Transferecia De Embriones En Bovinos

Transferencia de Embriones en Bovinos

INTRODUCCI ÓN La Transferencia de Embriones (T.E.) era ya una realidad a principios de los años 70’s, cuando la Recuperación de Embriones como la Transferencia era en forma quirúrgica y por lo mismo era imposible aplicarla en México, por los altos costos del equipo y del personal. La Transferencia de Embriones, tiene más de 100 años de antigüedad ya que en 1980 se realizó la primera T.E. en conejos; en bovinos se obtuvo la primer cría hace más de 50 años (1951), pero su uso comercial empezó entre los años (19751976); al principio todo fue de forma quirúrgica. Los primeros trabajos realizados en México fueron en 1979, con el equipo del Dr. Cesar Soto trabajando con ganado cebuino y suizo. Yo tuve la oportunidad de tomar un curso de T.E., invitado por la compañía Carnation Genetic en el estado de California (7/junio/1979), que era entonces la pionera en T.E., el cual recordaré toda mi vida. Se trabajaba 5 a 6 donadoras diarias de lunes a viernes, la gran mayoría eran de raza Hostien, y un poco de ganado de carne (Simmental, Chianina y unas cuantas de raza Beefalo que eran cruza de Bisonte Americano con Brahaman o Charolais), esta última cruza era de un temperamento sumamente bravo, como si fuera ganado de lidia; así mismo, contaban con un grupo de excelentes receptoras, eran puras novillas de 15 a 17 meses de edad y eran aproximadamente 300 receptoras. Se empezaba a trabajar desde las 7 de la mañana y se terminaba entre 5 y 7 de la noche. Afortunadamente la colección de Embriones era con el método no quirúrgico que se acababa de implementar. Con el uso de probetas para decantar los embriones no se utilizaban filtros para concentrar los embriones, ya que anteriormente se hacía con el método quirúrgico. Sin embargo la aplicación o transferencia de embriones se hacía por el método quirúrgico en una sala estéril como un quirófano vestidos con bata, gorro, cubre boca y se utilizaba anestesia entubada, así mismo se contaba con mesas portátiles e hidráulicas por cada vaca

operada, la incisión se hacía delante de la ubre, sobre la línea media de 12 a 15 cm de longitud. El embrión era implantado a la mitad o en el último tercio del cuerno uterino que tenía el cuerpo lúteo (+/- 7-8 días de haber presentado el celo). Todo me pareció maravilloso, aprendí toda la técnica de superovulación, sincronización de donadoras con receptoras, preparación de medios de lavado e implante, lavado o recolección de embriones, búsqueda y clasificación de embriones, esterilización y manejo de equipo, etc. Lo que no me pareció práctico fue que se necesitaba todo un equipo de anestesia intubada, mesa quirúrgica entre otros; por lo cual se me hacía imposible llevarla a cabo en México por el alto costo. Platiqué con mi instructor y jefe de la clínica que todo estaba muy bien, pero se me hacía imposible hacerlo por el método quirúrgico con anestesia intubada en México, por el alto costo de todo el material y equipo que se necesitaba; por lo que le comenté que por que no lo hacíamos con la vaca de pié, metida en una prensa con tranquilizante, con anestesia local y con un bloqueo epídural por el flanco izquierdo o derecho, ya que esto se me hacía más factible realizarlo en México. Me comento que era una buena opción, siempre y cuando yo anestesiara a la vaca. Operamos dos vacas al día siguiente sin problemas y descubrí que esta era la solución para realizar la T.E. en México, únicamente teniendo una prensa o chut y un cuarto cerrado que sirviera como cuarto de operaciones, y teniendo la vaca tranquilizada. Así como un pequeño laboratorio para búsqueda y manejo de embriones. Regresé a México y realizamos la primer Transferencia en el Rancho “La Cotera” en Ixtapaluca, Estado de México (4/octubre/1979). Al principio convencer a los ganaderos de la Transferencia de Embriones (T.E.) era muy difícil, afortunadamente nuestros resultados eran muy buenos, por lo cual esto se comenzó a difundir en todo el país, se trabajaba con mucho ganado cebuino que estaba de moda (gyr, indobrasil, nelore y guzerat) y obtuvimos la primer cría gyr por transplante de embriones en Tizimin, Yucatán (18/septiembre/1985). Llegamos a operar 6000 vacas. Cuando empezaba la técnica no quirúrgica facilitó mas las cosas. Teníamos un promedio de 58% de fertilidad; que era un promedio muy estable, en diferentes estados del país. Al principio combinamos el método quirúrgico y el no quirúrgico para comprobar resultados. En 1994 todos los implantes se realizaron en forma no quirúrgica hasta la fecha. En mayo del ’85 tomé un curso de congelación de embriones, utilizando glicerol, por que muchas veces nos sobraban embriones y teníamos que tirarlos. Han pasado más de 30 años y la técnica se ha simplificado tanto que ya se realiza en diversos ranchos de forma rutinaria casi en todo el país.

Contamos con veterinarios de mucha experiencia en varios Estados de la República, lo que antes era imposible. Nuevas técnicas se han implementado a la Transferencia de Embriones (T.E.), como la aplicación no quirúrgica de embriones, la congelación y descongelación directa de embriones con etilenglicol (1992) sin necesidad de un microscopio que un técnico con experiencia en Inseminación artificial lo puede realizar. La fertilización in vitro que es otra maravilla de la tecnología y que ya se trabaja en el país en por lo menos 3 laboratorios comerciales. También se está realizando la bipartición de embriones para sacar el máximo provecho. El sexaje de embriones por DNA. El semen sexado para la Inseminación Artificial o para la fertilización in vitro. En México ya existen compañías que venden todo el material necesario para la Transferencia de Embriones ([email protected]). La tecnología está a nuestro alcance, lo que hace 30 años era imposible, está ya en nuestras manos. La investigación sigue y el futuro es muy alentador. El futuro nos está alcanzando.

IMPORTANCIA DE DONADORAS Y RECEPTORAS

FUNCIÓN DE LAS RECEPTORAS La principal función es incubar el embrión y alimentarlo hasta el parto, mediante los anticuerpos del calostro, protegerlo y amamantarlo durante los primeros meses de vida. El principal objetivo es obtener el mayor número de preñeces por donadora, las receptoras tiene que ser muy fértiles. SELECCIÓN DE RECEPTORAS. Para la selección de receptoras debemos de considerar diversos factores como son:

1) Sanidad: que se encuentren libres de enfermedades contagiosas y vacunadas contra todas las enfermedades que causen aborto, así como otras enfermedades que afecten en la zona. 2) Reproductivo: revisión ginecológica rectal y vaginal en el cual solo los animales normales serán escogidos para estos programas. Las vacas viejas y las vacas o novillas repetidoras serán excluidas de este programa. 3) Aptitud materna: que sean buenas productoras de leche, así como mantener sano y fuerte un ternero de alto valor genético.

4) Estructura pélvica: que sea óptima y amplia para evitar partos difíciles. 5) Identificación de receptoras: con aretes de color en ambas orejas o marcado con fuego o nitrógeno líquido en las piernas o costillas, es muy importante su identificación, para tener un mayor control de celos, preñeces y manejo.

FACTORES IMPORTANTES EN LA SELECCIÓN Y MANEJO DE RECEPTORAS. 1.- Raza 2.- Biotipo. 3.- Funcionabilidad y adaptación.

4.- Origen. 5.- Examen clínico. 6.- Número e identificación. 7.- Sincronización de celos. 8.- Combinación de Transferencia Embrionaria e Inseminación Artificial.

