HALAMAN PENGESAHAN Judul Penelitian:
: Preservasi residual ridge tulang alveolaris melalui Induksi mangosteen pericarp : Kesehatan, Penyakit tropis, Gizi dan obat : Pengembangan vaksin, obat dan obat tradisional (Bahan alam )
Topik Riset Mandat Bidang Fokus Ketua Peneliti a. Nama Lengkap b. NIDN c. Jabatan Fungsional d. Program Studi e. Nomor HP f. Alamat surel (e-mail) Anggota Peneliti (1) a. Nama Lengkap b. NIDN c. Perguruan Tinggi Anggota Peneliti (2) d. Nama Lengkap e. NIM f. Perguruan Tinggi Anggota Peneliti (3) g. Nama Lengkap h. NIDN i. Perguruan Tinggi
: Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM : 0023098101 : Lektor : Bedah Mulut dan Maksilofasial : 081390909100 :
[email protected] : Dr. Pratiwi Soesilawati, drg.,MKes.,PA(K) : 00221169003 : Universitas Airlangga : Gde Djodi Satria Rurus : 02141133045 : Universitas Airlangga : dr. Tobiume Kei Ph.D :: Hiroshima University
Lama Penelitian Keseluruhan : 1 Tahun Biaya Penelitian Keseluruhan : Rp. 100.000.000,Biaya Tahun berjalan : - Diusulkan ke UNAIR : Rp. 100.000.000,- Dana institusi lain :- Inkind, sebutkan :Mengetahui, Ketua Lembaga Penelitian dan Inovasi
Prof. Hery Purnobasuki, M.Si., Ph. NIP 196705071991021001
Surabaya, 29 Juli 2019 Ketua Peneliti
Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM NIP. 19810923 200501 1 001
Menyetujui Wakil Rektor 3
Prof. Ir Moch. Amin Alamsjah, M.Si., Ph.D NIP. 197001161995031002 1
DAFTAR ISI Halaman Halaman Pengesahan ........................................................................................................ 1
Daftar Isi............................................................................................................................ 2 Ringkasan .......................................................................................................................... 5 Bab 1 Pendahuluan ......................................................................................................... 7 1.1 Latar Belakang ............................................................................................................ 7 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................................... 9 1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................................................ 9 1.4 Manfaat Penelitian .................................................................................................... 10 1.5 Rencana Target Capaian Tahunan ............................................................................ 11 Bab 2 Tinjauan Pustaka ............................................................................................... 13 2.1 Penyembuhan Luka ................................................................................................... 13 2.2 Penyembuhan luka pasca pencabutan gigi ................................................................ 15 2.3 Angiogenesis ............................................................................................................. 15 2.4 Vascular Endothelial Growth Factor-A (VEGF-A).................................................. 17 2.5 Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2)....................................................................... 18 2.6 Fibroblas ................................................................................................................... 19 2.7 Platelet-derived growth factor -B (PDGF-B) .......................................................... 20 2.8 Transforming Growth Faktor-Beta1 (TGF-β1) ....................................................... 21 2.9 Protein penand/ marker proses inflamasi ................................................................. 21 2.9.1 Interleukin-1 (IL-1) ……………………….………………………..…................ 22 2.9.2 Interleukin-6 (IL-6) …………………………………………………………….. 23 2.9.3 Interleukin-10 (IL-10) ……………………………….………………………….. 23 2.9.4 Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) …………… ………………………….. 23 2.9.5 C-Reactive Protein (CRP) ………………………………………………………. 24 2.10 Penanda / Marker Proses Osteogenesis …………………………………………. 24 2.10.1 Bone Sialoprotein (BSP) ………………………………………………………. 26 2.10.2 Alkali Phospahate(ALP) ………………………………………………………. 27 2.10.3 Run-Related Transcription Factor 2 (RUNX2) ………………………………. 28 2.10.4 Colagen 1 Alpha 1 (Coll1α1) …………………………………………………. 29 2.10.5 Osterix (OSX) ………..………………………………………………….......... 29 2
2.11 Kulit Buah manggis ……………………………………………………………… 30 2.12 Methyl-Thiazol-Tetrazolium atau MTT Assay ………………………………….. 31 2.13 Wound Healing Assay …………………………………………………………... 32 2.14 Polymerase Chain Reaction (PCR) …………………………………………….... 32 2.15 Real-Time PCR …………………………………………………………………. 33 2.16 Osteoblastic Cell Line MC3T3-E1 ……………………………………………… 34 2.17 Lipopolisakarida (LPS) ………….……………………………………………… 34 Bab 3 Metode Penelitian ............................................................................................... 36 3.1 Jenis Penelitian .......................................................................................................... 36 3.2 Rancangan Penelitian ................................................................................................ 36 3.3 Sampel dan Besar Sampel ......................................................................................... 36 3.3.1 Jenis Sampel ........................................................................................................... 36 3.3.2 Besar Sampel .......................................................................................................... 36 3.4 Variabel Penelitian .................................................................................................... 37 3.5 Definisi Operasional.................................................................................................. 38 3.5.1 Human Gingival Fibroblas ..................................................................................... 38 3.5.2 Osteoblastic Cell Lini MC3T3-E1 ……………………………………….………38 3.5.3 Lipopolisakarida ..................................................................................................... 38 3.5.4 Ekstak Kulit manggis ............................................................................................. 38 3.6 Tahapan Penelitian …………………………………………………………..…… 42 3.7 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................................... 44 3.8 Alat dan Bahan Penelitian ......................................................................................... 44 3.8.1 Alat penelitian ........................................................................................................ 44 3.8.2 Bahan Penelitian .................................................................................................... 45 3.9 Cara Kerja ................................................................................................................ 47 3.9.1 Pembuatan Ekstrak kulit buah Manggis ................................................................ 47 3.9.2 Kultur sel ………………………………………………………….…………… 48 3.10 PCR …………………………………………………………..………………….. 49 3.10.1 Ekstraksi RNA .................................................................................................. 49 3.10.2 Pengukuran kadar dan kemurnian RNA .............................................................. 49
3
3.10.3 Perancangan dan optimasi PCR primer PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, CRP, Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP……………………………………………………………………..............50 3.10.4 Visualisasi hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis pada gel .................. 51 3.11 PCR Real Time………………………………………………………………….. 52 3.12 MTT Assay …………………………………………..………………………….. 54 3.13 Wound healing assay pada kultur Human Gingival Fibroblast ..……………….. 55 3.14 Analisis Data ......................................................................................................... 55 3.15 Luaran Per Tahun .................................................................................................... 55 3.16 Indikator Capaian….……………………………………………………….......... 55 Bab 4 Road Map Penelitian ………………………………………………………….56 Bab 5 Anggaran Biaya dan Jadwal Penelitian ........................................................... 57 5.1 Anggaran Biaya ......................................................................................................... 57 5.2 Jadwal Penelitian....................................................................................................... 58 5.3 Proyeksi Publikasi Hasil penelitian ……………………………………………….. 59 5.4 Indikator Keberhasilan (Target Capaian) …………………………………………..59 Daftar Pustaka ................................................................................................................. 60 Lampiran ....................................................................................................................... 65 Lampiran 1: Biodata Ketua dan Anggota........................................................................ 63 Lampiran 2: Susunan Organisasi Tim Pengusul dan Pembagian Tugas ......................... 84 Lampiran 3:Skema keterkaitan antara isu, strategi dan tema tema penelitian ................ 85 Lampiran 4: Justifikasi Anggaran Penelitian .................................................................. 86 Lampiran 5: Surat pernyataan ketua peneliti dan anggota .............................................. 91 Lampiran 6 : Letter Of Consultan …………………………………………………….. 92
4
RINGKASAN Perawatan dental implant merupakan perawatan ideal untuk menggantikan gigi yang hilang akibat pencabutan gigi. Pencabutan gigi dikatakan ideal apabila dilakukan tanpa memberikan trauma yang berlebih terutama kepada prosesus alveolaris. Pada keadaan yang normal pasca pencabutan gigi terjadi resorbsi tulang alveolaris dalam arah horizontal dan vertical sehingga mempersulit pemasangan dental implant. Banyak penelitian yang telah dilakukan mengenai preservasi soket bekas pencabutan yang memanfaatkan bahan alam salah satunya adalah kulit dari buah manggis (Garcinia mangostana). Kulit buah manggis mengandung saponin dan tanin yang dapat mempercepat proses proliferasi fibroblas dan proses angiogenesis. sehingga dapat mempercepat proses penyembuhan luka. Indikator untuk penyembuhan luka adalah dengan pemberian ekstrak kulit buah manggis dapat melibatkan banyak protein, salah satunya adalah peningkatan jumlah fibroblast dan indikator pembentukan osteoblast dengan melihat ekspresi PDGF-B, FGF-2, ,VEGF-A, TGF-β1 dari tingkat mRNA atau protein. Kulit buah manggis mengandung Xanthone yang mempunyai efek antiinflamasi sehingga dapat membatasi ekspresi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP pada proses penyembuhan luka, sehingga resorbsi yang berlebihan pada tulang alveolar bisa teratasi pasca pencabutan gigi. Indikator untuk penyembuhan tulang adalah, salah satunya adalah peningkatan jumlah indikator pembentukan osteoblast dengan melihat ekspresi Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP dari tingkat mRNA atau protein. Tujuan jangka panjang peneliti adalah menghasilkan suatu produk Gel yang berisi ekstrak kulit manggis untuk mengisi soket bekas pencabutan gigi sehingga dapat mempercepat penyembuhan tulang, mengurangi resiko terjadinya infeksi dan mempertahankan dimensi vertical dan horizontal tulang alveolar. Apabila semua tujuan bisa tercapai maka bisa mempermudah klinisi memasang implant tanpa memikirkan untuk penambahan bahan tulang tandur. Seperti yang kita ketahui bahwa pemilihan bahan tandur tulang yang berasal dari tubuh sendiri 5
dapat mengakibatkan defek pada tubuh sedangkan penambahan tulang dari tulang organisme lain dapat mengeluarkan biaya yang tidak sedikit.
6
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Kehilangan gigi tetap pasca pencabutan gigi tanpa penggantian gigi yang
hilang dapat mengakibatkan gangguan fungsi pengunyahan, estetik dan fonetik. Selain itu dapat terjadi gangguan keseimbangan organ mastikasi dalam mulut, seperti migrasi gigi tetangga, ekstrusi gigi antagonis, kehilangan kontak, karies, resesi gingiva dan poket periodontal yang mengakibatkan masalah kesehatan gigi dan mulut yang lebih kompleks. Penggantian gigi yang hilang dapat dilakukan dengan aplikasi gigi tiruan baik sebagian maupun lengkap, gigi tiruan cekat ( crown dan bridge ) dan dental implant. Seiring dengan kebutuhan dan keinginan penderita serta perkembangan tehnologi dalam bidang kedokteran gigi, implant gigi merupakan alternatif terbaik. Perawatan dental implant merupakan perawatan ideal untuk menggantikan gigi yang hilang akibat pencabutan gigi. Pencabutan gigi dikatakan ideal apabila dilakukan tanpa memberikan trauma yang berlebih terutama kepada prosesus alveolaris. Keberadaan dimensi vertikal maupun horizontal. Prosesus alveolaris sangat menunjang dalam pemasangan dental implant. Pada keadaan yang normal pasca pencabutan gigi terjadi resorbsi tulang alveolaris dalam arah horizontal dan vertical sehingga mempersulit pemasangan dental implant. Diperlukan metoda untuk menghambat proses resorpsi tulang alveolaris sehingga dimensi soket gigi dapat dipertahankan sampai pada saat pemasangan implant, disebut dengan prosedur socket preservation. Prosedur socket preservation dilakukan dengan menempatkan bahan yang dapat mempercepat proses penyembuhan soket pasca pencabutan gigi sehingga diharapkan dapat menghambat proses resorpsi tulang alveolaris. Saat ini banyak penelitian yang telah dilakukan mengenai preservasi soket dan penyembuhan luka yang memanfaatkan bahan alam. Diantaranya digunakan 7
obat tradisional sebagai antiinflamasi. Hal ini dikarenakan kepercayaan masyarakat terhadap kelebihan dari obat tradisional dibandingkan dengan obat modern yaitu efek samping obat tradisional relatif kecil jika digunakan secara tepat (Katno, 2007). Bahan dari alam yang dapat dimanfaatkan untuk penyembuhan tulang adalah kulit dari buah manggis (Garcinia mangostana) (Chaovanalikit, 2012). Di dalam kulit buah manggis mengandung saponin dan tanin yang dapat merangsang proliferasi fibroblas. Derivat dari senyawa fenol yaitu antosianin, flavonoid dan tanin memiliki sifat antioksidan dan antimikroba (Sakagami, 2012). Derivat dari xanthone yaitu α-mangostin memiliki aktivitas sebagai antijamur, antioksidan, antiviral, antibakteri, serta anti inflamasi (Chaverri, 2008). Proses penyembuhan luka setelah pemberian ekstrak kulit buah manggis melibatkan banyak faktor, salah satunya adalah peningkatan jumlah fibroblast dan proses angiogesis. Angiogenesis merupakan pembentukan pembuluh darah baru yang terjadi secara alami didalam tubuh baik dalam kondisi sehat maupun patologi. Pada keadaan terjadi kerusakan jaringan proses angiogenesis berperan dalam mempertahankan kelangsungan fungsi berbagai jaringan dan organ yang terkena luka. Hal ini terjadi melalui terbentuknya pembuluh darah baru yang menggantikan pembuluh darah yang rusak ( Frisca et al. 2009 ) Ada berbagai macam growth factor yakni PDGF (Platelet Derived Griwth Factor) , VEGF ( Vascular Endothelial Growth Factor ), TGF-β ( Transforming Growth Factor Beta ) FGF ( Fibroblast Growth Factor ), Osx ( Osterix ), RUNX-2 ( Runt Related Transcription Factor -2 ) dan ALP ( Alkali Phosphatase ) yang dapat mempengaruhi proses migrasi fibroblast dan proses osteogenesis pada proses penyembuhan ulang. Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap ekspresi PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP ditingkat DNA dan Protein kultur sel human gingiva fibroblast sebagai strategi potensial untuk mempercepat penyembuhan tulang. Dari penelitian ini dapat dilanjutkan dengan membuat gel ekstrak kulit buah manggis yang diaplikasikan kepada soket pasca pencabutan gigi untuk mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi infeksi. 8
Proses penyembuhan luka setelah pemberian ekstrak kulit buah manggis melibatkan banyak faktor, salah satunya adalah peningkatan jumlah Osteoblast dan proses Osteogenesis. Osteogenesis merupakan proses perkembangan yang melibatkan pembentukan fibrocartilago dan aktivitas osteogenik dari sel tulang utama ( Solomon et al, 2010 ). Proses osteogenesis terdiri dari 5 fase, yaitu fase hematoma, fase inlamasi dan proliferasi seluler, pembentukan callus, konsolidasi, remodeling (Shapiro, 2008) Ada berbagai macam marker osteogenesis yaitu Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP yang dapat mempengaruhi proses osteogenesis pada proses penyembuhan tulang. Dan selain itu ada berbagai macam marker inflamasi yaitu IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP yang berperan dalam proses inflamasi. Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap ekspresi Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP serta marker inflamasi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP pada media Osteoblastic Cell Line MC3T3-E1 sebagai strategi potensial untuk menghambat resorpsi tulang pada proses inflamasi post ekstraksi gigi. Dari penelitian ini dapat dilanjutkan dengan membuat gel ekstrak kulit buah manggis yang diaplikasikan kepada soket pasca pencabutan gigi untuk mempercepat penyembuhan luka, dan menghambat proses resorpsi tulang.
1.2
Rumusan Masalah
a. Apakah aplikasi ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi PDGF, FGF, VEGF, TGF-β secara seluler dan wound healing assay pada human gingiva fibroblast? b. Apakah aplikasi ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP serta menurunkan marker inflamasi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP yang dievaluasi dengan realtime PCR dengan media Osteoblastic cell line MC3T3-E1?
1.3
Tujuan Penelitian a. Mengetahui dosis optimal ekstrak kulit buah manggis pada kultur sel human gingiva fibroblast.
9
b. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat mempercepat wound healing assay pada kultur sel human gingiva fibroblast c. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi RNA dan protein PDGF-B pada kultur sel human gingiva fibroblast. d. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi RNA dan protein FGF-2 pada kultur sel human gingiva fibroblast. e. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi RNA dan protein VEGF-A pada kultur sel human gingiva fibroblast. f. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan ekspresi RNA dan protein TGF-β1 pada kultur sel human gingiva fibroblast. g. Mengetahui dosis optimal ekstrak kulit buah manggis pada Osteoblastic cell line MC3T3-E1 h. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat meningkatkan Ekspresi gen Osterix, ALP, RUNX2, COL1α, dan BSP pada Osteoblastic cell line MC3T3-E1 i. Membuktikan bahwa ekstrak kulit buah manggis dapat menurunkan IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP pada Osteoblastic cell line MC3T3-E1
1.4
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah : 1. Sebagai
model
penyembuhan
luka
untuk
memperbaiki
atau
mempercepat proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi melalui migrasi fibroblast, proses jalur pencegahan keradangan dan aktivasi proses angiogenesis. 2. Meningkatkan efektifitas pendayagunaan ekstrak kulit buah manggis sebagai bio-produk yang baik sebagai bahan alternatif untuk mempercepat
penyembuhan
luka
pasca
mengurangi terjadi resiko terjadi infeksi.
10
pencabutan
gigi
dan
3. Sebagai
model
penyembuhan
luka
untuk
memperbaiki
atau
mempercepat proses penyembuhan luka pasca pencabutan gigi melalui proses jalur pencegahan keradangan dan aktivasi proses osteogenesis. 4. Meningkatkan efektifitas pendayagunaan ekstrak kulit buah manggis sebagai bio-produk yang baik sebagai bahan alternatif untuk mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi terjadinya resorpsi tulang alveolar pasca pencabutan gigi.
1.5 No .
Rencana Target Capaian Tahunan Jenis Luaran
Indikator Capaian TS1)
TS+1
TS+2
TS+3
Internasional Nasional Terakreditasi
ada Tidak ada
ada
ada
ada
Draf
Submitted
Published
Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan
Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan Sudah dilaksanakan
Draf
Terdaftar
Terdaftar
Draf
Terdaftar
Terdaftar
Draf
Terdaftar
Terdaftar
Draf
Terdaftar
Terdaftar
1.
Publikasi ilmiah2)
Internasional
Draf
Terdaftar
2.
