Starter Kulture Bakterija I Kvasaca U Proizvodnji Vina

TEHNOLOŠKI FAKULTET, NOVI SAD

Biologija proizvodnih mikroorganizama - SEMINARSKI RAD -

Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

PROFESOR:

STUDENT:

prof. dr Siniša L. Markov

MSc Marina Rajič Oktobar, 2014.

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

SADRŽAJ 1. Uvod......................................................................................................................................1 2. Primena kvasaca kao starter kultura......................................................................................1 2.1. Selekcija sojeva kvasaca za proizvodnju vina...............................................................1 2.2. Karakterizacija kvasaca za vino....................................................................................2 2.3. Odabir aktivne suve starter kulture kvasca....................................................................3 2.4. Primena aktivne suve starter kulture kvasca..................................................................4 2.4.1. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca................................................................5 2.4.2. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca primenom rehidratišućeg nutrijenta.......6 2.4.3. Primena više sojeva Saccharomyces cerevisiae kao starter kulture..................7 2.4.4. Inokulisanje grožđanog mošta sa Saccharomyces i ne-Saccharomyces sojevima.......................................................................................................................8 2.4.5. Primena starter kultura kvasaca za nedovršene fermentacije............................9 3. Primena bakterijskih starter kultura.....................................................................................11 3.1. Selekcija i karakterizacija bakterija mlečno-kiselog vrenja za pripremu starter kultura u proizvodnji vina................................................................................................................12 3.2. Priprema malolaktičke starter kulture..........................................................................13 3.3. Odabir odgovarajuće malolaktičke starter kulture.......................................................15 3.4. Pokretanje zastale malolaktičke fermentacije..............................................................17 3.5. Doprinos malolaktičke starter kulture senzornom kvalitetu vina................................19 3.5.1. MLF otkriva arome sorte................................................................................20 3.5.2. Regulisanje diacetila – uticaj brzine inokulacije MLB i vremena dodavanja na profil arome................................................................................................................21 3.5.3. Uticaj post-MLF tehnika u proizvodnji vina na senzorne osobine.................23 4. Zaključak.............................................................................................................................23 5. Literatura.............................................................................................................................24

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

1. Uvod Iako su kvasci za proizvodnju vina poznati od davnina, proizvodnja vina bila je više umetnost nego nauka sve do pre 50-ak godina. Proizvodnja i upotreba aktivnog suvog kvasca (ADY – Active Dry Yeast) počela je u Sjedinjenim Američkim Državama sredinom 1960-ih i odatle se proširila po celom svetu (Degre 1993). U inokulisanim fermentacijama, odabrani sojevi Saccharomyces cerevisiae se dodaju obično do postizanja populacije od oko 105–106 ćelija/mL u moštu kako bi se obezbedio brži početak fermentacije, povećana brojnost i dominacija u odnosu na autohtone sojeve kvasaca i kako bi se obezbedile karakteristične osobine vina. Istorija kontolisane malolaktičke fermentacije (MLF) je još kraća. Uprkos ranom otkriću bakterija mlečne kiseline (LAB – Lactic Acid Bacteria) od strane MüllerThurgau 1891. godine, koji doprinose redukciji kiseline u vinu tako što jabučnu kiselinu razgrađuju na mlečnu kiselinu i CO2, komercijalne starter kulture su dospele na tržište tek početkom 1980-ih. Najčešće se koriste starter kulture Oenococcus oeni (ranije nazivan Leuconostoc oenos), mada postoje i drugi laktobacili koji su se pokazali da daju dobre rezultate (Prahl 1989). Malolaktičke (ML) starter kulture za laku direktnu inokulaciju su postale dostupne tokom ranih 1990-ih. Santiago i sar. (2011) detaljno su se bavili problemom proizvodnje starter kultura za vino. U jedanaestom poglavlju njihove knjige „Molekularna mikrobiologija vina“ mogu se naći podaci o izolaciji i selekciji sojeva, razvoju biomase, procesima koji prethode pakovanju i prodaji, kao i o načinu upotrebe odabranih sojeva kvasaca i bakterija mlečne kiseline koji se koriste u proizvodnji vina.

2. Primena kvasaca kao starter kultura U spontanim alkoholnim fermentacijama postoji rana i brza sukcesija određenih vrsta kvasaca kao što su Hanseniaspora, Kloeckera, Candida stellata, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii ili Pichia, koji inače rastu u moštu (Henschke 1997) ali na kraju odumiru, dok Saccharomyces cerevisiae uglavnom dominira i zaslužan je za kompletnu alkoholnu fermentaciju (Fleet i Heard 1993). Kritična tačka spontane alkoholne fermentacije je oko 4% vol. alkohola (Dittrich i Grossmann 2005), kada ne-Saccharomyces kvasci odumiru a sojevi Saccharomyces cerevisiae postaju dominantni. Ipak, dominacija Saccharomyces cerevisiae ne garantuje uspešnu alkoholnu fermentaciju; ona zavisi i od genetske predispozicije dominantnih sojeva. Godinama su vođene rasprave u kojima su se razmatrali relevantni faktori za spontanu alkoholnu fermentaciju u odnosu na indukovanu alkoholnu fermentaciju. Konačno rešenje ovog problema ne može se ustanoviti jer zavisi od vrste grožđa, željene vrste vina, sastava grožđanog soka i berbe.

2.1. Selekcija sojeva kvasaca za proizvodnju vina Poznato je da Saccharomyces cerevisiae proizvode različite koncentracije aromatičnih komponenti u zavisnosti od tretmana mošta i uslova u kojima se izvodi fermentacija,

1

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

uključujući temperaturu, vrstu grožđa, mikronutrijente, vitamine i sadržaj azota u moštu (Carrau i sar. 2010). Danas je širom sveta dostupno preko 200 komercijalnih sojeva kvasaca. Ovi sojevi su odabrani zbog svojih specifičnih osobina (Tabela 1) koje mogu biti podeljene u dve grupe: poželjne i nepoželjne karakteristike (Degre 1993), kao i zbog tehnoloških i kvalitativnih osobina koje su opisali Dittrich i Grossmann (2005).

2.2. Karakterizacija kvasaca za vino Potrebe za kiseonikom i azotom: Kvasci mogu od amonijumovih jona da sintetišu gotovo sve amino kiseline i azotne baze koje su im neophodne za rast i razvoj, iako je njihov rast brži ukoliko u hranljivoj podlozi postoje već spremni gradivni blokovi, amino kiseline. Sadržaj azota u moštu može biti limitirajući faktor (Amerine i sar. 1980); pronađena je veza između početnih koncentracija i maksimalne brzine fermentacije (Bely i sar. 1991). Vrednost manja od oko 150 mg/L usvojivog azota (YAN – Yeast Assimilable Nitrogen) u moštu ima veze sa većim šansama za probleme u fermentaciji (Henschke i Jiranek 1993). Dodavanje azota tokom stacionarne faze može biti efikasno, ali neki autori su demonstrirali to da ovaj efekat zavisi od osobina samog soja (Jiranek i sar. 1991). Julien i sar. (2000) predložili su metod za određivanje količina azota i kiseonika koje su potrebne kvascima u zavisnosti od soja kvasaca. Potrebe azota su određivane tokom stacionarne faze fermentacije. Kako bi se odredila efikasnost usvajanja dodatog azota tokom ove faze, primenjena je fermentacija pri konstantnoj brzini. Primećene su veoma bitne razlike: neki sojevi su imali dvostruko veće potrebe za azotom u poređenju sa ostalim sojevima, pri istoj brzini fermentacije. Na osnovu ovih saznanja sojevi kvasaca su klasifikovani kao nisko, srednje i visoko zahtevni za azotom. Kiseonik je drugi bitan faktor za metabolizam kvasaca tokom proizvodnje vina jer je neophodan za sintezu sterola i masnih kiselina. Sablayrolles i sar. (1996) dokazali su prednost kombinovanog dodavanja kiseonika i azota u cilju sprečavanja spore ili nepotpune alkoholne fermentacije. I u ovom slučaju, različiti sojevi kvasaca variraju u potrebama za kiseonikom (Julien et al. 2001). Tabela 1 | Kriterijumi za selekciju sojeva kvasaca za komercijalnu upotrebu Poželjni Nepoželjni Kvalitativne osobine: Kvalitativne osobine:  Proizvodnja prijatnih voćnih aroma i  Proizvodnja sumpor dioksida  Proizvodnja vodonik sulfida estara  Proizvodnja komponenti sa S-derivatima  Proizvodnja β-glukozidaze  Proizvodnja isparljivih kiselina i etil  Proizvodnja glicerola acetata  Proizvodnja mano-proteina  Proizvodnja komponenti koje vezuju SO2 (acetaldehid, piruvat...) Za specijalne primene:  Razgradnja jabučne kiseline  Formiranje prekursora etil karbamata  Formiranje mlečne kiseline  Proizvodnja polifenol oksidaze  Formiranje izoamilacetata  Proizvodnja biogenih amina  Brza autoliza

2

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

        

Tehnološke karakteristike: Potpuna fermentacija šećera Visoka tolerancija na alkohol Rezistentnost na sumpor dioksid Minimalna lag-faza tokom rehidratacije Fermentacija na niskim temperaturama Tolerancija na visoke temperature Fermentacija pod pritiskom Aktivnost tokom fermentacije Fenomen ubice

Tehnološke karakteristike:  Stvaranje pene  Stvaranje biofilma  Aktivnost tokom fermentacije

Za specijalne primene:  Svojstva aglomerizacije  Svojstva sedimentacije Temperaturna i alkoholna tolerancija: Temperatura značajno utiče na rast kvasaca. Saccharomyces cerevisiae može da raste u temperaturnom opsegu od 0-45 °C, dok je optimalna temperatura za alkoholnu fermentaciju između 20 i 30 °C (Henick-Kling 1988). Važno je obratiti pažnju na temperaturnu toleranciju odabranih kvasaca, što se obično određuje rastom na sintetičkoj podlozi na 10, 12, 15, 20, i 30 °C, kako bi se odabrao najbolji soj kvasca za specifične uslove proizvodnje vina. Alkoholna tolerancija se testira na istoj podlozi. Većina odabranih sojeva kvasca toleriše do 14% vol., ali se za fermentaciju sokova veoma zrelog crnog grožđa preporučuju kvasci sa višom tolerancijom alkohola od 16% vol. pa nadalje.

