Tecnicas Inmunologicas

Técnicas Inmunológicas

Reacción Antígeno - Anticuerpo Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas, hacen que estos métodos se empleen ampliamiente.

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Técnicas Inmunológicas - Clasificación • • • • • • • • •

Técnicas de Precipitación Técnicas de Floculación Técnicas de Aglutinación Electroforesis Técnicas de Fluorescencia y Citometría de Flujo Técnicas de Inmunocromatografía Técnicas Inmunoenzimáticas Técnicas de Radioimnunoensayo Técnicas Quimioluminiscentes LLCH

Técnicas de Precipitación • Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ag como el Ac se encuentren en un medio fluído en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac

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Técnicas de Precipitación Los principales son: 1.- Reacciones de precipitación sobre gel • Pruebas de inmunodifusión • Inmunoelectroforesis 2.- Reacciones de precipitación en disolución • Inmunonefelometría • Inmunoturbidimetría LLCH

Inmunodifusión Radial • Placa de difusión radial de Mancini

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Aplicaciones Clínicas: • Cuantificación de Ig séricas

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

Patrón de identidad parcial

Patrón de identidad LLCH

Inmunoelectroforesis

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Inmunoelectroforesis

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Inmunoelectroforesis

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Inmunoelectroforesis en cohete

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Inmunoelectroforesis en cohete

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Inmunoelectroforesis Bidimensional

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Inmunoelectroforesis Bidimensional

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Contrainmunoelectroforesis

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Contrainmunoelectroforesis

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Inmunonefelometría

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Inmunonefelometria Aplicaciones clínicas:

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IgA • α- 1 antitripsina IgG • Pre – Albúmina Ig M • Haptoglobina Cadenas ligeras totales κ Cadenas ligeras totales λ Fracción complemento C3 • Fracción complemento C4 LLCH

Inmunoturbidimetría

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Inmunoturbidimetría Aplicaciones clínicas:

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Proteína C Reactiva • Ferritina Factor Reumatoide • Dímero D • Microalbuminuria ASL O Transferrina sérica

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Técnicas de Floculación • Reacción de precipitación en la cual se forman los precipitados inmunológicos, que son complejos insolubles formados por la unión de Ac (precipitinas) y Ag (precipitógenos), que se encuentran en solución.

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Floculación

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Floculación Aplicaciones Clínicas: • VDRL • RPR

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Técnicas de Aglutinación • Cuando el antígeno se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar por aglutinado celular o bacteriano formado.

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Aglutinación Aglutinación Directa Aplicaciones Clínicas: • Grupo Sanguíneo • Reacción de Widal - Hudlesson

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Aglutinación Directa

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Aglutinación Aglutinación Indirecta Aplicaciones Clínicas • Test de Coombs Directo • Test de Coombs Indirecto • PCR en latex

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Aglutinación Indirecta Test de Coombs Directo

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Aglutinación Indirecta Test de Coombs Indirecto

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Aglutinación Indirecta Prueba de Látex

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Inhibición de la Aglutinación Aplicaciones Clínicas: • Test de Embarazo

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Inhibición de la Aglutinación

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Inhibición de la Aglutinación

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Aglutinación 1.- Prozona (Exceso de Ac frente al Ag) 2.- Zona de Equivalencia 3.- Postzona (Exceso de Ag)

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Hemaglutinación Aplicaciones Clínicas: • Grupo Sanguíneo • MHA-TP • Waler Rose

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Hemaglutinación

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Hemaglutinación

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Electroforesis • Es el fenómeno de migración de partículas cargadas eléctricamente. • Una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo. • Las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (polo positivo) LLCH

Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Técnicas de Fluorescencia y Citometría de Flujo • Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag – Ac por la fluorescencia emitida.

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InmunoFluorescencia

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InmunoFluorescencia

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Inmunofluorescencia indirecta

Inmunofluorescencia directa

Utiliza un 2° anticuerpo conjugado

Utiliza un solo anticuerpo

Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Antígenos

Anticuerpo 1° Antígenos

Ventajas

El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones

Se necesitan pocos pasos Posibilidad de doble marcación

Desventajas

Se evita la disminución de afinidad del Ac 1°

Menor sensibilidad (nec. mucho Ac 1º) Es necesario purificar el Ac

El Ac puede perder afinidad LLCH

Se necesitan muchos pasos de tinción Con ag múltiples se necesita que los Ac 1º sean de distintas especies

Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo De dispersión

Señales De fluorescencia

Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo Ventajas:

-Realiza múltiples marcajes -Analiza hasta 5000 partículas/segundo

-Analiza intensidad antigénica -Mayor sensibilidad y objetividad

Desventajas:

-Permite almacenar información

- se pierde información sobre arquitectura de tejidos, interacción y medio que los rodea.

