap
standar yang diketahui, seringkali
kita dapat mengetahui zat yang kita
Asam amino dapat ditentukan secara
selidiki. Dalam eksperimen ini, kita
kuantitatif
hendak menganalisa secara kualitatif
menggunakan intensitas warna yang
suatu larutan yang berisi bermacam-
terbentuk
sebanding
macam asam amino.
konsentrasi
asam
Pada penyemprotan
percobaan dengan
ini larutan
ninhidrin dilakukan untuk pewarnaan noda-noda asam amino pada kertas kromatografi yang telah kering. Uji ninhidrin terjadi apabila ninhidrin dipanaskan bersama asam amino akan terbentuk kompleks berwarna.
dengan
jalan dengan
amino
yang
tersebut. Pada reaksi ini dilepaskan CO2 dan NH4 sehingga asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 dan NH3
yang
amino
dilepaskan.Asam-asam
yang
bereaksi
dengan
ninhidrin membentuk suatu produk yang
disebut ungu Ruhmann
(Nyoman, 2010).
Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :
+
ninhidrin
anion ungu + RCHO + CO2 + 3H2O + H+
Asam amino larut dalam air
Semua asam amino, kecuali
dan pelarut polar lainnya, tetapi tidak
glisin dapat dianggap sebagai derivat
larut dalam pelarut organik non
alanin.
polar, seperti dietil eter atau benzena.
pertama kalinya oleh Weyl dari hasil
Alanin
diperoleh
untuk
hidrolisis fibroin, yaitu protein yang terdapat pada sutera. Struktur alanin :
Glisin adalah asam amino yang paling sederhana dan terdapat pada skleroprotein.
Pada
tahun
1820
METODE PERCOBAAN
Braconnot menemukan glisin dari hasil hidrolisis gelatin. Struktur glisin :
Sebanyak 100 mL larutan nbutanol ditambahkan dengan 100 mL
Alat dan Bahan : Alat-alat
yang
digunakan
aquades dan 24 mL asam asetat
pada percobaan ini adalah 1 buah
glasial.
pipet mikro, 1 buah chamber, 1 buah
ditempatkan dalam corong pisah dan
gelas kimia 250 mL, 5 buah gelas
kemudian
kimia 100 mL, 2 buah batang
terlihat
pengaduk, 1 buah spatula, 2 buah
kemudian kedua lapisan tersebut
pipet tetes, 1 buah penggaris, 1 buah
dipisahkan.
gunting, 1 buah pinset, 1 buah hot air
Penyiapan Kertas Kromatografi
gun
(pemanas),
Sedangkan
dan
pensil.
bahan-bahan
yang
digunakan pada percobaan ini adalah larutan elusi n-butanol, asam cuka glasial,
aquades,
larutan
leusin,
larutan larutan
glisin,
triptofan,
larutan alanin, larutan ninhidrin, alkohol, HCl pekat, Fenol, dan kertas saring. Prosedur Percobaan Pembuatan Larutan Elusi
Ketiga
larutan
dikocok.
kedua
tersebut
Jika
lapisan
sudah
terbentuk
Kertas kromatografi disiapkan dengan ukuran 8.5 cm x 10 cm disesuaikan dengan chamber yang digunakan. Kemudian pada kertas saring diberikan jarak sekitar 1.5 cm dari tepi bawah kertas ditandai dengan pensil. Proses
Kromatografi
Menggunakan
Eluen
Dengan Fenol
:
Aquades (20 mL : 8 mL) Kertas
kromatografi
dengan
ukuran7.5 cm x 10 cm pada ujung
atas kertas saring dilipat pada batang
antara sampel satu dengan yang
pengaduk dan direkatkan dengan
lainnya adalah 1.5 cm. Kemudian
menggunakan
kertas saring yang sudah berisi
selotip.
