Practica 3

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA CURSO: MICROBIOLOGÍA GENERAL – LABORATORIO PRÁCTICA 3 TÍTULO: “TINCIÓN DIFERENCIAL ÁCIDO - RESISTENTE” Integrantes: · · · · ·

20 Bolimbo Orellana, Cristhian 20141343 Candiotti Gamero, Franco 20130085 Chávez Corcuera, Gonzalo 20141359 Lázaro, Luis 20141362 Munguia Dionisio, Juan Manuel

MESA N°: 3 GRUPO: Jueves, 11am – 1 pm

I.

INTRODUCCIÓN

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son importantes criterios de clasificación taxonómica. Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. (Ramos, 2004 ) El presente informe se enfoca en las técnicas de tinción de endosporas. Los géneros de bacterias productoras de esporas son conocidas, por tanto uno de los usos de estas técnicas puede ser la determinación e identificación del microorganismo. La técnica más usada es la de Schaeffer y Fulton la cual se basa en la gran resistencia de las endosporas a la decoloración una vez han sido coloreadas. Además usaremos la técnica de Dörner que también tiñe endosporas usando el calor como fijador del colorante; la diferencia entre ambas técnicas es que una usa alcohol ácido como decolorante para luego contrastar mientras que la de Dörner se basa en la insolubilidad de la nigrosina en agua. II. -

OBJETIVOS Observar la estructura bacteriana especial, como la endospora con tinciones selectivas. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias.

III.

MARCO TEÓRICO

La mayoría de las bacterias se colorean por tinción simple o por tinción de Gram, pero existen algunas especies de los géneros Mycobacterium y Nocardia que son resistentes a estas coloraciones y pueden teñirse calentándolos con carbolfucsina. El calentamiento permite la entrada del colorante dentro de las células (Tortora 2007) Una vez que las mismas han tomado la carbolfucsina, resisten la decoloración aun aplicando una mezcla de ácido-alcohol como agente decolorante. Como consecuencia de esta propiedad, estos organismos se clasifican como ácido-alcohol resistentes y se visualizan de color rojo, en tanto que, si el colorante puede ser extraído por el decolorante, los microorganismos se clasifican como acido-alcohol no resistentes y utilizando esta técnica aparecerán de un color diferente debido a la contra coloración con otro colorante. Esta diferencia característica entre las mycobacterias y los otros microorganismos se debe al alto contenido lipídico de la pared celular de las primeras, en la que el peptidoglucano está unido mediante enlaces covalentes a un polímero de ácido micólico- galactosa- arabinosa (Tortora 2007). M.tuberculosis y M. leprae representan bacterias que son patogénicas para los humanos, esta técnica es de vital importancia para el diagnóstico y la identificación de estos organismos. Tinción de esporas Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas (Rodríguez 2006). La detección de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes para la célula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca la esporulación de las bacterias (Rodríguez 2006). La presencia de esporas en el ámbito clínico nos dirige hacia los géneros Clostridium y Bacillus. Técnicas para tinción de esporas A)

TÉCNICA SCHAEFFER-FULTON

Para realizar este método necesitamos utilizar un colorante primario, un agente decolorante y un contrastante: COLORANTE PRIMARIO: CARBOL FUCSINA: La carbol fucsina es un colorante fenólico que es soluble en la cera de las paredes de las micobacterias, por lo tanto,

puede penetrarlas y permanecer retenida en ellas. La penetración de este colorante es intensificada mediante tratamiento con calor. Todas las células aparecerán rojas. AGENTE DECOLORANTE: ACIDO-ALCOHOL (HCl 3%-Etanol 95%): Antes de la decoloración el extendido debe enfriarse, esto permite que la cera solidifique. Una vez aplicado el agente decolorante, las células ácido-alcohol resistentes resisten la decoloración, debido a que el colorante primario es más soluble en la cera de la pared que en el agente decolorante. Por lo tanto, el colorante primario será retenido y las micobacterias permanecerán rojas. Este no será el caso con los organismos ácido-alcohol no resistentes los cuales carecen de la pared de cera. El colorante primario será fácilmente removido y las células quedarán incoloras. CONTRACOLORANTE: VERDE MALAQUITA: Este colorante es utilizado como el reactivo final que colorea a las células incoloras. Las células ácido-alcohol resistentes, debido a la composición de su pared no serán teñidas por este colorante, estas se verán color fucsia ya que previamente fueron teñidas con el colorante primario. Es por esto que la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde. B)

TÉCNICA DE DORNER

Esta es una técnica muy similar a la anterior y los principios teóricos son los mismos. En este caso se utiliza carbol fucsina como colorante primario, agua como decolorante y nigrosina como contra colorante. Las esporas se verán de color rojo, el resto de la bacteria incolora, sobre un fondo negro. Ambas técnicas emplean el fenol y alta temperatura como agentes coadyuvantes para lograr la penetración de la fucsina en la estructura de la espora.