Pemakalah dalam temu ilmiah3)
Nasional
Draf
Terdaftar
Invited speaker dalam temu ilmiah4)
Internasional
Draf
Terdaftar
Nasional
Draf
Terdaftar
Internasional
Draf
Terdaftar
3.
4.
Visiting Lecturer5)
Merek dagang
Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada
Rahasia dagang
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Desain Produk Industri
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Indikasi Geografis
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Paten Paten sederhana Hak Cipta
5.
Hak Kekayaan Intelektual (HKI)6)
11
Perlindungan Varietas Tanaman Perlindungan Topografi Sirkuit Terpadu 6.
Teknologi Tepat Guna 7)
7.
Model/Purwarupa/Desain/Kary a seni/Rekayasa Sosial8)
8.
Buku Ajar (ISBN)9)
9.
Tingkat Kesiapan Teknologi (TKT)10)
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Draf
Produk
Penerapan
Tidak ada Tidak ada Tidak ada
Draf
Produk
Penerapan
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
1
2
3
4
12
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Penyembuhan Luka Penyembuhan luka merupakan suatu proses penggantian jaringan yang
mati/rusak dengan jaringan baru yang sehat oleh tubuh melalui proses regenerasi. Luka dikatakan sembuh apabila permukaannya dapat bersatu kembali dan didapatkan kekuatan jaringan yang mencapai optimal. Penyembuhan luka meliputi 2 kategori yaitu regenerasi dan reparasi. Regenerasi merupakan pemulihan jaringan seperti semula baik struktur maupun fungsinya. Reparasi merupakan pemulihan atau penggantian oleh jaringan ikat. Tahapan proses penyembuhan meliputi proses inflamasi, proliferasi, reepitelisasi, pembentukan jaringan granulasi, angiogenesis interaksi antara berbagai sel dan matriks, serta remodeling jaringan. Tujuan proses ini adalah untuk mengembalikan keadaan jaringan seperti semula (Cockbill, 2002). Suatu proses penyembuhan dimulai segera setelah terjadinya luka, akan tetapi mekanisme, kecepatan penyembuhan dan jaringan baru yang menyusun luka bergantung pada tipe dari luka tersebut (Cockbill, 2002). Proses penyembuhan dimulai setelah terjadi luka memiliki 3 tahap utama yaitu keradangan, perbaikan jaringan, dan maturasi jaringan. Beberapa menit setelah terjadi trauma pada jaringan, biasanya juga melibatkan pembuluh darah, terbentuknya gumpalan darah yang menutup daerah tersebut (Goepel, 1992). Tiga tahapan proses penyembuhan luka meliputi (Goepel, 1992): 1) Tahap Inflamasi (Inflamatory phase) Tahap inflamasi dari suatu proses penyembuhan luka secara klinis dapat dikarakteristikkan melalui tanda-tanda kardinal radang yaitu kemerahan (rubor), panas (kalor), ada pembesaran (tumor), terdapat rasa sakit (dolor), dan hilangnya fungsi (function laesa) (Jorge, 2006). Tahap keradangan berlangsung pada 72 jam pertama setelah terjadi luka. Berbagai sel termasuk sel darah putih dan sel radang segera menuju ke daerah luka untuk memulai proses pembersihan debris (Clark, 2001). Sel darah putih yaitu neutrofil akan menginvasi daerah tersebut. Neutrofil akan
13
menghancurkan semua debris dan bakteri yang ada pada daerah tersebut. Adanya neutrofil menandakan mulai terjadinya respon inflamasi yang ditandai dengan peningkatan aliran darah dan permeabilitas pembuluh darah, aktivasi reseptor nyeri, dan aktivitas neutrofil dan sel darah putih lain yang mengeliminasi debris dan bakteri. 48 jam setelah terbentuknya luka, sel makrofag akan menggantikan peran utama sel neutrofil dalam proses inflamasi. Makrofag berfungsi menghancurkan neutrofil yang mati dan eksudat lain yang ada pada daerah tersebut (Goepel, 1992). Sel-sel
makrofag
kemudian
memproduksi
senyawa
yang
menyebabkan fibroblast menggandakan diri, fibroblast merupakan sel yang berperan penting dalam memproduksi protein untuk memperbaiki jaringan, terutama kolagen (Clark, 2001). 2) Tahapan perbaikan jaringan (Proliferasi)
Perbaikan dan regenerasi jaringan bergantung pada tiga faktor utama yaitu: eliminasi debris, regenerasi sel-sel endotelial dan produksi fibroblas yang menyusun jaringan penghubung di seluruh tubuh dan sebagai dasar dari jaringan parut (Clark, 2001). Fibroblas dan sel endotel merupakan sel utama yang berperan penting dalam tahap proliferasi pada proses penyembuhan luka. Fibroblas mulai muncul ketika terjadi penurunan jumlah neutrofil dan terjadi peningkatan jumlah makrofag. Fibroblas berimigrasi dari jaringan sekitar ke daerah luka dimulai 72 jam setelah terjadi luka dan menggandakan diri oleh karena respon cytokines dan growth factors yang dilepas pada tahap awal proses penyembuhan luka (Ibelgaufts, 2002). 3) Tahap maturasi jaringan (Remodelling) Remodeling / fase maturasi dapat berlangsung selama beberapa tahun dan melibatkan keseimbangan antar degradasi dan pembentukan matriks. Kebutuhan metabolik penyembuhan luka mengalami penurunan, sehingga jaringan kapiler mulai berkurang. Matriks kolagen yang dipengaruhi oleh sitokin dan faktor pertumbuhan terus terdegradasi, resintesis, reorganisasi, dan distabilkan oleh ikatan silang (cross-link). Fibroblas mulai menghilang
14
secara bertahap. Tensile strength dari jaringan parut bertahap meningkat dan akhirnya mendekati sekitar 80% dari kekuatan aslinya. Homeostasis kolagen dan Extra Cellular Matrix (ECM) diatur oleh serine proteases dan matrix metalloproteinases (MMPs). Inhibitor jaringan dari MMPs mengontrol aktvitas proteolitik dalam jaringan parut.
Setiap gangguan dapat
menyebabkan degradasi matriks yang berlebihan sehingga menghasilkan bekas luka (Shetty & Bertolami 2004, p.5-6). 2.2
Penyembuhan Luka Pasca Ekstraksi Gigi Penyembuhan
soket
setelah
ekstraksi
gigi
merupakan
contoh
penyembuhan dengan second intention. Segera setelah pencabutan gigi dari soket, darah mengisi soket. Bekuan dimulai dalam 24 sampai 48 jam dengan pembengkakan dan pelebaran pembuluh darah di dalam sisa-sisa ligamen periodontal, diikuti oleh migrasi leukosit dan pembentukan lapisan fibrin. Pada minggu pertama bekuan membentuk kerangka (scaffold) sementara dimana sel-sel inflamasi bermigrasi. Epitel di pinggiran luka tumbuh di atas permukaan bekuan. Osteoklas yang ada di sepanjang puncak tulang alveolar mulai aktif meresorpsi. Angiogenesis berlangsung di sisa-sisa ligamen periodontal. Pada minggu kedua bekuan terus terorganisir melalui fibroplasia dan angiogenesis yang mulai menembus ke tengah bekuan darah. Pada minggu ketiga soket diisi dengan jaringan granulasi dan tulang yang sedikit terkalsifikasi. Permukaan luka sudah mengalami re-epitelisasi dengan pembentukan jaringan parut yang minimal atau tanpa pembentukan jaringan parut. Remodeling tulang aktif. Berdasarkan hasil radiografi, pembentukan tulang mulai tampak nyata pada minggu keenam sampai minggu kedelapan setelah pencabutan gigi (Shetty & Bertolami 2004, pp.7-8).
2.3
Angiogenesis Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru yang terjadi
secara alami didalam tubuh, baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Proses angiogenesis terdiri dari beberapa tahapan yang dimulai dari proses inisiasi, yaitu dilepaskannya enzim protease dari sel endotel yang teraktivasi, pembentukan
15
pembuluh darah vaskular, antara lain terjadinya degradasi matriks ekstraseluler (Extra Cellular Matrix, ECM), migrasi dan proliferasi sel endotel, serta pembentukan ECM baru yang kemudian dilanjutkan dengan maturasi atau stabilisasi pembuluh darah yang terkontrol dan dimodulasi untuk memenuhi kebutuhan jaringan (Plank, 2004). Tahapan-tahapan angiogenesis dapat dijelaskan sebagai berikut: a)
Pelepasan faktor stimulus angiogenik Kumpulan sel pada jaringan yang mengalami kerusakan atau mengalami
hipoksia, akan melepaskan faktor angiogenik berupa faktor pertumbuhan dan protein rantai pendek lainnya, yang dapat berdifusi ke sel-sel pada jaringan sekitarnya kemudian disusul dengan terjadinya proses inflamasi. Pada proses inflamasi, pembuluh darah kecil yang terdapat secara lokal sel endotel akan berinteraksi dengan faktor peradangan dan angiogenik. Faktor-faktor angiogenik ini dapat menarik dan mendorong proliferasi sel endotel dan sel radang. Menjelang proses migrasi, sel-sel radang juga mensekresi molekul yang juga berperan sebagai stimulus angiogenik (Carmeliet, 2000). b)
Pelepasan enzim protease dari sel endotel yang teraktivasi Faktor angiogenik berupa growth factor kemudian berikatan dengan
reseptor spesifik yang terdapat pada reseptor sel endotel (EC) di sekitar lokasi pembuluh darah lama. Ketika faktor angiogenik berikatan dengan reseptornya, sel endotel akan teraktivasi dan menghasilkan signal yang kemudian dikirim dari permukaan sel ke nukleus. Organel-organel sel endotel kemudian mulai memproduksi molekul baru antara lain adalah enzim protease yang berperan penting dalam degradasi matriks ekstraseluler untuk mengakomodasi percabngan pembuluh darah (Lieken et al, 2008). c)
Disosiasi sel endotel dan degradasi ECM yang melapisis pembuluh darah lama. Disosiasi sel endotel dari sel-sel sekitarnya, distimulasi oleh faktor
pertumbuhan angiopoietin serta aktivitas enzim yang dihasilkan oleh sel endotel yang teraktivasi, seperti urokinase-plasminogen activator (uPA) dan matrix metalloproteinases (MMPs), dibutuhkan untuk menginisiasi terbentuknya pembuluh darah baru (Polverini, 2002). Pada sistem enzimatik tersebut, sel
16
endotel dari pembuluh darah lama akan mendegradasi ECM dan menginvasi stroma dari jaringan disekitarnya sehingga sel endotel yang terlepas dari ECM ini akan sangat responsif terhadap signal angiogenik (Frisca dkk, 2009). d)
Migrasi dan proliferasi sel endotel Degradasi proteolitik dari ECM segera diikuti dengan migrasinya sel
endotel ke matriks yang terdegradasi. Proses tersebut kemudian diikuti dengan proliferasi sel endotel yang distimulasi oleh faktor angiogenik, yang beberapa di antaranya dilepaskan dari hasil degradasi ECM, seperti fragmen peptide, fibrin atau asam hialuronik (Kleinsmith et al, 2008). e)
Pembentukan lumen dan pembuatan ECM baru Sel endotel yang bermigrasi tersebut kemudian mengalami elongasi dan
saling mensejajarkan diri dengan sel endotel lain untuk membuat struktur percabangan pembuluh darah yang kuat. Proliferasi sel endotel meningkat sepanjang
percabangan vaskular. Lumen kemudian terbentuk dengan
pembengkokan dari sel endotel. Pada tahap ini kontak antar sel endotel mutlak dibutuhkan (Frisca dkk, 2009). f)
Fusi pembuluh darah baru dan inisiasi aliran darah Struktur pembuluh darah yang terhubung satu sama lain akan membentuk
rangkaian pembuluh darah untuk memediasi terjadinya sirkulasi darah. Pada tahap akhir, pembentukan struktur pembuluh darah baru akan distabilkan oleh sel mural (sel otot polos dan pericytes) sebagai jaringan penyangga dari pembuluh darah yang baru terbentuk. Tanpa adanya sel mural, struktur dan jaringan antar pembuluh darah sangat rentan dan mudah rusak (Frisca dkk, 2009).
2.4
Vascular Endothelial Growth Factor - A (VEGF-A) VEGF merupakan glikoprotein pengikat heparin yang disekresi dalam
bentuk homodimer. Salah satu fungsi VEGF yang pertama kali diketahui adalah memediasi peningkatan permeabilitas pembuluh darah pada mikrovaskular tumor. Oleh karena itu VEGF disebut juga Vascular Permeability Factor (VPF) (Berman dkk, 2000). Dalam keadaan normal, VEGF diekspresikan dalam kadar yang bervariasi oleh berbagai jaringan, termasuk diantaranya otak, ginjal, hati, dan limpa.
17
Tekanan oksigen dapat berfungsi sebagai regulator VEGF. Paparan kondisi hipoksia menginduksi ekspresi VEGF dengan cepat. Sebaliknya, dalam kondisi kadar oksigen normal, ekspresi VEGF menurun dan mengalami stabilisasi. Tingkat ekspresi VEGF juga bergantung pada jumlah sitokin inflamatori dan hormon pertumbuhan, termasuk diantaranya Epidermal Growth Factor (EGF), Interleukin-1β (IL-1β), plateled derived growth factor (PDGF), Tumor Necrosis Factor (TNF-α), dan transforming growth factor (TGF- β1) (Goepel. 1992). VEGF beraksi sebagai mitogen yang terbatas pada sel endotel vaskular dan terlibat dalam banyak tahap respon angiogenik, antara lain menstimulasi degradasi matriks ekstraseluler disekitar sel endotel, meningkatkan proliferasi dan migrasi sel endotel, membantu pembentukan struktur pembuluh darah.
2.5
Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) Fibroblast Growth Factor-2 (FGF) merupakan faktor angiogenik yang
juga dapat membentuk kompleks dengan heparin. Kompleks heparin-FGF membentuk suatu struktur yang tahan terhadap panas dan protease. Ikatan dengan heparin juga menyababkan terjadinya bentuk dimer dan oligomer dari FGF, yang akan meningkatkan efisiensi aktivitas sel menyusul terjadinya ikatan antar FGF dengan reseptornya (Frisca dkk, 2009). FGFs sebetulnya merupakan sebuah keluarga yang terdiri dari 28 anggota. FGF ditemukan pada kelenjar pituitari, otak, hipotalamus, mata, kartilago, tulang, corpus luteum, ginjal, plasenta, makrofag, kondrosarkoma, dan sel hepatoma. Dua struktur primer asam amino dari FGF ditemukan pada tahun 1985, antara lain acid FGF atau a-FGF (tersusun dari 140 asam amino) dan basic FGF atau b-FGF (tersusun dari 146 asam amino). a-FGF merupakan hasil faksinasi FGF pada kondisi pH asam, sedangkan b-FGF merupakan hasil faksinasi FGF pada kondisi basa. Dalam kondisi normal, a-FGF dan b-FGF terdapat dalam bentuk monomer. Kedua protein ini memiliki homologi asam amino yang cukup tinggi (53%). Meskipun a-FGF dan b-FGF memiliki reseptor yang sama (FGFR-1 sampai FGFR-4) namun keduanya memiliki tingkat afinitas yang berbeda. Afinitas a-FGF dalam pengikatan terhadap reseptornya (FGFR1-4)
18
lebih tinggi dibandingkan b-FGF. a-FGF banyak terdapat pada otak dan retina dan diketahui berperan dalam menjaga kondisi fisik tubuh, termasuk diantaranya menjaga homeostasis tubuh seperti pertumbuhan pembuluh darah menjelang regenarsi jaringan dan penyembuhan luka. Sedangkan b-FGF berperan dalam pembentukan tumor, memediasi proses angiogenesis dan juga penyambuhan luka (Frisca dkk, 2009). Spesifitas a-FGF dan b-FGF cukup luas pada sejumlah sel target, termasuk diantaranya adalah sel endotel dan sel otot polos, fibroblas dan sel epitel. Diketahui bahwa faktor angiogenik ini tidak hanya menstimulasi proliferasi sel endotel secara in vitro (pada konsentrasi 1 sampai 10 mg/ml) namun juga pada proses angiogenik in vivo. Diantaranya adalah pertumbuhan pembuluh darah baru pada proses penyembuhan luka dengan meningkatkan proses reendotelialisasi pada pembuluh darah yang mengalami kehilangan atau kerusakan sel endotel dan pembentukan pembuluh darah pada vaskularisasi jantung (Frisca dkk, 2009).
2.6
Fibroblas Fibroblas adalah sel dominan pada jaringan ikat. Sel ini bertanggung
jawab untuk pembentukan dan pemeliharaan komponen berserat dan substansi dasar jaringan ikat. Fibroblas biasanya dikenali dengan ciri khas hubungan sel ini dengan kumpulan serat kolagen. Sel fibroblas dalam kondisi tidak aktif adalah sel memanjang dengan sedikit sitoplasma dan gelap, inti pipih mengandung kromatin kental. Fibroblas aktif memiliki bentuk oval, nukleus dan sejumlah besar sitoplasma berwarna lebih pucat. Tingkat kapasitas sintetis dan sekresi fibroblas ini dibuktikan dengan jumlah retikulum endoplasma yang kasar, butiran sekresi, dan mitokondria, dan sejauh mana kompleks Golgi di sitoplasma (Nanci, 2013). Sel paling dominan yang ditemukan pada jaringan ikat adalah sel fibroblas. Fibroblas yang penting dalam proses perkembangan, struktur dan fungsi gigi. Fungsi utama dari fibroblas adalah pembentukan serat ekstraseluler pada jaringan ikat. Serat yang dibentuk adalah kolagen, elastis, dan oxytalan. Selain ini, fibroblas melakukan berbagai fungsi lainnya (Chandra et al, 2010).
19
Fibroblas merupakan sasaran dari banyak golongan protein yang disebut growth factors yang mempengaruhi pertumbuhan sel dan diferensiasi. Pada orang dewasa, jaringan ikat fibroblas jarang melakukan pembelahan sel. Namun, fibroblas akan bermitosis dan melanjutkan siklus sel ketika jaringan membutuhkan fibroblas tambahan yang dirangsang oleh growth factors yang dilepaskan secara lokal misalnya, untuk memperbaiki organ yang rusak. Fibroblas yang terlibat dalam penyembuhan luka kadang-kadang disebut myofibroblasts (Junqueira & Mescher, 2013). Migrasi fibroblas ke daerah yang cedera didorong oleh chemokines, TNF, PDGF, TGF-b, dan FGF. Proliferasi fibroblas selanjutnya juga dipicu oleh beberapa growth factor, termasuk PDGF, EGF, TGF-b, FGF, dan sitokin IL-1 dan TNF. Makrofag adalah sumber utama untuk zat-zat faktor ini, meskipun sel inflamasi lain dan trombosit juga dapat menghasilkan zat – zat tersebut (Kumar et al, 2010). Fibroblas yang pertama yang masuk ke daerah luka mengandung aktin melimpah, myosin dan memiliki sifat kontraktil, sehingga sering disebut contractile fibroblasts atau myofibroblasts. Sel-sel ini menyambung satu sama lain dan dengan fibril jaringan ikat. Dan ketika berkontraksi, myofibroblasts dapat menarik tepi luka bersama-sama, sehingga mengurangi luas permukaan dan memudahkan penyembuhan (Nanci, 2012).