Kemudian
kertas saring yang sudah direkatkan
totolan
pada batang pengaduk dicoba untuk
dikeringkan dengan menggunkan hot
dimasukan
air gun. Besarnya noda hendaknya
sehingga
ke
dalam
ujung
chamber
bawahnya
sampel
asam
amino
tepat
tidak melebihi 0.4 cm. Kertas saring
menyentuh dasar chamber dan tidak
dijaga tetap bersih dan sedapatnya
melipat. Kemudian kertas saring
tidak tersentuh oleh jari. Kemudian
dikeluarkan dari chamber dan dibuat
kertas saring dimasukkan ke dalam
garis mendatar sekitar 3 cm
dari
chamber yang telah berisi eluen.
ujungatas dan 1.5 cm dari ujung
Kertas digantungkan dalam ruang
bawah dengan menggunakan pencil
kromatografi
dan penggaris. Kemudian pelarut
beberapa
jam
(eluen) Fenol : Aquades ( 20 mL : 8
berjalan.
Setelah
mL ) dimasukkan ke dalam chamber.
berjalan ± 10 cm dari batas sampel,
Kemudian kertas saring yang sudah
elusi dihentikan dan kertas saring
disiapkan
dalam
dikeluarkan dari chamber. Kemudian
menjenuhkan
kertas saring dikeringkan dengan
dimasukkan
chamber
untuk
ke
keadaan ruang kromatografi.
jenuh, yang ditandai dengan naiknya eluen membasahi kertas saring, maka saring
dikeluarkan
dari
chamber. Kemudian kertas saring dengan ukuran 7.5 cm x 10 cm tadi ditotol
dengan
larutan
sampel
(triptofan, leusin, alanin, dan glisin), ditotolkan
dengan
agar
selama
elusi
dapat
larutan
elusi
menggunakan hot air gun(pemanas).
Setelah chamber dalam keadaan
kertas
(chamber)
menggunakan
pipetmikro dengan jarak 2 cm dari ujung kertas saring. Jarak totolan
Setelah kertas dikeringkan kemudian disemprot dengan larutan ninhidrin yang
selanjutnya
dikeringkan
kembali dengan menggunakan hot air gun(pemanas) sampai noda-noda asam amino yang berwarna tampak ketika dikeringkan. Kemudian nodanoda yang tampak tersebut ditandai dengan
menggunakan pensil dan
ditentukan nilai Rf dari masingmasing noda dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:
Nilai Rf =
Proses
Kromatografi
Dengan
menjenuhkan
Menggunakan Eluen Campuran
kromatografi.
N-Butanol : Aquades : Asam Asetat Glasial ( 100 mL : 100 mL : 24 mL)
keadaan
ruang
Setelah chamber dalam keadaan jenuh, yang ditandai dengan naiknya eluen membasahi kertas saring, maka
Kertas
kromatografi
dengan
kertas
saring
dikeluarkan
dari
ukuran8.5 cm x 10 cm kemudian
chamber. Kemudian kertas saring
pada ujung atas kertas saring dilipat
dengan ukuran 7.5 cm x 10 cm tadi
pada
ditotol
batang
direkatkan
pengaduk
dengan
dan
menggunakan
dengan
larutan
sampel
(triptofan, leusin, alanin, dan glisin),
selotip. Kemudian kertas saring yang
ditotolkan
sudah
batang
pipetmikro dengan jarak 2 cm dari
pengaduk dicoba untuk dimasukan
ujung kertas saring. Jarak totolan
ke dalam chamber sehingga ujung
antara sampel satu dengan yang
bawahnya tepat menyentuh dasar
lainnya adalah 1.5 cm. Kemudian
chamber
kertas saring yang sudah berisi
direkatkan
dan
pada
tidak
melipat.
dengan
Kemudian kertas saring dikeluarkan
totolan
dari
garis
dikeringkan dengan menggunkan hot
dari ujung
air gun. Besarnya noda hendaknya
atas dan 1.5 cm dari ujung bawah
tidak melebihi 0.4 cm. Kertas saring
dengan menggunakan pencil dan
dijaga tetap bersih dan sedapatnya
penggaris. Kemudian pelarut (eluen)
tidak tersentuh oleh jari. Kemudian
N-Butanol:Aquades:Asam
cuka
kertas saring dimasukkan ke dalam
glasial dengan perbandingan 100
chamber yang telah berisi eluen.
mL : 100 mL : 24 mL dimasukkan ke
Kertas digantungkan dalam ruang
dalam chamber. Kemudian kertas
kromatografi
saring
disiapkan
beberapa
jam
dimasukkan ke dalam chamber untuk
berjalan.