2.3. Odabir aktivne suve starter kulture kvasca Tokom 70-ih i 80-ih godina, kada su se prve suve starter kulture koristile za proizvodnju vina, kvasci su birani prvenstveno na osnovu prednosti u tehnološkom simislu; danas je njihov doprinos senzornim karakteristikama i opštem kvalitetu vina podjednako važan. Tako da sojevi koji su nedavno odabrani igraju veću ulogu od jednostavnog fermentovanja šećera u etanol. Iako postoji velika verovatnoće da će inokulisani S. cerevisiae da dominira u fermentaciji (Schütz i Gafner 1993), njegovo zasejavanje neće obavezno garantovati 100% dominaciju soja ili njegov isključiv doprinos fermentaciji. Značajni faktor koji utiče na rezultat jeste populacija autohtonih kvasaca koji se već nalaze u soku, izboru soja kvasca i njegovoj adaptaciji specifičnim uslovima u vinu. Neophodno je izabrati odgovarajući soj kvasca koji će rasti i biti metabolički aktivan u datim uslovima, npr. soj kvasca koji dobro podnosi niske temperature za fermentaciju belih vina, ili soj kvasca koji može da podnese više temperature pri niskom pH i visokom % alkohola u fermentaciji crvenog vina. Kako nije uvek lako odabrati soj kvasca za specifične uslove u vinu i za doprinos senzornim osobinama, kompanija Lallemand, koja se između ostalog bavi i proizvodnjom komercijalnih sojeva, sastavila je „tabelu kvasaca“ (Tabela 2) kako bi se olakšalo proizvođačima vina da prevaziđu poteškoće u odabiru odgovarajućeg kvasca za svaku fermentciju.

3

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

Tabela 2 | Brza ocena kvasaca Kriterijum za odabir soja kvasca Odgovarajuće za proizvodnju belog vina Odgovarajuće za proizvodnju roze vina Odgovarajuće za proizvodnju crvenog vina Odgovarajuće za restartovanje zastalih fermentacija Senzorni efekti Temperaturni opseg (°C) Brzina fermentacije Faktor kompetencije Alkoholna tolerancija Relativni zahtevi za azotomb Proizvodnja H2S (60 ppm N) Proizvodnja H2S (170 ppm N)

Ocena 1-4 1-4 1-4 1-4

4 Comment [m1]: KAKO SE OVA TABELA KORISTI MENI JE JEDINO JASNO DA JE 4 DOBAR ALI KAKO STIŽEM DO BROJA 4

Neutralno – estri – EVCa Opseg ne indicira „optimalni temperaturni opseg“ Spora – srednja – brza Senzitivni – neutralni – aktivni Daje se najviši nivo alkohola koji podnosi Nisko – srednje – visoko Nisko – srednje – visoko Nisko – srednje – visoko

Najviša ocena (kompatibilnost) = 4, Najniža ocena = 1. Sam proizvođač daje ocenu u zavisnosti od toga za koju je vrstu vina namenjen kvasac. a EVC = Enhances Varietal Character (pojačava karakter raznolikosti) b „relativni zahtevi za azotom“ odnosi se na to koliko azota jedan soj zahteva u odnosu na druge sojeve u tabeli u uslovima limitiranog azota Mnogobrojnost i varijacije u mogućim načinima pripreme odabranog aktivnog suvog kvasca za proizvodnju vina mogu biti još više zbunjujući jer različiti proizvođači obezbeđuju različite informacije za svoje sojeve kvasaca. Kako bi se vinarima olakšalo da naprave najbolji izbor, Istraživački Centar Geisenheim napravio je jedinstveni sistem podataka kako bi se pratile najbitnije osobine odabranih kvasaca koji su dostupni na tržištu u Nemačkoj. Ovi podaci su prikupljeni u bazu podataka i može im se pristupiti u elektronskoj formi na web stranici istraživačke stanice ili preko www.hefefinder.de. Sistem je napravljen tako da predlaže najpogodniji soj kvasca za specifične uslove i vrstu vina na osnovu detalja koje može bilo ko uneti na sajtu, a takođe vrši i rangiranje između sojeva kvasaca.

2.4. Primena aktivne suve starter kulture kvasca Pored tradicionalne metode inokulisanja sveže pripremljenog soka sa određenom količinom aktivnog fermentišućeg soka, koriste se dva tipa starter kultura kvasaca: tečne starter kulture i pripreme suvih starter kultura kvasaca. Većina starter kultura kvasaca su čiste i sastoje se samo od jednog soja Saccharomyces cerevisiae. Pripremljeni tečni kvasci imaju ograničeno tržište jer imaju kratak rok trajanja. Tečne starter kulture pripremaju same vinarije ili komercijalni dobavljači (npr. lokalne laboratorije za vino ili instituti). Glavna razlika između ovih kultura i aktivnih suvih kvasaca jeste u tome što one nisu podvrgavane sušenju tako da imaju veliku populaciju vijabilniih ćelija, ali samo u kratkom vremenskom periodu. Njihova glavna primena je u fermentaciji specifičnih sokova kao što su selekcije suvih bobica ili

Comment [M2]: U KATALOGU NA SAJTU HTTP://WWW.LALLEMANDWINE.COM/SPIP.PHP?RUBRI QUE33&ID_MOT=19&LANG=EN SU OCENE U VIDU ***, **, *, 0

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

hladna vina, pa čak i za pripremu penušavih vina. Aktivne suve starter kulture kvasaca se uzgajaju u više koraka sa odgovarajućim izvorima kiseonika i nutrijenata kako bi se proizvelo kvasci sa optimalnim sadržajem proteina, ergosterola, nezasićenih masnih kiselina i rezervnih materijala (Monk 1986). Zatim se kvasac suši kako bi se očuvao tokom transporta i skladištenja. Pored soja, sadržaj trehaloze u ćelijama je jedan od najbitnijih faktora koji utiču na otpornost kvasca na sušenje i naknadnu rehidrataciju. Iz tog razloga postoje dobre inicijative za proizvođače kvasaca da stimulišu stvaranje trehaloze tokom proizvodnje kako bi se povećala rezistentnost ćelija kvasaca na stres dehidratacije i rehidratacije (Degre 1993).

2.4.1. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca Komercijalno pripremljen suvi kvasac obično sadrži manje od 8% rezidualne vlage, u mnogim slučajevima čak i manje (6%). Zato se aktivni suvi kvasac mora rehidrirati kako bi se revitalizirao. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca je veoma bitna, jer ako se ne odradi kako treba može dovesti do oslobađanja velikih količina ćelijskog sadržaja i gubljenja vijabilnosti i vitalnosti (Henick-Kling 1988). Iako je rehidratacija kvasca direktna operacija, i objavljena je nekolicina naučnih i tehničkih članaka koji opisuju ispravne tehnike za održavanje zdrave membrane i optimalnog tehnološkog procesa, uputstva proizvođača variraju. Degre (1993) je predložio opštu proceduru u proizvodnji vina:  Posuti 500 g suvog kvasca u 5 L tople vode (35-40 °C)  Promešati suspenziju nakon 5 min kako bi se resuspendovale sve ćelije  Ostaviti ćelije kvasca da stoje u suspenziji ne duže od 30 min kako bi se izbeglo korišćenje rezervnih materija Dodati kvasac u 20-25 hL mošta koji treba da se fermentiše, što odgovara dozi od 25-30 g/hL (oko 2-4 × 106 CFU/mL). Neki proizvođači kvasaca precizno preporučuju da se kvasci drže „u čistoj vodi bez hlora tokom 15-30 min pre mešanja“. Drugi proizvođači preferiraju „natapanje kvasca“ u mešavini soka i vode na temperaturi 35-40 °C, jer će pri dodatku soka ćelije kvasca, koje bi teoretski počele pupljenje tokom rehidratacije, imati izvor nutrijenata i mogu se prilagoditi na uslove soka/mošta. Ova procedura može imati prednosti ukoliko rehidratacija traje duže od preporučenih 30 min. Radler i sar. (1985) su u svom najdetaljnijem ispitivanju rehidratacije kvasca za vino, dobili da maksimalne vrednosti temperature za rehidrataciju, pri kojima su ćelije kvasca još uvek vijabilne i vrše fermentaciju, iznose od 38 do 45 °C. U toku 2 sata za rehidrataciju, nije uočena nikakva promena u ovim aktivnostima, ali je sastav rehidratišuće podloge imao bitnog uticaja. Otkriveno je da mešavina soka od grožđa i vode, rastvori koji sadrže šećer, vitamine ili soli imaju uticaj na metaboličku aktivnost rehidratisanog kvasca. Najbolja aktivnost je postignuta rehidratacijom u 1% rastvoru KCl. Rehidratacija u više od 50% soka se ne preporučuje zbog osmotskog pritiska, niskog pH i ponekad visokih koncentracija SO2 ili fungicida.