VI.

MATERIALES Y MÉTODO 4.1 MATERIALES A. Tinción de Dörner  Cultivos de 48 horas de Bacillus sp  Aceite de inmersión (cedro)  Asa de Kölle  Láminas porta objeto  Soluciones colorantes (fucsina y nigrosina)  Agua destilada B. Tinción de Schaeffer y Fulton  Cultivos de 48 horas de Bacillus sp  Aceite de inmersión  Asa de Kölle  Láminas porta objeto  Mechero de alcohol  Pinzas  Colorantes (fucsina y verde malaquita)  Solución decolorante (alcohol ácido) 4.2 MÉTODOS A. Tinción de Dörner  Colocar 1 mL de agua destilada en un tubo de ensayo  Añadir la muestra de la cepa de Bacillus sp y disolver  Añadir el mismo volumen de fucsina (1 mL)  Llevar a baño María por 30 minutos  Separar un poco de muestra en una lámina porta objeto  Agregar la misma cantidad de nigrosina y luego diseminar a lo largo de la lámina  Esperar a que se seque al aire  Agregar una gota de aceite de inmersión  Observa y dibujar los resultados B. Tinción de Schaeffer y Fulton  Fijar la muestra de Bacillus sp  Agregar fucsina  Calentar con el mechero de alcohol por 3 minutos  Decolorar con alcohol ácido  Enjuagar con agua destilada  Agregar verde de malaquita durante 30 segundos  Lavara con agua destilada  Secar  Agregar aceite de inmersión de cedro, observar y dibujar

V.

RESULTADOS

VI.

DISCUSIONES

Al empezar agregarle carbol fucsina, sabemos que éste es un colorante fenólico que es soluble en la cera de las paredes de algunas bacterias, por lo tanto puede penetrarlas y permanecer retenida en ellas. La penetración de este colorante es intensificada mediante tratamiento con calor. (UNQ, 2008). Las endosporas son estructuras que no se tiñen fácilmente, pero una vez teñidas son muy resistentes a las decoloraciones. De esta manera, si cambiamos el ácido alcohol por otro decolorante como la solución de alcohol-acetona, la endospora seguirá resistiendo a la decoloración. La larga exposición (10 min) a altas temperaturas (100 °C, agua en ebullición) de la muestra en la primera etapa de la técnica sirve para la fijación de la safranina. El calor ayuda al tinte a penetrar en las relativamente impermeables capas de la endospora (Sumbali, 2009). Durante el proceso exposición a altas temperaturas la endospora y la célula vegetativa son teñidas por la safranina, pero luego la célula vegetativa es decolorada por la difusión de las moléculas de safranina hacia las de nigrosina (Prakash, 2014), colorante negro insoluble en agua, que no penetra la célula vegetativa.

VII. -

CONCLUSIONES Se pudo observar las endosporas de las bacterias con dos técnicas distintas, una con más claridad que otra. La distinción de estas bacterias que presentan dichas estructuras nos ayuda a reconocer que tipo de bacterias son y, así prevenir ciertas enfermedades ocasionas por estas mismas.

VIII.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas bacterianas? A qué le atribuye la diferencia. Cuando se utilizó el método de Dörner se obtuvieron mejores resultados ya que las estructuras bacterianas, en este caso las endosporas, eran más visibles que cuando se utilizó la técnica de tinción de Schaeffer y Fulton. En el método de Dörner, el calor, debido al baño maría que se aplica a la suspensión del organismo con carbolfucsina, permeabiliza la endospora permitiendo que la fucsina la tiña su estructura. Por otro lado, en la técnica de Schaeffer y Fulton, a pesar de que se aprecia el comportamiento ácido-resistente de la endospora, una sobre exposición a alcohol ácido durante la decoloración podría causar una decoloración total de modo que las endospora no se distinguirán de la parte vegetativa. 2. ¿Qué defecto produciría el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el alcohol cetona? Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos de cadena larga que les confiere resistencia la decoloración por ácidos como el alcohol-ácido, el cual se aplica después de la tinción con colorantes básicos. El uso de otros decolorantes como el alcohol cetona, debido a su naturaleza química, podría efectivamente decolorar las estructuras teñidas, de modo tal que no se notará una diferenciación entre endospora y parte vegetativa. Por otro lado otros decolorantes, a diferencia del alcohol ácido no son tan veloces. 3. ¿Qué otro género de bacterias pueden formar endosporas?                         