Setelah
chamber
dan
dibuat
mendatar sekitar 3 cm
yang
sudah
sampel
menggunakan
asam
(chamber) agar
amino
selama
elusi
dapat
larutan
elusi
berjalan ± 10 cm dari batas sampel,
elusi dihentikan dan kertas saring
air gun(pemanas) sampai noda-noda
dikeluarkan dari chamber. Kemudian
asam amino yang berwarna tampak
kertas saring dikeringkan dengan
ketika dikeringkan. Kemudian noda-
menggunakan hot air gun(pemanas).
noda yang tampak tersebut ditandai
Setelah kertas dikeringkan kemudian
dengan
disemprot dengan larutan ninhidrin
ditentukan nilai Rf dari masing-
yang
masing noda dengan menggunakan
selanjutnya
dikeringkan
kembali dengan menggunakan hot
menggunakan pensil dan
persamaan sebagai berikut:
Nilai Rf =
HASIL DAN PEMABAHASAN Hasil Tabel 1.Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Fenol dan Aquades (20 mL : 8 mL) No.
Larutan Sampel
1. 2. 3. 4.
Triptofan Leusin Alanin Glisin
Jarak Tempuh (cm) Eluen Noda 8.3 8.3 8.3 8.3
5.5 7.8 7.7 7.5
Nilai Rf
Warna
0.66 0.94 0.93 0.90
Noda Violet Violet Violet Violet
Tabel 2.Proses Kromatografi Dengan Menggunakan Eluen Campuran N-Butanol : Aquades : Asam Asetat Glasial ( 100 mL : 100 mL : 24 mL)
No.
Larutan Sampel
1. 2. 3. 4.
Triptofan Leusin Alanin Glisin
Jarak Tempuh (cm) Eluen Noda 8.5 8.5 8.5 8.5
6.8 7.7 3.7 2.8
Nilai Rf
Warna
0.80 0.91 0.43 0.33
Noda Violet Violet Violet Violet
Pembahasan
air bersifat polar, jadi asam asetat
Kromatografi
kertas
adalah
salah satu cara analisa yang ampuh dan
sering
penelitian suatu
digunakan
dalam
komponen-komponen campuran.
membandingkan
Dengan
pemindahan
zat
diselidiki dengan pemindahan zat-zat standar yang diketahui, seringkali kita dapat mengetahui zat yang kita selidiki. Dalam eksperimen ini, kita hendak menganalisa secara kualitatif suatu larutan yang berisi bermacammacam asam amino.
dan air akan saling bercampur, sedangkan n-butanol dan dua pelarut lain
akan
tidak
saling
campur.
Setelah mendiamkan beberapa saat larutan terpisah menjadi dua dengan lapisan atas keruh dan lapisan bawah bening. Eluen kemudian dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup sampai jenuh, tujuannya yaitu untuk menjenuhkan chamber dengan uap pelarut
sehingga
mempercepat
pemisahan. Asam asetat glasial pada pembuatan eluen ini bertujuan untuk
Kromatografi yang dilakukan
mendistribusikan kedua pelarut (air
sebanyak 2 kali yaitu menggunakan
dan n-butanol) yang tidak saling
elusi fenol dengan aquades (20 mL :
bercampur, dimanaaquades dan n-
8 mL) dan juga campuran dari n-
butanol
sama-sama
dapat
butanol : aquades : asam asetat
terdistribusi
dalam
asetat
glasial (100 mL : 100 mL : 24 mL).
sehingga pada perbandingan volume
Pada campuran n-butanol, akuades,
tertentu dapat diperoleh campuran
dan
terjadi
yang mengandung n-butanol, asam
aquades
asetat, dan air dalam satu fase (pada
merupakan senyawa polar sedangkan
lapisan atas dari campuran ketiga
n-butanol
pelarut tersebut yang dihasilkan).
asam
perbedaan
asetat fase
glasial karena
merupakan
nonpolar.Ketika
senyawa larutan
Pemilihan
asam
eluen
sangat
dicampurkan, terbentuk dua lapisan.