2.7
Platelet-derived growth factor - B ( PDGF-B ) Platelet-derived growth factor (PDGF-B) in vitro merangsang sintesis
DNA dan kemotaksis fibroblas dan sel-sel otot polos dan merangsang kolagen, glikosaminoglikan, dan produksi kolagenase oleh fibroblas. Sifat-sifat in vitro menunjukkan bahwa PDGF-B diantarkan oleh trombosit ke cedera in vivo yang mungkin memainkan peran penting dalam inisiasi proses perbaikan luka. Penambahan PDGF-B murni dapat mengakibatkan kenaikan yang signifikan dalam lebar jaringan dan lapisan epidermis. Penambahan PDGF-B dapat mengakibatkan peningkatan yang signifikan dalam tingkat protein dan sintesis DNA luka bekas operasi. Efek yang sama diperoleh ketika faktor pertumbuhan ILGF-1 ditambahkan dalam kombinasi dengan PDGF-B murni. Faktor
20
pertumbuhan insulin-seperti saya sendiri tidak menyebabkan perubahan morfologi yang signifikan. FGF yang dikombinasi dengan PDGF-B mengakibatkan penebalan hanya dari epidermis.
2.8
Transforming Growth Faktor – beta1 ( TGF-β1 ) Superfamili Transforming Growth Faktor (TGF-β1) Adalah salah satu
kelompok yang sitokin paling kompleks dengan efek luas pada banyak aspek pertumbuhan dan perkembangan. Isoform dari TGF-β1 dan anggota keluarga lainnya, misalnya Activins dan BMP, memiliki efek yang beragam di sejenis situasi fisiologis dan terlibat dalam proses penyembuhan luka. Manipulasi rasio TGF-β anggota superfamili, khususnya rasio TGFfil relatif TGFP3, mengurangi jaringan parut dan fibrosis. Manipulasi tersebut termasuk mengurangi tingkat TGFβ l / TGFβ-2 menggunakan antibody yang netral atau mencegah aktivasi dari TGF-β. Pada luka kronis atau gangguan penyembuhan luka dengan penambahan eksogen anggota superfamili TGF-β1 dapat mempercepat aspek dari proses penyembuhan. Kumar et al, 2010).
2.9 Protein penanda / marker pada proses inflamasi Inflamasi atau yang sering dikenal dengan istilah radang merupakan suatu kejadian normal dari tubuh yang berkaitan dengan sistem kekebalan tubuh. Inflamasi ini terjadi akibat sistem pertahan yang ada dalam tubuh sudah tidak mampu lagi melawan paparan benda asing dari tubuh (virus dan bakteri) secara biologis tempat tempat yang mendapatkan serangan dari luar tersebut akan terjadi inflamasi atau peradangan. Beberapa produk gen pro-inflamasi telah diidentifikasi memiliki peran
penting pada penekanan apoptosis, proliferasi, angiogenesis,
invasi, dan metastasis. Di antara produk gen tersebut adalah TNF alfa dan anggota superfamilinya, IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP (Paulo V, 2015).
21
Gambar 1. Jalur signal inflamasi ( Paulo V, 2015).
Jalur pro inflammatory signaling dipengaruhi oleh zinc. Mirip dengan pensinyalan TLR, jalur pensinyalan IL-1, dan TNF-R bertemu pada kompleks IκB kinase umum yang memfosforilasi protein penghambat NF-κB, menghasilkan pelepasan NF-κB dan translokasi ke nukleus. Seng mencegah pemisahan NF-κB dari protein penghambatnya, sehingga mencegah translokasi nuklir NF-κB dan menghambat peradangan selanjutnya. Seng juga menghambat aktivasi STAT3 yang dimediasi IL-6 ( Kent LW,1996)..
2.9.1 Interleukin-1 (IL-1) Merupakan mediator inflamasi yang berikatan dengan IL-8 yang berperan pada pada reseptor inflamasi pada pembentukan osteoblast pada proses osteogenesis (Germolec DR, 2010).
22
Gambar 2. Peran Interleukin-1 pada proses osteogenesis (Germolec DR, 2010).
2.9.2
Interleukin-6 (IL-6)
Merupakan mediator inflamasi yang berkembang pada hiperinsulinemia yang berperan dalam metabolisme karbohidrat dan lemak untuk meningkatkan lipolysis dengan menghambat lipase (LPL) (Kent LW,1996).
2.9.3
Interleukin-10 (IL-10)
Merupakan mediator inflamasi yang diproduksi oleh sel T-helper , limfosit, Blimfosit, monosit dan makrofag, dimana dapat menjadi anti inflamasi yang meregulasi system imun. 2.9.4
Tumor necrosis factor- alpha (TNF-α)
Merupakan mediator inflamasi yang memiliki autokrin, parakrin, dan akssi endokrin. Dimana sel adiposite memberikan peranan pentingdalam regulasi akumulasi lemak tubuh.
23
2.9.5 C-Reactive Protein (CRP) Merupakan marker protein pada fase akut inflamasi, terdiri dari level serum fibrinogen yang berhubungan dengan pembentukan fibrin, agregrasi platelet dan viskositas plasma. 2.10 Penanda / marker proses osteogenesis Metabolisme tulang juga dipengaruhi oleh beberapa protein dan faktor pertumbuhan, yang dilepaskan dari platelets, makrofag, dan fibroblast. Proteinprotein ini membantu tulang untuk membentuk vaskularisasi baru, menjadi padat, bergabung dan berfungsi secara mekanis. Protein ini juga menginduksi sel-sel dari mesenkimal seperti monosit dan fibroblast, untuk bermigrasi, berproliferasi dan berdifferensiasi di dalam tulang. Protein yang meningkatkan penyembuhan tulang meliputi BMP, insulin-like growth faktor, faktor pertumbuhan transformasi, faktor pertumbuhan yang diturunkan dari platelet dan faktor pertumbuhan dari fibroblast (Lauing et al. 2013). Protein yang cukup dikenal adalah BMP, derivat glikoprotein yang berasal dari matriks tulang. Bone Morphogenesis Proteins (BMP) menginduksi sel-sel mesenkimal untuk berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang. Meskipun biasanya hadir dalam beberapa saat di dalam tubuh, beberapa BMP telah disintesis menggunakan teknologi DNA rekombinan dan saat ini sedang menjalani uji klinik untuk menilai potensinya dalam penyembuhan tulang pada manusia. Protein-protein yang lain mempengaruhi penyembuhan tulang dengan cara yang berbeda. Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) mengatur angiogenesis, pembentukan tulang, sintesis
matriks
ekstraseluler.
Osteonectin,
fibronectin
dan
osteocalsin
berpengaruh pada perlekatan sel, memfasilitasi migrasi sel dan mengaktifkan sel. (Bellahcene, 2000). Osteoblas dan osteoklas terdapat pada permukaan tulang kompak dan tulang kanselus untuk membentuk dan menyerap tulang. Sel-sel progenitor multipoten di periosteum dapat berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang dan tulang rawan, yang penting ketika cedera terhadap tulang. Dua jenis sel utama langsung
24
bertanggung jawab untuk pemeliharaan massa tulang adalah osteoklas (penyerapan tulang) dan osteoblas (pembentuk tulang) (Sharaway, 2001)
Gambar 3. Proses remodelling tulang. (Lauing et al. 2013).
Pada remodelling tulang dimulai oleh perubahan muatan mekanis yang terdiri dari 4 langkah berturut-turut, yaitu aktivasi, resorpsi, pembalikan, dan pembentukan.
Aktivasib
osteoklas
dikendalikan
melalui
jalur
RANK/RANKL/OPG. Setelah deposisi tulang osteoblast dapat berdiferensiasi menjadi osteosit (osteositogenesis), beralih ke sel-sel yang melapisi tulang, atau memasuki apoptosis (Bellahcene, 2000). Sel ini diatur dalam bone remodelling units (BRU) atau basic multicellular units (BMU), yang mempertahankan aktivasi yang berkesinambungan dari osteoklas diikuti oleh osteoblas yaitu resorpsi diikuti pembentukan tulang. Osteoblas mensekresikan matriks organik unmineralized yaitu osteoid, yang sebagian besar terdiri dari kolagen tipe I, selain proteoglikan, glikoprotein, dan protein noncollagenous lainnya seperti osteocalcin (Lauing et al. 2013).
25
Gambar 4. Proses Osteogenesis (Kalfas, Iain 2001).
Pada proses sel progenitor (MSC) berpotensi proliferasi dan diferensiasi menjadi osteosit, termasuk garis keturunan osteogenik dan adipogenik berdasarkan stimulasi dengan pertumbuhan yang berbeda dan isyarat diferensiasi. Diferensiasi garis keturunan spesifik adalah proses multi tahap dan terkoordinasi dengan baik yang diatur oleh master regulator, seperti PPARγ dan EBPβ untuk adipogenesis dan Runx2 dan osterix untuk osteogenesis. Diferensiasi osteogenik dapat dipentaskan dengan mengukur alkaline phosphatase (penanda awal) dan osteocalcin dan osteopontin (penanda akhir) (Lauing et al, 2013). 2.10.1 Bone Sialoprotein (BSP) Ekspresi gen BSP, yang diinduksi dalam osteoblas yang baru terbentuk, diatur oleh hormon dan sitokin yang meningkatkan pembentukan tulang dan diatur oleh faktor-faktor yang menekan pembentukan tulang. Dengan demikian, BSP memiliki sifat biofisik dan kimia dari nukleator, dan ekspresi temporospasialnya bertepatan dengan mineralisasi de novo di tulang dan sementum. Namun, kemampuan BSP untuk memediasi perlekatan sel dan memberi sinyal melalui titik motif RGD untuk fungsi alternatif untuk BSP yang perlu diselidiki lebih lanjut. Dalam kombinasi, sekuens asam poliglutamat pengikat hidroksiapatit dan RGD memberikan entitas bi-fungsional yang melaluinya BSP dapat menengahi penargetan dan perlekatan sel normal dan metastasis pada permukaan tulang. Bone Sialoprotein (BSP) adalah glikoprotein asam, terfosforilasi yang disintesis oleh osteoblas dan sel-sel yang menyerupai osteoklastik dalam kultur. Ini memiliki massa tanpa glukosilasi 33 kDa (glikosilasi, 70-80 kDa). Meskipun 26
fungsi BSP masih belum sepenuhnya dipahami, BSP merangsang pembentukan hidroksiapatit in vitro dan tampaknya memediasi interaksi sel-sel melalui situs pengikatan integrin. BSP relatif terbatas pada tulang tetapi juga diekspresikan oleh trofoblas dan sangat diregulasi oleh banyak tumor ganas (mis. Kanker payudara dan prostat). Baru-baru ini, telah disarankan bahwa BSP dapat berperan dalam angiogenesis yang terkait dengan pembentukan tulang, pertumbuhan tumor, dan metastasis (Bellahcene, 2000). Sejumlah kecil BSP ditemukan dalam sirkulasi dan dengan demikian merupakan penanda potensial pergantian tulang (Shaarawy, 2001). Kadar BSP serum dilaporkan meningkat pada penyakit tulang ganas (Diel, 1999; Woitge, 2001) dan osteoporosis pascamenopause, dan menurun dengan pengobatan antiresorptif (Seibel, 1996; Shaarawy, 2001). BSP stabil pada −80 ° C tetapi sedikit yang diketahui tentang kinetika dan metabolisme BSP dalam serum. Penanda dapat berguna dalam deteksi dini metastasis tulang dan gangguan tulang lainnya, dan pengujian baru dan lebih baik untuk imunoreaktif BSP saat ini sedang dikembangkan ( Seibel M.J, 1996). Osteoblas yang telah dewasa/matang secara metabolik aktif merupakan bone forming cells. Osteoblas mensekresikan osteoid yang merupakan unmineralized organic matrix yang kemudian mengalami proses mineralisasi yang menyebabkan tulang menjadi keras dan kaku. Sebagian dari osteoblas berubah menjadi osteosit, sedangkan sebagian lainnya tetap berada di permukaan periosteum dan endosteum (Kalfas, Iain 2001). 2.10.2 Alkali Phosphatase (ALP) Alkali fosfatase (ALP) adalah grup enzim yang dihasilkan oleh hepar, tulang, usus, plasenta, dan ginjal (tubulus proksimal). ALP akan meningkat dalam plasma pada keadaan obstruksi saluran empedu, kolestatik intrahepatik, sirosis hepatis, fatty liver, tumor hepar, metastase hepar, hepatitis, dan intoksikasi obat (Sherlock, 1979). Alkaline phosphatase (ALP) merupakan enzim yang banyak ditemukan di hepar (isoenzim ALP-1) dan tulang (isoenzim ALP-2), serta sedikit diproduksi oleh sel-sel pada saluran pencernaan, plasenta, dan ginjal. ALP sering 27
digunakan untuk mendeteksi penyakit yang berhubungan dengan organ-organ tersebut. Kadar ALP dalam darah sangat bervariasi tergantung dari jenis kelamin, usia, kehamilan, morfometrik tubuh, serta obat-obatan. Peningkatan kadar ALP dapat terjadi antara lain karena : 1. Obat-obatan seperti glukokortikoid dan antikonvulsan. 2. Pengaruh usia. Kadar ALP tertinggi terdapat pada bayi yang baru lahir, pada usia 10-11 tahun untuk anak perempuan dan 13-14 tahun untuk anak laki-laki. 3. Penyakit-penyakit seperti gangguan hepatobilier, hyperadrenocorticism, dan peningkatan aktivitas osteoblas. 2.10.3 Run-related transcription factor 2 (RUNX2) Protein runx2 pertama kali terdeteksi pada preosteoblas, dan ekspresi diregulasi dalam osteoblas imatur, tetapi diturunkan regulasi pada osteoblas dewasa. Runx2 adalah faktor transkripsi pertama yang diperlukan untuk penentuan garis turunan osteoblast. Runx2 menginduksi diferensiasi sel mesenkimal multipoten menjadi osteoblas yang belum matang, mengarahkan pembentukan tulang yang belum matang, tetapi Runx2 menghambat pematangan osteoblas dan pembentukan tulang yang matang. Biasanya, tingkat protein Runx2 dalam osteoblas berkurang selama perkembangan tulang, dan osteoblas memperoleh fenotipe matang, yang diperlukan untuk pembentukan tulang matang. Lebih jauh, Runx2 memicu ekspresi gen matriks tulang utama selama tahap awal diferensiasi osteoblas, tetapi Runx2 tidak penting untuk pemeliharaan ekspresi gen ini dalam osteoblas dewasa (Bruderer M, et al, 2014). Mekanisme yang bertanggung jawab atas regulasi gen Runx2 sendiri baru saja mulai dipahami. Sebelumnya diasumsikan bahwa Runx2 mengatur gen osteogenik dimediasi semata-mata oleh kadar protein Runx2, dan karenanya kadar mRNA. Asumsi ini didasarkan pada data yang dikumpulkan dari model nonmanusia (biasanya tikus). Studi terbaru miliki menunjukkan bahwa kadar Runx2
28
selama in vitro diferensiasi osteoblas manusia primer tidak menunjukkan perubahan besar, sedangkan kadar gen hilir seperti sialoprotein tulang dan alkaline phosphatase meningkat secara dramatis. Data menunjukkan itu Level runx2 mRNA diekspresikan secara konstitutif, dengan kurangnya korelasi antara Runx2 mRNA / tingkat protein dan perolehan fenotip osteoblas (Kirkham GR and Cartmell SH, 2007). 2.10.4 Collagen 1 Alpha 1 (Coll11) Gen Coll11 memberikan instruksi untuk membuat bagian dari molekul besar yang disebut kolagen tipe I. Kolagen adalah keluarga protein yang memperkuat dan mendukung banyak jaringan dalam tubuh, termasuk tulang rawan, tulang, tendon, kulit, dan bagian putih mata (sklera). Kolagen tipe I adalah bentuk kolagen paling melimpah di tubuh manusia. Komponen kolagen tipe I yang disebut rantai pro-α1 (I) diproduksi dari gen Coll11. Kolagen dimulai sebagai molekul prokolagen seperti tali yang masing-masing terdiri dari tiga rantai. Kolagen tipe I terdiri dari dua rantai pro-α1 (I) dan satu rantai pro-α2 (I) (yang dihasilkan dari gen Coll12). Molekul prokolagen tiga-untai diproses oleh enzim di luar sel untuk membuat kolagen dewasa. Molekul-molekul kolagen kemudian mengatur diri mereka sendiri menjadi fibril-fibril panjang dan tipis yang membentuk interaksi stabil (ikatan silang) satu sama lain dalam ruang-ruang di antara sel-sel. Cross-link menghasilkan pembentukan serat kolagen tipe I yang sangat kuat (Gastelbondo,2018).