Los factores más importantes que afectan el costo de la T.E. son: el grupo de receptoras, porcentaje de preñez, abortos y pérdidas perinatales por partos distócicos. Para el ganadero el mayor costo de la transferencia embrionaria T.E., es el mantenimiento de receptoras hasta que queden preñadas. Este es el factor económico más importante de todo el programa; así mismo el número de receptoras implican un capital, ocupan campo y se alimentan. El porcentaje de preñeces depende en gran parte del manejo y la fertilidad de las receptoras, así como también de la experiencia y la habilidad de los técnicos. La inversión en hormonas, materiales, así como los honorarios profesionales ocupan un menor costo dentro del programa de Transferencia de Embriones. Número de receptoras En zonas templadas el número de receptoras por cada embrión disponible es de 1.5 a 2 receptoras. En zonas tropicales se necesitan 2 a 2.5 receptoras cruzadas de razas bos índicus con bos taurus por cada embrión disponible, debido a que el porcentaje de sincronización del celo es 60% en zonas tropicales, pero el índice de aprovechamiento es de un 52%, se desecha a la palpación +/- un 15%, por que no ovularon, por que no tienen un cuerpo lúteo palpable, por que salió con quistes, etc. Oportunidad de las receptoras. Como una norma, las receptoras 2 oportunidades para quedar preñadas, se envían con el toro para monta directa o se inseminan si salen vacías a la palpación; posteriormente se revisan entre 35 a 40 días de preñez y se vuelven a rechecar entre 60 a 90 días de gestación. Edad de las receptoras. Las novillonas o vaquillas vírgenes tienen una gran ventaja, debido a que consumen menos alimento, responden mejor a la sincronización y se obtiene un porcentaje 5 a 10% superior a las vacas adultas, la única desventaja contra las vacas adultas, es que pueden tener mayores problemas durante el parto y menor producción de leche. Sincronización de receptoras. Es importante que las receptoras estén recibiendo una ración bien balanceada con minerales, que estén en balance energético positivo, con una buena ganancia diaria de peso, desparasitadas y vacunadas contra todas las enfermedades que producen aborto. Es importante sincronizar el grupo de receptoras para que salga en celo (+/-) 24 horas antes o (+/-) 24 horas después del celo de la donadora.

Lo ideal es que salgan a la misma hora que la donadora, sin embargo esto es muy difícil. Altas preñeces son adquiridas cuando la sincronización es muy exacta. Embriones colectados de una donadora al día 7 de su ciclo, deberán ser transferidos en receptoras del día 6, 7 u 8 de su ciclo, tenemos varias opciones que puede ser a calor natural que coincida con el ciclo de la donadora. Otra opción es a base de implantes en la oreja conteniendo Norgestomet, combinado con 2 ml de Norgestomet (Valerato de Estradiol) inyectados. Aproximadamente un 80% de los animales implantados demuestran celo 36 horas después de haber removido el implante de la oreja. A los 9 o 10 días de su implante se retiran 48 horas antes del celo esperado de la donadora. Algunos veterinarios aplican prostaglandina conjuntamente en el retiro del implante. Otra elección puede ser el uso de prostaglandinas, con una o doble inyección, con un lapso de 10 a 13 días, aplicado la 2ª inyección – 30 o 48 horas antes del celo esperado de la donadora, para que se aglutinen los celos muy cerca de la donadora. Los resultados de fertilidad, son muy similares entre prostaglandinas y progestágenos (implantes) cuando el porcentaje de los celos observados es bajo, coincide con ciertos inconvenientes como: lluvias, nortes, tormentas y viento, bajo estas condiciones los animales sufren estrés y no manifiestan la conducta estral, así mismo, el propio porcentaje de las receptoras que se llegan a implantar son muy bajos. Como recomendación final, se sugiere tener el doble de receptoras disponibles, sobre el número de embriones que se van a transferir, para escoger las más aptas y obtener más alto el porcentaje de preñez.

ESQUEMAS DE LA SUPEROVULACIÓN Y NUEVAS ESTRATEGIAS APLICADAS A LA SUPEROVULACIÓN Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES El objetivo de los tratamientos superovulatorios en las vacas es obtener el máximo de embriones fertilizados y de la calidad transferible con alta probabilidad de producir gestaciones. Sin embargo la asicronía ovárica y las variaciones en las respuestas al tratamiento utilizado para la super estimulación ovárica, es el principal factor limitante en la transferencia embrionaria para obtener una mejor producción de embriones transferibles para hacer costeable esta práctica. Existen varios ejemplos de las respuestas superovulatorias de revisiones de programas experimentales y comerciales de transferencia embrionaria (T.E.) y su reporte incluye el ganado de carne 6.2 embriones transferibles colectados de cada vaca donadora; sin embargo, 24% de las colectas no producen embriones viables, 64% de las donadoras producen pocos embriones transferibles y solo el 30% de las colectas o lavados producen 70% de los embriones. Estos resultados reportados, revelan que existe un alto grado de valores impredecibles en la respuesta superovulatoria. El control de las ondas foliculares presenta una nueva alternativa y una nueva luz para mejorar y reducir estas variaciones. Tradicionalmente, en los programas de superovulación en los bovinos de ha utilizado la detección del celo seguido por tratamientos de F.S.H. los días 9 a 11 del ciclo estral aproximadamente la mitad del ciclo estral.

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P R O G R AM A P ARA S U P E R O VUL A C I Ó N C O N “ F O LLT R O S I NCRO N I Z AC I Ó N D E CE L O S DE D O NAD O RA S P I ND”ía

Po ne r im p la nte SM B + iny e cc ión SM B ó pro s ta g la ndina ó CRE S T AR Q uita r im pla nte ó p ros ta g la n dina y ap lic a r 10 c c . D e V it E – Se le n io O bs e rv a r c a lore s.

9 11 – 12 9 – 1 0 D ía s 21 22 23 24

S U P E R O VU L A CI ÓN

2 .4 m l. FSH (p .m .) 2 .0 m l. FSH (p .m .) 1 .6 m l. FSH (p .m .) 1 .2 m l. de F S H + 5 c c. L u ta lys e (p .m .) 2 D ía s D E T E C CI Ó N DE CE L O S DE DO N ADO RA S 26 I.A . (p .m .) 27 I.A . (a .m .) 7 D ías des p u és L av ad o y T ran s feren cia o C o ng elac ión de E m b rio ne s. N o ta : 4 º D ía d e la s upe rov ulac ión a p lic a r pr os ta g la nd inas a.m . y p .m .

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

2 .4 m l. 2 .0 m l. 1 .6 m l. 1 .2 m l. (a .m .)

FSH (a .m .) FSH (a .m .) FSH (a .m .) F S H + 5 cc . L u ta ly s e

Tabla de dosis para FOLLTROPIN (VETREPHARM, 35 mg/20ml) 14 mg. 20 mg. 24.5 mg. 30.8 mg. 35 mg. cc. cc. cc. cc. cc. a.m. 1.6 2.0 2.5 2.8 3.0 p.m. 1.6 2.0 2.5 2.8 3.0 a.m. 1.2 1.6 2.0 2.4 2.6 p.m. 1.2 1.6 2.0 2.4 2.6 a.m. .8 1.2 1.5 2.0 2.4 p.m. .8 1.2 1.5 2.0 2.4 a.m. .4 .8 1.0 1.6 2.0 p.m. .4 .8 1.0 1.6 2.0 Nota: Aplicar Prostaglandina a.m. en el día 4.

14 a 20 mg 20 a 24.5 mg 30 mg 35 mg

Dosis para diferentes razas, pesos y edades (FOLLTROPIN). Novillas Novillas y ganado cebuino Vacas adultas (Holstein) Vacas adultas muy grandes y pesadas.

Estos programas requieren de gran tiempo invertido y un control ineficiente de las ondas foliculares de los bovinos. Las variaciones de las respuestas ováricas al tratamiento superovulatorio se responsabiliza al estatus de la onda folicular al tiempo del tratamiento. Existe suficiente evidencia que indica que el tratamiento superovulatorio iniciado al tiempo de la emergencia de la onda folicular (espontánea o inducida) se obtiene la máxima respuesta superovulatoria.