penting karena jika eluen yang
Sehingga
digunakan memiliki konsentrasi yang
diperlukan
dalam
pencampuraanya
pengocokan
dan
tidak sesuai dengan sampel yang
dipisahkan dalam corong pisah. Hal
akan dipisahkan, maka kromatografi
ini terjadi karena n-butanol bersifat
tidak dapat berjalan. Jika eluen
non polar sedangkan asam asetat dan
terlalu
polar
akan
bergerak pada fase diamnya. Pada
menyebabkan seluruh noda yang
saat menggaris batas bawah dan
ditotolkan pada kertas naik sampai
batas atas harus menggunakan pensi,
batas
karena pensil terbuat dari grafit yang
atas
maka
tanpa
mengalami
pemisahan. Jika eluen kurang polar,
tidak
maka noda yang ditotolkan tidak
Sedangkan jika menggunakan pulpen
akan bergerak sama sekali.
maka tinta akan larut yang akan
Pada percobaan ini, kertas
akan
larut
dalam
eluen.
mengganggu penampakan noda.
saring yang akan ditotolkan larutan
Sampel asam amino yang akan
sampel asam amino ( triptofan,
digunakan dalam percobaan adalah
leusin, alanin, dan glisin) diberikan
triptofan, leusin, alanin, dan glisin.
batas atas dan batas bawah dengan
Setelah itu, masing-masing sampel
ukuran 3 cm dan 1.5 cm. Pemberian
asam amino ditotolkan pada kertas
batas tersebut bertujuan untuk : pada
saring dengan menggunakan pipet
batas
mikro. Setelah sampel ditotolkan
bawah
didaerah
untuk
mana
membatasi
sampel
akan
pada kertas saring, terlihat larutan
tempat
sampel asam amino (triptofan, leusin,
tidak
alanin, dan glisin) terserap oleh
tercelup pada eluen (fase gerak). Hal
kertas saring, sehingga tidak terlihat
ini dimaksudkan agar sampel yang
adanya larutan. Penotolan sampel
telah ditotolkan pada garis batas
harus
yang telah dibuat pada kertas saring
ketika dilakukan elusi tidak akan
tidak larut dalam fase gerak, jika hal
diperoleh pelebaran warna noda dari
ini terjadi (totolan sampel tercelup
sampel, yang berarti pemisahan yang
pada kertas saring), maka proses
dilakukan
elusi (pemisahan) tidak akan terjadi
Namun, jika diperoleh pelebaran
karena eluen tidak membawa sampel
warna noda, berarti pemisahan yang
yang akan dipisahkan. Sedangkan
dilakukan kurang baik. Kemudian
tujuan pemberian batas atas berjarak
kertas saring yang telah ditotolkan
3 cm dimaksudkan agar proses
sampel
pembawaan sampel atau gerak eluen
menggunakan
dapat
Pengeringan kertas saring setelah
ditotolkandimana
pada
penotolan
tersebut
sampel
dideteksi
seberapa
jauh
sekecil
mungkin
dapat
sehingga
dikatakan
dikeringkan hot
baik.
dengan air
gun.
penotolan
sampel
dengan
yangpaling atas merupakan sampel
menggunakan hot air gun merupakan
yang paling larut dalam pelarut
salah
yangartinya bersifat paling non polar
satu
proses
mengeluarkan
asam
untuk
amino
dari
dibandingkan
sampel
asam
kertas. kemudian dimasukkan ke
amino lainnya. Molekul-molekul sep
dalam
chamber
dijenuhkan
oleh
yang
telah
erti ini akan bergerak sepanjang kerta
uap
eluen.
sdiangkut oleh pelarut. Mereka akan
Kemudian chamber ditutup rapat agar
terjadi
pemisahan
yang
sempurna. Pemisahan asam amino dengan cara kromatografi kertas disebabkan
adanya
perbedaan
koefisien partisi antara air dan pelarut
organik.
Fase
air
akan
tertahan dengan kuat di pori-pori kertas karena adanya interaksi yang kuat
antara
air
dengan
gugus
hidroksil dari selulosa, dimana gugus ini bersifat hidrofilik. Perbedaan koefisien
partisi
perbedaan
laju
menunjukkan rambatan
pada
permukaan kertas dari air dan pelarut organik
yang
merambat
secara
perlahan.