2.10.5 OSTERIX (OSX) Osterix(OSX) adalah factor transkripsi yang mengandung zinc finger yang penting untuk diferensiasi osteoblast dan pembentukan tulang, terutama di ekspresikan pada semua tulang dalam masa perkembangan. Jika tidak ada osterix maka tidak ada tulang kortikal dan trabekula yang terbentuk melalui intramembran atau osifikasi endochondral. Selama pembentukan tulang endochondral yang normal, degradasi matriks tulang rawan yang termineralisasi oleh osteoclast dan deposisi dari matriks tulang terjadi dengan koordinasi ketat. Pada kondisi tidak ada OSX, sel mesenkim dari periosteum dengan pembuluh
29
darah menginvasi matriks mineral dari daerah kondrosit yang mengalami hipertrofi. Sel mesenkimal yang bermigrasi dengan osteoclast dan pembuluh darah tidak dapat mendeposit matriks tulang, sehingga tidak terjadi penulangan pada matriks dengan mesenkim (Kazuhisa et al, 2012). Penelitian yang dilakukan oleh Ying Cao.,Et al.2008 menunjukan adanya down regulasi pada level transkripsional oleh OSX terhadap ekspresi dan produksi dari IL-1α, suatu sitokin yang menstimulasi pembentukan osteoklas dengan memproduksi RANKL oleh sel stromal sumsum tulang dan osteoblast. Sitokin seperti IL-1α, IL-6, IL-11, dan prostaglandin E2 menunjukan partisipasi dalam proses bone remodelling dengan menginduksi RANKL dan pembentukan osteoklas. Karena itu perubahan dari kadar sitokin ini dapat mempengaruhi bone lysis (Ying Cao et al, 2008) 2.11 Kulit Buah Manggis Manggis merupakan tanaman buah berupa pohon yang berasal dari hutan tropis yang teduh dikawasan Asia Tenggara, yaitu hutan belantara Malaysia atau Indonesia. Manggis memiliki nama latin Garcinia mangostana L dan termasuk ke dalam keluarga Clusiaceae. Buah manggis dikenal dengan sebutan Queen fruit atau ratunya buah. Hasil penampisan fitokimia ekstrak kulit buah manggis menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mengandung komponen kimia alkaloid, saponin,
tanin,
fenolik,
flavonoid,
triterpenoid,
steroid
dan
glikosida.
Dibandingkan dengan buah yang lainnya, kandungan antioksidan dalam kulit manggis juga jauh lebih tinggi. Kulit manggis pun dapat dipakai untuk kemoterapi dan untuk mengurangi dampak dari kemoterapi (Lih-Geeng et al, 2008). Komponen aktif utama dari buah manggis disebut xanthones. Xanthone adalah sejenis senyawa polifenol yang secara biologis aktif dan secara struktural mirip dengan bioflavanoids. Senyawa ini jarang terdapat di alam, paling banyak ditemukan hanya dalam dua keluarga tanaman. 200 jenis xanthones alami yang sejauh ini telah diidentifikasi. Sekitar 40 jenis diantaranya telah ditemukan dalam buah manggis. Xanthone dan turunannya telah terbukti memiliki beberapa manfaat, termasuk anti-inflamasi dan anti-alergi (Cui et al, 2010). Berdasarkan studi literatur penelitian Garcinia mangostana L mempunyai aktivitas anti
30
inflamasi adalah -mangosten dan -mangosten yang merupakan senyawa utama dari xanthone yang menghambat produksi enzim siklooksigenase(COX) yang merupakan penyebab radang (Jung dkk, 200. Beberapa uji pra-klinik pada hewan coba tikus menunjukkan zat aktif gamma mangostin (derivat xanthone) secara langsung menghambat aktivitas enzim Ikappa B kinase mencegah proses transkripsi gen COX-2 (gen target NF-kappaB), menurunkan produksi PGE2 dalam proses inflamasi (Middleton, 2000). Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa xanthone dalam ekstrak kulit manggis menghambat aktivitas ROS intraselular. Inhibisi aktivitas ROS intraselular akan menghambat aktivitas enzim yang mengaktifkan nuclear factor kappa B (NF-kB) untuk translokasi ke dalam nukleus dan meregulasi mediator pro-inflamasi seperti IL-1, IL-6, TNF-alpha (Ibrahim, 2014).
2.12 Methyl-Thiazol-Tetrazolium atau MTT Assay MTT assay merupakan alat yang berfungsi untuk melihat viabilitas sel. NAD(P)H MTT assay merupakan Methyl-Thiazol-Tetrazolium suatu metode 3(4,5-dimethylthiazol-2-il)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide.
Metode
ini
merupakan metode menggunakan uji enzimatik yang bertujuan untuk mengukur kemampuan sel hidup berdasarkan aktivitas mitokondria dari kultur sel. Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium oleh sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk Kristal formazan berbentuk Kristal formazan berbentuk Kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air. Penambahan reagen stopper bersifat detergenik akan melarutkan Kristal berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA Reader. Pengukuran menggunakan alat spectrophotometer menghasilkan data berupa angka-angka optical density. Angka optical density tersebut merupakan nilai dari kepekaan yang ditunjukkan dengan warna ungu pada kultur sel tersebut. Semakin pekat warna yang dihasilkan, maka semakin tinggi angka optical density nya. Intensitas warna ungu yang terbentuk merupakan gambaran proporsional dengan jumlah sel hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka diartikan bahwa jumlah sel hidup semakin banyak.
31
2.13 Wound Healing Assay Uji scratch assay secara in vitro adalah metode yang mudah, murah dan dikembangkan untuk mengukur migrasi sel secara in vitro. Langkah awal dengan membuat "goresan" dalam sel monolayer, mendokumentasikan gambar di awal scratch dan secara berkala selama migrasi sel untuk menutup goresan, dan membandingkan gambar untuk mengukur tingkat migrasi sel. Dibandingkan dengan metode lain, uji ini sangat sesuai untuk mempelajari tentang efek interaksi sel-matriks dan sel-sel pada migrasi sel, melihat pola migrasi sel selama penyembuhan luka secara in vivo dan kompatibel dengan pencitraan sel hidup selama migrasi secara intraselular. Selain memonitor migrasi populasi sel homogen, metode ini juga telah diadopsi untuk mengukur migrasi sel individual di tepi awal goresan. Uji ini biasanya menggunakan waktu yang beragam mulai dari beberapa jam setelah goresan sampai 24 jam.( Chi Liang et al,2007)
2.14 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metode PCR sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA spesifik. Metode PCR dapat melipatgandakan suatu fragmen DNA sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit. Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) Template DNA, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (25 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, (3) deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim DNA polymerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer (Yuwono, 2006). Reaksi melipatgandakan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi template DNA sehingga rantai DNA rantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (95oC) selama 1–2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55oC sehingga primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen
32
dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Suhu inkubasi kemudian dinaikkan menjadi 72oC selama 1,5 menit, pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerisasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada daerah cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk selajutnya akan 20 didenaturasi lagi dengan menaikan suhu inkubasi menjadi 95oC. Rantai DNA yang baru terbentuk selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerisasi berikut. Reaksi-reaksi diulang sampai 25–30 siklus. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung dari konsentrasi DNA target di dalam campuran reaksi, akan tetapi, pada umumnya konsentrasi DNA Taq polimerisasi terbatas setelah 25–30 siklus (Yuwono, 2006.; Sambrook et al., 1989).
2.15 Real-Time PCR Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) merupakan salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler modern. RT-PCR memiliki berbagai keunggulan untuk amplifikasi atau perbanyak DNA fragmen yang dapat diamati secara tepat untuk menentukan konsentrasi DNA yang terdapat dalam sampel (Higuchi, 1993). Prinsip proses amplifikasi menggunakan real-time PCR dengan cara mengukur peningkatan pewarna (dye) fluoresen yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Oleh karena sifat inilah pertumbuhan fragmen DNA hasil amplifikasi sapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluoresensi yang dihasilkan Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan pictogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluoresensi digambarkan
melalui kurva
amplifikasi yang menunjukkan 3 fasa yaitu fase awal, fase eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Hoongbao et al, 2016). Terdapat tiga komponen utama dalam instrument RT-PCR yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis data. Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak
33
sampel dalam waktu bersamaan menggunakan multiwell plates (Soong R et al, 2001).
2.16. Osteoblastic cell line MC3T3-E1 MC3T3-E1 mewakili garis sel osteoblast popular mewakili fenotip pra osteoblastik. Beberapa sub-klon telah dibentuk dari yang baru lahir ini garis sel klonal calvaria tikus. Terdapat 5 diantaranya subklon 4,8,11,14, dan 26. Sub-klon mineralisasi menyatakan tingkat tinggi mRNA untuk BSP, osteocalcin, dan reseptor PTH/ PTHrP. Dari klon-klon ini hanya sub-klon 4 dan 14 yang ditunjukkan untuk membuat mineral matriks ekstraseluler kolagen dan mirip dengan osteogenesis intramembran in vivo.
2.17 Lipopolisakarida (LPS) Lipopolisakarida merupakan memberan luar bakteri gram negative, yang terdiri dari kompossi endotoksin terdiri ata rantai polisakarida (Rantai O). Endotoksin bakteri gram negative mangikat larutan LPS-Binding protein atau membrane luar sel mononukleus. Pengaruh interaksi antara monosit, makrofag dan netrofil melepas mediator inflamasi seperti Interleukin (IL), Interferon (IF), Platelet activating factor (PAF) dan Tumor necrosis factor (Naqvi, 2015).
Gambar 5. Komponen Membran luar gram negative (LPS) (Naqvi, 2015).
Metabolit bakteri dan produk toksik dapat merusak jaringan dan merangsang terjadinya inflamasi, di antaranya lipopolisakarida endotoksin (LPS)
34
yang dikandung dinding sel bakteri gram negatif dan dikeluarkan ketika bakteri mati.8 Bakteri agresif penyebab periodontitis terutama adaMetabolit bakteri dan produk toksik dapat merusak jaringan dan merangsang terjadinya inflamasi, di antaranya lipopolisakarida endotoksin (LPS) yang dikandung dinding sel bakteri gram negatif dan dikeluarkan ketika bakteri mati. Bakteri agresif penyebab periodontitis terutama adalah Porphyromonas
gingivalis (P.
gingivalis).
P.gingivalis (viable atau konstituennya) teridentifikasi pada plak aterosklerotik manusialah Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). P.gingivalis (viable atau konstituennya) teridentifikasi pada plak aterosklerotik manusia (Harazy, 2000).
35
BAB III METODE PENELITIAN
3.1
Jenis Penelitian Jenis penelitian merupakan penelitian experimental laboratories.
3.2
Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang digunakan adalah post test only control group
design. 3.3
Sampel dan Besar Sampel
3.3.1
Jenis Sampel
Sampel penelitian menggunakan kultur sel human gingival fibroblast yang diperoleh dari laboratorium Tropical Disease Center Universitas Airlangga Surabaya dan Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 yang didapatkan dari Universitas Hiroshima Jepang 3.3.2
Besar Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposive sampling. Penentuan besar sampel penelitian ditentukan dengan menggunakan rumus Lemeshow: 2
2𝛿 2 (𝑍1−𝛼 + 𝑍1−𝛽 ) 𝑛= (𝜇1 − 𝜇2 )2
n:2
Keterangan: 𝑛
: banyaknya sampel tiap kelompok
𝛿
: standar deviasi kelompok kontrol
36
𝑍1−𝛼
: nilai pada distribusi normal standar yang sama denga tingkat kemaknaan (untuk = 0.05 adalah 1.64)
𝑍1−𝛽
: nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan power test sebesar yang diinginkan (untuk β= 0.10 adalah 1.282)
(𝜇1 − 𝜇2 )2 : beda rata-rata masing-masing kelompok
Dalam rumus ini diperoleh besar sampel minimal adalah 2. 3.4
Variabel Penelitian a.
Variabel Bebas Ekstrak kulit manggis
b. Variable Tergantung Ekspresi IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP Ekspresi Col1α, Osterix, Runx-2, Bsp dan ALP. Ekspresi PDGF, FGF, VEGF, TGF-β
c.
Variable Terkendali -
Kultur sel Human Gingiva Fibroblast
-
Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1
-
Kriteria sampel
-
Volume pemberian ekstrak kulit manggis
-
Tempat pemeliharaan kultur sel dalam kondisi yang sama
-
Lingkungan dengan temperature, suhu kamar (25o-27o C)
-
Pemeriksaan dengan menggunakan RT-PCR dan Realtime-PCR
37
3.5
Definisi operasional
3.5.1 Human gingival fibroblast Human gingival fibroblast (HGnF) adalah sel yang diisolasi dari human gingiva, di cryopreserved pada passage one dan dalam kondisi beku. Bebas dari HIV-1, HBV, HCV, mycoplasma, bakteri, yeast dan fungi. 3.5.2 Osteoblastic cells line MC3T3-E1 MC3T3-E1 Adalah sel precursor osteoblast yang berasal dari tulang Calvaria Mus Musculus ( Mouse C57BL/6 calvaria). Dengan medium MEM α + 2mM Glutamine + 10% Foetal Bovine Serum (FBS)
3.5.3 LPS Lipopolisaccharides ( LPS ) adalah komponen karakteristik dari dinding sel bakteri gram negative, terlokalisasi di lapisan luar membrane dan termasuk dalam golongan tidak berkapsul, terpapar pada permukaan sel. LPS berkontribusi pada integritas membrane luar, dan melindungi sel terhadap garam empedu dan antibiotic lipofilik.
3.5.4 Ekstrak Kulit manggis Ekstrak kulit manggis adalah ekstrak yang dibuat dengan 200gram serbuk kulit manggis (Garcinia mangostana L.) yang dibasahi dengan pelarut DMSO 0,1% dan dishacker selama 2x24 jam, disaring dengan 3x penyaringan menggunakan kain saring, dan di rotary evaporator dengan waktu 12 jam menjadi 40cc ekstrak.
38
3.5.5 Ekspresi marker penanda inflamasi 3.5.5.1 IL-1 Interleukin-1A Mouse Recombinant yang diproduksi di E.Coli adalah rantai Polipeptida tunggal, non-glikosilasi yang mengandung 156 asam amino dan memiliki massa molekul 17,9 kDa. IL-1A dimurnikan dengan teknik kromatografi eksklusif. Interleukin 1 alpha (IL1α) juga dikenal sebagai hematopoietin 1 adalah sitokin dari keluarga interleukin 1 yang pada manusia dikodekan oleh gen IL1A. IL1α diproduksi terutama oleh makrofag teraktivasi, serta neutrofil, sel epitel, dan sel endotel. Memiliki aktivitas metabolik, fisiologis, hematopoietik, dan memainkan salah satu peran sentral dalam pengaturan respons imun. Ia berikatan dengan reseptor interleukin-1 dan di jalur yang mengaktifkan tumor necrosis factor-alpha
3.5.5.2 IL-6 Interleukin-6 Mouse Recombinant yang diproduksi di E.Coli adalah rantai polipeptida nonglikosilasi tunggal yang mengandung 187 asam amino dan memiliki massa molekul 21709 Dalton. IL-6 dimurnikan dengan teknik kromatografi eksklusif. Interleukin-6 adalah sitokin proinflamasi yang kuat, utamanya diproduksi oleh sel T teraktivasi dan bermacam sel lainnya termasuk sel endotel dan makrofag. IL-6 mempengaruhi limfosit B dan T dan telah terbukti memiliki peran dalam pertahanan inang, reaksi fase akut, respon imun dan hematopoiesis.
3.5.5.3 IL-10 IL10 adalah sitokin yang diproduksi terutama oleh monosit dan pada tingkat lebih rendah oleh limfosit. Sitokin ini memiliki efek pleiotropik dalam imunoregulasi dan peradangan. Mendownregulasi ekspresi sitokin Th1, MHC kelas II Ags, dan molekul costimulatory pada makrofag. Ini juga meningkatkan kelangsungan hidup sel B, proliferasi, dan produksi antibodi. Sitokin ini dapat memblokir aktivitas NF-kappa B, dan terlibat dalam regulasi jalur pensinyalan JAK-STAT.
39
3.5.5.3 TNF α Tumor necrosis factor-α (TNF-α) adalah sitokin proinflamasi yang kuat yang memainkan peran sentral dalam aktivitas antitumor, modulasi imun, peradangan, anoreksia, cachexia, syok septik, replikasi virus, dan hematopoiesis. TNF-α diekspresikan oleh beragam sel, dengan banyak agen induktif dan supresif. Terutama, TNFα diproduksi oleh makrofag dalam menanggapi tantangan imunologis seperti bakteri (lipopolysaccharides), virus, parasit, mitogen dan sitokin lainnya
3.5.5.4 CRP C-Reactive Protein (CRP), juga dikenal sebagai Pentraxin 1, adalah protein pentamerik yang disekresikan yang berfungsi sebagai sensor dan aktivator untuk respon imun bawaan. Pada manusia, itu adalah protein fase akut utama; konsentrasinya yang beredar meningkat secara dramatis pada permulaan peradangan.
3.5.6
Ekspresi marker penanda osteogenesis
3.5.6.1 Osterix Osterix (Osx) adalah faktor transkripsi khusus osteoblas yang penting untuk diferensiasi osteoblas dan pembentukan tulang. Tikus knock-out Osx kekurangan tulang sepenuhnya. Satb2 sangat penting untuk diferensiasi osteoblas sebagai faktor transkripsi pengikatan kaya AT
3.5.6.2 Coll1α Kolagen tipe I bertanggung jawab untuk stabilitas mekanik, elastisitas, kekuatan dan ketangguhan, diamati pada tendon, ligamen, kulit, kornea, tulang, dentin dan banyak jaringan lainnya. Kolagen tipe 1 memiliki peran struktural dalam matriks ekstraseluler dengan memberikan dukungan mekanis dan ketahanan terhadap ketegangan. Beberapa
40
penyakit genetik yang lebih penting, secara langsung atau tidak langsung melibatkan jenis kolagen ini termasuk sebagian besar kasus osteogenesis. Kolagen tipe I berkontribusi maksimal pada kandungan protein berserat pada mamalia. Protein ini memiliki struktur silinder memanjang dengan ujung meruncing, memiliki heliks tangan kiri dengan tiga helai polipeptida tipe-poliproline II. 3.5.6.3Runx-2 Faktor transkripsi yang terlibat dalam diferensiasi osteoblastik dan morfogenesis kerangka. Penting untuk pematangan osteoblas dan osifikasi intramembran dan endokhondral. CBF berikatan dengan situs inti, 5'-PYGPYGGT-3 ', dari sejumlah peningkat dan promotor, termasuk virus leukemia murine, penambah poliamavirus, peningkat reseptor sel-T, osteocalcin, osteopontin, sialoprotein tulang, alfa 1 (I) kolagen , Promotor LCK, IL-3 dan GM-CSF. Menghambat aktivasi transkripsi tergantung KAT6B (Dengan kesamaan). Dalam osteoblas, mendukung aktivasi transkripsi: bersinergi dengan SPEN / MINT untuk meningkatkan aktivasi yang dimediasi FGFR2 dari elemen responsif FGF osteocalcin FGF (OCFRE) 3.5.6.4 BSP BSP (Bone Sialoprotein) adalah komponen dari jaringan mineral seperti tulang, dentin, sementum dan kartilago terkalsifikasi. BSP adalah komponen signifikan dari matriks ekstraseluler tulang dan telah disarankan untuk membentuk sekitar 8% dari semua protein non-kolagen yang ditemukan dalam tulang dan sementum. sebagian besar spesifik untuk jaringan mineral dan diekspresikan selama pembentukan awal tulang dan sementum.