5

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

2.4.2. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca primenom rehidratišućeg nutrijenta Studije koje su sproveli Fornairon-Bonnefond i sar. (2002) pokazale su pozitivan uticaj specifičnih sterola tokom faze rehidratacije na strukturu plazmatske membrane, što rezultuje boljim kapacitetom fermentacije, pogotovo u teškim uslovima u vinu. Beker i sar. (1984), su ukazali na to da,pošto su membrane pod stresom tokom procesa dehidratacije i rehidratacije, kvasac mora da mobiliše lipidne rezerve za obnavljanje. Soubeyrand (2005) je dokazao da kvasac može takođe i da inkorporira ekstracelularne lipide, uključujući i sterole, što je interesantno jer ovi molekuli mogu da igraju važnu ulogu u vitalnosti ćelije kvasca i u poslednjim fazama alkoholne fermentacije (Luparia i sar. 2004). U grožđanom moštu steroli su prisutni u obliku fitosterola, ali njihova priroda se razlikuje od sterola koji su sintetisani u kvascima tokom rasta. Zbog razlike u hemijskoj strukturi, ovi fitosteroli nisu dovoljni za zagarantovan integritet kvasca tokom cele alkoholne fermentacije (Luparia i sar. 2004). Soubeyrand (2005) je proučavao mogućnost inkorporiranja specifičnih kvasnih sterola tokom rehidratacije tako što je u medijum za rehidrataciju dodavao specifične inaktivirane kvasce koje su bogati sterolima. Uticaj rehidratacije ADY u prisustvu mikronitrijenata i/ili sterola i nezasićenih masnih kiselina iz obogaćene suspenzije inaktiviranih kvasaca imalo je neverovatan uticaj na vijabilnost kvasaca (Kontkanen 2004). Korišćenjem ovog tipa rehidratacije primećena je povećana maksimalna gustina ćelija kvasca (Slika 1) i kraći ukupni period fermentacije (Slika 2), naročito u uslovima visoke koncentracije šećera. Uticaj na kasniji učinak kvasaca je odličan. Preporučen postupak za rehidrataciju kvasca korišćenjem rehidratišućeg nutrijenta prikazan je u Tabeli 3.

Slika 1 | Uticaj rehidratacije ADY u suspenziji inaktiviranog kvasca, obogaćenoj mikronutrijentima i sterolima, na vijabilnost ćelija na kraju alkoholne fermentacije (potencijalni sadržaj alkohola 14% vol., temperatura fermentacije 28 °C). Plava linija predstavlja kontrolni uzorak (rehidratacija bez dodataka): 28 × 106 CFU/mL (42%). Crna linija predstavlja rehidrataciju u prisustvu specifičnih rehidratišućih nutrijenata: 42 × 106 CFU/mL (50%)

6

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

Slika 2 | Promena količine oslobođenog CO2 od strane Saccharomyces cerevisiae soja EC1118 u Chansan moštu (240 g/L šećera i 266 mg/L slobodnog amino azota) poređenje rehidriranih ADY u suspenziji inaktiviranih kvasaca obogaćenih mikronutrijentima i sterolima, i standardne rehidratacije u vodi. Plava linija je kontrola (rehidratacija bez dodataka); Crna linija predstavlja rehidrataciju u prisustvu specifičnih rehidratišućih nutrijenata. Fermentacija je vođena u fermentorima zapremine 1,1 L u izotermskim uslovima (28 °C) uz lagano mešanje (Sablyrolles 1993). Stopa proizvodnje CO2 je automatski računata na osnovu masenog bilansa fermentora, izražena je u funkciji vremena. Tabela 3 | Uputstvo za optimalnu rehidratacaiju kvasca primenom rehidratišućeg nutrijenta za inokulaciju 100 hL mošta Korak Radnja Suspendovati 3 kg (30 g/hL) rehidratišućeg nutrijenta za kvasac u 20 puta većoj 1 masi čiste vode (43 °C). Kada se temperatura rastvora nutrijenta za rehidrataciju spusti na 40 °C, dodati 2,5 2 kg aktivnog suvog kvasca (25 g/hL). Lagano promešati kako bi se razbile eventualno prisutne grudvice. Ostaviti suspenziju da odstoji 15-30 min i ponovo lagano promešati. U toku od 5 min polako sjediniti masu mošta za fermentaciju sa suspenzijom 3 kvasca. Ovo će pomoći kvascu da se prilagodi na hladniju temperaturu mošta i izbeći će se šok na hladnoću koji se može desiti kada temperatura naglo padne za više od 10 °C. Ovaj korak temperiranja trebalo bi ponoviti ukoliko je temperatura mošta izuzetno niska. Svaki stepen temperiranja trebalo bi da traje oko 5 min. Kada se počne punjenje sudova moštom, dodati suspenziju kvasca na dno 4 fermentora

2.4.3. Primena više sojeva Saccharomyces cerevisiae kao starter kulture Sponatana alkoholna fermentacije obično je vođena od strane više sojeva kvasaca. Nove molekularne biološke metode omogućavaju određivanje različitih populacija kvasaca u prirodnim „divljim“ fermentacijama u zavisnosti od faze fermentacije. Učinak različitih

7

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

sojeva kvasca može stvoriti veću kompleksnost arome vina na kraju, kako u pozitivnom tako i u negativnom smislu. Pored preporuka za postizanje kompleksnosti u kontrolisanim uslovima, pripremom odvojenih fermentacija sa odabranim sojevima kvasca i naknadnim spajanjem fermenata različitih kultura Saccharomyces cerevisiae, razvijene su i tehnike kojima se imitira raznolikost spontane alkoholne fermentacije. Sojevi kvasca se proizvode kao pojedinačne kulture, a konačna kombinacija se dobija mešanjem suvih čistih kultura. Ipak, tržište za mešane kulture Saccharomyces cerevisiae je malo zbog različite uspešnosti ovakvih inokulacija. Zbog različitosti matriksa sok/vino, uslovi u vinu mogu da više pogoduju jednom od sojeva i da omoguće njegovu dominaciju, kao i da negativno utiču na interakcije između sojeva, što na kraju utiče na senzorne karakteristike dobijenog vina.

2.4.4. Inokulisanje grožđanog mošta sa Saccharomyces i ne-Saccharomyces sojevima U nekim slučajevima vina koja se proizvode pomoću čistih mono-kultura nemaju kompleksnost ukusa kao što daju dobre prirodne fermentacije. Ali divlje fermentacije zahtevaju veću opreznost i predstavljaju rizik, mogu dovesti do stvaranja neprijatnih ukusa ili nepotpunih fermentacija sa visokim koncentracijama rezidualnog šećera, a sve to zbog prisustva pretežno nepoželjnih ne-Saccharomyces sojeva. Sojevi koji mogu obilno da rastu u vinu, a koji imaju potpuno aerobni metabolizam ili su slabo fermentujući organizmi (npr. Pichia membranifaciens, Pichia anomala i Candida spp.) su poznate po tome što formiraju film na velikim površinama vina i u polupopunjenim tankovima u kojima se ne nalazi dovoljno sulfita za sprečavanje njihovog rasta (Ocón i sar. 2010). Neke studije (Loureiro i Malfeito-Ferreira, 2003) su pokazale da sojevi kvasaca poput Dekkera/Brettanomyces spp., Zigosaccharomyces bailii i Saccharomycodes ludwigii, predstavljaju najopasnije sojeve za vino jer uzrokuju njegovo kvarenje. Ipak, ovi sojevi se retko nalaze na grožđu i u moštu vina. Nedavna istraživanja vina su otkrila „egzotične“ sojeve ne-Saccharomyces kvasaca i pružila veće saznanje o njihovom stvarnom uticaju na senzorni profil vina (Ciani 1997). Neki od ovih sojeva, kao što su Pichia fermentans, Candida stellata ili Torulaspora delbrueckii, proučavani su zbog svojih interesantnih organoleptičkih doprinosa (Clemente-Jimenez i sar. 2005; Ciani i Ferraro 1996; Moreno i sar. 1991). Iako neki od ovih sojeva mogu da doprinesu bukeu vina, većina njih nije sposobna da dovrši alkoholnu fermentaciju. Iz tog razloga je proučavano uključivanje sojava Saccharomyces cerevisiae sa ne-Saccharomyces sojevima kako bi se prevazišao ovaj nedostatak. Prve mešovite komercijalne Saccharomyces cerevisiae/ne-Saccharomyces starter kulture predstavljene su početkom XXI veka sa različitim uspehom usled nepredvidivih interakcija između populacija kvasca, koje su bile indukovane matriksom vina koji pospešuje dominaciju jednog soja u odnosu na druge. Nedavna studija koju su sproveli Languet i sar. (2006) pokazala je da se dobar uspeh može ostvariti reprodukovanjem prirodnog nasleđa populacije kvasaca sa sekvencijalnom inokulacijom prvo ne-Saccharomyes sojeva a zatim dodavanjem

8

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

dobro fermentišućih sojeva Saccharomyces cerevisiae u kasnijim fazama alkoholne fermentacije. Ova sekvencijalna inokulacija pokazala je ne samo bolje rezultate u pogledu intenziteta, već i senzorne kompleksnosti. Primena starter kultura kvasaca u proizvodnji penušavih vina: za proizvodnju penušavih vina ili vina tipa šampanjca koriste se suve i tečne starter kulture kvasaca za sekundarnu fermentaciju u boci. Tečne kulture moraju se napraviti u sterilnim uslovima ne samo da bi se povećala zapremina inokuluma, već i da bi se prilagodili teškim uslovima u bazi penušavog vina. Takođe je neophodno i aklimatizovati kulture aktivnog suvog kvasca pre inokulacije za sekundarnu fermentaciju, jer direktno dodavanje suspenzije rehidratisanog kvasca u medijum koji sadrži veće koncentracije alkohola može da ošteti ćelije kvasca. I u ovom slučaju postoje varijacije protokola, a jedna široko primenjena je opisana dole:  Rehidratisati ADY prema uputstvu proizvođača, poželjno uz prisustvo rehidratišućeg nutrijenta  Dodati suspenziju kvasca u deo baze penušavog vina (3-10% ukupne zapremine) uz dodatak soka od grožđa (do 50 g/L) ili šećera (50-100 g/L) i amonijum fostata (0,5-2 g/L). Varijacija tradicionalne metode pripreme starter kulture sastoji se u upotrebi smeše jednakih delova baze vina, vode i tiražnog likera (Wilkinson 1986).  Aklimatizovati tokom 12-20 h (kvasci počinju da proizvode alkohol) na 20-25 °C. Suspenzija se mora povremeno promešati kako bi kiseonik stimulisao rast kvasca. Ako su uslovi veoma otežani ili je temperatura baze vina veoma niska, aklimatizovanje se može izvesti i na konstantno niskim temperaturama.  Opet, neophodno je izbegavati temperaturne razlike veće od 5 °C pri prenošenju suspenzije aklimatizovanog kvasca u konačnu zapreminu vina.