En la sincronización de las ondas foliculares se ha utilizado el ultrasonido para romper y aspirar el folículo dominante o un régimen de combinación de progesteronas y estrógenos como tratamiento. La ruptura o punción de todos los folículos (+/-) 5mm de diámetro en novillas de un desconocido ciclo estral induce a la emergencia de una nueva onda folicular 1.5 días después de la punción. El tratamiento con progesteronas y estradiol, administrados en combinación resulto en supresión del folículo dominante y a la emergencia de una nueva onda folicular. El intervalo del inicio del tratamiento superovulatorio de la emergencia de una nueva onda folicular. El intervalo del inicio del tratamiento superovulatorio de la emergencia de una nueva onda folicular. El intervalo del inicio del tratamiento superovulatorio de la emergencia de la onda folicular depende del tipo de estradiol usado: 4.3 días en terneras tratadas con estradiol - 17b. 5.3 días con benzoato de estradiol 5.0 días con valerato de estradiol. Los tratamientos superovulatorios son iniciados al tiempo esperando de la onda folicular inducida, en cualquier fase del ciclo estral, resultando en respuestas comparables o superior al sistema tradicional administrado de 8 a 12 días después del celo detectado. El propósito de este artículo es comparar aspectos teóricos y aspectos prácticos de la foliculogénesis del bovino, para manipular el incremento de los folículos o del propósito de una mejor respuesta superovulatoria. La sincronización de las ondas foliculares en animales ciclando, elimina la necesidad de la sincronización de los celos antes de la superovulación y facilita el manejo de las donadoras en gran escala y los programas de campo de la transferencia embrionaria. INTRODUCCIÓN Los tratamientos superovulatorios en los bovinos han sido imprescindibles, se han utilizado diferentes tipos de hormonas como el suero de yegua preñada (PMSG) sola o combinada con Anti-PMSG. Se utiliza la hormona F.S.H. con cantidades de LH hormona leutinizante como contaminante, algunas más purificadas con una proporción más o menos de 5 a 1, de F.S.H. y L.H. Se ha reportado que este tipo de hormonas produce una gran número de embriones que son colectado si la relación FSH a LH es baja. Sin embargo, los resultados no son concluyentes, existe mucha variaciones en las investigaciones y reportes con respecto a las diferentes hormonas para superovular, muchos factores pueden contribuir en la variación en las respuestas de las donadoras, los resultados no demuestran una diferencia significativa en las preparaciones de F.S.H para superovular.

Existen muchos factores que afectan la superovulación en la vaca, algunos pueden ser controlados y existen otras variables que tienen poco o ningún control, la habilidad de responder al tratamiento es a veces muy desalentado, sin embargo, controlando los principales factores que pueden afectar, los resultados son buenos.

FACTORES QUE AFECTAN LA SUPEROVULACIÓN Controlables 1. Nutrición 2. Ciclando regularmente 3. C.L. palpable 4. Historia de la buena fertilidad 5. Haber parido 6. Semen probado 7. Técnico experimentado en I.A. 8. Detección de celos 9. Previas superovulaciones 10.Excelentes hormonas superovulatorias 11.Régimen de tratamiento 12. Condición corporal. Poco o ningún control 1. Poca habilidad para responder a las hormonas 2. Factores climáticos 3. Factores no conocidos Desde 1970 muchos tratamientos han sido experimentados, incrementando o disminuyendo la dosis de hormonas, por 4 ó 5 días de tratamiento 2 veces al día, algunos utilizan una vez al día duplicando la dosis por 4 días, otros han experimentado en una sola dosis vía subcutánea el total de la dosis. Reportes frecuentes son publicados, mencionando o reportando mejores respuestas, y hasta la fecha ningún tratamiento ha sido claramente superior. Desde 1981 trabajamos muchas vacas para la superovulación y el óptimo de F.S.H: L.H, la relación era de 5:1, nuestro promedio era 5.3 embriones transferibles por vaca muy similar al actual promedio con hormonas más modernas, más purificadas y libres de L.H. Existen muchos reportes en la literatura que dicen que mucha contaminación de L.H disminuye la ovulación, resultando pocos cuerpos lúteos y más folículos, y con la disminución de número de embriones transferibles. 5

Herrier et al comparó F.S.H purificada contra F.S.H suplementada con 40% de L.H, otra con 20 % y otra tercera contaminada con 80% de L.H y no observó una gran diferencia en los resultados.

ONDAS FOLICULARES EN LA VACA El desarrollo de los folículos ováricos de la vaca es una secuencia dinámica de eventos organizados. EL desarrollo de una onda folicular ha sido definido ha sido definido como el crecimiento sincronizado de un gran número de folículos de 4 a 5mm de diámetro, seguido por selección y desarrollo de un folículo dominante y supresión de los subordinados. Durante cada ciclo estral, las vacas pueden presentar de 2 a 3 ondas de crecimiento folicular. Existe una gran variación n la proporción de animales demostrado 2 o 3 ondas de ciclo estral, algunas pueden presentar una sola onda, estas variaciones en las ondas foliculares han sido atribuidas a: nutrición, balance energético, medio ambiente y posible genética. El folículo dominante de una onda folicular es más grande que los otros folículos y produce esteroides y sustancias no esteroidales, sustancia que suprimen el desarrollo de folículos subordinados y previene la emergencia de la siguiente onda folicular. Ha sido demostrado recientemente el tiempo de selección del folículo dominante, concurre una baja concentración de F.S.H. La emergencia de una onda folicular es precedida por un incremento en las concentraciones de F.S.H. de uno a 2 días antes. El conocimiento de factores que inhiben la secreción de gonadotropinas o interfiere con la foliculogénesis debe ser aprovechada para el control exógeno del desarrollo folicular. La primera onda folicular aparece de 2 a 3 días después del estro, la segunda onda folicular aparece de 8 a 10 días de la ovulación y la tercera onda aproximadamente a los 18 días. Se ha demostrado que el folículo dominante inhibe a los folículos subordinados por una inadecuada recepción de gonadotropinas sobre todo F.S.H. Estradiol e inhibina son producidas por células de la granulosa y ambos disminuyen o suprimen la concentración de F.S.H. necesaria para estimular el crecimiento de folículos subordinados. SUPEROVULACIÓN Lo ideal en una superovulación es suprimir la atresia de un gran número de folículos. Por más de dos décadas muchas investigaciones para obtener una mejor respuesta a la superovulación y mejorar los resultados de la transferencia embrionaria así como simplificar la técnica, muchos productos han sido utilizadas y los resultados no han sido halagadores. La variación en la respuesta ovárica ha sido relacionada con tratamientos diferentes, lotes de hormonas, duración de los tratamientos, tiempo de tratamiento en relación al estro, total de dosis de gonadotropinas, relación F.S.H y L.H otros factores identifican al animal y su medio ambiente.

Muchos factores pueden incluir estratos nutricional bajo, edad, raza. Los tratamientos superovulatorios han sido utilizados el día 8 al 12 después del celo por 4 ó 5 días seguidos. Otras investigaciones superovulatorias han demostrado altas respuestas en terneras 10 días después del celo, son embargo, ninguno de estos estudios valoró el crecimiento folicular de estos animales al tiempo de la superovulación. A través de la información generada por el ultrasonido es ahora conocido que 8 a 12 días después del estro, emerge la segunda onda folicular y que en este tipo de tratamientos superovulatorios son un factor muy importante en la respuesta, durante la mitad de la onda folicular el folículo dominante induce atresia de otros folículos que están desarrollándose. Tratamientos iniciados por la presencia de un ultra sonido y detectando un folículo dominante disminuye la respuesta superovulatoria. En otros estudios cuando los tratamientos están iniciados en una onda folicular temprana, sin la presencia de un folículo dominante los resultados fueron halagadores, sobre todo con la presencia de un gran número de folículos, esta es una gran alternativa para aprovechar la evaluación de la onda folicular a través del ultrasonido. Tal vez mejor alternativa es tratar de controlar el desarrollo de la onda folicular y destruir el folículo dominante a través de hormonas o punción del folículo dominante para permitir la emergencia de una nueva onda folicular. CONTROL DEL DESARROLLO SUPEROVULACIÓN

DE

LAS

ONDAS

FOLICULARES

Y

LA

El efecto supresor del folículo dominante en el desarrollo de otros folículos ha sido demostrado en varios experimentos. La inhibición es posible por la disminución de la concentración de F.S.H en el plasma. El valerato de estradiol e inhibina son producidas por células de la granulosa y ambas disminuyen la liberación de la F.S.H, necesaria para el desarrollo de folículos subordinados. Estrógenos endógenos son conocidos que inducen la liberación de hormona luteinizante (L.H) de 16 a 20 horas después de su administración. Ahora es posible obtener una nueva onda folicular por alteración experimental por punción de folículo dominante o por tratamiento hormonal. TRATAMIENTO: 1) Punción folicular. Consiste en la punción y aspiración de todos los folículos de ± 5 mm de diámetro, sin conocer el día del ciclo estral, esto resulta en una nueva onda folicular 1-5 días, los animales así tratados pueden ser superovulados de 1 a 2 días después de la ruptura de los folículos dominantes, la respuesta fue muy similar a los controles tratados a mitad del ciclo estral. En otro estudio los folículos fueron aspirados 2 días

antes de la superovulación en la vaca o novilla a la mitad de su ciclo estral, los resultados fue una mejor respuesta sin la influencia del folículo dominante. TRATAMIENTO: 2) Estradiol y Progesterona Algunas hormonas han sido utilizadas para alterar el desarrollo folicular. Progesterona exógena ha demostrado en varios experimentos que suprime el desarrollo de folículos. El estradiol también induce atresia folicular. El efecto de la combinación de estradiol-progesterona potencializa suprimiendo el desarrollo de folículos sobre todo el folículo dominante, y emergiendo una nueva onda folicular (+/-) 4 a 5 días después de la aplicación del estradiolprogesterona La superovulación puede ser iniciada 4 días después implantes en la oreja o implantes vaginales (CIDR) combinada progesterona intramuscular, la respuesta similar o superior iniciados a mitad del ciclo estral. La sincronización de las ondas detección de celos y sincronización previa a la superovulación.