41
3.5.6.5 ALP ALP (Alkaline phosphatase) adalah enzim yang ditemukan di beberapa jaringan di seluruh tubuh. Konsentrasi ALP tertinggi hadir dalam sel -sel yang terdiri dari tulang dan hati. Peningkatan kadar ALP dalam darah paling sering disebabkan oleh penyakit hati atau gangguan tulang. Tes ini mengukur tingkat ALP dalam darah. 3.6
Tahapan Penelitian
Ekstrak yang didapatkan dari proses ekstraksi kulit buah manggis jenis Garcinia mangostana dengan metode maserasi yang dilarutkan dalam larutan DMSO 0,1% (Poelongan & Praptiwi, 2010) 1.
Pemeliharaan kultur sel thowing human gingival fibroblast dilakukan mulai dari membangunkan sel (selama ± 2 minggu).
1. Sel thawing human gingival fibroblast dilakukan multiple scratch dan diinkubasi selama 24 jam 2.
Masing-masing sampel diberi ekstrak kulit manggis sebanyak 800 µg/ml pada kelompok treatment dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator 37ºC
3.
Setelah 24 jam maka setiap sampel dilakukan ekstraksi RNA dan protein.
4.
Dilakukan RT-PCR dengan primer PDGF, FGF, VEGF dan TGF-β.
5.
Dilakukan pemeriksaan western blotting dengan antibody PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP.
6.
Dilakukan Immunohistokimia pada tepi guratan wound healing assay dengan antibody PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP
7.
Dilakukan penelitian wound healing assay dan dilihat wound closure setiap 24 jam, 48 jam dan 72 jam.
42
8.
Hasil dari RT-PCR kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel elektroforesis dan dilihat dengan bantuan sinar ultraviolet untuk melihat katebalan dari band.
9.
Hasil dari immunohistokimia akan dihitung setiap sel yang memancarkan protein PDGF, FGF, VEGF, TGF-β, Osterix, Runx-2 dan ALP
Ekstrak yang didapatkan dari proses ekstraksi kulit buah manggis jenis Garcinia mangostana dengan metode maserasi yang dilarutkan dalam larutan DMSO 0,1% (Poelongan & Praptiwi, 2010) 1. kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan mulai dari membangunkan sel (selama ± 2 minggu) 2.
Kultur
sel
Osteoblastic
cells
line
MC3T3-E1
diberi
perlakuan
LPS
(Lipopolisakarida) sehingga terjadi respon inflamasi selama 24 jam. 3.
Masing-masing sampel diberi ekstrak kulit manggis sebanyak 800 µg/ml pada kelompok treatment dan diinkubasi selama 48 jam di dalam inkubator 37ºC
4.
Setelah 72 jam maka setiap sampel dilakukan ekstraksi RNA
5.
Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan RT-PCR dengan untuk melihat marker osteogenesis: Osterix, Col1α, Runx-2, Bsp dan ALP
6.
Kultur sel Osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan RT-PCR dengan untuk dmelihat marker inflamasi: IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, dan CRP.
7.
Dilakukan penelitian dengan waktu perlakuan pada sampel setiap 6 jam, 12 jam, 24 jam, 48 jam dan 72 jam.
8.
Hasil dari RT-PCR kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel elektroforesis dan dilihat dengan bantuan sinar ultraviolet untuk melihat katebalan dari band.
43
3.7
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada tahun 2019 mulai bulan Agustus sampai Desember, dengan rincian tempat penelitiannya, adalah: a.
Pembuatan ekstrak di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.
b.
Pemeliharaan, pemberian perlakuan serta analisis hasil pada kultur sel thowing human gingival fibroblast dilakukan di Tropical Disease Center Universitas Airlangga.
c.
Pemeliharaan, pemberian perlakuan serta analisis hasil pada kultur sel osteoblastic cells line MC3T3-E1 dilakukan di Hiroshima University Japan
3.8
Alat dan Bahan penelitian
3.8.1
Alat Penelitian a. PCR cycle (Gene Amp, PCR System 2400, Perkin Elmer) b. Spectrophotometer (UV-Visible Spectrophometer, Shimatzu) c. Electrophoresis d. Centrifuge (Himac SCR 20B, Hitachi) e. Ependorf micropipette White tips (0,5-10µl), yellow tips (10-100µl) dan blue tips (100-1000 µl) f. Tips Micropipet White, Yellow dan Blue g. Transluminator UV h. Kamera digital dengan resulusi 3,2 megapixel atau diatasnya i. Transsonic 310 (Elma) j. Spinator (Millipore) k. Tabung eppendorf 0,5cc dan 1,5cc l. Timbangan elektrik (Libror EB-3200B,Shimadzu) 44
3.8.2 Bahan Penelitian A. Bahan untuk ekstraksi RNA: a. DNAzol® Reagent (Organic method) b. larutan 100% ethanol
1 ml 0,5 ml
c. larutan 75% ethanol
0,8 – 1 ml
d. Distilled water (Sigma)
25 – 30 µl
B. Bahan untuk PCR: a. PCR Mix (12,5 µl) yang terdiri: dNTP (ATP, CTP, TTP, GTP), MgCl2 dan Taq Polimerase. b. DW sigma (Nuclease Free water) c. Primer forward dan Reverse PDGF ( 489 bp ) : Forward : 5’ –CTGGGCACGTGAGGGCAGCGTCT-3’ Reverse :5’ –TGCCGGAAGTCCATCCTCACAGTC-3’ FGF ( 453 bp ) : Forward : 5’ –CCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG-3’ Reverse :5’ –GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG-3’ VEGF ( 478 bp ) : Forward : 5’‐UGUAGCAGCCAGGGCCUAGAGAAGG‐3’ Reverse :5’‐TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ TGF-β ( 455 bp ) : Forward : 5’‐ACCACAGTCCATGCCATCAC‐3’ Reverse : 5’‐TGGAGGACCTGGTAGAGGAA‐3’
ALP ( 97 bp ) : 45
Forward : GGCTTCTTCTTGCTGGTGGAA Reverse : CCTGGTCCATCTCCACTGCT Coll1 α (137 bp): Forward : GCTTCTACCTCAGCCGCAT Reverse : TTTCACCACATCAGACACGCT
BSP (128 bp): Forward : TTTGGAGAGTCCAGAGCGAC Reverse : TAAAGGCCATTCCACCACCA
RUNX2 (168 bp): Forward : ATCCCCATCCATCCACTCCA Reverse : AGTTCTGAAGCACCTGCCTG
Osterix ( 131 bp) Forward : 5′-GCCTACTTACCCGTCTGACTTT-3′ Reverse : 5′-GCCCACTATTGCCAACTGC-3′
IL-1 ( 152 bp ) Forward : CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G Reverse : GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA IL-6 (141 bp ) Forward : CAG AAT TGC CAT CGT ACA ACT CTT TTC TCA Reverse : AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA IL-10 ( 190 bp ) Forward : GGT TGC CAA GCC TTA TCG GA Reverse : ACC TGC TCC ACT GCC TTG CT TNF α ( 155 bp ) Forward : GGGGCCACCACGCTCTTCTGTC Reverse : TGGGCTACGGGCTTGTCACTCG
46
CRP (440 ) Forward : TCGTATGCCACCAAGAGACAAGACA Reverse : AACACTTCGCCTTGCACTTCATACT
C. Bahan Elektroforesis a. 40% acrylamide:bis (19:1) b. TEMED c. TBE 0,5% d. Marker 100 bp e. Urea f. Bind silane (methacryloxypropyltrimethoxysilane) g. Distilled water (Sigma) h. 10% Amonium Persulfat (APS) i. Gel Slick® j. 0,5% asam asetat dalam 95% ethanol
3.9
Cara Kerja
3.9.1 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis Kulit buah manggis yang baru diambil dari pohonnya ditimbang sebanyak 2500 gram, dikuliti, ditinggal batangnya saja dan ditimbang lagi hingga 1000 gram. Kemudian diblender hingga halus dan ditimbang lagi hingga tinggal 850 gram. Ditambahkan aquadest steril sebanyak 150 cc, kemudian disaring menggunakan alat Bugner yang dihubungkan dengan Vacuum pump (Gast, USA) hingga tinggal 820 cc ekstrak kulit buah manggis. Dari hasil freeze dryed, bubuk ekstrak kulit buah manggis ditimbang kembali hingga tinggal 2.7 gram. Hasil dari freeze dryed kulit buah manggis diambil sebanyak 0.5
47
gram kemudian dihaluskan untuk digunakan dalam penelitian ini. Sedangkan sisanya disimpan di dalam botol dan ditutup menggunakan kertas perak (Farmakope, 1995).
3.9.2 Kultur sel 3.9.2.1 Human gingival Fibroblast Kultur sel Human Gingiva Fibroblast dibangunkan dari keadaan beku. Sel kemudian di kultur kedalam medium DMEM + 10% FBS + 1% Streptomycin dan di inkubasi kedalam inkubator 37ºC selama 1 bulan untuk mendapatkan hasil yang maksimal.
3.9.2.2 Osteoblastic clls line MC3T3-E1 Kultur sel Osteoblastic clls line MC3T3-E1 dibangunkan dari keadaan beku. Sel kemudian di kultur kedalam medium DMEM + 10% FBS + 1% Streptomycin dan di inkubasi kedalam inkubator 37ºC selama 1 bulan untuk mendapatkan hasil yang maksimal.
3.9.2.3 Pemberian Ekstrak Kulit Buah Manggis Pada Kultur sel Human gingival Fibroblast dan Osteoblastic cells line MC3T3-E1. Ekstrak kulit buah manggis sebanyak 600 µg/ml di campur dengan medium yang berisi sel Human gingival Fibroblast dan Osteoblastic cells line MC3T3-E1 pada 6 wells dish dan di inkubasi selama 24 jam didalam inkubator 37ºC.
3.10
Polymerase Chain Reaction ( PCR )
3.10.1
Ekstraksi RNA
1. Hasil irigasi ditambah 1 ml RNAzol® Reagent, keduanya dicampur dengan cara di-vortex, kemudian inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar. Selanjutnya di
48
centrifuge 10.000 rpm selama 10 menit temperatur 4 0C, diambil viscous supernatant dan dipindahkan tabung baru. 2. Pada tabung baru tersebut ditambahkan 0,5 ml 100% ethanol (absolute), di bolakbalik, di inkubasi pada suhu kamar selama 1-3 menit, centrifuge 4000 rpm selama 1-2 menit temperatur 40C. Supernatant dibuang dengan hati-hati agar RNA (pelet) tidak ikut terbuang. 3. Pelet dicuci dengan 0,8-1 ml 75% ethanol sebanyak 2 kali dan setiap kali pencucian tabung dibolak-balik sebanyak 3-6 kali. 4. Tabung diletakkan pada posisi tegak selama 0,5-1 menit, setelah itu ethanol 75% dibuang dengan cara pipeting atau decanting. Pelet dikeringkan dengan cara membiarkan tabung terbuka selama 5-15 detik. 5. Pelet yang berisi RNA tersebut dilarutkan dengan 25-30 µl DW, di-vortex secukupnya, kemudian di simpan pada suhu -20º C.
3.10.2 Pengukuran kadar dan kemurnian RNA Pengukuran kadar dan kemurnian RNA pada sampel penelitian yang sebelumnya telah diekstraksi RNAnya menggunakan UV-spectrophotometer. Kemurnian RNA ini diukur dengan nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai panjang gelombang 260 nm digunakan untuk pengukuran kuantitas atau kadar RNA dengan rumus berikut: Kadar RNA = (A260 x faktor pengenceran x 50) μg/mL Keterangan : A260: nilai absorbansi sampel RNA pada panjang gelombang 260 nm 50 (Konversi Spectrophotometer): Nilai satu dalam satuan absorbansi gelombang 260 nm sama dengan 50 µg/ml RNA. 49
Idealnya, nilai ratio (λ260 : λ280) yang didapatkan seharusnya berkisar antara 1.8 – 2.0 (RNA dikatakan murni atau kualitas RNA baik). Jika nilai ratio lebih kecil dari 1.8, berarti RNA tersebut telah terkontaminasi dengan protein lain. Namun bila nilai ratio lebih besar dari 2.0, ada RNA dalam sampel tersebut (QIAGEN, 2001; Jain, 2004; Moore et al, 2004; Saili dkk., 2010).
3.10.3 Perancangan PCR primer PDGF-B, FGF-2, VEGF-A dan TGF-β1, IL-1, IL-6, IL-10, TNF α, CRP, Col1α, Osterix, Runx-2, Bsp dan ALP. Program PCR (Promega Corporation, 2010): PCR Mix sebanyak 12,5 µl ditambah dengan kedua primer (masingmasing 2,5 µl). Kemudian DNA dari lokus yang akan diperiksa (vWA). Setelah itu, tambahkan nuclease free water sehingga volume total sebesar 25µl. tahap I: - initial denaturation 96ºC selama 2 menit - subsequent denaturation 94ºC selama 1 menit - annealing 60ºC selama 1 menit - extension 70ºC selama 1 menit 30 detik - cycle: 10 cycles tahap II: - denaturation 90ºC selama 1 menit - annealing 60ºC selama 1 menit ( Tergantung pada masing-masing primer ) - extension 70ºC selama 1 menit 30 detik
50
3.10.4 Visualisasi hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis pada gel A. Pembuatan Gel Poliacrylamide 1.
Masing-masing plat kaca dietsa pada satu sisi kemudian ditandai. Cuci dengan ethanol 95% dan Kimwipes® sebanyak 2x pada bagian plat kaca yang panjang dan yang pendek.
2.
Aplikasikan 3ml larutan Gel slick® pada bagian plat kaca yang lebih panjang yang telah dietsa kemudian diratakan pada seluruh permukaan dengan gerakan memutar menggunakan lap kering.
3.
Tunggu 5 menit sampai larutan Gel slick® mengering. Bersihkan kelebihan larutan Gel Slick® yang masih tersisa dengan lap yang telah diberi distilled water, lalu keringkan dengan Kimwipes® tissue.
4.
Persiapkan larutan fresh binding dengan menambahkan 3µl silane kedalam 1 ml asam asetat 0,5% didalam 95% ethanol pada tabung 1,5ml. Usap bagian plat kaca pendek dengan Kimwipes® tissue yang telah disaturasi dengan larutan fresh binding.
5.
Tunggu 5 menit sampai larutan kering. Usap dengan ethanol 95% dan Kimwipes® tissue 3-4x untuk membersihkan kelebihan larutan.
6.
Hindari kontak antara 2 bagian plat kaca yang telah diberi perlakuan dengan menempatkan spacer 0,4 mm.
7.
Siapkan larutan acrylamide 6% dengan mencampurkan : Urea 31,50 gr ditambah dengan distilled water 36,25 ml + 10x TBE buffer 3,75 ml+ 40 % acrylamide:bis (19:1) 11,25 ml sehingga hasil akhir volume larutan sebesar 75 ml.
8.
Saring larutan acrylamide dengan filter 0,2 micron.
9.
Campurkan larutan acrylamide dengan TEMED 50µl dan 10% ammonium persulfate 500µl.
51
10. Tuangkan perlahan larutan acrylamide diantara plat kaca, hindari terbentuknya gelembung udara dengan cara menuangkan perlahan dan konstan pada satu sisi. 11. Berikan cetakan atau comb pada gel diantara plat kaca (yang dipakai berisi 9 cetakan).
B. Running gel elektroforesis 1. Pindahkan comb dan spacer yang dipasang pada gel. 2. Tambahkan 0,5x TBE pada ruangan dibagian bawah alat elektroforesis. 3. Masukkan sampel DNA hasil PCR pada bagian cetakan di gel sebesar masingmasing 10 µl. 4. Masukkan larutan marker sebesar 3 µl pada sumuran yang dikehendaki. 5. Running gel elektroforesis dengan listrik kekuatan 100 volt sampai larutan turun kebawah seluruhnya.
3.11 PCR Real Time 1. Pengambilan ekstraksi RNA kultur sel dilakukan pada 24, 48 dan 72 jam, dengan cara: a.
Buang medium dari dish
b.
Cuci dengan PBS steril
c.
Ditambahkan Isogen II (250 µL) sebagai langkah awal ekstraksi RNA
d.
Resuspensi untuk melepaskan sel dari dasar plate, kemudian diambil dan dimasukkan ke microtube.
e.
Microtube digoyang dengan shaker selama 15 detik.
f.
Ditambahkan ddH2O (100 µL)
g.
Microtube digoyang dengan shaker selama 15 detik.
h.
Inkubasi 5 menit dalam suhu ruangan
i.
Centrifuge 15.000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4°C.
j.
Didapatkan dua lapis cairan dalam microtube: lapisan bawah merupakan Isogen II, lapisan atas berwarna jernih (aquaeous phase) merupakan sel.
52
k.
Ambil bagian lapisan yang jernih (280 µL) dan dipindahkan ke microtube baru.
l.
Ditambahkan isopropanol 230 µL.
m. Microtube digoyang dengan tangan selama 15 detik. n.
Inkubasi 10 menit dalam suhu ruangan.
o.
Centrifuge 15.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4°C
p.
Didapatkan pellet dan supernatan, buang supernatantnya.
q.
Cuci pellet RNA dengan ethanol 75% 500 µL.
r.
Centrifuge 15.000 rpm selama 3 menit dengan suhu 4°C
s.
Keringkan pellet RNA di suhu ruangan selama 10 menit (tidak boleh terlalu kering).
t.
Ditambahkan RNAse free water 30µL.
u.
Simpan dalam suhu -80°C.
2. Mengukur konsentrasi dan kemurnian RNA: a.
Teteskan 1.5 µL RNA pada bagian detektor RNA biodrop machine.
b.
Catat kemurnian dan konsentrasi RNA yang terlihat pada monitor.
3. Proses Two Step Reverse Transcriptase PCR Konvensional menggunakan PCR kit RiverTra Ace (Toyobo, Tokyo, Japan) a.
Membuat template cDNA dari masing-masing sampel: - Membuat reverse transcription reaction mix dalam microtube berisi: NucleaseFree Water 9.75µl, RiverTra 5X Reaction Buffer 4µl, dNTPs 2µl, OligoDT 1µl, ReverTra Ace 1µl, Recombinat RNasin Ribonuclease Inhibitor 0,25 µl untuk tiap 1 sampel. Pembuatan total master mix didapatkan dengan mengalikan jumlah sample dengan tiap-tiap reagen. - Mencampurkan 2µl RNA dan 18µl reverse transcription reaction mix dalam microtube. - Anneal dengan suhu 25°C selama 5 menit - Extend dengan suhu 42°C selama 60 menit - Inactivate Reverse Transcriptase dengan suhu 90°C selama 5 menit.