2.4.5. Primena starter kultura kvasaca za nedovršene fermentacije Dr. Paul Monk je govorio: „Najbolje rešenje za nepotpunu fermentaciju jeste njena prevencija“. Problemi se javljaju zbog izbistravanja mošta, niske temperature fermentacije, visokih temperatura pogotovo u prisustvu alkohola, nedostatka azota, mikro-nutrijenata, sterola, visokih koncentracija šećera ili alkohola, negativnoh interakcija sa drugim mikrobima u vinu, rezidua prskanja. Različiti faktori mogu imati negativan uticaj na vitalnost kvasaca (Dittrich 1977), i koliko god okolnosti može da uzrokuje nedovršene alkoholne fermentacije, toliko je protokola proučeno i preporučeno za ponovno pokretanje nedovršene fermentacije (Graf i Bannister 1996; Leske i Henschke 1996; Bisson i Butzke 2000; Fischer 2000). Svi protokoli preporučuju odbacivanje starog kvasca i upotrebu alkohol-tolerantnog, energičnog fermentišućeg soja kvasca, kako bi se ponovo pokrenula nedovršena fermentacija. Većina protokola takođe preporučuje i dodatak SO2 (30 mg/L) i/ili lizozima kako bi se izbegao rast divljih kvasaca ili bakterija koje izazivaju kvarenje. Ako se u vinu očekuju potencijalno inhibotrne supstance, preporučuje se i dodatak 25 g/hL inaktiviranog kvasca (LafonLafourcade i sar. 1984). Nakon što se inaktivirani kvasac istaloži (oko 48 h) vino se mora odliti ili filtrirati. Priprema novog kvasca varira među različitim proizvođačima kvasaca i

9

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

istraživačkih grupa. Grossmann je u poglavlju 7.6. knjige o mikrobiologiji vina (2005) dao 4 različite preporuke koje su objavljene u literaturi o vinu. Lallemand preporučuje: 1. Rehidratacija kvasca za spašavanje (50 g/hL) u rehidratišućem nutrijentu: odgovarajuća količina rehidratišućeg nutrijenta za kvasac iznosi 1,25 puta veću masu od mase kvasca koja će se koristiti. Suspenziju rehidratišućeg nutrijenta rastvoriti u 20 puta većoj masi čiste vode na temperaturi od 45 °C, uz lagano mešanje, omogućavajući rastvoru da se ohladi do 40 °C. Kvasac se zatim pospe po suspenziji uz lagano mešanje kako bi se izbeglo stvaranje grudvica. Ostaviti suspenziju da odstoji 15-30 min. 2. U međuvremenu, u drugoj posudi pripremiti smešu starter kulture sa 2,5% zapremine vina sa nedovršenom fermentacijom i 2,5% zapremine vode i kompletnog kvasnog nutrijenta (mešavina 50 g/hL vina i vode). Koncentracije šećera podesiti na 5 Brix (50 g/L) pomoću soka, koncentrata ili šećera. Temperaturu smeše podesiti na 25-30 °C. 3. Suspenzija rehidratisanog kvasca za ponovno pokretanje fermentacije mora se polako dodavati u smešu vino/voda/šećer. Temperaturu bi trebalo održavati na 15-30 °C. Nivo šera se prati i kada opadne za polovinu (oko 2,5 Brix odn. 25 g/L) vino sa nedovršenom fermentacijom se dodaje starter kulturi u šaržama od po 20% od ukupne zapremine vina (ukupno 5 dodavanja starter kulturi). Temperaturu bi tada trebalo održavati između 20 i 25 °C. Veoma je bitno da se izbegne potpuna konverzija šećera pre dodatka nove šarže. Jedino je dozvoljeno da se pre dodatka poslednje šarže vina sa nepotpunom fermentacijom utroši sav šećer. Pre deset godina Gafnerova grupa (Sütterlin et al. 2004) predložila je upotrebu Zygosaccharomyces bailii za povratak odnosa glukoza-fruktoza na nivo iznad 0,1 zbog svog fruktofilnog karaktera. Najbolji rezultati su dobijeni kada je soj Zygosaccharomyces bailii inokulisan zajedno sa sojem Saccharomyces cerevisiae jer je Zygosaccharomyces bailii gubio vijabilnost nakon korekcije glukoza-fruktoza odnosa, i tada soj Saccharomyces preuzima fermentaciju vina do suvoće. Prve starter kulture Zygosaccharomyces bailii za restartovanje nedovršene alkoholne fermentacije predstavljena je na nemačkom tržištu 2007. godine. Još jedan inovativni pristup jeste primena imobilizovanih sojeva kvasca Saccharomyces cerevisiae koji su odabrani na osnovu svojih fermentacionih mogućnosti i visoke tolerancije na alkohol. Jedna od tipičnih načina imobilizacije jeste inkapsuliranje koje podrazumeva oblaganje mikroorganizama u alginatni matriks (prirodni polisaharid koji se ekstrahuje iz morskih algi). Inkapsuliranje omogućava supstratu i metabilitima da lako difunduju kroz matriks gela bez otpuštanja ćelija kvasca u mošt ili vino. Prednost ove tehnike jeste u tome što se kvasac može lako inokulisati i odstraniti iz vina nakon konvertovanja šećera u alkohol.

10

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

3. Primena bakterijskih starter kultura Dugo vremena je spontano opadanje kiselosti vina bilo povezano samo sa taloženjem tartarne kiseline, iako je još 1891. Müller-Thurgau pretpostavio da smanjenje kiselosti može biti usled bakterijske aktivnosti. Godine 1913. Müller-Thurgau i Osterwalder, su svojim epohalnim ispitivanjem bakterija mlečne kiseline u vinu, objasnili bakterijsku degradaciju jabučne kiseline u mlečnu i CO2 prema formuli: C4H6O5 = C2H6O3 + CO2 Ovaj fenomen su nazvali biološka deacidifikacija ili malolaktička fermentacija, a Bacterium gracile je opisan kao odgovorni organizam. Od ovih ranih otkrića, istraživanje bakterija mlečne kiseline (LAB – Lactic Acid Bacteria) je napredovalo. Ime Bacterium gracile koje je u prošlosti često korišćeno za imenovanje organizma koji je zaslužan za malolaktičku fermentaciju, je revidirano. Radler (1963) je dokazao da bakterije mlečne kiseline koje se nalaze u moštu i vinu pripadaju rodovima Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus, a nešto novija istraživanja su dokazala i Oenococcus (Dicks i sar. 1995). Različite LAB dospevaju u grožđani sok i vino sa površine grožđa, stabljika, lišća, zemljišta i opreme u vinarijama. Ipak, usled visoko selektivnih uslova u različitim sokovima i vinima, samo nekoliko tipova LAB može da raste u vinu (Wibowo i sar. 1985). Proučavanja u nekoliko država pokazala su da je Oenococcus oeni predominantna vrsta koja vrši malolaktičku fermentaciju u vinu, iako u kompoziciji LAB na početku fermentacije dominiraju sojevi Lactobacillus. Istorijski posmatrano, MLF je opisana kao fenomen koji je nepredvidiv i nedovoljno razumljiv, ali od velike važnosti za krajnji proizvod. U nedavnoj prošlosti vinari su bili zadovoljni prepuštanjem prirode da ide svojim tokom i jednostavno su čekali da se MLF odigra spontano (Rich Morenzoni 2005). Ovo strpljenje je bilo ključno za komentare u vezi sa MLF tipa „ne odigrava se kad ja to hoću“ i „ne sviđa mi se šta napravi u vinu“. Nedavno istraživanje MLF pomoglo nam je da bolje razumemo ovaj proces biološke deacidifikacije vina i limitirajuće faktore u vinu koji su odgovorni za učinkovitost bakterija mlečne kiseline koje vrše ovu biotransformaciju. „Kada se susretnemo sa vinom koje je prošlo kroz spontanu malolaktičku fermentaciju, to znači da su bakterije mlečne kiseline prevazišle sve poteškoće koje su se javile tokom njihovog boravka u vinu. Ipak, to ne znači da će nam ove bakterije dati MLF koju možemo da predvidimo, niti će nam omogućiti baš onu koja pozitivno utiče na senzorne i organoleptičke osobine koje mi želimo. To jedino znači da su bakterije mlečne kiseline prisutne u vinu, i da one, a ne vinar, imaju ultimativnu kontrolu na kvalitet gotovog proizvoda“ (Rich Morenzoni 2005).