de la aplicación de con 50 o 100mg de a los tratamientos foliculares elimina la

Ejemplo: Día 0. Inserte CIDR Vaginal+ 2.5mg de B.de Estradiol+50mg de progesterona. DIA 4 5 6 7 8

7 am 7pm 2.5ml Folltropin 2.5ml Folltropin 2.0ml Folltropin 2.0ml Folltropin 1.5ml Folltropin 1.5ml Folltropin 1.0mlFolltropin + 2 ml. 1.0mlFolltropin + 2 ml. Prosolvin o 5 ml. Lutalyse Prosolvin + retiro CIDR I.A. I.A.

RESUMEN Los implantes de norgestomet, como el CIDR son de gran valor, para reemplazar el cuerpo lúteo del ciclo, en programas de superovulación y como una ayuda la incorporación de valerato de estradiol o benzoato de estradiol produce atresia de folículos antrales, en las vacas con implantes, induciendo una nueva onda folicular 4 a 5 días después e iniciado la superovulación en ese momento. EL resultado son menos fallas, embriones de mejor calidad. La sincronización de las ondas foliculares, eliminan las necesidades de detectar celos, antes de la superovulación, mejorando el tiempo y disminuyendo el trabajo de campo.

LITERATURA CONSULTADA 1. 2. 3. 4. 5.

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TÉCNICA DE COLECCIÓN Y RECUPERACIÓN DE EMBRIONES

Los embriones pueden ser recuperados quirúrgicamente, lo ideal es recuperarlo del 7 al 8 día después del celo, embriones recuperados del 9 al 14 día después del estro ya no tienen zona pelúcida, son difíciles de localizar ya que se confunden con dendritus celulares y son más susceptibles a infectarse, todos los procesos para congelación y bipartición están entre los días 6, 7 u 8 después del celo, un pequeño porcentaje se puede quedar en el oviducto si se hace la colecta del 5 al 6 después del estro. MÉTODO NO QUIRURGICO DE RECUPARAR EMBRIONES El primer paso en la recuperación no quirúrgica es palpar los ovarios vía rectal y estimar el número de cuerpos lúteos. Es muy difícil acatar el número de cuerpos lúteos, sobre todo cuando la donadora está súper estimulada, ovarios del tamaño de una naranja, el mejor estímulo es ± el tamaño de una mandarina o el tamaño de un huevo de gallina, cuando existen 2- 3 cuerpos lúteos por ovario se pueden palpar y predecir el número de embriones que se puede colectar. La ULTRASONOGRAFÍA da un resultado más acertado de la respuesta en los ovarios. Las DONADORAS se recomienda AYUNARLAS 12 horas antes de la colecta, para evitar, que estén defecando y contaminando mangueras y sondas. ANESTESIA EPIDURAL. Es recomendado para este procedimiento, la cola el sacro y la zona vulvar, son lavadas y desinfectadas con yodo-povidona y luego con alcohol al 70% para disminuir el estrés del animal y la presión del esfínter anal sobre el brazo del operador, se aplican de 5 a 7 ml de xilocaína al 2% en el espacio epidural, así como una dosis de tranquilizante de Promacina, 10mg intravenosa, ya que la cola esté flácida, es el momento de empezar. El cérvix uterino, está cerrado, se cateteriza con un dilatador cervical metálico atraumático hasta llegar al cuerpo del útero (bifurcación de los cuernos). Se introduce una sonda Foley de calibres (14-16-18) según el tamaño, la edad de donadoras- 14 para novillas,- 16 para vacas o vaquillas y del número 18 hasta el 20 para vacas muy grandes y de cuernos gruesos, el globo del catéter es inflado con 5 a 12cc de solución salina fisiológica estéril o bien aire, cuando la punta de la sonda, esté a la mitad del cuerno uterino. Algunas veces se encuentra dificultad para pasar el cérvix,

sobre todo en novillas de algunas razas. Es necesario hacerlo con todo cuidado y paciencia, es muy importante para no lastimar un cérvix o la mucosa uterina. Un error muy común es súper inflar el globo del catéter, causando rotura del endometrio, o del útero. El líquido del lavado, saldrá sanguinolento o se perderá dentro del útero, o caerá en la cavidad abdominal. Se utiliza una manguera estéril larga que está en circuito cerrado, un extremo penetra en el frasco o bolsa, que contiene medio lavado, otro extremo penetra en la sonda Foley y el otro extremo es conectado a un filtro, colector de embriones. La bolsa o frasco, que contiene 1 o 2 litros de medio de colecta, se coloca a una altura de 80 a 100cm sobre el nivel de la vaca, para que el líquido pueda penetrar por gravedad. FILTRO COLECTOR. Al reflujo del líquido que penetro al útero ± 30 a 80cc de líquido por cada lavado, a la palpación en el útero, es aproximadamente una preñez de 35 a 40 días, se da un ligero masaje al cuerno, que contiene el líquido del lavado, para tratar de desprender los embriones, que están en la mucosa uterina, estos van a caer a un FILTRO COLECTOR Y CONCENTRADOR de embriones, este filtro posee una malla de 70 micras y retiene embriones ya que estos miden de 140 a 160 micras. Este lavado se repite de 5 a 8 veces en cada cuerno uterino, utilizando 500cc a 1000cc por cuerno uterino, la solución es Dulbecco (PBS-modificado) con 2% de suero fetal o 4 gramos de Albúmina Bovina por litro de lavado, adicionado de antibióticos y antimicóticos. El tiempo promedio para hacer una colecta de embriones ±30 minutos esto depende de la práctica y la experiencia. ¿TRATAMIENTO COLECTA?

QUE

RECIBEN

LAS

DONADORAS

DESPUÉS

DE

LA

Una vez terminado de lavar los cuernos uterinos, las donadoras, son inyectadas con una dosis doble de prostaglandina y se repite de 12 a 14 días después. El objetivo de esto es evitar procesos inflamatorios uterinos o gestacionales múltiples ya que algunos embriones pueden permanecer aún en los oviductos. Se puede aplicar un antibiótico no irritante, como preventivo de alguna contaminación. RECUPERACIÓN DE LOS EMBRIONES DEL FILTRO Al terminar el lavado de ambos cuernos, el filtro es llevado al LABORATORIO. El contenido es lavado y filtrado, varias veces hasta que queda ± 20 a 30cc de medio y esto es depositado en una caja de Petri de 150 x 25mm con cuadrícula para su revisión al microscopio esteroscópico a 15x. Si el contenido tiene moco o dendritus

celulares –conviene hacer un lavado con jeringa de 30cc con medio y una aguja pequeña, hacer lavados a presión sobre la malla del filtro, esto es depositando en la misma caja de Petri o en otra, para evaluar la técnica es mejor con un lavado o con 2 algunos embriones se pueden quedar pegados con moco a la pequeña malla. La búsqueda e identificación, se realiza con la ayuda de la zona pelúcida que rodea a la masa embrionaria, también de la forma esférica y la tendencia a rodar sobre el fondo de la placa. Los embriones u óvulos son recolectados con una micropipeta de cristal, adaptada a una pequeña jeringa de 1cc y son colectados en una caja de Petri muy pequeña de 35 X 10mm para su aislamiento en P.B.S ya enriquecido con 10% de suero fetal o con albúmina bovina al 4% así como antibióticos. La temperatura en el laboratorio debe ser de 20 a 30°C. CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES Los embriones son evaluados al microscopio esteroscópico a 50x y clasificados según las normas de IETS de acuerdo a su aspecto morfológico, estadio y calidad en cinco CATEGORÍAS: Estadio Ovulo fertilizado, 1 célula Embrión de 2 células Embrión de 4 células Embrión de 8 células Embrión de 16 células Estadio Mórula temprana Mórula compactada Blastocisto temprano Blastocisto mediano Blastocisto expandido Blastocisto saliendo de la zona Blastocisto expandido fuera de la zona