Técnicas de Inmunocromatografía • Permite detectar la presencia de Ag y Ac específicos.

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Inmunocromatografía

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Inmunocromatografía

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Inmunocromatografía

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Técnicas Inmunoenzimáticas • Las técnicas inmunoenzimáticas se basan en el marcaje de Ac o Ag con enzimas para su posterior detección. Clasificación de las técnicas inmunoenzimáticas: • Técnicas Homogéneas • Técnicas Heterogéneas

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ELISA

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ELISA

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ELISA

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ELISA 1.- Métodos no Competitivos 1.1.- Placa recubierta de Ag

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ELISA 1.2.- Placa recubierta con Ag

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ELISA 2.- Métodos Competitivos 2.1.- ELISA competitivo para detectar Ag

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ELISA 2.2.- ELISA competitivo para detectar Ac.

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Inmunoelectrotransferencia • Es de gran utilidad en el análisis de mezclas antigénicas y sus interacciones con Ac. • Esta técnica combina una separación electroforética de los Ag, su transferencia electroforética a un medio de soporte en forma de membrana u hoja y finalmente su inmunodetección mediante el uso de Ac marcados. LLCH

Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Técnicas de Radioimnuensayo • En estas técnicas al Ac se le une un isotopo radioactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag – Ac a través de la radioactividad emitida.

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RIA

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RIA

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RIA

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Técnicas Quimioluminiscentes • Se caracteriza por generar a partir de sustratos estables productos enzimáticos capaces de emitir fotones al pasar de un estado intermedio inestable y energéticamente superior a uno de energía inferior mas estable. • Estos fotones se detectan mediante un fotomultiplicador. LLCH

Quimioluminiscencia

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Técnicas Quimioluminiscentes • • • •

Existen 4 generaciones: Quimioluminiscencia directa Quimioluminiscencia indirecta Electroquimioluminiscencia Quimioluminiscencia amplificada

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Quimioluminiscencia directa • En esta técnica el Ac está marcado directamente con la molécula luminiscente, por lo tanto, por cada Ac marcado se emiten una cantidad limitada de fotones. • Una reacción de oxidación del sustrato libera una molécula luminiscente con la liberación de un número de fotones.

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Quimioluminiscencia indirecta • El Ac está marcado con una enzima y ésta actúa sobre un sustrato que es el que emite la luz, obteniéndose por cada Ac marcado la producción de muchos fotones. • En esta técnica la enzima es la que se encuentra marcada con una molécula luminiscente y la amplificación resulta por el cambio en el sustrato. LLCH

Quimioluminiscencia Aplicaciones Clínicas • Cortisol (orina y sangre) • DHEAS • Ac Valproico • Fenobarbital • Carbamazepina • GH • ACTH • Digoxina

• Acs anti – tiroglobulina • TORCH

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Electroquimioluminiscencia • En este inmunoensayo el Ac utilizado recubre unas partículas imantadas, que tras la formación del complejo Ag-Ac, se fijan por magnetismo a un electrodo. Dicho Ac está conjugado con un marcador (derivado del rutenio) capaz de emitir fotones cuando se aplica una pequeña diferencia de potencial sobre el electrodo. LLCH

Electroquimioluminiscencia

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Electroquimioluminiscencia

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Electroquimioluminiscencia

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Electroquimioluminiscencia Aplicaciones Clínicas • Ácido Fólico • Vitamina B12 • FSH • LH • Estradiol • Progesterona • Testosterona total • Prolactina

• • • • • • • • LLCH

TSH T3 Y T4 libre AFP CEA PSA total y libre Ca 125 Ca 15-3 Ca 19-9

Quimiluminiscencia amplificada • Es una quimioluminiscencia indirecta, siendo una reacción generadora de señal, que es leída por un luminómetro. • Aquí también se va a tener una enzima marcada que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molécula (catalizador) que acelera la reacción entre la enzima y el sustrato. LLCH

Quimiluminiscencia amplificada

Quimiluminiscencia amplificada • Se utiliza la peroxidasa de rábano (HRP) es utilizado para el marcaje de la enzima. • Enzima: Fosfatasa Alcalina • Sustrato: Luminol + Peróxido de Hidrógeno • Acetanilida: Amplificador (actúa como catalizador de la reacción aumentando 1000 veces la oxidación del luminol por el HRP) LLCH

Gracias Totales

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