11

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

3.1. Selekcija i karakterizacija bakterija mlečno-kiselog vrenja za pripremu starter kultura u proizvodnji vina Oslanjanje na autohtone sojeve bakterija da na vreme dovrše poželjnu malolaktičku fermentaciju može biti nepouzdano, čak i pri niskim pH vrednostima u moštu i vinu. Čak i kada su poželjne bakterije jabučne kiseline nastanjene u vinarijama, za početak malolaktičke fermentacije može biti potrebno i do nekoliko meseci, i može se dogoditi da se javi samo u nekim buradima i tankovima dok u drugim ne. Iz tog razloga, preferira se opcija pokretanja MLF primenom odabranih starter kultura bakterija. Oenococcus oeni je organizam izbora za MLF, ali nisu svi sojevi ove bakterije dobri kandidati za primenu kao starteri. Odabir soja Oenococcus oeni, koji je najbolji u pogledu učinka i proizvodnje najinteresantnijeg ukusa, je višestruk i složen zadatak (Bou i Powell 2005). Važno je da se izoluju i kultivišu samo prirodni sojevi malolaktičkih bakterija (MLB). Tako su Ruiz i sar. (2010) vršili su selekciju autohtonih sojeva O. oeni prema njihovim enološkim osobinama i rezultatima vinifikacije. Analiziranli su 84 soja O. oeni koji su bili predstavnici svakog velikog klastera dobijenog u dendogramu iz prethodne studije biodiverziteta (Izquierdo i sar. 2009). Vina koja imaju prirodno selektivni niski pH, nisku temperaturu u podrumu, visoku koncentraciju alkohola i SO2, koriste se kao izvor izolata malolaktičkih bakterija. Fiziologija i genetski profil novih sojeva i sojeva od interesa određuju se u laboratoriji i pilot vinarijama. Jedan od prvih kriterijuma za izolat odabranih bakterija jeste sposobnost da podnese rigorozni stres kojem se izlaže tokom proizvodnje vina (Bou i Powell 2005) kao i korak liofilizacije (freeze-drying). Pored visoke rezistentnosti na limitirajuće uslove u vinu kao što su pH, alkohol, SO2 i temperatura, bakterije se biraju i na osnovu željenih metaboličkih aktivnosti i odstustva neželjenih osobina (Tabela 4). Tabela 4 | Kriterijumi za selekciju malolaktičkih bakterija za proizvodnju vina Poželjni Nepoželjni            

Tehnološke karakteristike: Otpornost na stres tokom proizvodnje Otpornost na liofilizaciju Otpornost na niski pH Visoka tolerancija na alkohol Visoka tolerancija na SO2 Dobar učinak na niskim temperaturama Kratka lag-faza Brza razgradnja jabučne kiseline Dobra tolerancija na kiseonik Tolerancija na pesticide Povećana rezistencija na lizozime Proizvodnja bakteriocina

Tehnološke karakteristike:  Formiranje velikih količina egzopolisaharida  Domaćini pro-faga  Previsoka tolerancija na SO2  Prebrza degradacija jabučne kiseline (ima ulogu u crvenom vinu i za stabilizaciju boje)

   

Kvalitativne osobine: Aktivnost β-glukozidaze Aktivnost esteraze Proizvodnja prijatnih voćnih aroma Smanjenje vegetativnih nota

Kvalitativne osobine:  Proizvodnja biogenih amina  Proizvodnja etil karbamata  Proizvodnja komoponenti S-derivata  Proizvodnja isparljivih kiselina

12

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

        

Zaokruživanje osećaja u ustima Smanjenje adstrigentnosti Smanjenje gorčine Povećanje kompleksnosti Smanjenje ukupnog SO2 (razgradnja acetaldehida i keto-komponenti) Proizvodnja acetaldehida (stabilizacija boje crvenog vina) Proizvodnja umerenih količina diacetila Proizvodnja butandiola Niski afinitet prema glukozi

 Proizvodnja etil acetata  Proizvodnja mirisa na miševinu  Proizvodnja nestabilnih fenola  Proizvodnja neprijatnih ukusa poreklom od geranijuma  Proizvodnja (prekomernih količina) diacetila  Brza degradacija limunske kiseline  Proizvodnja/degradacija acetaldehida  Degradacija limunske kiseline

3.2. Priprema malolaktičke starter kulture Kontrola malolaktičke fermentacije, koja je sastavni deo procesa proizvodnje vina, često je bila ignorisana, sve dok nisu postale dostupne malolaktičke starter kulture. Tečne ML kulture bile su dostupne i koristile su se decenijama sve do ranih 1980-ih, kada su razvijene liofilizirane starter kulture malolaktičkih bakterija. 1990-ih razvijena je tehnika direktne inokulacije liofilizovanih ML starter kultura i njihova upotreba je doslovno revolucionarno uticala na kontrolu i predvidivost malolaktičke fermentacije u vinu (Specht 2005). U Tabeli 5 sumirani su parametri koji se odnose na različite tipove ML startera u proizvodnji vina. Na većinu starter kultura koje su dostupne za proizvodnju vina povoljno utiču uslovi čuvanja u frižideru ili zamrzivaču, u njihovom originalnom, neotvorenom pakovanju; ambalaža se ne bi smela otvarati sve do samog momenta upotrebe. Pored toga, bakterije koje su pripremljene liofilizacijom trebalo bi da se drže van kontakta sa kiseonikom, povišenom vlagom i visokim temperaturama, jer ti uslovi štetno deluju na preživljavanje bakterija. Kako bi se obezbedio maksimalni efekat starter kultura ML bakterija uvek se mora pratiti preporuka proizvođača o načinu čuvanja i rukovanja. Dole je predstavljen pregled najčešće korišćenih uputstava za pripremu ML starter kultura: Zamrznute ML starter kulture 1. Odmrznuti u vodi na sobnoj temperaturi, ne u frižideru. Pomešati 3 L vode, 3 L soka od grožđa i 30 g ekstrakta kvasca. Podestiti pH na 4,0 pomoću kalcijum karbonata ili nekog drugog dozvoljenog pufera i dobro promešati. Dodati 170 g odmrznute kulture, zatvoriti balon i dobro promešati. Držati na 18-24 °C tokom 48 h pre inokulacije. 2. Direktno dodati zamrznute pelete u vino. Tečna suspenzija ML starter kultura Koristiti bistar istaložen sok bez dodatog SO2. Ako je moguće, zagrejati sok na 60 °C. Podesiti nivo šećera na 180 g/L dodatkom vode (ako je sok nedostupan, može se zameniti sa 50% gotovog vina (< 10 ppm bez SO2 i niski ukupni SO2), 25% vode i 25% soka od jabuke). Podesiti pH na 3,5-3,6 primenom kalcijum karbonata. Ako je u inokulisanom vinu pH < 3,2

13

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

14

podesiti u međukoraku na 3,4. Dodati kulturu i održavati temperaturu na 22-26 °C. Pratiti do 100% razgradnje jabučne kiseline, zatim uvećati inokulum za 10% u svakoj narednoj fazi. Ako se koristi gotovo vino za pripremu starter kulture onda se starter uvećava tako što se dodaje duplo veća zapremina vina sve dok se ne postigne 5-10% od ukupne zapremine koja se inokuliše. Direktna inokulacija starter kulturama (npr. malolaktičke bakterije MBR® firme Lallemand) Specijalna priprema NIJE POTREBNA, ali se radi olakšanog rukovanja kultura može suspendovati u čistoj vodi bez hlora, na temperaturi od 20 °C, najduže tokom 15 min. Brza build-up starter kultura (1-STEP® pribor) Faza rehidratacije: rastvoriti sadržaj aktivatora u 100 L vode za piće na temperaturi od 18 i 25 °C. Dodati sadržaj kesice sa bakterijama i pažljivo suspendovati uz lagano mešanje. Sačekati 20 min. Faza aklimatizacije: pomešati bakterije i rastvor aktivatora sa 100 L vina, pH > 3,5; temperatura između 20 i 25 °C. Sačekati 18 do 24 h. Preneti aktivnu kulturu u 1000 hL vina. Tradicionalna liofilizirana STANDARDNA starter kultura Rehidratisati u smeši 50:50 voda/vino. Vino bi trebalo da ima pH > 3,3 i ukupni SO2 < 30 mg/L. Pratiti opadanje koncentracije jabučne kiseline, kada se ~2/3 konvertuje u mlečnu kiselinu, proširiti sa dodatkom 5% inokuluma u vino. Pobrinuti se da pH > 3,3 i sadržaj alkohola bude < 12,5%. Pratiti opadanje koncentracije jabučne kiseline, kada se ~2/3 konvertuje u mlečnu kiselinu, proširiti sa dodatkom 4% inokuluma u vino. Tabela 5 | Osobine ML starter kultura (prilagođeno iz Specht 2005) Tip kulture malolaktičkih bakterija Brza build-up kultura Direktna (umnožavanje inokulacija Zamrznuta Tečna u 1 koraku) (MBR) kultura suspenzija Osobina Temp. skladištenja i rok trajanja

Otvorena ambalaža Vreme za pripremu startera Nutritivni suplementi

Do 120 dana na -26 °C ili do 1 godine na -29 °C u zamrzivaču bez leda Nakon otvaranja iskoristiti odmah, ne zamrzavati 48 h pre inokulacije 30 g ekstrakta kvasca na podlogu za

Tradicionalna liofilizirana kultura (standard)

Do 2 dana na sobnoj temp. ili do 2 nedelje na -4 °C

Do 18 meseci na -4 °C ili do 30 meseci na -18 °C

Do 18 meseci na -4 °C ili do 30 meseci na -18 °C

Do 18 meseci na -4 °C ili do 30 meseci na -18 °C

Iskoristiti odmah

Iskoristiti odmah

Iskoristiti odmah

Iskoristiti odmah

desetostruki rast tokom 3-7 dana 1 g ekstrakta kvasca po

0-15 min

18-24 h

3-14 dana

Odgovarajući MLB nutrijenti koji

Odgovarajući aktivator. MLB

Odgovarajući MLB nutrijenti koji

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

Stepen iskorišćenosti

aktivaciju

litru podloge za rast

Crveno vino 1 g/hL; Belo vino 3-8,5 g/hL

2-5% zapremine inokuluma, odn. 5-10% zapremine ukoliko se koristi gotovo vino za pripremu startera.

su preporučeni za zahtevnije uslove MLF. 1 g/hL

nutrijenti koji su preporučeni za zahtevnije uslove MLF. 0,5 g/hL

15

su preporučeni za zahtevnije uslove MLF. 1 g/hL

3.3. Odabir odgovarajuće malolaktičke starter kulture Postoje dve osnovne stavke koje se razmatraju pri odabiru malolaktičke starter kulture: 1. Bezbednost – kompatibilnost kulture sa uslovima u vinu 2. Senzorne osobine – željeni doprinos različitih ML sojeva Za uspešno pokretanje malolaktičkih fermentacija, najvažnije je da se na što bolji način malolaktičke bakterije pripreme za uslove sredine koji preovladavaju u vinu (Tabela 6). Kako 4 limitirajuća faktora (alkohol, pH, temperatura i SO2) imaju kumulativni učinak na stres bakterija, Lallemand je razvio tablicu, koja omogućava davanje ocene, kumulativnih „bodova“, uticaja različitih parametara u vinu (Tabela 7). Rezultujući TOTAL odgovara nivou otežanosti za početak MLF u vinu: < 13 bodova = povoljna 13-22 bodova = nepovoljna 23-40 bodova = teška > 40 bodova = ekstremno teška U zavisnosti od soja Oenococcus oeni, u uopštenom slučaju starter kulture prilikom direktne inokulacije imaju sledeću toleranciju:  Alkoholna tolerancija < 15 % vol.  pH tolerancija > 3,1  Tolerancija ukupnog SO2 < 60 ppm  Temperaturna tolerancija > 12 °C Pored uslova u vinu koji su opisani u Tabelama 6 i 7, drugi uslovi koji se moraju uzeti u obzir kada se planira selekcija, priprema i inokulacija za MLF podrazumevaju:  Vina koja su imala otežanu alkoholnu fermentaciju imaju veću verovatnoću da ne sadrže dovoljno nutrijenata koji su neophodni za održavanje bakterija tokom MLF.