Edad(Días) 0a2 1a3 2a3 3a5 4a5 (Estadios Transferibles) Edad(Días) 5a6 6a7 7 a 7.5 7.5 a 8 8 a 8.5 8.5 a 9 9 a 10

Código 1-1 cel 2-2 cel 2-4 cel 2-8 cel 2-16 cel Código 3 4 5 6 7 8 9

TRANSFERIBLES: 1) EXCELENTES Y BUENOS, 2) REGULARES, 3) POBRES NO VIABLES: 4)HUEVOS FERTILIZADOS DEGENERADOS O MUERTOS 5) HUEVOS SIN FERTILIZAR U-OOCITOS. Las principales características morfológicas evaluadas para clasificar los embriones fueron: Estadío de desarrollo acorde con la edad; tamaño normal (150 a 200) micras forma esférica y su contenido: Integridad de la zona pelúcida, compactación celular color

ámbar, picnocis, vesículas, tamaño de las vesículas, presencia de Dentritus celulares o blastómeros excluidos de la masa embrionaria en el espacio previtelino.

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

En la vaca los embriones son rutinariamente transferidos al cuerno uterino, esto es porque los embriones son recuperados no quirúrgicamente del útero y deben ser transferidos al mismo sitio. PRIMER PASO: Es necesario palpar los ovarios en forma acertada, para seleccionar el que tiene el cuerpo lúteo (cuerpo amarillo) SEGUNDO PASO: Es pasar el aplicador con el embrión, a través del cérvix. Recordemos que la aplicación o transferencia se hace del día 6-7 u 8 del ciclo estral cuando está en fase lútea; el cérvix puede estar ocluido y con presencia de mucosidad. Las novillas presentan un reto por su pequeño cérvix, algunas razas son más difíciles que otras. El mejor entrenamiento es tener mucha experiencia en Inseminación Artificial. TERCER PASO: Es colocar el embrión, a la mitad del cuerno uterino o al último tercio, esto debe ser muy gentil y en forma rápida. Los técnicos inseminadores generalmente requieren 100 a200 transferencias para adquirir experiencia. TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE LA COLECTA Y LA TRANSFERENCIA Es mejor transferir los embriones tan pronto como sea posible. Normalmente son transferidos entre 1 a 4 horas del fin de la colecta de embriones. ¿CÓMO CARGAR LOS EMBRIONES PARA TRANSFERIRLOS? Se utilizan pajillas de I.A. de 0.25cc, una jeringa de 1cc, se enjuaga la pajilla con medio de implante varias veces, no importa que la pajilla este estéril, es para eliminar cualquier tóxico de la pajilla. Los embriones fueron cargados en la pajuela, primero medio de implante, luego un espacio de aire, luego medio, aire, medio con embrión, aire y luego medio, hasta que el algodón de la pajilla se humedezca y solidifique el PVC, de esta manera aseguramos que el embrión es expelido de la pajilla.

INSTRUMENTAL PARA TRANSFERIR EN FORMA NO QUIRÚRGICA El aplicador de embriones más utilizado al principio del método no quirúrgico fue la pistola de inseminación de CASSOU con pajilla de 0.25 cc francesa, esto es muy barato. Sin embargo son cortas y gruesas en su punta para novillas receptoras o vacas con cuernos largos o pelvis grandes no sirven. Fue hecha la vaina azul miniaturizada desechable, especialmente para bovinos y novillas con cérvix pequeño, fue diseñada con punta roma y ciega, con dos orificios laterales. Es más largo que el aplicador de Inseminación Artificial. El cateterismo cervical y uterino, el sitio de depósito del embrión y el tiempo empleado en depositar el embrión en el cuerno uterino (mitad del cuerno o el último terco del cuerno uterino) dependen mucho del instrumento utilizado, de la anestesia epidural, de un animal tranquilizado, así como la habilidad y experiencia del técnico o Médico Veterinario. Existen otros catéteres metálicos, que trabajen muy bien, se deslizan muy rápido dentro del cuerno uterino. ¿QUÉ RECEPTORAS SON ÚTILES PARA RECIBIR UN EMBRIÓN? Las receptoras son seleccionadas por 2 cosas: a) Tener un cuerpo lúteo palpable. b) Estar sincronizadas con las donadoras en +/- 24 horas con el embrión a la donadora. Las receptoras son tranquilizadas ½ hora antes de la transferencia, la anestesia local es recomendable 10 minutos antes de la transferencia de preferencia xilocaína o lidocaína al 2%, cuando la cola está flácida, es el momento de transferir. Los embriones deben ser depositados lo más profundo posible en el tercio medio anterior del cuerno uterino que tiene el cuerpo lúteo. El técnico que palpa con el brazo izquierdo, se facilita mucho cuando la transferencia es del cuerno derecho, pero es poco difícil cuando hay que depositar en el cuerno izquierdo, por eso es muy importante, que la anestesia epidural esté bien puesta (+/-) 8 cc de xilocaína es la dosis. La colocación debe ser lo más profundo posible, de la mitad del cuerno hacia delante. Es necesario que sea realizado con mucha destreza y calma para no lastimar el endometrio.

EVALUACIÓN Y MANIPULACIÓN EMBRIONARIA EN BOVINOS EVALUACIÓN EMBRIONARIA INTRODUCCIÓN La evaluación precisa del embrión es uno de los pasos más importantes para que la TE sea exitosa. Aunque existen muchos métodos alternativos para determinar la viabilidad embrionaria, la evaluación basada en criterios morfológicos continua siendo la más simple, rápida, y confiable. La evaluación morfológica realizada con el microscopio estereoscópico es la más comúnmente utilizada y generalmente se realiza después de la búsqueda y localización de los mismos. Se tiene que reconocer que la evaluación visual de los embriones es una evaluación subjetiva de algo biológico y por lo tanto no es una ciencia exacta (Robertson and Nelson, 1998). Tiene la desventaja de ser subjetiva. Diferentes técnicos solo han coincidido en el 68% de las observaciones, difiriendo principalmente entre los de calidad buena y regular (Farin et al. 1995). También se ha demostrado que existe un 30% de fallas a nivel de campo cuando los mismos embriones han sido evaluados posteriormente al microscopio electrónico (Aguilar et al. 2002). La evaluación morfológica se relaciona con el porcentaje de gestación posterior a su transferencia, sin embargo este parámetro depende también de la calidad de la receptora, del técnico y condiciones ambientales (Robertson and Nelson, 1998). La capacidad para predecir la tasa de preñez a alcanzar entre grupos de embriones, sin embargo tiene limitaciones cuando se requiere determinar la viabilidad de un embrión en particular, es decir para demostrar que está vivo (Overström, 1996). Debido a lo anterior se han desarrollado algunas técnicas metabólicas y de evaluación morfo-funcional, como las de tinción de exclusión y de fluorescencia, de actividad enzimática, de consumo de oxígeno, de toma y utilización de substratos, que están correlacionadas con la morfología y la sobrevivencia de los embriones posterior a la transferencia (Lindner et al, 1983; Buttler and Biggers, 1989; Overström, 1996). Sin embargo, estos métodos requieren de equipo complejo y aumentan el periodo de cultivo in vitro, por lo que son de escaso valor bajo condiciones campo (Lindner et al, 1983). El cultivo in vitro de los embriones durante 12 a 24 horas permite distinguir un embrión no viable basándose en el retraso en su desarrollo, pero requiere de equipo especial, eleva el costo y el tiempo de la evaluación, y lo que es más importante, altera el crecimiento normal del producto (Overström, 1996). Por lo mismo, la evaluación morfológica de los embriones, a pesar de ser subjetiva y poco precisa sigue siendo más accesible, inocua y de aplicación a nivel de campo, para seleccionar los embriones transferibles.