4. Running Real-Time Reverse Transcriptase PCR: cDNA diamplifikasi dalam volume 10 l dengan 0.11 x SYBR Green I (CAMBREX, Rockland, ME, USA), 0.2 mM/satuan dNTPs, 0.5 M/satuan tiap pasangan primer, dan 0.5unit Dream Taq Hot Start DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) dalam kondisi sebagai berikut: 95°C selama 5 menit, dilanjutkan 55 PCR siklus 53
pada 95°C selama 30 detik, 60°C selama 20 detik, dan 72°C selama 40 detik. Sinyal fluorescent diukur secara real time, dan kemudian tiap sample dikuantifikasi menurut petunjuk dari pabrik. Sekuens primer yang digunakan pada studi ini dapat dilihat pada table 1. Untuk penghitungan normalisasi dari perbedaan tiap sampel total RNA di tiap reaksi, Ribosomal protein L13a (Rpl13a) digunakan sebagai kontrol endogenous. Unit arbitrary ditentukan dengan membagi konsentrasi tiap produk PCR dengan konsentrasi produk PCR dari Rpl13a. Tiap reaksi real-time PCR analysis dibuat dalam triplikasi, dan diulang setidaknya 3 kali untuk memastikan hasil yang konsisten.
3.12 MTT assay 1. Sel Human Gingiva Fibroblast dilakukan splitting dan dicuci dengan larutan PBS dan diberi tripsin sebanyak 2-2,5 ml dan diinkubasi selama 5 menit 2. Dilakukan resuspensi dengan DMEM untuk menghilangkan tripsin 3. Dilakukan splitting dan dipindahkan dalam mikroplate 96 sumuran dan setiap sumuran di beri sel sebanyak 5x104 + DMEM 100µl dan diinkubasi sampai sel kondisi 80 % 4. Setelah sel dalam kondisi 80% diberi perlakuan dengan Ekstrak kulit buah manggis bertingkat ( 200 µg/ml, 400 µg/ml, 600 µg/ml, 800 µg/ml, 1000 µg/ml dan 1200 µg/ml ) + DMEM 50 µl dan diinkubasi selama 24 jam. 5. Setelah 24 jam diberi reagen MTT pada setiap sumuran sebanyak 25 µl dan diinkubasi selama 4 jam. 6. Setelah 4 jam medium pada mikroplate dipindahkan ke mikroplate reader yang baru 7. Dibaca dengan menggunakan ELISA reader.
3.13 Wound Healing Assay pada kultur Human Gingival Fibroblast Sel Human Gingival Fibroblast dengan jumlah 1x105 dikultur pada 6 sumuran. Scratch yang linier dibuat pada sel yang confluent monolayer dengan menggunakan pipet 200 µl. Debris sel di bilas dengan menggunakan medium 54
DMEM. Gap scratch diobservasi menggunakan kamera mikroskop cahaya dengan berbagai macam perbedaan waktu.
3.14 Analisis Data Data yang diperoleh dilakukan pengamatan langsung hasil band hasil RT-PCR , ekspresi protein imunositokimia antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.
3.15 Luaran per tahun Hasil penelitian ini akan ditulis jurnal dan di masukkan ke dalam jurnal international scopus dengan minimal grade Q3 sebanyak 2 jurnal. Dan setelah hasil ini dicapai maka peneliti akan membuat gel ekstrak kulit manggis yang akan dipatenkan ke HAKI.
3.16. Indikator Capaian Indikator capian dapat tercapai setelah 2 jurnal dapat diterima pada jurnal international scopus minimal grade Q3.
55
BAB 4 ROAD MAP PENELITIAN
Osteogenesis
MC3T3-E1
Xanthone
Inflamasi
TNFα
OSTERIX
CRP
Runx2
IL-1
ALP
IL-6
BSP
IL- 10
Coll1α1
Mangosteen Pericarp
LPS
Keterangan : : menginduksi : menghambat : Kandungan / penanda
56
BAB 5 ANGGARAN BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN
5.1
Ringkasan Anggaran Biaya Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Biaya yang Diusulkan
No.
Jenis Pengeluaran
1.
Honorarium untuk pelaksana, petugas laboratorium, pengumpul data, pengolah data, penganalisis data dan honor operator
Rp. 25.000.000,-
2.
Primer PCR 4 pasang, Antibodi monoklonal/poliklonal 7 protein, Bahan habis pakai, ATK, fotocopy, surat menyurat, penyusunan laporan, cetak, penjilidan laporan, publikasi, pulsa, internet, bahan laboratorium, langganan jurnal
Rp. 25.000.000,-
3.
4.
Tahun I
Perjalanan untuk biaya survey /sampling data, seminar/workshop DN-LN, biaya akomodasi-konsumsi, lumpsum, transport Administrasi, Publikasi 5 jurnal terindeks scopus min Q4, Pembuatan laporan, Seminar Luar negeri Total
57
Rp. 30.000.000,-
Rp. 20.000.000,-
Rp. 100.000.000,-
5.2 Jadwal Penelitian No.
Jenis Kegiatan
1.
Persiapan bahan-bahan
2.
Sintesis kulit buah manggis
3.
Pengujian kulit buah manggis
4.
Kultur sel Human Gingiva Fibroblast
5.
MTT assay
6.
Ekstraksi RNA
7.
Pembuatan cDNA
8.
Proses PCR dan elektroforesis
9.
Kultur sel Osteoblast
11.
Ekstraksi RNA
12.
Pembuatan cDNA
13.
Proses realtime PCR dan elektroforesis
14.
Analisis data
15.
Tahun 2019 - 2020 8
9
10
11
12
Persiapan laporan dan seminar hasil penelitian
16.
Laporan hasil penelitian
17.
Publikasi Jurnal indeks Scopus min Q4
58
1
2
3
4
5
6
7
8
5.3 Proyeksi Publikasi Hasil Penelitian
NO 1.
JUDUL ARTIKEL
JURNAL YANG DITUJU
Effect of Mangosteen Pericarp Saudi Dental Journal
QUARTIL 3
Extract (Gracinia mangostana L.)
on the
Human
Expression of
Gingival
Fibroblast
Cell Culture Growth Factor
2.
Mangosteen Pericarp Extract Iranian Journal of Medical Science
3
(Gracinia mangostana L.) pre treatment
reversed
LPS
induced inhibition of osteoblast differentiation in MC3T3
5.4 Indikator Keberhasilan (Target Capaian) NO 1 2 3
4 5 6
INDIKATOR KEBERHASILAN Menghasilkan 2 paper terindeks Scopus dengan Quartil 3 Memberikan informasi tentang manfaat tentang kulit manggis Memperkenalkan potensi tropical fruit sebagai salah satu bahan untuk mepercepat penyembuhan luka pasca ekstraksi gigi. Mengirim mahasiswa untuk pendidikan di Hirosima Tobiume kei dr Associated professor Hiroshima University Dilakukan penandatanganan MOU antara Universitas Airlangga dan Hiroshima Universiy
59
JUMLAH 2 1
1 1 1
DESKRIPSI
DAFTAR PUSTAKA
Arabski M, Weglerek-Cluk A, Czerwonka G, Lankoff A, Kaca W. 2012. Effects of Saponins Againts Clinical E. coli Strains and Eukayotic Cell Line. J. of Biomedicine and Biotechnology. pp: 1-7. Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko MS, Brem H, Tomic-Canic M. 2008. Growth Factors and Cytokines in Wound Healing. Wound Rep Reg. 16: 585-601. Butler M. 2005. Animal Cell Culture and Technology. 2nd ed. London and New York. BIOS Scientific Publisher. Carson SN. 2005. Basics of Wound Healing and Treatment. Available from: http://www.Baybutt.net/pubs/wound. Accessed at: 30th Desember 2011. Chaovanalikit A, Mingmuang A, Kitbunluewit T, Choldumrongkool N, Sondee J, Chupratum S. 2012. Anthosyanin and Total Phenolics Content of Mangosteen and Effect of Processing on the Quality of Mangosteen Products. Int Food Rsch J. Vol 19 (3). pp: 1047-1053. Chaverri JP, Rodriguez NM, Ibarra MO, Rojas JMP. 2008. Medicinal Properties of Mangosteen. J. Food and Chemical Toxicology. (46): 3227-3239. Diegelmann RF, Evans MC. 2004. Wound Healig: An Overview of Acute Fibrotic, and Delayed Healing. Frontiers in Bioscience. 9:283-289 Freshney RI. 2010. Culture animal cells : a manual of basic technique and specialized applications 6th. New Jersey : John Wiley & Sons, Inc. Pp 1-8, 111-114, 187-206, 365-377. Gao Y, Li D, Han T, Sun Y, Zhang J. 2009. TGF-ß1 and TGFBR1 are Expressed in Ameloblast and Promote MMP20 Expression. Weifang, Shandong, China. WileyLiss, Inc. Pp: 886. Guo F, Carter DE, Mukhopadhyay A, Leask A. 2011. Gingival fibroblasts display reduced adhesion and spreading on extracellular matrix: a possible basis for scarless tissue repair. USA. PloS ONE. Hayyu NS. 2013. Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Garcinia mangostana Linn terhadap Sel Fibroblas Gingiva Manusia. Surabaya. Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Hoffman D. 2003. Medical Herbalism: The Science and Practice of Herbal Medicine. Rochester, Vermont. Healing Art Press. p: 116. Harazy VI., Zambon JJ., Trevisan M., Zeid M., Genco RJ. 2000. Identification of Periodontal Pathogens in Atheromathous Plaques. J. Periodontal. 71:1554-60. Hunt KT. 2003. Wound Healing: Current Surgical Diagnosis and Treatment. 12th Ed., McGraw-Hills, USA. In: Doherty MG. p75-87 60
Ibelgaufts H. 2002. Wound Healing. Cytokins and Cells Online Pathfinder Encyclopedia. www.cope.cgi.htm. Accessed on 16 April 2014. Innis MA, Gelfand DH. 1990. PCR Protocols a Guide to Methods and Applications. California. Academic Press. Naqvi AR, Fordham JB, Khan A, Nares S. 2015. microRNAs responsive t o A . a c tin o m y c e m c o mit a n s a n d P.gingivalis LPS modulate expression of genes regulating innate immunity in human macrophages. HHS Public Access. I n n a t e I m m u n . Author manuscript : 540-551. 21
Kent LW, Rahemtulla F, Hockett Jr. RD, Gilleland RC, Michalek SM. 1998. Effect of Lipopolysaccharide and Inflammatory Cytokines on Interleukin-6 Production by Healty Human Gingival Fibroblast. U.S. America. American Society for Microbiology. 66(2) p: 608-614. Liska-yunitasari. 2011. Gempur 41 Penyakit dengan Buah Manggis : Khasiat dan Cara Pengolahannya untuk Pengobatan. Yogyakarta: Pustaka Baru Press. Hal 24-34. Mann A, Breuhahn K, Schirmacher P, Blessing M. 2001. Keratinocyte-Drived Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor Accelerates Wound Healing: Stimulation of Keratinocyte Proliferation, Granulation Tissue Formation, and Vascularization. J. Invest Dermatol. 117:1382-1390. Massague, J. 1998. Tgf-beta signal transduction [Review]. Annual Review of Biochemistry, 67: 753-791. Miryanti, YIPA, Sapei L, Budiono K, Indra S. 2011. Ekstraksi Antioksidan dari Kulit Buah Manggis. Karya Tulis Ilmiah. Universitas Katolik Parahyangan Bandung. Hal: 11. Putra ATW, Ade W, Hamidy MY. 2010. Tingkat Kepadatan Fibroblas pada Luka Sayat Mencit dengan Pemberian Gel Lidah Buaya (Aloe chinensis Baker). Hal: 1-8. Ryan John. 2008. Introduction to Animal Cell Culture. Technical bulletin. Available from : www.corning.com/lifesciences. Acces :24 Maret 2012. Sakagami H, Kushida T, Makino T, Hatano T, Shirataki Y, Matsua T, Matsuo Y, Mimaki Y. 2012. Functional Analysis of Natural Polyphenols and Saponins as Alternative Medicines. Availabe at www.Intechopen.com. Accessed at 6 April 2014. Shibata MA, Matoba Y, Tosa H, Iinuma M. 2013. Effects of Mangosteen Pericarp Extract Againts Mammary Canceri. Altern Integ Med. Vol. 2. pp: 139. Tjahjaningtyas. 2011. Manggis Ratu Buah Kaya Manfaat: Khasiat Dahsyat dan Tips Mengkonsumsinya. Surabaya. Stomata. Hal 23-88. Tukiran, Suyanto, Hidayanti N. 2015. Uji Awal Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.). Surabaya. Universitas Negeri Surabaya. C-82. Werner S. Dan Grose R. 2003. Regulation of wound healing by growth factor and cytokines. London. Physiol Rev 83, p: 835-70.
61
Kazuhisa Nakashima,2 Xin Zhou,2 Gary Kunkel,3 Zhaoping Zhang, Jian Min Deng, Richard R. Behringer, and Benoit de Crombrugghe1. The Novel Zinc FingerContaining Transcription Factor Osterix Is Required for Osteoblast Differentiation and Bone Formation. Cell, Vol. 108, 17–29, January 11, 2002. Yatman E. 2012. Kulit Buah Manggis Mengandung Xanton yang Berkhasiat Tinggi. Jakarta. Univesitas Borobudur. No. 324. Hal: 2-3. Ying Cao1, Shu-Fang Jia1, Geetika Chakravarty2, Benoit de Crombrugghe3, and Eugenie S. Kleinerman1 . 2008. The Osterix Transcription Factor Down-Regulates Interleukin-1α Expression in Mouse Osteosarcoma Cells. Mol Cancer Res. 2008 January ; 6(1): 119–126. doi:10.1158/1541-7786 Bruderer M, et al. Role and Regulation of RunX2 in Osteogenesis. European Cells and Materials Vol.282014 (pages 269 - 286) DOI :10.22203/eCM.v028a19) 2014 Kirkham GR and Cartmell SH. Genes and Proteins Involved in the Regulation of Osteogenesis. Topics in Tissue Engineering, Vol. 3, 2007. Eds. N Ashammakhi, R Reis & E Chiellini. Gastelbondo B. Gene expression of collagen type I alpha 2 and its relationship with dental fluorosis. Journal Oral and Craniofacial Sciences. 2018; 7(6):172-175. doi:10.17126/joral res.2018.056 Soong R et al (2001) Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Detection of Cytokeratin 20 in Noncolorectal Lymph Nodes. Clinical Cancer Research, 7: 3423–3429. Hoongbao M et al, Application of Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The Journal of American Science, 2(3), 2006, Ma, et al., Real-time Polymerase Chain Reaction. P 1-14 Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (NY). 1993;11(9):1026-30. Yuwono dan Tribowo, 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Panduan Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini, Penerbit Andi, Yogyakarta
62
Lampiran 1. Biodata Ketua Pengusul A. Identitas diri 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Nama Lengkap Jenis Kelamin Jabatan fungsional NIP/NIK/Identitas lainnya NIDN Tempat dan Tanggal Lahir E-mail Nomor Telepon/HP Alamat Kantor Nomor Telepon/Faks Lulusan yang telah dihasilkan 12. Mata kuliah yang diampu
Andra Rizqiawan, drg., SpBM., Ph.D Laki-laki Lektor 19810923200501001 0023098101 Surabaya, 23 September 1981
[email protected] (031) 5352577 / 0859 3113 0100 Jl. Prof. Dr. Moestopo No. 47 Surabaya (031)-5030255/5030256 S-1= 89 orang; S-2= - orang; S-3= - orang 1. 2. 3. 4.
Ilmu Bedah Mulut I Ilmu Bedah Mulut II Skills Lab Bedah Mulut dan Maksilofasial Ilmu Bedah Mulut I Pendidikan Dokter Gigi Spesialis Bedah Mulut dan Maksilofasial 5. Ilmu Bedah Mulut II Pendidikan Dokter Gigi Spesialis Bedah Mulut dan Maksilofasial
B. Riwayat Pendidikan Nama Perguruan Tinggi Bidang Ilmu
S-1 Universitas Airlangga Pendidikan Dokter Gigi
Spesialis Universitas Airlangga Spesialis Bedah Mulut dan Maksilofasial
Tahun masuk-lulus 1999-2004 Judul Kekuatan Tarik skripsi/Thesis/Disertasi Diametral pada GIC yang telah kadaluarsa
2004-2015 Pengaruh paparan rekombinasi protein Galectin-1 terhadap proliferasi sel OM-1
Nama pembimbing/promotor
Prof. Coen Pramono, drg., Sp.BM(K)
Drg Edhi Arief Sp.KG
63
S-3 Hiroshima University Oral Health Promotion and Developmental Dentistry 2010-2013 Snail-dependent upregulation of Galectin-1 promoted to complete EMT process in Snail Expressing cells Prof. Nobuyuki Kamata
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir No. Tahun Judul Penelitian
Pendanaan Sumber
1
2015
Jml (Juta Rp)
Rancang bangun kit diagnostik DIPA DIToseointegrasi implant dental berbasis LITABMAS DNA melalui analisis polimorfisme gen MMP-1
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir Pendanaan No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Sumber 1
Jml (Juta Rp)
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Dompu
SPONSOR + BOPTN
66,989,200
2
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Lombok Timur
SPONSOR + BOPTN
67,219,200
3
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Sitobondo
SPONSOR + BOPTN
50,412,800
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Dompu
SPONSOR
58,845,600
5
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Pare, Kediri
SPONSOR + BOPTN
44,546,480
6
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RSUD Tongas - Probolinggo
SPONSOR
37,723,120
7
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Besuki, Situbondo
SPONSOR
12,765,920
8
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RSUD Dr. Soedjono -Lombok Timur
SPONSOR
74,201,600
9
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RS Tk. III dr. R. Soeharsono – Banjarmasin
SPONSOR
85,380,000
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Situbondo
SPONSOR
18,736,000
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RSUD Dr. Soedjono -Lombok Timur
SPONSOR
120,150,640
4
10
11
2013
2014
2015
64
12
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RSUD Tongas - Probolinggo
SPONSOR
148,320,000
13
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RS. Tentara Tk. IV Wirasakti – Kupang
SPONSOR
82,258,000
14
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Bima
SPONSOR
121,551,440
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RS. Tentara Tk. IV Wirasakti – Kupang
SPONSOR
97,143,581
16
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di Bima
SPONSOR
139,800,000
17
Bakti Sosial Operasi Bibir Sumbing di RSUD Dr. Soedjono -Lombok Timur
SPONSOR
120,143,007
15
2016
E. Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal dalam 5 Tahun Terakhir Volume/Nomor/Tahun No. Tahun Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal 1
2
2013
2013
Snail promotes Cyr61 to prime collective cell migration and form invasive tumor nests in squamous cell carcinoma
Cancer Letter Journal
AKT primes snailinduced EMT concomitanly with the collective migration of squamous cell carcinoma cell
Journal of Cellular Biochemistry
Biochemical and Biophysical Research Communications 441 : 904-910 (2013)
3
2013
Autocrine galectin-1 promotose collective cell migration of squamous cell carcinoma cell through up-regulation of distinct integrins
4.