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

 Limitirani nutrijenti smatraju se jednim od glavnih uzroka nepotpunih malolaktičkih fermentacija.  Što je niži pH u vinu, ispod 3,5 to su veće nutritivne potrebe bakterija za MLF.  Sposobnost bakterija da rastu i vrše MLF drastično opada sa padom temperature vina. U zavisnosti od alkoholnog sadržaja vina, povišene temperature vina mogu takođe da deluju inhibitorno na razvoj i aktivnost ML bakterija. Tabela 6 | Opšta karakterizacija uslova za MLF u vinu Uslovi u vinu za MLF Alkohol (% v/v) pH Slobodni merljivi SO2 (mg/L) Ukupni SO2 (mg/L) Temperatura (°C) Problemi u vezi sa alkoholnom fermentacijom Preporučena metoda za inokulaciju MBR

Povoljna < 13 > 3,4 <8

Teška 13-15 3,1-3,4 8-12

Gruba 15-17 2,9-3,1 12-20

Izuzetno otežana/nepotpuna MLF > 17 < 2,9 > 20

< 30

30-40

40-60

> 60-80

18-22 Nema

14-18 Stres kvasaca

10-14 Spora/prekinuta

< 10

Direktna (MBR) – bez aklimatizacije

Direktna (MBR) ili uz proceduru aklimatizacije

Direktna (MBR) kultura uz proceduru aklimatizacije

MLF se ne odigrava; metod MBR aklimatizacije za inokulaciju vina sa prekinutim MLF

Opšte uputstvo za izbegavanje inhibitornih efekata glasi: 1. Sadržaj alkohola u vinu (% v/v), temperatura za MLF ne bi trebalo da osciluje: manje od 14,5 % 28 °C više od 14,5 % 23 °C 2. Sadržaj isparljivih kiselina u vinu iznad 0,4 g/L (u obliku tartarne kiseline) verovatno će inhibirati malolaktičke bakterije 3. Vina koja se duže od 3 meseca čuvaju na inaktiviranim kvascima najbolje je očistiti pre pokušaja da se sprovede MLF. Postoje razne procedure aklimatizovanja kako bi se prevazišli limitirajući uslovi u vinu. Protokol koji je opisan dalje u poglavlju 3.4. razvijen je u cilju inokulacije MBR priprema bakterija u vina, kako bi se pokrenula zastala malolaktička fermentacija. Tabela 7 | Bodovna tablica za određivanje lakoće fermentacije jabučne kiseline Alkohol (% vol) pH Slobodni SO2 (mg/L) Ukupni SO2

1 poen

2 poena

8 poena

10 poena

Rezultat

< 13 > 3,4 <8

13-15 3,1-3,4 8-12

15-17 2,9-3,1 12-15

> 17 < 2,9 > 15

= = =

< 30

30-40

40-60

> 60

=

16

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

(mg/L) Temperatura 18-22 14-18 ili 10-14 ili < 10 ili = (°C) 18-24 24-29 > 29 Nutritivne Niske Srednje Visoke Veoma = potrebe kvasca visoke = Produžen Bez Prolazni Spora/ Lakoća kontakt problema stres kvasca nepotpuna alkoholne kvasca AF fermentacije Početni nivo 2-4 4-5 ili 1-2 5-7 ili 0,5-1 > 7 ili < 0,5 = jabučne kiseline (g/L) 2-4 4-6 >6 = Maksimalni AF < 2 odnos (max. gubitak Brix/dan) Napomena: Drugi, trenutno manje poznati faktori, koji nisu razmatrani u ovoj bodovnoj tabeli, mogu se odnositi na nivo rastvorenog kiseonika, sadržaj polifenola, sleganje taloga, ostatke pesticida itd. Ukupni rezultat za lakoću malolaktičke fermentacije dobija se kao suma vrednosti iz poslednje kolone.

3.4. Pokretanje zastale malolaktičke fermentacije Vinari su svesni toga da su bakterije Oenococcus oeni, koje su odgovorne za malolaktičku fermentaciju, uspešne samo ako se prilagode teškim uslovima u fermentujućem moštu ili gotovom vinu. Direktno dodavanje MLB sojeva od ozbiljnih proizvođača, koji su odabrani kako na osnovu njihovog doprinosa senzornim osobinama, tako i zbog njihove sposobnosti da se prilagode nepovoljnim uslovima, opisano je ranije. Tokom proizvodnje kultura, ćelije MLB prolaze kroz biofozičko stanje koje indukuje proizvodnju zaštitnog proteina. U ovom fiziološkom stanju, ćelije se prikupljaju i zamrzavaju nakon čega se suše u smrznutom stanju. Kao rezultat toga, dobijaju se ćelije koje su sposobne da razviju prirodnu otpornost na uslove u vinu tako da se direktno mogu dodati u vino bez značajnog gubitka vijabilnosti. Nekad se prekinuta MLF može pokrenuti jednostavnim dodavanjem sveže rehidratisanih kultura MLB. U drugim slučajevima je potrebna nešto veća adaptacija MLB da bi se postigao isti učinak. Ova adaptacija može biti od presudnog značaja za smanjenje uticaja nepovoljne sredine u matriksu vina na bakterije, i pospešiti završavanje MLF. Lallemand je u saradnji sa MLF R&D timom u Australiji radio na razvijanju strategije aklimatizovanja MLB za dovršavanje zastalih malolaktičkih fermentacija u vinu. Protokol adaptacije za rukovanje zastalim malolaktičkim fermentacijama (Specht 2005) I Faza  Izvršiti predtretman vina i podesiti temperaturu  Pripremiti vino sa zastalom MLF odstranjivanjem taloga, potencijalnih inhibitornih toksina i inhibitornih organizama kvarenja. Male količine SO2 i/ili lizozim (ili

17

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

filtracija) mogu biti neophodni kako bi se kontrolisale nepoželjne bakterije Lactobacillus ili Pediococcus.  Lizozim je veoma efikasan u inhibiranju bakterija mlečne kiseline koje uzrokuju kvarenje, naročito ako je pH vina > 3,5. Ukoliko se koristi lizozim, mora se voditi računa da ne ostaje nikakva rezidualna aktivnost u tretiranom vinu pre inokulacije malolaktičkih bakterija. U vinu sa zastalom MLF za koje se sumnja da sadrži supstance koje su toksične za MLB, preoručuje se predtretman sa inaktiviranim reziduama kvasca (inaktivirani kvasci) u koncentraciji 6,25-12,5 g/hL. Pripremiti suspenziju inaktiviranih kvasaca u vodi ili vinu, i zatim dodati u vino sa zastalom MLF uz mešanje.  Konačno, podesiti temperaturu vina sa zastalom MLF na18-22 °C (65-72 °F) Lizozim je enzim koji se ekstrahuje iz belanceta jajeta a ima dokazano dejstvo na bakterije mlečne kiseline. Postoje primeri koji ukazuju na to da korišćenje lizozima može da spreči MLF i kada se koriste manje količine SO2. Prema Gerbaux i sar. (1998), dodavanje SO2 može biti smanjeno kada je prisutan lizozim u vinu i dovoljna mikrobiološka zaštita postiže se i sa 30 ppm slobodnog SO2. Korišćenje lizozima nema nikakvog direktnog uticaja na alkoholnu fermentaciju. Kada se uzima u obzir da li koristiti lizozim u belom vinu, trebalo bi uzeti u obzir sledeće činjenice (Preuzeto sa www.pavin.hr):  Lizozim nema antioksidativno dejstvo. Znači SO2 se ne može kompletno izostaviti.  Pošto lizozim ima proteinsku strukturu, tretman bentonitom će ga odmah inaktivirati.  Lizozim je protein, i njegovo delovanje prestaje nakon nekoliko nedelja. Znači lizozim može biti blokiran ili inhibiran za vreme vinifikacije, a vino se mora filtrirati pre punjenja u flaše kako bi se sprečila MLF u flaši.  Aktivnost lizozima opada sa smanjenjem pH.  Postoji rizik od kontaminacije kada se kupažiraju tretirana i netretirana vina.  Inaktivirani lizozim će preostati u vinu. Zbog proteinske strukture lizozima, tretirana vina će pokazati pozitivnu reakciju tokom zagrevanja. Međutim, brojni eksperimentikroz nekoliko godina nisu pokazali proteinsku nestabilnost vina u flaši.  Najveća korist upotrebe lizozima uočava se u sanitarnom enološkom pogledu vina. UPOZORENJE: Dodatak metavinske kiseline, u svrhu stabilnosti vina na tartarate, u vina tretirana lizozimom prouzrokovaće jače zamućenje vina. II Faza Napomena: Dole navedene zapremine odnose se na 10.000 L vina sa zastalom MLF. Aklimatizovati kulturu bakterija u tri koraka: 1. Pripremiti medijum za aklimatizovanje:  Pomešati: - 10 L soka od grožđa (bez SO2) - 10 L vode (bez hlora) - 20 L vina sa zastalom MLF  Nakon dodatka svih sastojaka podesiti pH između 3,6 i 4,0. Temperaturu podesiti na 25-30 °C.