EVALUACIÓN MORFOLÓGICA EMBRIONARIA La evaluación morfológica de los embriones mediante el microscopio estereoscópico es simple, rápida y de resultados inmediatos que permite en cierta medida tomar una decisión acerca del destino de cada embrión y la viabilidad de los mismos. Se realiza con el microscopio estereoscópico a 40 o 50 aumentos. Los embriones de los rumiantes miden de 130 a 140 μ, excepto los blastocistos expandidos, que son 30% más grandes. La zona pelúcida mide 15μ y debe estar íntegra, pues su función es proteger al embrión de microorganismos y otros contaminantes. La integridad de la zona pelúcida es indispensable cuando los embriones van a ser congelados y es un requisito para su exportación. Se requiere girar al embrión, para observarlo perfectamente desde diferentes ángulos. Para la evaluación embrionaria se consideran dos criterios: a) Grado de desarrollo b) Calidad morfológica Grado de desarrollo Representa las divisiones celulares del cigoto, o blastómeros. Cada división mitótica se lleva a cabo a partir de la misma cantidad de material celular, por lo que las células resultantes tendrán la mitad del tamaño o volumen de la que le dio origen, lo que implica que cada vez se van haciendo más pequeñas; a este tipo de división se le denomina segmentación para diferenciarla de la mitosis normal. El grado de desarrollo deberá ser acorde a la edad del embrión, es decir, al día en que se llevó a cabo la colecta embrionaria tomando como día 0 al día del inicio del estro. La Figura 1 muestra el desarrollo cronológico del embrión y su localización en el aparato genital. El grado de desarrollo del embrión con relación a la edad del mismo parece ser un mejor indicador de la viabilidad que la apariencia morfológica. Los embriones tempranos se clasifican por el número de blastómeros presentes: 2, 4, 8, 16 células; posteriormente reciben la denominación de: Mórula temprana Agrupación o masa de células. Los blastómeros son difíciles de diferenciar individualmente debido a sus uniones (compactación). El embrión recibe este nombre por su semejanza a la fruta mora. Mórula compacta El número de blastómeros ha aumentado y la masa celular ocupa entre el 60 y 70% del espacio perivitelino. A partir de esta etapa el embrión es transferible. Blastocisto temprano Se caracteriza por presentar una cavidad llamada "blastocele".En este estadio las células han sufrido su primera diferenciación, dando lugar a las células del botón o

tabique embrionario y las del trofoblasto. La masa celular ocupa el 70% del espacio perivitelino. Blastocisto maduro El embrión tiene la apariencia de un anillo y ocupa el 90% del espacio perivitelino. El embrión ocupa la totalidad del espacio perivitelino. Blastocisto expandido El tamaño del embrión aumenta un 20 o 30% y la zona pelúcida sufre un adelgazamiento. Estos embriones en ocasiones se colapsan sin que se aprecie el blastocele, sin embargo la zona pelúcida permanece adelgazada y en alguna zona su contorno puede ser irregular. Blastocisto eclosionado Se identifica como una masa compactada de pequeños blastómeros y sólo ocasionalmente se observa el blastocele. En ocasiones se encuentran zonas pelúcidas vacías, sobretodo cuando la colección se lleva a cabo después del día 8. En ese caso, es necesario revisar cualquier acúmulo de células. Calidad morfológica Este criterio ha consistido tradicionalmente en asignar una calificación al embrión, de acuerdo a sus características morfológicas, al observarlo al microscopio, como un indicador de su “salud” o “viabilidad”, como son el color, la homogeneidad en el tamaño de los blastómeros, la granulación del citoplasma o la fragmentación de los blastómeros (Overström, 1996). De esta forma, el embrión se clasifica como: excelente, bueno, regular y no transferible o degenerado. La correlación entre la calificación que se le da a un embrión y la habilidad de este para transformarse en una cría no ha sido alta. Esta correlación aumenta sustancialmente sólo cuando se separan los embriones con defectos morfológicos graves del resto o normales (Buttler and Biggers, 1989). Por otro lado, el examen visual no es un buen indicador de viabilidad, ya que embriones que parece anormales, pueden resultar en una preñez (Killen and Moore, 1971; Shea, 1981). Calidad del embrión Excelente o calidad 1 Embrión con desarrollo de acuerdo a su edad, compactado, esférico, perfectamente simétrico, con granulación uniforme, color ámbar, sin blastómeros extruidos y con la zona pelúcida intacta. Bueno o calidad 2 Embrión con desarrollo de acuerdo a su edad, compactado o con leve descompactación, ligera asimetría, algunas imperfecciones leves, granulación uniforme o presencia de vesículas, pero no abundantes, de color uniforme (tal vez con algunas zonas obscuras), zona pelúcida intacta, con algún blastómero excluido.

Regular o calidad 3 Descompactación marcada, blastómeros extruidos y con signos de degeneración (vesículas), de color obscuro, masa celular pequeña, pero no menor al 50% de lo normal, con zona pelúcida intacta. No transferible o degenerado, calidad 4 Signos marcados de degeneración, como retraso en el desarrollo (más de dos días), descompactación, color obscuro, granulación no uniforme (vesículas), muchos blastómeros extruidos o irregulares. (Elsden RP and Seidel, 1988; Lindner and Wright, 1983) (Ver Cuadro 1). Dado que la fertilidad de los embriones excelentes y buenos es semejante, algunos autores han considerado clasificar al embrión simplemente como a) bueno, b) regular y c) malo o no transferible (Lindner y Wright, 1983).

DESARROLLO Y LOCALIZACIÓN DEL EMBRIÓN EN EL APARATO GENITAL BOVINO

*DIAS 1

2 cel

2 3

4

4 cel

8 cel

5 6 7

Mc y Bt

16 cel Mt

8 9

B, Be

Be 1 0

Be

*Día de inicio del celo (día 0) ADAPTADO DE: Palma, 2001;

Tomada de Killen & Moore., 1971 Figura 2. Embrión ovino de 4 células, con partículas anucleadas (1); embrión de 7 células, con partículas anucleadas (2); embrión de 4 células teñido con orceína (3). Las flechas indican las partículas anucleadas.

Tomada de Lindner et al., 1983

Figura 3. Mórula temprana (a); mórula compacta (b); blastocisto temprano (c); Blastocisto (c); blastocisto expandido (e) y blastocisto eclosionado (f)

Tomada de Lindner et al, 1983 Figura 4. Cuatro mórulas compactas de calidad: excelente (a); buena, se nota un blastómero extruido y el contorno irregular (b); regular, con blastómeros extruidos y algunas células degeneradas (c) y no transferible, numerosos blastómeros extruidos y signos de degeneración celular, pero con una masa aparentemente viable (d).

a

b

c

Tomadas de Palma, 2001

Figura 5. a) Muestra un blastocisto en eclosión (izquierdo) y un blastocisto expandido (derecho); b) un blastocisto eclosionado con su zona pelúcida vacía; c) blastocisto eclosionado.

Cuadro 1 EVALUACIÓN MORFOLÓGICA CRITERIOS

a) Grado de desarrollo. Acorde al día posterior a la inseminación Grado de desarrollo Óvulo

Clave

Edad del embrión

Núm. de células

2 a 16 blastómeros

2

2-4 días

2-16

mórula temprana

3

5 días

>16

mórula compacta

4

6 días

32-64

blastocisto temprano

5

7 días

160

blastocisto maduro

6

7 días

180

blastocisto expandido

7

8 días

200

blastocisto en eclosión

8

9 días

>200

embrión eclosionado

9 Elsden and Seidel, 1988

b) Calidad embrionaria Calidad embrionaria Clave Excelente 1 Bueno 2 Pobre o regular