Pada saat kertas saring ditotolkan larutan sampel asam amino, maka akan
campuran
memilikisedikit
interaksi
non-polar akan
terjadi
pemisahan,
dimana
pelarut organik merambat ke atas melalui kapiler kertas mengangkut campuran asam amino yang ada ditotolkan pada kertas saring. Asam amino yang paling larut di dalam pelarut organik, akan diangkut paling cepat dan asam amino yang paling kurang larut akan tertinggal paling bawah. Jadi, karena pelarut yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air dan fenol : air bersifat nonpolar, maka dari keempat sampel asam
Molekul-molekul dalam
memiliki nilai Rf yang relatiftinggi.
amino
yang
digunakan
(triptofan, leusin, alanin, dan glisin), dapat
dilihat
sifat kepolarannya.
dengan
Sampel yang paling atas merupakan
molekul-molekul air dan molekul-
sampel yang paling larut dalam
molekulyang melekat pada selulosa,
pelarut yang artinya bersifat paling
dan karena akan menghabisakan
non polar dibandingkan sampel asam
banyakwaktunya untuk larut dalam
amino
pelarut yang bergerak. Maka sampel
mencapai
lainnya. batas
Setelah yang
sampel telah
ditentukan,sampel dikeluarkan dari
noda-noda pada kertas saring dapat
eluen
terlihat yakni noda yang berwarna
dan
mengeringkan
menggunakan hot air gun. Kemudian
ungu
menyemprotkan
larutan ninhidrin pada kertas saring tadi. Asam amino merupakan jenis zat tidak berwarna, sehingga untuk mengetahui letak noda diperlukan pereaksi lokasi. Dalam percobaan ini digunakan larutan ninhidrin yang disemprotkan
pada
kertas
saringsetelah dikeringkan, sehingga
ketika
kertas
dikeringkan
lagi
menggunakan gun.Terbentuknya ungu
ini
kromatografi dengan
hot
air
noda
berwarna
disebabkan
karena
terjadinya reaksi antara hidrat dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam
amino.Adapun
persamaan
reaksi yang terjadi untuk tiap sampel adalah sebagai berikut :
Alanin
+
ninhidrin
Anion ungu
+ CH3CHO + CO2 + 3H2O + H+
Reaksi alanin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :
Glisin
+
ninhidrin
anion ungu + HCHO + CO2 + 3H2O + H+
Reaksi glisin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :
Leusin
Triptofan
Noda-noda ini kemudian diukur dengan
membandingkan
jarak
dengan jarak pergerakan pelarut, disimbolkan dengan Rf.
komponen yang dipisahkan (analit)
Nilai Rf =
Dari
hasil
perhitungan
nilai
diketahui
Rf bahwa
masing-masing asam amino memiliki harga Rf yang berbeda. Untuk eluen pertama yaitu triptofan Rf = 0.66 ; leusin Rf = 0.94; alanin Rf = 0.93 dan glisinRf = 0.90. Sedangkan untuk eluen kedua, ialah harga Rf triptofan = 0.80; Rf leusin = 0.91;Rf alanin = 0.43 ; dan Rfglisin= 0.33. Perbedaan
ini
dipengaruhi
oleh
keterikatan analit terhadap eluen. Karena
eluen
yang
digunakan
bersifat non polar maka senyawa yang lebih non polar akan terikat lebih kuat pada eluen sehingga harga Rf akan semakin besar. Berdasarkan literatur, harga Rf untuk alanin, leusin, glisin, dan triptofan adalah 0.38; 0.67; 0.26 ;0.66. Harga Rf ini berbeda dengan hasil percobaan, karena perbedaan
kemungkinan komposisi
terdapat eluen
dan
besarnya ukuran kertas kromatogarfi yang digunakan. Untuk eluen pertama, harga Rf sampel asam amino dari yang paling besar adalah leusin, triptofan, alanin dan glisin. Artinya glisin lebih polar dibandingkan
denganleusin,
triptofan, dan alanin, dimana leusin bersifat non polar. Hal ini sesuai dengan literatur yaitu pada eluen pertama ini digunakan pelarut fenol yang bersifat non polar, sehingga senyawa yang lebih larut urutannya adalah leusin terlebih dahulu lalu triptofan dan alanin karena dilihat dari strukturnya leusin bersifat lebih non polar dibandingkan kedua asam amino lainnya, dan triptofan bersifat lebih non polar dibandingkan dengan asam amino alanin dan glisin atau dapat dikatakan bahwa alanin dan glisin merupakan asam amino yang paling polar dibandingkan kedua sampel asam amino yang digunakan.