18

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

2. Rehidratacija starter kulture ML bakterija:  Podesiti temperaturu vode za piće (bez hlora) na 22-25 °C. Suspendovati 1 kg rehidratišućeg nutrijenta za ML u 5 L vode.  Rehidratisati 100 g malolaktičkih bakterija direktnom inokulacijom u 5 L suspenzije voda/nutrijent.  Ostaviti suspenziju bakterija da odstoji 15 min. 3. Aklimatizovanje rehidrirane kulture malolaktičkih bakterija  Pomešati medijum za aklimatizaciju (iz 1. koraka) sa rehidriranim malolaktičkim bakterijama (iz 2. koraka).  Ostaviti malolaktičke bakterije da se aklimatizuju na 22-25 °C najmanje tokom 2 h a najviše tokom 4 h.  Nakon ovog prvog stepena aklimatizacije, udvostručiti zapreminu aklimatizovane kulture vinom sa zastalom fermentacijom (npr. u 50 L kulture dodati 50 L vina). Ukoliko nije moguće analizirati sadržaj jabučne kiseline na licu mesta, u cilju praćenja MLF, može se pretpostaviti da će inokulisana kultura biti spremna za 4-6 h. Razvoj CO2 trebalo bi da bude očigledan i/ili trebalo bi da se oseti blagi mlečni miris. Ukoliko je dostupna brza analiza jabučne kiseline, 50-70% bi se trebalo, pre početka III faze, konvertovati u mlečnu kiselinu. III Faza  Dodati ML nutrijent i aklimatizovanu kulturu iz II faze u vino sa zastalom fermentacijom.  Pre inokulacije dodati nutrijent (20 g/hL) u vino. Cilj je da se prevaziđu eventualni nedostaci hranljivih materija i da se smanji rizik od rezidualnih nutrijenata u vinu.  Uz lagano mešanje, kako bi se izbegla prekomerna aeracija, prebaciti aklimatizovanu kulturu malolaktičkih bakterija u 10.000 L vina sa zastalom MLF. Preporučuje se redovno praćenje nivoa jabučne kiseline (svake 2 nedelje) i nestabilnih kiselina (jednom nedeljno).

3.5. Doprinos malolaktičke starter kulture senzornom kvalitetu vina Uloga svake isparljive komponente kao mirisa u kompleksnoj aromi vina može se opisati u vidu jednog ili više senzornih opisa (Franco i sar. 2004). Pored toga, kao što su i drugi autori navodili (Gomez-Mıguez i sar. 2007; Muñoz i sar. 2007; Peinado i sar. 2006), mirisne (ili aromatične serije se mogu definisati grupisanjem svih isparljivih komponenti sa sličnim senzornim osobinama; može se izračunati opšti OAV (Odour Activity Value) svake aromatične serije sabiranjem OAV pojedinačnih komponenti. Na taj način može se uspostaviti mirisni profil vina crtanjem grafika svih opštih OAV od svake aromatične serije; dobijenni „OAV aromatični krug“ omogućuje povezivanje kvantitativnih osobina, dobijenih

19

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

hemijskom analizom, sa senzornim percepcijama, i pruža validno sredstvo za upoređivanje aromatskih profila vina (Capone i sar. 2013). Smanjenje kiselosti vina i modifikacija njegovog ukusa usled sekundarne bakterijske fermentacije, često se smatraju beneficijom za kvalitet vina. Prednost indukcije malolaktičke fermentacije (MLF) inokulacijom odabranih sojeva bakterija mlečne kiseline je dvostruka. Prvo, bolja je kontrola vremena i brzine konverzije jabučne kiseine; i drugo, pozitivno utiče na ukus i kvalitet vina. Istraživanja tokom poslednjih godina pokazala su pozitivan učinak specifičnih bakterija starter kultura i uslova, uključujući brzinu i vreme inokulacije za MLF, na senzorni profil belog, crvenog i roze vina. Metabolička aktivnost malolaktičkih bakterija (MLB), kao i kinetika MLF, utiču na profil vina u zavisnosti od različitih tehnika proizvodnje vina, fizičkog i hemijskog sastava vina (pH, alkohol, temperatura, sadržaj limunske kiseline, SO2 i aeracija) i prisustva taloga (Lallemand Winemaking Update 01/2007). Malo toga se zna o uticaju stresa poput pH i etanola na mogućnost proizvodnje isparljivih aromatičnih komponenti od strane LAB (Knoll i sar. 2011). Olguín i sar. (2009) su ispitivali uticaj sadržaja etanola i vrednosti pH na ekspresiju gena za citratni ciklus u O. oeni i pokazali su da na ekspresiju ovih gena etanol ima velikog uticaja, dok je efekat pH nešto manji.

3.5.1. MLF otkriva arome sorte Od svih bakterija mlečne kiseline koje su aktivne u vinu, Oenococcus oeni je najčešće odgovoran za malolaktičku fermentaciju. Njegov sekundarni metabolizam ima veliog uticaja na senzorne osobine vina (Bartowsky i Borneman, 2011). Analize strukture populacije O. oeni, putem genetske karaterizacije reprezentativnih vrsta, smatra se neophodnim korakom u cilju ispitivanja mikrobiologije MLF u određenim područjima gde se proizvode vina (Borneman i sar. 2012). Iz tog razloga se poslednjih godina radi se na intenzivnijem ispitivanju ovih bakterija. Cappello i sar. (2014) izvršili su bio-molekularnu karakterizaciju autohtonih O. oeni sojeva iz Negroamaro vina. Bakterije O. oeni smanjuju kiselost i modifikuju senzorni profil vina, što povoljno utiče na njegov kvalitet. Na primer, intenziteti cvetnih, voćnih, začinskih i mednih nota arome (Slika 3), povezani su sa povećanjem isparljivih komponenti poreklom od glikozida, koje nastaju tokom MLF. Studija koju su sproveli Ugliano i Moio (2006) potvrđuje ulogu O. oeni u razvoju isparljivih komponenti karakterističnih za sortu. Njihov rad je pokazao da koncentracije ukupnih glikozida drastično opadaju tokom MLF. Dolazi do hidrolize glikozidnih aromatičnih prekursora i kao posledica toga oslobađaju se sortne arome iz grožđa. Važnost ovog fenomena zavisi i od bakterija koje su se koristile za MLF i od sastava vina. Drugim rečima, ekspresija ovih različitih aroma, koje su značajne za ukupnu aromu vina, zavisi ne samo od potencijala sorte grožđa već i od tipa malolaktičke kulture. Ovim se potvrđuju ranija posmatranja uticaja aktivnosti glukozidaze iz MLB. Na primer, tokom MLF aktivnost glukozidaze iz O. oeni dovodi do oslobađanja isparljivih komponenti koje su povezane sa prekursorima arome grožđa, uključujući 3-hidroksidamaskon, α-terpineol, vanilin, metil-vanilat, 4-hidroksibenzoat i tirozol iz Chardonnay ekstrakta (Bartowsky i

20

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

Henschke 2004), kao i linalool, α-terpenol, nerol i geraniol iz Muscat ekstrakta (Ugliano i sar. 2003). Ove studije ukazuju na mogućnost glikozidne aktivnosti O. oeni, i naknadnog oslobađanja grupa aroma tokom MLF, da utiču na pojačavanje senzornih karakteristika vina.

Slika 3 | Krug aroma za senzornu ocenu vina (Preuzeto sa www.chaikenvineyards.com)

3.5.2. Regulisanje diacetila – uticaj brzine inokulacije MLB i vremena dodavanja na profil arome Diacetil je jedna od glavnih aromatičnih komponenti koje nastaju u toku malolaktičke fermentacije, i odgovoran je za note putera i lešnika koje su tipične za MLF. Njegov uticaj je veoma bitan za profil vina, i u zavisnosti od željene vrste vina, može biti željena ili veoma nepoželjna komponenta. I zaista, različite studije koje su sproveli Martineau i Henick-Kling