3

No transferible

4

Morfología Esférico, simétrico, células uniformes, buen color Imperfecciones ligeras, blastómeros extruidos, vesículas Alteraciones más severas, vesículas, células degeneradas Alteraciones graves, signos de degeneración, vesículas Elsden

and

Seidel, 1988

MANIPULACIÓN EMBRIONARIA La manipulación embrionaria comprende en una serie de técnicas, generalmente invasivas mediante la micromanipulación o microcirugía, con diferentes finalidades como son la bipartición o producción de gemelos idénticos y la toma de biopsias para producir quimeras o determinar el sexo el embrión. La mayoría se realizan con el micromanipulador que es un sistema que consta de un microscopio estereoscópico adaptado a un equipo que permite manejar micropipetas para fijar al embrión o tomar

muestras de blastómeros, micronavajas y otros utensilios, todo ello con movimientos microscópicos. Bipartición o producción de gemelos idénticos Consiste en partir a un embrión (mórula o blastocisto) en dos mitades y obtener una cría de cada mitad. Esto sería especialmente importante cuando sólo se obtiene uno o dos embriones (Seidel and Elsden, Smith et al, 2007). Dado que cada mitad proviene del mismo embrión se consideran como clonas. La técnica permite aumentar el número de crías nacidas a 0.9-1.2, comparado con 0.6-0.7 de un programa de transferencia convencional. También permite reducir el número de animales experimentales para la investigación (Palma, 2001). Cuando se utilizan blastocistos es necesario que cada mitad tenga parte de las masa de células internas ya que de otra manera se formará una vesícula trofoblástica, no un embrión. El procedimiento se realiza generalmente con el micromanipulador, sin embargo también es posible realizarlo con el microscopio estereoscópico común usando un medio especial (Vigro splitting media) que permite que el embrión se adhiera al piso de la caja de Petri, lo que facilita su bisección. La división del embrión en más partes no ha tenido éxito debido a la baja tasa de desarrollo. La proporción de hemiembriones incluidos dentro de la zona pelúcida que se transforman en fetos es de 38% (40/105), de 42.2% (46/109) sin zona pelúcida y de 36% al ser embebidos en gelatina al 7% . No existió diferencia en la tasa de gestación al transferir uno o dos hemiembriones por cada receptora (Warfield et al, 1987). En otra investigación reciente, de once pares de hemiembriones transferidos a 11 receptoras, nueve se transformaron en blastocistos (Albihn et al, 2007). La bipartición del embrión no llenó las expectativas que se habían previsto debido a que: la microcirugía requiere tiempo, la división conduce a menores tasas de preñez (50 vs 60% de embriones intactos) y la congelación de hemiembriones también reduce las tasas de preñez (Seidel 1995). Una posibilidad futura sería el combinar la bisección con el sexado pues la biopsia que implica el sexado del embrión afecta la tasa de preñez, pero esta se vería compensada al obtener un mayor número de crías de los hemiembriones (Palma, 2005). Sexado de embriones La preselección del sexo ofrece múltiples ventajas en la producción animal y una de las formas de hacerlo es determinando el sexo de los embriones. Para sexar los embriones se han intentado diversas técnicas como son los análisis citogenéticos, ensayos para determinar actividad enzimática ligada al cromosoma X, la tasa diferencial de desarrollo, la detección de antígenos específicos del macho y el uso de sondas de ADN específicas del cromosoma Y (Lopatarova et al, 2007). Esta última, junto con el desarrollo de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el enfoque más utilizado. La técnica es invasiva pues implica la toma de biopsia del embrión, es decir la obtención de algunos blastómeros con una micronavaja o aspirandolos con una micropipeta a través de la zona pelúcida. La amplificación por PCR de secuencias específicas de genes del cromosoma Y por PCR es el método

más práctico para determinar el sexo del embrión (Herr et al, 1990, Herr and Reed, 1991). Las sondas utilizadas son específicas para el gen SRY (Chen et al, 2004).

Fotografías tomadas de Lopatarova et al, 2007

Figura 1 Se muestra la biopsia de un embrión por medio de una micronavaja para el sexado.

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BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA REPRODUCCIÓN ANIMAL INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha generado el desarrollo de una serie de técnicas en la biotecnología reproductiva, se han logrado avances genéticos e incrementado poblaciones más rápidamente que con los esquemas convencionales de cruzamiento utilizados tradicionalmente en los sistemas de producción en bovinos y otras especies. En la especie bovina la técnica de inseminación artificial y de la transferencia de embriones se han visto beneficiadas con el desarrollo de la fertilización in vitro y aspiración folicular OPU-FIV, determinación del sexo, bipartición de embriones. La tendencia actual de este tipo de tecnologías está encaminada al desarrollo de razas de animales altamente productivos, resistentes a enfermedades y a condiciones ecológicas propias de la región geográfica de su producción, a través del aprovechamiento del material genético de animales con una gran capacidad productiva y eficiencia reproductiva. FERTILIZACIÓN IN VITRO - ASPIRACIÓN FOLICULAR OPU-FIV La técnica de fertilización in vitro permite realizar una serie de manipulaciones con gametos (óvulos y espermatozoides), bajo condiciones de laboratorio siendo posible el desarrollo embrionario hasta la etapa de mórula o blastocisto, etapa en la que el embrión puede ser transferido a una receptora ó congelado. Los embriones producidos in vitro, se producen a partir de óvulos recuperados de ovarios que pueden provenir de animales sacrificados o de animales vivos (aspiración folicular OPU), estos óvulos se maduran, fertilizan y cultivan los ovocitos fertilizados. Con OPU se colectan ovocitos a través de una sonda especial, provista de una aguja adaptada a un equipo de ultrasonido que permite la punción directa de los folículos presentes en los ovarios, este método también puede ser usado en combinación con la ovulación múltiple cuando se desea obtener óvulos madurados. Esta técnica facilita también el aprovechamiento de ovocitos que son reclutados en las oleadas foliculares que se presentan en cada ciclo estral de la vaca. Se colectan ovocitos de folículos de 2 a 6mm de diámetro, posteriormente con el apoyo de un microscopio estereoscópico se buscan y clasifican de acuerdo a sus características morfológicas, para seleccionar los que reúnen las condiciones para ser madurados (18 a 24 hrs), fertilizados (18 a 24 hrs) y cultivados bajo condiciones in vitro durante siete días. Finalizado este período, los embriones producidos están en condiciones de ser transferidos a una vaca receptora, o congelados para ser transferidos en el momento apropiado. Las condiciones de cultivo a las que son sometidos los ovocitos con medios específicos para cada etapa (maduración, fertilización y desarrollo embrionario) en la incubadora son: 39 ºC de temperatura, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. La producción de embriones in vitro ha avanzado considerablemente, hoy en día algunas empresas producen un 40 a 60% de embriones con sus protocolos de FIV. Los porcentajes de gestaciones que se han logrado con embriones producidos mediante esta técnica son relativamente altos y

oscilan entre un 50 a 55%. La producción de embriones de manera comercial mediante esta técnica se realiza ya en varios países. VENTAJAS DE OPU-FIV Una vez que la OPU-FIV no requiere tratamiento hormonal para su éxito, se puede aprovechar de forma más eficiente en animales que no responden a superovulación, ya sea por anomalías adquiridas (resistencia a las hormonas) o por ser refractarias a la superovulación. Vacas que poseen gran potencial genético pueden ser donadoras de óvulos, sin importar su respuesta a la superovulación. Son muchos los casos de animales infértiles o subfértiles por problemas adquiridos. Son frecuentes los casos de adherencias del ovario y del útero, metritis crónicas, infecciones tubaricas y otras patologías. La OPU-FIV permite la producción de progenie de animales con estas patologías, una vez que ella no necesita del total del aparato reproductivo, basta con que el ovario produzca folículos de tamaño suficiente para su aspiración. Producción de un mayor número de embriones Actualmente los promedios de producción están en 9 embriones por sesión de OPU, generando un promedio de 3.5 preñeces por trabajo en cada hembra. En general una hembra esta produciendo un promedio de 80 a 120 preñeces por año. Producción de embriones de vacas gestantes Donadoras gestantes hasta los 120 días de preñez poseen tasas de producción iguales o superiores a los animales no preñados. Los riesgos para la preñes son muy pequeños, pero es importante resaltar, que pueden pasar absorciones. Utilización en novillas pre púberes Es posible obtener gestaciones de animales mucho antes de su primer ciclo estral. Esta puede ser una estrategia para diagnostico precoz de la calidad de la producción de un animal. Aprovechamiento del semen Una vez que el semen es descongelado y diluido para a su utilización, una pajilla puede ser suficiente para fertilizar los ovocitos de hasta 10 donadoras dependiendo de la calidad del semen y de la cantidad de ovocitos. Utilización de animales con problemas reproductivos Es importante tener en consideración que problemas reproductivos congénitos o hereditarios pueden ser transmitidos a las crías. Por lo que no es recomendable la utilización de animales con este tipo de alteraciones. Pueden ser utilizadas donadoras sacrificadas, siempre respetando un intervalo de máximo 40 minutos para retirar los ovarios de la canal, y un máximo de 8 horas de transporte hasta el laboratorio de FIV.