Terjadinya perbedaan sifat kepolaran
kromatografi
ini dapat ditunjukkan oleh harga Rf
sedangkan n-butanol bersifat non
dan
polar yang akan melarutkan asam
dari
literatur.
Pada
eluen
sebagai
fase diam,
keduaaquades lebih tertarik pada
amino
dan
dapat
diketahui
kertas kromatografi, kertas yang
pergerakannya
dengan
bersifat hidrofilik, sehingga asam
diatas, dengan begitu dapat diketahui
amino yang bersifat non polar lebih
sifat kepolaran dari masing-masing
larut bersama dengan pelarut N-
asam amino tersebut.
harga
Rf
Butanol yang bersifat non polar juga, hal ini dapat dilihat dari harga Rf alanin yang lebih besar dibandingkan
KESIMPULAN
dengan glisin dan triptofan.
Berdasarkan hasil percobaan
Sedangkan untuk eluen kedua,
yang telah dibahas, maka dapat
harga Rf masing-masing sampel
disimpulkan bahwa nilai Rf pada
asam
menunjukkan
eluen pertama menunjukkan bahwa
kecenderungan semakin besar dari
masing-masing sampel asam amino
triptofan, leusin, dan alanin namun
menunjukkan nilai Rf yang berbeda.
nilai Rf turun pada glisin. Artinya
Nilai Rf sampel asam amino pada
alanin dan leusin lebih larut dalam
eluen pertama yaitu triptofan (0.66),
eluen kedua, yaitu n-butanol yang
leusin (0.94), alanin (0.93), dan
bersifat non polar sehingga dapat
glisin (0.90). Sedangkan pada eluen
dikatakan bahwa alanin dan leusin
kedua juga menunjukkan nilai Rf
bersifat lebih non polar dibandingkan
yang berbeda-beda pada masing-
dengan kedua sampel lainnya, tetapi
masing sampel asam amino yaitu
karena harga Rf leusin lebih besar
triptofan (0.80), leusin (0.91), alanin
dibandingkan dengan alanin, maka
(0.43),
dapat
sifat
Berdasarkan literatur, harga Rf untuk
kepolaran leusin lebih rendah dari
alanin, leusin, glisin, dan triptofan
pada alanin. Dalam hal ini asam
adalah 0.38; 0.67; 0.26 ;0.66. Harga
asetat dan air bersifat polar sehingga
Rf
dapat
percobaan,
amino
dinyatakan
larut
bahwa
bersama-sama
dan
berkumpul dalam pori-pori kertas
dan
ini
glisin
berbeda karena
(0.33).
dengan
.
hasil
kemungkinan
terdapat perbedaan komposisi eluen
dan
besarnya
ukuran
kertas
kromatogarfi yang digunakan.
AnalisisKimia Kuantitatif Edisi Keen am. Jakarta : Erlangga Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga.
UCAPAN TERIMAKASIH
Erlangga:
Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada
Dr. I Nyoman
Tika, M.Si., sebagai dosen pengampu mata kuliah Praktikum Biokimia kare na sudah membimbing penulis selam
Jakarta Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta. Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun
a praktikum berlangsung hingga pen
Praktikum Biokimia.
ulis mampu menyelesaik-an
Singaraja: Universitas
artikel
ini, Made Wirahadi Kusuma selaku
Pendidikan Ganesha
asisten dosen, dan Ni Putu Lilik Laboratorium D3 Analis Kimia atas
Toha, A., dan Hamid, A., 2001, Biokimia : Metabolisme Biomolekul, Alfabeta, Bandung.
bantuan dalam melengkapi segala
Takeuchi,
Pratami, S.Si selaku laboran di
keperluan
bahan
dan
alat
di
Yoshito
.
2007.
Kromatografi Kertas. Diakses
laboratorium yang berkaitan dengan
dari
praktikum sehingga percobaan ini
try.org/kromatografi_kertas
dapat dilaksanakan dengan lancar.
pada tanggal 26 September
DAFTAR PUSTAKA
2018
http://www.chem-is-
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Clark
,Jim.
2007.
Kertas.
Kromatografi
Diakses
dari
http://www.chem-ispada tanggal 26 September 2018 RA.,
Junior
Underwood.
dan
Singaraja:
Biokimia. Universitas
Pendidikan Ganesha.
try.org/kromatografi_kertas
Day,
Pratikum
A.L. 2006.