2011
PGE2 targets squamous cell carcinoma cell with the activated epidermal 65
329 : 243-252 (2013)
114: 2039-2049 (2013)
307 : 227-236 (2011)
growth factor receptor family for survival against 5-fluorouracil through NR4A2 induction 5.
2018
Cancer Letters
Demineralized FreezeDried Bovine Cortical Bone : Its potential for Guided Bone Regeneration Membrane
International Journal Dentistry
2017;2017:5149675
F. Pemakalah Seminar Ilmiah dalam 5 Tahun Terakhir No. 1.
2.
3.
Nama Temu Ilmiah/Seminar
Judul Artikel Ilmiah
Waktu dan Tempat
The 58th Congress of the Japanese Society of Oral and Maxillofacial Surgeons The 57th Congress of the Japanese Society of Oral and Maxillofacial Surgeons 3rd Continuing Education In Oral and Maxillofacial Surgery
Snail-dependent upregulation of Galectin-1 promoted in complete EMT process in snail-expressing squamous cell carcinomans cells Galectin-1 involved in cell migration and invasion by upregulation integrin alpha 2 in SCC correlated with EMT Bagaimana menanggulangi perdarahan pada pencabutan gigi
Fukuoka, Japan 11-13 Oktober 2013
Yokohama, Japan 19-21 Oktober 2012
Surabaya, Indonesia 14 – 15 Agustus 2015
G. Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir No.
Judul Buku
Tahun
Jumlah Halaman
Penerbit
Jenis
Nomor P/ID
1
H. Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir No.
Judul/Tema HKI
Tahun
1
66
I. Pengalaman Merumuskan Kebijakan Publik/Rekayasa Sosial lainnya dalam 10 Tahun Terakhir No. Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Tahun Tempat Respon lainnya yang Telah Ditetapkan Penerapan Masyarakat 1 J. Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah, asosiasi atau institusi lainnya) Tahun No. Jenis Penghargaan Institusi Pemberi Penghargaan 1 Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Proposal Riset Mandat Universitas airlangga 2019
Surabaya, 29 Juli 2019
Andra Rizqiawan, drg., Ph.D., Sp.BM
67
BIODATA ANGGOTA PENELITI A. Identitas diri 1.
Nama Lengkap 2. Jenis kelamin 3. Jabatan fungsional 4. Jabatan struktural 5. NIP 6. NIDN 7. Tempat,tgl lahir 8. E-mail 9. No tlp/fax/hp 10. Alamat Kantor 11. No tlp/fax 12. Lulusan yang telah dihasilkan 13. Mata kuliah yang 14. diampu 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.
Dr. Pratiwi Soesilawati, drg.,MKes.,PA(K) P Lektor 196911221996012001 00221169003 22 november 1969
[email protected] 031-71003623 / 08123240605 Prof. Moestopo 47 Surabaya 031-5030255 s-1= 16 org. S-2= 4org. S-3= org 1. Histologi Kedokteran gigi ( Kuliah ) 2. Histologi kedokteran gigi ( Praktikum ) 3. Biologi Oral I ( Kuliah ) 4. Biologi Oral I ( Praktikum ) 5. Biologi Oral II ( Kuliah ) 6. Biologi Oral II ( Praktikum ) 7. Research instrumentation (Kuliah S2) 8. Patobiologi molekuler (Kuliah S2) 9. Genetika Molekuler (Kuliah S2) 10. Proteomik oral (Kuliah S2) 11. Imunologi ( Kuliah Program Pendidikan Dokter gigi Spesialias)
B. Riwayat Pendidikan Nama Perguruan Tinggi Bidang Ilmu Tahun masuk-lulus Judul skripsi/Thesis/Disertasi
Nama pembimbing/promotor
S-1 Universitas Airlangga Kedokteran Gigi 1989-1995 Pengaruh daya tekan hancur pada semen gypsum Bonded
Bob Subijantoro, drg
S-2 Universitas Airlangga Ilmu Kesehatan Gigi 2001-2004 Peran gigi untuk deteksi jenis kelamin melalui PCR dan penentuan usia melalui RST Prof. Indrayana N, dr.,MS., SpF(K),DVM
C. Pengalaman Penelitian dalam 5 tahun terakhir No Tahun Judul penelitian 1
2007
Efektifitas penggunaan mini primer Amelogenin pada amplifikasi
68
S-3 Universitas Airlangga Ilmu Kedokteran 2007-2011 Analisis varian HLADRB1 pada jalur imunogenetik sekresi sIgA saliva sebagai risiko karies gigi Prof. Dr. Harianto Notopuro, drg.,MS
Pendanaan Sumber Medical Research Unit, fak Kedokteran
Jumlah(Rp) 7
2
2008
3
2009
4
2010
5
2011
6
2011
7
2013
8
2013
9
2014
10
2014
11
2014
DNA odontoblas, Medical Research Unit, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga. : Penentuan usia pada tubulus dentin dengan metode Ratio Of Sclerosis to Tubulus sebagai penunjang odontology forensik. Analisis genotip HLA-DRB1 pada etnis Jawa di Surabaya
Peran Polimorfisme HLA-DRB1 Pada Kerentanan Genetik Karies Gigi Melalui Analisis Single Nucleotide Polymorphism ( analisis genomik ) Peran Polimorfisme HLA-DRB1 Pada Kerentanan Genetik Karies Gigi Melalui Analisis Single Nucleotide Polymorphism ( analisis proteomik ) Pemanfaatan Teknologi Phytosome untuk meningkatkan Bioavailabilitas Produk Obat Herbal Desain Metode diagnosa presymptomatik karies gigi melalui analisis jalur imunogenetik sekresi sIgA pada berbagai varian HLADRB1 Modulasi Fase Proliferasi Ekstrak Teripang Emas (Stichopus Hermanii) Sebagai Terapi Ulkus Mukosa Oral Desain Metode diagnosa presymptomatik karies gigi melalui analisis jalur imunogenetik sekresi sIgA pada berbagai varian HLADRB1 Efek Anti Inflamasi Ekstrak Teripang Emas (Stichopus Hermanii) Sebagai Terapi Ulkus Mukosa Oral Deteksi Α-Amylase Stain Saliva Sebagai Materi Ekstraksi Dna Genomik Pada Odontologi Forensik Molekuler
69
Unair
DIP A PNBP Universitas Airlangga.
7
Riset Binaan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran, Badan Penelitian Dan Pengembangan Penelitian, Departemen Kesehatan RI Penelitian Multi Tahun Hibah Bersaing I, Direktorat Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Penelitian Multi Tahun Hibah Bersaing II, Direktorat Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Riset Insentif Kementrian Riset dan Teknologi.
125
Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Tahun I
50
Riset Kolaborasi Dosen-Mahasiswa FKG UA
10
Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Tahun II
50
Riset Kolaborasi Dosen-Mahasiswa FKG UA
10
Hibah Penelitian dasar FKG UA
20
32,5
35
200
12
2016
Rancang Bangun Kit Diagnostik Karies Gigi Berbasis Imunogenetik Melalui Deteksi Mutasi HLA-DRB1 Ekson 2 Dengan ASO-PCR
Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi
65
12
2016
Hibah Airlangga Health Science Institute
50
13
2017
Desain Kit Diagnostik Imunogenetik Karies Gigi Melalui Hibridisasi Mikro Dot-Blot Berlabel Non-Radioaktif Dengan Probe Oligonukleotida HLA-DRB1 Uji Stabilitas Prototype Kit Diagnostik Hla-Drb1 Untuk Deteksi Presymptomatik Karies Gigi Pada Anak
Penelitian Terapan Unggulan Perguruan Tinggi
90
14
2017
Research Frame Work Rancang Bangun Kit Diagnostik Oligoprobe Interleukin 10 Untuk FKG Unair1 Penderita Periodontitis Kronis Dengan Risiko Preeklamsia
100
15
2018
Uji Stabilitas Prototype Kit Penelitian Terapan Diagnostik Hla-Drb1 Untuk Unggulan Perguruan Deteksi Presymptomatik Karies Tinggi Gigi Pada Anak
100
16
2018
Analisis Respon Jaringan Pasca Hibah Penelitian AHS Penanaman Sub Cutan Universitas Airlangga Demineralized Dentin Matrix Membrane (DDMM) Sebagai Biomaterial Guided Bone Regeneration
50
D. Pengalaman Pengabdian masyarakat dalam 5 Tahun terakhir No Tahun Judul pengabdian Masyarakat Pendanaan Sumber 1 2011 Bulan Kesehatan Gigi Indonesia Unilever 2 2012 Bulan Kesehatan Gigi Indonesia Unilever 3 2012 Pelatihan DHE dlm rangka DIES BOPTN FKG UA Natalis Universitas Airlangga 4 2013 Dentistry Charity-Lombok Timur BOPTN FKG UA 5 2014 Bulan Kesehatan Gigi Indonesia Unilever
70
Jumlah(juta Rp) 5 5 -
6
2015
7
2016
8
2016
9
2016
10 11
2017 2017
12
2017
13
2018
14
2018
15
2018
Iptek bagi Masyarakat Layanan Kesehatan Dan Peningkatan Ketrampilan Wirausaha Jamur Tiram Kelompok Anak-Anak Tunanetra Pelatihan wirausaha produk pangan fungsional Yoghurt Probiotik bagi Kelompok Lansia Sehat Pelatiahan dan Penyuluhan Kesehatan Gigi di Pondok Pesantren Qomarudin Gresik (Pelatihan dan Penyuluhan Peringatan Dies Natalis UNAIR tahun 2016 Bulan Kesehatan Gigi Indonesia Operasi katarak di Kecamatan Kedungpring Kab lamongan Operasi katarak di Kecamatan Sambeng Kab lamongan Forum Grup Discussion Potensi air bersih di Kab Lamongan Revitalisasi Bumi Perkemahan di Desa Candisari sambeng lamongan Pendampingan Telemedicine Proyek Citarum Harum Sektor 7 Kab Bandung
Dikti
37
BOPTN
30
BPPTNBH
8
BPPTNBH
15
Unilever Kemenko PMK
60
Kemenko PMK
25
Kemenko PMK
25
Kemenko PMK
25
Mandiri
30
E. Pengalaman Penulisan artikel ilmiah dalam jurnal dalam 5 tahun terakhir N Judul Artikel Vol/No/Thn o Ilmiah 1 Peran TGF-β1 vol 13 no 3,2011 sebagai http://journal.unair.ac.id/download-fullpapersRegulator Vol%2013%20No%203%20September%202011Switching 1.pdf Isotype sekresi sIgA 2
3
Cytotoxicity study of reconstruction plate made of Stainless steel 316L compared to Commercially pure titanium on babby hamster kidney21 fibroblast culture. Human SNP resulting in novel mutation
Nama jurnal Jurnal Biosains Pascasarjana Univ Airlangga
Vol 44 no 1, 2011 http://journal.unair.ac.id/DENTJ@cytotoxicity-studyof-reconstruction-plate-made-of-stainless-steel-316lcompared-to-commercially-pure-titanium-on-babyhamster-kidney-21-fibroblast-culture-article-3294media-2-category-0.html
Dental Journal
Vol 5 no 24, January 2014 https://ejournals.ph/article.php?id=2769
Science and clinical laboratory
71
4
5
6
of HLA-DRB1 gen for salivary sIgA secretion The effects of golden sea cucumber extract (Stichopus hermanii) on the number of lymphocytes during the healing process of traumatic ulcer on wistar rat’s oral mucous Acceleration of fibroblast number and FGF-2 expression using Channa striata extract induction during wound healing process: in vivo studies in wistar rats Cytotoxicity test of 40, 50 and 60% citric acid as dentin conditioner by using MTT assay on culture cell line
int journal
Vol 48, No 2 , June 2015 DOI: 10.20473/j.djmkg.v48.i2.p100-103 · License: CC BY-SA 4.0
Dental journal Majalah Kedokteran Gigi
Vol 49, No 3. September 2016
Dental
DOI: 10.20473/j.djmkg.v49.i3.p125-132 · License: CC BY-SA 4.0
journal Majalah Kedoktera n Gigi
Vol 41, No 3, September 2008
Dental
DOI: 10.20473/j.djmkg.v41.i3.p103-106
journal
https://e-journal.unair.ac.id/MKG/article/view/992
Majalah Kedoktera n Gigi
7
8
Characterizatio n of lactoferrin in gingival crevicular fluid of chronic periodontitis patient Demineralized Freeze-Dried Bovine Cortical Bone: Its
Vol 47, No 3, Januari 2014 DOI: 10.20473/j.djmkg.v47.i3.p141-145 · License: CC BY-SA 4.0
vol. 2017, Article ID 5149675, 10 pages, 2017. doi:10.1155/2017/5149675 https://www.hindawi.com/journals/ijd/2017/514967 5 72
Dental journal Majalah Kedokteran Gigi
Internationa l Journal of Dentistry
9
10
Potential for Guided Bone Regeneration Membrane The influence of moderate Exercise on Caspase-3 Expression In Inhibiting Transformation of Oral Squamous Epithelial Cells Gambaran histopatologi penyembuhkan luka pencabutan gigi pada makrofag dan neovaskular dengan pemberian getah batang pisang ambon
Vol 11 No 1 ISSN 1309-100X http://www.jidmr.com
Journal of Internationa l Dental and Medical research
Vol 3, No 3 (2017): December https://doi.org/10.22146/majkedgiind.17454
Majalah Kedokteran Gigi Indonesia
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir No Nama Pertemuan Ilmih Judul Artikel Waktu&tempat 1 Hiroshima Confference, Faculty Varian Analysis HLA- 9-10 Oktober 2011 of Dentistry, Hiroshima DRB1 on Hiroshima University, University Immunogenetic Japan Pathway of sIgA Secretion in Saliva as Dental Caries Risk 2 Seminar Nasional Penelitian Peran Polimorfisme 11 Mei 2011 Hibah Bersaing Direktur Jenderal HLA-DRB1 Pada Surabaya Pendidikan Tinggi Kementrian Kerentanan Genetik Pendidikan Nasional Karies Gigi Melalui Analisis Single Nucleotide Polymorphism, , 3 Human SNP resulting Manila,Phillpines,Novem Asian Conference on in novel mutation of ber 2013 Multidisciplinary Research in HLA-DRB1 gen for Higher Education 2013 salivary sIgA secretion 4 Genetic susceptibility Surabaya, 7 Desember East Java Association of influencing 2013 Periodontist Scientific Meeting osseointegrated dental implant failure Variant Analysis Of Surabaya, 22 november Scientific Meeting Airlangga –
73
5
Kagoshima University
HLA-DRB 1 On Immunogenetic Pathway Of sIga Secretion In Saliva As Dental Caries Risk Effect Of Dental Health Education With Audio Media For Improving Knowledge And Attitude Of Dental Caries On The Foundation For The Education Of Blind Children Surabaya
2012
6
Joint Scientific meeting In Dentistry
7
Thailand International Concerence on Oral Biology
HLA-DRB1 Genetic susceptibility influencing dental caries in Indonesian children
Bangkok, 17-18 November 2016
8
Thailand International Concerence on Oral Biology
Stain Detection αAmylase Saliva as A genomic source in Molecular Forensic Odonthology
Bangkok, 17-18 November 2016
9
Thailand International Concerence on Oral Biology
Effect of MMP-1 Level on Inflammation Phase Post Dental Implant Surgery
Bangkok, 17-18 November 2016
10
Thailand International Concerence on Oral Biology
Bangkok, 17-18 November 2016
11
Pekan Ilmiah Nasional Persatuan Ahli Anatomi Indonesia
The Role of probiotic Yoghurt to Regulate Body Weight and Viral Load of HIV Patiens Pengaruh Mutasi Ekson 2 HLA-DRB1 Terhadap Presentasi Antigen: Analisis Doking Molekuler HLA-DRB1 dan TCR
12
Lokakarya Translational Research
Surabaya, 7 Desember 2016
13
Temu Ilmiah Nasional and Joint scientific Meeting in Dentistry
Perkembangan Riset Translasional di Bidang Kedokteran Gigi Prevalence Of Dental Caries And Its Correlation With The
74
Surabaya, 2-3 Oktober 2015
Surabaya, 29-30 Juli 2016
Surabaya, 5-7 Oktober 2017
141
15
Immunological Assessment Of Cytokine Profile Of Cd4+ Cells In Patients With Different HlaDrb1 Variants ( Study In Javanesse Population-Surabaya Indonesia) nd 2 regional oral biology scientific Deteksi amelogenin meeting dan D21S11 melalui α-amylase stain saliva sebagai materi ekstraksi dna genomic pada odontology forensic molekuler Joint Scientific Meeting in Examining The Dentistry Caries Risk With The Characteristics Of Hla Drb1 Gene
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir No tahun Judul 1 Histologi Kedokteran Gigi 2017 2 Atlas Histologi Kedokteran 2017 Gigi 3 Histologi rongga mulut 2017 4 Imunogenetik karies gigi 2017
Bandung, 3-4 November 2017
Surabaya, 2-3 Oktober 2018
Jenis Buku referensi Buku referensi Buku referensi Buku referensi
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 – 10 Tahun Terakhir No tahun Jenis Judul 1 Formula Herba Pegagan 2012 Paten (cotunggal dan campuran inventor) dengan rimpang Kencur sebagai Obat Herbal terstandar untuk Mempercepat Penyembuhan Luka Ekstraksi Gigi 2 Metode penentuan 2015 Paten(inventor) usiaAnte Mortem Berdasarkan Ratio Schlerosis to Tubulus 3 Metode Isolasi DNA Sel 2015 Paten(inventor) Odontoblas Sebagai Materi Identifikasi jenis Kelamin Ante Mortem
75
No
No No Permohonan Paten P00201200109
No Permohonan Paten P 00201502157 No Permohonan Paten P 00201502158
4
5
6
Formula Fitosom dan Lipososm Ekstrak Daun Ungu Untuk Terapi Hemorhoid Oral dan Topikal Varian HLA-DRB1 Pada Populasi Jawa di Surabaya
2016
Paten(coinventor)
No Permohonan Paten P 00201608362
2016
Paten (Inventor)
Isolasi DNA genomik dari stain saliva melalui pengenalan enzim aamilase
2016
Paten(inventor)
No Permohonan Paten P 00201608899 No Permohonan Paten P 00201608900
I. Pengalaman Merumuskan Kebijakan Publik/Rekayasa Sosial Lainnya Dalam 5 Tahun Terakhir No Jenis kebijakan Institusi Tahun No 1 Pembangunan instalasi Pemda 2018 penyaringan air bersih di kabupaten dusun Nongko ds Candisari Lamongan Kec Sambeng Kab Lamongan J. Penghargaan yang Pernah Diraih dalam 10 tahun Terakhir (dari pemerintah, asosiasi atau institusi lainnya)
No 1 2 3 4
Jenis penghargaan Poster Terbaik I Konsultan Presentasi oral terbaik 4 Dosen Terbaik 3 FKG Unair 2017
Institusi Seminar nasional Hibah Bersaing 2012 Persatuan Ahli Anatomi Indonesia Research Expo Universitas Airlangga
Tahun 2012 2011 2015
Fakultas Kedokteran Gigi Universitas airlangga
2017
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Proposal Riset Mandat Universitas airlangga 2019
Surabaya, 29 Juli 2019
Dr Pratiwi Soesilawati, drg.,MKes, PA(K)
76
BIODATA ANGGOTA PENELITI A. Identitas diri 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Nama Lengkap Jenis Kelamin Jabatan NIM NIDN Tempat dan Tanggal Lahir 7. E-mail 8. Nomor Telepon/HP 9. Fakultas 10. Universitas 9. Alamat Kantor 10 Nomor Telepon/Faks
Gde Djodi Satria Rurus Laki-laki Mahasiswa 02141133045 Surabaya, 23 September 1981
[email protected] 0812 1678 7819 Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Jl. Prof. Dr. Moestopo No. 47 Surabaya (031)-5030255/5030256
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Proposal Riset Mandat Universitas airlangga 2019
Surabaya, 29 Juli 2019
Gde Djodi Satria Rurus
77
BIODATA ANGGOTA PENELITI A. Identitas diri 1. 2. 3. 4.