1 Acetonema 5. Alkalibacillus 6. Ammoniphilus 7. Amphibacillus 8. Aneurinibacillus 9. Anoxybacillus 10. Bacillus 11. Brevibacillus 12. Caldanaerobacter 13. Caloramator 14. Caminicella 15. Cerasibacillus 16. Clostridium 17. Clostridiisalibacter 18. Cohnella 19. Dendrosporobacter 20. Desulfotomaculum 21. Desulfosporomusa 22. Desulfosporosinus 23. Desulfovirgula 24. Desulfunispora 25. Desulfurispora 26. Filifactor 27. Filobacillus 28. Gelria

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29. Geobacillus 30. Geosporobacter 31. Gracilibacillus 32. Heliobacterium 33. Heliophilum 34. Lentibacillus 35. Mahella 36. Moorella 37. Oceanobacillus 38. Ornithinibacillus 39. Oxalophagus 40. Oxobacter 41. Paenibacillus 42. Paraliobacillus 43. Pelospora 44. Pelotomaculum 45. Piscibacillus 46. Pontibacillus 47. Propionispora 48. Salinibacillus 49. Salsuginibacillus 50. Sporacetigenium 51. Sporoanaerobacter 52. Sporobacter 53. Sporobacterium 54. Sporohalobacter 55. Sporolactobacillus 56. Sporomusa 57. Sporosarcina 58. Sporotalea 59. Sporotomaculum 60. Syntrophospora 61. Tenuibacillus 62. Tepidibacter 63. Terribacillus 64. Thalassobacillus 65. Thermoacetogenium 66. Thermoactinomyces 67. Thermoalkalibacillus 68. Thermoanaerobacter 69. Thermoanaeromonas 70. Thermobacillus 71. Thermovenabulum 72. Tuberibacillus 73. Virgibacillus 74. Vulcanobacillus

4. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las usadas en este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas. Las otras técnicas de tinción de esporas también utilizan el calor para que el tinte penetre la espora.

La técnica de Moeller Utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contra colorea con azul de metileno. Se observan las endosporas de color rojo y el resto de la bacteria azul. Ventajas: Desventajas: Un lavado excesivo con alcohol ácido puede alterar los resultados. El método de Ziehl-Neelsen (Baar) Se utiliza para determinación de la presencia de bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia de trascendencia clínica para el diagnóstico y estudio enfermedades. Se basa en la resistencia de estas bacterias a ser decoloradas con una mezcla ácido-alcohol, se debe a la alta concentración de lípidos de su pared (ácidos micólicos). La única variante con el método de Schaeffer y Fulton es el del contrastante (verde malaquita es reemplazada por azul de metileno)

Ventajas: es un diagnóstico preciso para la presencia de ciertas bacterias. Desventajas: Un lavado excesivo con alcohol ácido puede alterar los resultados.

IX.

BIBLIOGRAFÍA      

Prakash, B. Microbial Staining. IK International. New Delhi. 2014 pp 139-155. RAMOS, M. d. (2004). Microbiología General. México D.F.: Universidad Autónoma Metropolitana. RODRÍGUEZ, E. (2006). Bacteriología General: principios y prácticas de laboratorio. 1ra Edición. Editorial EUCR. Costa Rica Sumbali, G; Mehrota, R. 2009. Principles of Microbiology. 1° Edición. Nueva Delhi. Tata McGraw Hill Education. TORTORA (2007). Introducción a la Microbiología. 9na Edición. Editorial Médica Panamericana. Argentina UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES. 2008. Microbiología general. Departamento de Ciencia y Tecnología. Argentina. Consultado el 24 de setiembre del 2015. (En línea). Disponible en https://microbiologiaunq.files.wordpress.com/.../trabajospracticos-2008