21

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

(1995) i Bartowsky i Henschke (2004) pokazale su da proizvodnja diacetila od strane različitih sojeva starter kultura O. oeni može rezultovati potpuno drugačijim profilom arome. Pri odabiru malolaktičke kulture kao kriterijum mora se uzeti u obzir potencijal svakog bakterijskog startera za proizvodnju diacetila. Pored diacetila, tip startera koji se odabere može takođe da modifikuje i druge familije aroma. Inokulacija visokim nivoom malolaktičkih kultura ne samo da ubrzava početak i tok malolaktičke fermentacije, već i rezultuje nižim nivoom diacetila. Uopšteno se preporučuje da se vino inokuliše populacijom od 106 CFU/mL kako bi se postigla kritična bakterijska populacija, osigurala brza inicijacija MLF i pravilna razgradnja jabučne kiseline. Krieger (2005 a, b) proučavao je nivo diacetila u Pinot noir vinu gde je MLF inicirana različitim stopama inokulacije malolaktičkih bakterija. Pri niskoj stopi inokulacije od 2 × 104 CFU/mL produžena je lag-faza (14 dana) i proizvedeno je 3,9 mg/L diacetila, dok je inokulacijom 4 × 106 CFU/mL razgradnja jabučne kiseline otpočela momentalno i proizvedeno je 0,8 mg/L diacetila. Inokulisanjem više od 2 × 106 CFU/mL rezultovalo je taloženjem diacetila u vinu sa granicom od skoro 1,5 mg/L za bela i roze vina. Vreme kada se vrši inokulacija može biti jednako važno za krajnje senzorne osobine vina. U saradnji sa DLR Neustadt & Trier pravljena su Rizling vina primenom različitih tajminga inokulacije malolaktičkih kultura (Krieger 2006). Ovi eksperimenti pokazali su da koinokulacija – istovremena inokulacija bakterija i kvasaca – ne utiče na alkoholnu fermentaciju niti na povećanje isparljivih kiselina; ali smanjuje ukupno trajanje MLF. Koinokulisana Rizling vina nisu imala mlečne ili puteraste arome, koje potiču od MLF, ali su imali jak intenzitet isparljivih voćnih aroma. Diacetil koji je proizveden u takvim uslovima, tokom alkoholne fermentacije, momentalno je transformisan u butandiol, koji pri tim koncentracijama nema miris. Ista vina koja su inokulisana kulturama za MLF nakon alkoholne fermentacije imala su tipičniji senzorni karakter za MLF, sa dominacijom nota putera i lešnika dok je voćna aroma nestala. Kontrolna vina bez MLF bila su više kisela, zelena i vegetativna. Nešto novijeg datuma, Cañas i sar. (2012) su ispitivali uticaj vremena inokulacije odabranih autohtonih bakterija mlečne kiseline na senzorne osobine Tempranillo i Merlot vina u Španiji. Vreme koje je bilo potrebno da sadržaj šećera u svakoj vrsti mošta padne ispod 1 g/L i da koncentracija L-jabučne kiseline bude < 0,1 g/L, bilo je mnogo kraće u odnosu na primenu koinokulacije. Sama dužina trajanja MLF, koja je merena kao vreme od inokulacije LAB do smanjenja koncentracije jabučne kiseline, bilo je duže u slučajevima ispitivanja sekvencijalne inokulacije nego ukupno vreme fermentacije pri tretmanu koinokulacijom (Cañas i sar. 2012). Ovi rezultati se podudaraju sa izveštajima drugih autora (Azzolini i sar. 2010; Jussier i sar. 2006; Massera i sar. 2009) i značajni su sa tehnološke tačke gledišta jer je potrebno manje vremena za završavanje procesa proizvodnje vina i potvrđena je rana mikrobiološka stabilnost vina.

22

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

3.5.3. Uticaj post-MLF tehnika u proizvodnji vina na senzorne osobine Izbor između sazrevanja na talogu i filtriranja nakon malolaktičke fermentacije utiče na senzorni profil vina. Kvasci iz taloga mogu da razgrade diacetil, i batonaž može da smanji ili čak eliminiše puterastu aromu. Proizvodnja diacetila se povećava kada je vino u kontaktu sa kiseonikom. Kiseonik doprinosi oksidaciji acetolaktata u diacetil. Nielsen and Richelieu (1999) pokazali su da akumulacija diacetila u semi-aerobnim uslovima može biti i do 6 puta veća nego u anaerobnim uslovima. Pored toga, redukcija diacetila u acetoin i butandiol zavisi od redoks potencijala vina. Niski redoks potencijal je u vezi sa niskim nivoom diacetila.

4. Zaključak Širom sveta dostupno je više od 200 sojeva aktivnog suvog vinskog kvasca, što vinskoj industriji omogućuje značajnu biološku raznovrsnost. Broj komercijalno dostupnih aktivnih suvih malolaktičkih starter kultura je limitiran, ali se od nedavno povećao. Dok kulture aktivnog suvog kvasca uglavnom pripadaju Saccharomyces cerevisiae, starter kulture za pokretanje malolaktičke fermentacije uglavnom se sastoje od Oenococcus oeni. Sojevi kvasaca i bakterija odabrani su na osnovu njihove tolerancije na limitirajuće uslove u vinu, njihovih senzornih i enoloških sposobnosti da isprate kreativne i bezbednosne zahteve u savremenoj vinskoj industriji. Od suštinske važnosti je neophodno znati koji su parametri vina i osobine starter kultura kako bi se odabrao odgovarajući soj kvasca, bakterije i odgovarajući način ishrane u cillju pogađanja grožđa, fermentacionih uslova i zadatih stilskih ciljeva. Različiti komercijalni sojevi Saccharomyces cerevisiae su do sada primenjivani u proizvodnji vina, u nastojanju da se postigne dominanta populacija željenog soja za početak fermentacije i da se osigura potpuno iskorišćenje šećera (Carrau i sar. 2010). U budućnosti možemo se susresti sa zahtevima za primenu drugih sojeva kvasaca, pored Saccharomyces cerevisiae ili kultura bakterija mlečne kiseline koje nisu Oenococcus oeni.

23

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

5. Literatura Osnovna literatura: König H., Unden G., Fröhlich J. (editors), 2008. Biologyo f Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine, Springer, Heidelberg, Germany, pp. 489-510.

Dopunska literatura: Azzolini M., Tosi E., Vagnoli P., Krieger S., Zapparoli G., 2010. Evaluation of technological effects of yeast–bacterial co-inoculation in red table wine production. Italian Journal of Food Science 3 (22), 257-263. Bartowsky E.J., Borneman A.R., 2011. Genomic variations of Oenococcus oeni strains and the potential to impact on malolactic fermentation and aroma compounds in wine. Applied Microbiology and Biotechnology, 92, 441-447. Borneman A.R., McCarthy J.M., Chambers P.J., Bartowsky E.J., 2012. Comparative analysis of the Oenococcus oeni pan genome reveals genetic diversity in industrially relevan pathways. BioMed Central Genomics 13: 373. Cañas P. M. I., Pérez-Martín F., Romero E. G., Prieto S. S., Herreros M. L. P., 2012. Influence of inoculation time of an autochthonous selected malolactic bacterium on volatile and sensory profile of Tempranillo and Merlot wines. International Journal of Food Microbiology, 156, 245-254. Capone S., Tufariello M., Siciliano P., 2013. Analytical characterization of Negroamaro red wines by “Aroma Wheels”. Food Chemistry, 141, 2906-2915. Cappello M. S., De Domenico S., Logrieco A., Zapparoli G., 2014. Bio-molecular characterisation of indigenous Oenococcus oeni strains from Negroamaro wine. Food Microbiology, 42, 142-148. Carrascosa A. V., Muñoz R., González R. G. (editors), 2011. Molecular Wine Microbiology, Acadamic Press, Madrid, Spain, pp. 279-302. Carrau F., Medina K., Fariña L., Boido E., Dellacassa E., 2010. Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum size on wine fermentation aroma compounds and its relation with assimilable nitrogen content. International Journal of Food Microbiology, 143, 81-85. Franco M., Peinado R. A., Medina M., Moreno J., 2004. Off-vine grape drying effect on volatile compounds and aromatic series in must from Pedro Ximénez grape variety. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3905-3910. Gerbaux, V., Gerland, C., Villa, A., 1998. Le Lysozyme: Nouvel outil biotechnologique pour maîtriser les bactéries lactiques. Revue des Œnologues, 93, 44-46. Gomez-Mıguez J. M., Cacho J. F., Ferreira V., Vicario I. M., Heredia F. J., 2007. Volatile components of Zalema white wines. Food Chemistry, 100, 1464-1473. Izquierdo P.M., Ruiz P., Seseña S., Palop M. L., 2009. Ecological study of lactic acid microbiota isolated from Tempranillo wines of Castilla-La Mancha. Journal of Bioscience and Bioengineering, 108, 220-224.

24

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

Jussier D., Morneau A.D., Mira de Orduña R., 2006. Effect of simultaneous inoculation with yeast and bacteria on fermentation kinetics and key wine parameters in cool-climate Chardonnay. Applied and Environmental Microbiology, 72, 221-227. Knoll C., Fritsch S., Schnell S., Grossmann M., Rauhut D., du Toit M., 2011. Influence of pH and ethanol on malolactic fermentation and volatile aroma compound composition in white wines. LWT - Food Science and Technology, 44, 2077-2086. Loureiro V., Malfeito-Ferreira M., 2003. Spoilage yeasts in the wine industry. Review of International Journal of Food Microbiology, 86, 23-50. Massera A., Soria A., Catania C., Krieger S., Combina M., 2009. Simultaneous inoculation of Malbec (Vitis vinifera) musts with yeast and bacteria: effects on fermentation performance, sensory and sanitary attributes ofwines. Food Technology and Biotechnology, 47, 192-201. Muñoz D. M., Penaido R. A., Medina M., Moreno J. 2007. Biological aging of sherry wines under periodic and controller microaerations with Saccharomyces cerevisiae var. capensis: effect of odorant series. Food Chemistry, 100, 1188-1195. http://www.chaikenvineyards.com/http:/www.chaikenvineyards.com/archives/category/vinne z-newsletter (pristup 06.09.2014.) http://www.pavin.hr/clanak/kontrola-malolakti%C4%8Dne-fermentacije-prakti%C4%8Dnipristup (pristup 05.09.2014.) Ocón E., Gutiérrez A. R., Garijo P., López R., Santamaría P. 2010. Presence of nonSaccharomyces yeasts in cellar equipment and grape juice during harvest time. Food Microbiology, 27, 1023-1027. Olguín N., Bordons A., Reguant C., 2009. Influence of ethanol and pH on the gene expression of the citrate pathway in Oenococcus oeni. Food Microbiology, 26 (2), 197203. Peinado R. A., Mauricio J. C., Moreno J. 2006. Aromatic series in sherry wines with gluconic acid subjected to different biological aging conditions by Saccharomyces cerevisiae var. Capensis. Food Chemistry, 94 (2), 232-239. Ruiz P., Izquierdo P. M., Seseña S., Palop M. L., 2010. Selection of autochthonous Oenococcus oeni strains according to their oenological properties and vinification results. International Journal of Food Microbiology, 137, 230-235.

25