Nama Lengkap Jenis Kelamin Jabatan fungsional NIP/NIK/Identitas lainnya 5. NIDN 6. Tempat dan Tanggal Lahir 7. E-mail 8. Nomor Telepon/HP 9. Alamat Kantor 10. Nomor Telepon/Faks 11. Lulusan yang telah dihasilkan 12. Mata kuliah yang diampu
Tobiume Kei Laki-laki Associate Professor
tobi5651 hiroshima-u.ac.jp
6. 7. 8. 9. 10.
B. Riwayat Pendidikan S-1
Spesialis
K. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir No. Tahun Judul Penelitian
S-3
Pendanaan Sumber
1
Jml (Juta Rp)
DIPA DITLITABMAS
2015
L. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir Pendanaan No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Sumber 1
78
Jml (Juta Rp)
M.
Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal dalam 5 Tahun Terakhir No. Tahu Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal Volume/Nomor/Tahu n n 1.
2.
3.
4.
5.
2007
2007
2008
2009
2009
Apoptosis Signalregulating Kinase (ASK) 2 Functions as a Mitogen-activated Protein Kinase Kinase Kinase in a Heteromeric Complex with ASK1*
Journal of Biological Chemistry
Suppression of AP-1 Activity by Cycloprodigiosin Hydrochloride
Biological and Pharmaceutical Bulletin
CD44high/ALDH1high hea d and neck squamous cell carcinoma cells exhibit mesenchymal characteristics and GSK3β‐dependent cancer stem cell properties
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
ASK1 and ASK2 differentially regulate the counteracting roles of apoptosis and inflammation in tumorigenesis
The Embo Journal
ΔNp63α‐dependent expression of Id‐3 distinctively suppresses the invasiveness of human squamous cell carcinoma
International Journal of Cancer
79
282/10/2007 7522-7531
30/9/2007 1792-1795
72/6/2008 1564-1570
28/7/2009 843-853
124/12/2009 2837-2844
6.
7.
8.
9.
2010
2011
2011
2012
RHAMM/ERK interaction induces proliferative activities of cementifying fibroma cells through a mechanism based on the CD44–EGFR
Laboratory Investigation
PGE2 targets squamous cell carcinoma cell with the activated epidermal growth factor receptor family for survival against 5-fluorouracil through NR4A2 induction
Cancer Letters
Blocking of sodium and potassium iondependent adenosine triphosphatase-α1 with ouabain and vanadate suppresses cell–cell fusion during RANKLmediated osteoclastogenesis
European Journal of Pharmacology
Overexpression of receptor for hyaluronanmediated motility (RHAMM) in MC3T3E1 cells induces proliferation and differentiation through phosphorylation of ERK1/2
Journal of Bone and Mineral Metabolism
80
91 : 379-391 (2011)
307/2/202011 227-236
670/2-3/2011 409-4018
30/3/2012 293-303
10.
2013
11.
2013
13.
2013
14.
2013
15 .
16
2014
2014
Interleukin‐8 and CXCL10 expression in oral keratinocytes and fibroblasts via Toll‐like receptors
Microbiology and Immunology 57/3/2013 198-206
Journal of AKT primes snail‐ Cellular induced EMT Biochemistry concomitantly with the collective migration of squamous cell carcinoma cells
Autocrine galectin-1 promotes collective cell migration of squamous cell carcinoma cells through up-regulation of distinct integrins
Biochemical and Biophysical Research Communication s
Snail promotes Cyr61 secretion to prime collective cell migration and form invasive tumor nests in squamous cell carcinoma
Cancer Letters
Expression and Function of RIG-I in Oral 81
441/4/2013 904-910
329/2/2013 243-252
Journal of Cellular Physiology
TMEM16E (GDD1) Exhibits Protein Instability and Distinct Characteristics in Chloride Channel/Pore Forming Ability
114/9/2013 2039-2049
Cellular Physiology and
229/2/2014 181-190
34/5/2014 1556-1565
17 .
18 .
19 .
2016
2016
2018
Keratinocytes and Fibroblasts
Chemistry
CD44high/ALDH1high hea d and neck squamous cell carcinoma cells exhibit mesenchymal characteristics and GSK3β‐dependent cancer stem cell properties
Journal of Oral Pathology and Medicine
Snail-induced CD44high cells in HNSCC with high ABC transporter capacity exhibit potent resistance to cisplatin and docetaxel
Int J Clin Exp Pathology
Candida albicans βGlucan-Containing Particles Increase HO-1 Expression in Oral Keratinocytes via a Reactive Oxygen Species/p38 MitogenActivated Protein Kinase/Nrf2 Pathway
Infection and Immunity
45/3/2016 180-188
9/8/2016 790807918
N. Pemakalah Seminar Ilmiah dalam 5 Tahun Terakhir No.
Nama Temu Ilmiah/Seminar
Judul Artikel Ilmiah
1.
82
Waktu dan Tempat
O. Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir No.
Judul Buku
Tahun
Jumlah Halaman
Penerbit
Jenis
Nomor P/ID
1
P. Perolehan HKI dalam 10 Tahun Terakhir No.
Judul/Tema HKI
Tahun
1 Q. Pengalaman Merumuskan Kebijakan Publik/Rekayasa Sosial lainnya dalam 10 Tahun Terakhir No. Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Tahun Tempat Respon lainnya yang Telah Ditetapkan Penerapan Masyarakat 1 R. Penghargaan dalam 10 Tahun Terakhir (dari pemerintah, asosiasi atau institusi lainnya) Tahun No. Jenis Penghargaan Institusi Pemberi Penghargaan 1
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Proposal Riset Mandat Universitas airlangga 2019
Surabaya, 29 Juli 2019
Dr. Tobiume Kei Ph.D
83
Lampiran 2. Susunan Organisasi Tim Pengusul dan Pembagian Tugas No
Nama/NID
Instansi
.
N
Asal
1.
Bidang Ilmu
Fakultas
Bedah Mulut
Rizqiawan,
Kedokteran
dan
SpBM
Maksilofasial
/ Universitas
002309810
Airlangga
1
2.
Dr. Pratiwi
Uraian Tugas
(Jam/Minggu)
Andra
drg., PhD., Gigi
Alokasi Waktu
Fakultas
Patologi
Kedokteran
Anatomi
Gigi Universitas
a. Pembuatan Ekstrak kulit buah manggis b. Pemesanan primer IL-1, IL6, IL-10, TNF, CRP, RUNX2, OSX, BSP, ALP, Coll 1 c. Uji in-vivo d. Pemeriksaan PCR e. Analisis data f. Pembuatan laporan 10 Jam/min a. Pemeriksaan Realtime PCR ggu b. Analisis data c. Pembuatan laporan
10 Jam/minggu
Airlangga 3.
4.
Gde
Jodi Fakultas
Mahasiswa
Satria
Kedokteran
Kedokteran
Rurus
Gigi
gigi
Universitas
Universitas
Airlangga
Airlanga
Dr.
Hiroshima
Bedah Mulut
Tobiume
University
dan
Kei Ph.D
Maksilofasial
84
10 Jam/minggu
5 jam/ minggu
a. Pemesanan Primer PDGF, FGF, VEGF dan TGF-β b. Uji in-vitro c. Analisis data d. Pembuatan laporan a. Konsultasi hasil Penelitian b. Konsultasi Jurnal Publikasi
Lampiran 3. Skema Keterkaitan antara isu, strategi dan tema-tema penelitian
PRESERVASI RESIDUAL RIDGE TULANG ALVEOLARIS MELALUI INDUKSI MANGOSTEEN PERICARP
Resorbsi tulang alvelaris yang berlebihan mengakibatkan pemasangan dental implant menjadi tergangu dan sering gagal TEMA 1. Perbedaan Ekspresi growth Hormon pada Human Gingival Fibroblast dengan pemberian ekstrak kulit manggis pada wound healing assay 2. Ekstrak Mangosteen Pericarp (Gracinia mangostana L.) sebelum perawatan membalikkan LPS yang diinduksi penghambatan diferensiasi osteoblas pada MC3T3 OUTPUT Pembuatan Gel Eksrak kulit manggis yang diaplikasikan pada soket bekas pencabutan gigi OUTCOME Dapat mengurangi terjadinya resorbsi pada tulang alveolaris yang dapat mendukung untuk pemasangan dental implan
85
Lampiran 4. Justifikasi Anggaran Penelitian
1. Honorarium Honor
Honor/jam
Waktu
(Rp)
(Jam/minggu)
Minggu
Honor per Tahun (Rp) Tahun ke-1
Ketua
15.000
10
48
7.200.000
Anggota 1
12.000
10
48
5.760.000
Anggota 2
12.000
10
48
5.760.000
Anggota 3
12.000
10
24
2.880.000
Laborat
5.000
10
48
2.400.000
Analis data
5.000
10
7
350.000
Subtotal (Rp)
24.350.000
2. Pembelian bahan habis pakai
Material
Pembuatan kulit buah manggis gel
Justifikasi Pembelian
Sebagai perlakuan
Kuantitas
Harga Satuan (Rp)
Hara Peralatan Penunjang (Rp) Tahun ke-1
5000 gram
500.000
500.000
5x
500.000
3.500.000
Kultur Human
Jenis sel
Gingival
yang
Fibroblast
digunakan
Primer PDGF-B
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer FGF-2
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer VEGF-A Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer TGF-β1
2 buah
200.000
400.000
5x
500.000
3.500.000
Kultur Osteoblast Cell
Untuk PCR Jenis sel yang digunakan
Primer IL-1
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer IL-6
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
86
Primer IL-10
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer TNF-α
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer CRP
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer RunX2
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer OSX
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer BSP
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer ALP
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
Primer Col1α
Untuk PCR
2 buah
200.000
400.000
4x2 reaksi
500.000
4.000.000
8 liter
500.000
400 ml
6.000.000
6.000.000
4 liter
100.000
400.000
50 ml
300.000
300.000
1 – kit
17.000.000
17.000.000
1- kit
3.000.000
3.000.000
500.000
500.000
PCR
DMEM
FBS 5%
PBS PH 7,4
Pemeriksaan PCR Medium untuk sel Nutrisi untuk medium Washing Agent
Antibiotik
Antibiotik
Penicillin
untuk
Streptomycin
medium
Rneasy mini kit
PCR kit
Pemeriksaan PCR Pemeriksaan PCR
4.000.000
Gel
Pemeriksaan
Elektroforesis
PCR
dH2O
Sterile water
10 liter
100.000
100.000
Kultur sel
200 biji
10.000
2.000.000
Glass dan Cover glass
Subtotal (Rp) Perjalanan Perjalanan
Justifikasi Perjalanan
Kuantitas 2 orang
Administrasi 87
50.400.000 Harga Satuan (Rp)
Tahun ke-1
7.500.000
15.000.000
2.000.000
2.000.000
Etical Clearence
1.500.000
1.500.000
Akomodasi
1.500.000
1.500.000
Konsumsi
1.00.000
1.000.000
Pengolahan data
750.000
750.000
500.000
500.000
3.000.000
3.000.000
Laporan
dan
penggandaan Publikasi Subtotal (Rp)
25.250.000
TOTAL ANGGARAN YANG DIPERLUKAN
100.000.000
SETIAP TAHUN (Rp) TOTAL
ANGGARAN
YANG
DIPERLUKAN
SELURUHNYA (Rp)
88
100.000.000
Lampiran 5: Surat Pernyataan Ketua Peneliti SURAT PERNYATAAN KETUA PENELITI Yang bertanda tangan di bawah ini: Nama :Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM NIDN : 0023098101 Fakultas : Kedokteran Gigi Pangkat/Golongan : Penata / (III/c) Jabatan Fungsional : Lektor Dengan ini Mengajukan Proposal Hibah Riset Mandat Universitas Airlangga dengan judul: “ Preservasi residual ridge tulang alveolaris melalui induksi mangosteen pericarp “ saya sebagai Ketua peneliti menyatakan bahwa : 1. Saya bersedia menjadi Ketua/anggota peneliti dengan meluangkan waktu selama 200 jam / bulan untuk melakukan riset termasuk mpnev dan presentasi hasilnya 2. Saya bersedia menyerahkan bukti submit ke Jurnal Internasional terindeks SCOPUS selambat-lambatnya tanggal 29 Desember 2019 dan paling lambat 15 Agustus 2020 bukti Accepted 5 paper 3. Proposal riset yang saya ajukan diatas belum pernah dibiayai dan tidak sedang diajukan untuk dibiayai oleh instansi lain. 4. Proposal riset yang saya ajukan diatas tidak mengandung plagiasi atau autoplagiasi serta pengulangan riset yang telah dilakukan. Demikianlah pernyataan ini saya buat dengan sesungguhnya dan bersedia mengembalikan dana riset yang telah saya gunakan apabila terbukti bahwa pernyataan saya diatas tidak benar. Surabaya, 29 Juli 2019 Yang Menyatakan,
meterai Materai 6000 Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM NIP.19810923 200501 1 001
89
SURAT PERNYATAAN ANGGOTA PENELITI Yang bertanda tangan di bawah ini: Nama
: Dr. Pratiwi Soesilawati, drg., M.Kes., PA(K)
NIDN
: 00221169003
Fakultas
: Kedokteran Gigi
Pangkat/Golongan
: Penata / IIId
Jabatan Fungsional :Lektor Dengan ini Mengajukan Proposal Hibah Riset Mandat Universitas Airlangga dengan judul: “ Preservasi residual ridge tulang alveolaris melalui induksi mangosteen pericarp “ saya sebagai Ketua peneliti menyatakan bahwa : 1. Saya bersedia menjadi anggota peneliti dengan meluangkan waktu selama 200 jam / bulan untuk melakukan riset termasuk mpnev dan presentasi hasilnya 2. Saya bersedia menyerahkan bukti submit ke Jurnal Internasional terindeks SCOPUS selambat-lambatnya tanggal 29 Desember 2019 dan paling lambat 15 Agustus 2020 bukti Accepted 5 paper 3. Proposal riset yang saya ajukan diatas belum pernah dibiayai dan tidak sedang diajukan untuk dibiayai oleh instansi lain. 4. Proposal riset yang saya ajukan diatas tidak mengandung plagiasi atau autoplagiasi serta pengulangan riset yang telah dilakukan. Demikianlah pernyataan ini saya buat dengan sesungguhnya dan bersedia mengembalikan dana riset yang telah saya gunakan apabila terbukti bahwa pernyataan saya diatas tidak benar. Surabaya, 29 Juli 2019 Yang Menyatakan, meterai Materai 6000 Dr. Pratiwi Soesilawati, drg., M.Kes., PA(K) NIP.196911221996012001
90
SURAT PERNYATAAN ORIGINILITAS
Yang bertanda tangan dibwah ini saya :
Nama NIDN Fakultas Pangkat/Golongan Jabatan Fungsional
:Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM : 0023098101 : Kedokteran Gigi : Penata / (III/c) : Lektor
Menyatakan bahwa saya tidak melakukan plagiat dalam penelitan saya yang berjudul :
Judul Penelitian: Topik Riset Mandat Bidang Fokus
: Preservasi residual ridge tulang alveolaris melalui Induksi mangosteen pericarp : Kesehatan, Penyakit tropis, Gizi dan obat : Pengembangan vaksin, obat dan obat tradisional (Bahan alam )
Apabila suatu saat nanti terbukti melakukan plagiat maka saya akan menerima sanksi yang telah ditetapkan. Demikian surat pernyataan ini saya buat dengan sebenar-benarnya
Surabaya, 29 Juli 2019 Yang Menyatakan,
meterai Materai 6000 Andra Rizqiawan, drg., PhD., SpBM NIP.19810923 200501 1 001
91
Lampiran 5: Surat Pernyataan Ketua Peneliti
January 7th , 2019
Confirmation Letter as Consultant in Research Collaboration
To whom it may concern, With this letter, I would like to state that I will join as a research consultant in the institutional research with the title as follows;
Preservation of alveolar bone to mangosteen pericarp induction
Therefore, I would like to cordially invite my research team, Dr. Andra Rizqiawan, Dr. Pratiwi Soesilowati, and Mr. Gde Djodi Satria Rurus to come and conduct research activities at Hiroshima University in accordance with the applicable provisions in Hiroshima University.
Kei Tobiume, DDS, Ph.D Hiroshima University Graduate School of Biomedical & Health Sciences Kasumi 1-2-3, Minami-Ku, Hiroshima, 734-8533 JAPAN E-mail:
[email protected] Tel: +81-082-257-5651
92