DESVENTAJAS DE LA OPU-FIV La principal desventaja de la técnica de OPU-FIV es la gran variación dependiente de factores biológicos, independiente de la metodología utilizada en la producción de los embriones. Las variaciones corresponden a factores individuales, tanto del macho como de la hembra. Esto sin contar los factores intrínsecos de la interacción entre el macho y la hembra en la producción de embriones. Es necesario desarrollar y aplicar estas técnicas en el sector ganadero del país, para la producción de animales de excelente calidad genética que sirvan de base para el pie de cría. DETERMINACIÓN DEL SEXO El interés que existe en el desarrollo de técnicas que posibiliten la determinación de los cromosomas (XX ó HY) que portan los embriones ó espermatozoides, de manera rápida, económica y eficaz, que no pongan en riesgo la viabilidad de estos al momento de su manipulación, ha generado una serie de investigaciones sobre este tema, para establecer un método que pueda hacer esto posible a nivel comercial en la producción animal. Sexado de semen Las técnicas que se han aplicado para la separación de las poblaciones de espermatozoides con cromosoma XX ó XY, se han apoyado en las características fisicoquímicas (peso, densidad, y motilidad) de este gameto. También se han intentado implementar métodos inmunológicos dirigidos a inactivar el cromosoma Y con antígenos H-Y específicos de superficie. Sin embargo los resultados obtenidos con estos protocolos realizados no han proporcionado resultados consistentes y confiables. La técnica que actualmente provee la mayor confiabilidad (85 a 97%) en la separación de espermatozoides, es mediante citometría de flujo, el cual mediante un sorteador de células determina el peso del ADN de los cromosomas XX ó XY. Una desventaja de este procedimiento es que los equipos empleados para la separación de espermatozoides son lentos y la cantidad de estructuras obtenidas son bajas, se obtienen 20 millones de espermatozoides por hora, además del alto costo del equipo utilizado. Las dosis que se comercializan tienen una concentración de 2 millones y están recomendadas para novillas. La inseminación con semen sexado para la producción de hembras en el ganado bovino lechero ha tenido gran aplicación en muchos países del mundo, en el año 2008 se reporto que se vendieron 4 millones de dosis. Los datos de fertilidad logrados con semen sexado en novillas oscilan del 47 al 53% a primer servicio y en vacas en lactación del 27 al 35 %. Para la producción de embriones por FIV el semen sexado se utiliza de manera eficiente se aplica una concentración de 500 mil espermatozoides para 20 0 50 ovocitos. Con la técnica se inyección intracitoplasmatica (ICSI) el semen sexado podrá tener su maximo aprovechamiento. En vacas o novillas superovuladas para la producción de embriones no se recomienda su utilización, algunos lo han empleado y han obtenido resultados muy variables con muy baja fertilidad.

Sexado de embriones Diversas investigaciones se han generado para el sexado de embriones pero ninguno de estos ha logrado obtener resultados aceptables, pues son poco confiables y eficientes, ponen en riesgo la viabilidad del embrión. La ingeniería genética para la identificación de fragmentos específicos de DNA ha aportado un gran impulso a la metodología del sexado embrionario en ganado bovino, a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa PCR, que es capaz de identificar una secuencia particular repetida de ADN, en una cantidad diminuta de muestra de material genético. Actualmente se conocen diferentes secuencias específicas localizadas en los cromosomas sexuales como el SRY (Sexing Region YChromosome) y el ZFY (Zinc Finger Y-Chromosome) en diferentes especies, estas secuencias han sido empleadas con la PCR para determinar el sexo de los embriones. El sexado de embriones bovinos se realiza en forma rutinaria en varios países, empleando una sonda de ADN en combinación de la PCR. Los datos reportados indican una exactitud del 95 % de los embriones sexados mediante este procedimiento, con un 58 a 65 % de gestaciones obtenidas. Se recomienda que solamente los embriones de buena calidad puedan ser congelados después del procedimiento de sexado. BISECCIÓN DE EMBRIONES La Bisección de Embriones (BE) es una técnica que permite la producción de gemelos idénticos al dividir a un embrión usando técnicas de micro manipulación. Este método es una forma de clonación, porque hace posible la producción de individuos genéticamente iguales. La cantidad de crías idénticas que se pueden producir por esta técnica es limitada, pues si el embrión se divide en más de dos partes, disminuye la viabilidad del embrión seccionado. El método más práctico para realizar la bisección es con embriones obtenidos en la etapa de desarrollo de mórula ó blastocisto inicial, esto se realiza con embriones frescos o congelados. Para realizar este procedimiento se utiliza un microscopio adaptado con un equipo de micro manipulación para cortar los embriones por la mitad. Los porcentajes de preñez obtenidos con esta técnica son entre el 50 a 60% para cada mitad. A partir de la división de 100 embriones se obtienen 200 a 240 "medios" embriones, de esta cantidad si se logra un porcentaje de gestaciones del 50 al 60%, se obtendría una cantidad total de 100 a 120 crías. Comercialmente esta técnica se emplea para incrementar la producción de crías de alto valor genético, para determinar el sexo del embrión, y para mejorar la eficiencia de la investigación con animales modelos animales idénticos. LITERATURA CONSULTADA 1.

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History

of

commercializing

sexed

semen

for

cattle.

TÉCNICAS DE CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES EN BOVINOS INTRODUCCIÓN La conservación de células y embriones mediante la criopreservación se aplica actualmente de manera rutinaria en programas de mejoramiento y rescate genético en diferentes especies. En las especies domesticas estas técnicas permiten la creación de bancos de germoplasma (células y embriones) y facilita el intercambio y mantenimiento de líneas de alto valor genético. Este material se puede mantener congelado por tiempo indefinido en nitrógeno líquido (a 196 grados centígrados bajo cero). En la producción de embriones bovinos por superovulación o mediante la técnica de fertilización in vitro, la criopreservación ha sido el medio mas empleado para mantener la viabilidad de los embriones en el proceso de congelación y descongelación para su futuro desarrollo. En las distintas especies, la supervivencia de embriones congelados se obtuvo por los siguientes investigadores: Bovinos: Wilmut y Rowson, 1973; Ratas: Whittingham y col., 1975; Caprinos: Bilton y Moore, 1976; Conejos: Bank y Maurer, 1974; Ovinos: Willadsen y col., 1976. El proceso de criopreservación de material biológico en general, ya sean células o congregaciones de ellas (embriones, tejidos, órganos), se fundamenta en los efectos físico-químicos que la disminución de temperatura ejerce sobre estos sistemas vivos. La membrana celular se puede definir como una bicapa lipídica con una distribución asimétrica de proteínas en su interior. Esta estructura celular no sólo actúa como barrera física, sino que también ejerce un papel muy importante en el transporte iónico y de macromoléculas, así como en el reconocimiento de hormonas y neurotransmisores. Es un sistema heterogéneo complejo, cuyo comportamiento está determinado por la distribución de sus componentes y por el ambiente externo. La temperatura es un factor clave, ya que de ella depende tanto la velocidad o cinética de las reacciones bioquímicas, para que se realicen. La fluidez de los componentes de la membrana es dependiente de la temperatura, y esto afecta a la permeabilidad de su estructura, incluso cuando aún no se han producido cambios de estado inducidos por la variación de temperatura. Bajo estas condiciones, todas las reacciones bioquímicas, excepto algunos procesos de transferencia iónica están detenidas. En el proceso de criopreservación es esencial eliminar la mayor parte del agua intracelular antes de que el congelamiento se realice. De lo contrario, se formarán cristales intracelulares que causan daño mecánico y, frecuentemente, la muerte celular. El agua puede ser eliminada de las células osmóticamente, mediante crioprotectores con curvas de enfriamiento determinadas. El proceso de congelación comienza en el espacio extracelular, con la formación de cristales de agua pura (hielo). Esto causa un aumento en la concentración (hipertonicidad) de la solución líquida extracelular restante respecto al medio intracelular, lo que perturba el equilibrio osmótico atrayendo agua intracelular al exterior, y la célula queda

parcialmente deshidratada. Mientras siga la disminución de la temperatura, más hielo extracelular se forma, más agua abandona la célula, y el grado de deshidratación celular aumenta. La solución extracelular continúa aumentando de concentración, y el punto de congelación desciende considerablemente. En estas condiciones de sobresaturación, la solución es capaz de seguir enfriándose sin límite. El efecto general de un descenso de temperatura es el retardamiento de todos los procesos dinámicos, como son las tasas de difusión y reacción. Este retardamiento es bastante independiente de la congelación en sí, pero está muy influenciada por el aumento en la concentración de la solución que tiene lugar durante el proceso. El uso de nitrógeno líquido (-196 ºC) permite hoy en día, el almacenamiento indefinido de la mayoría de las células tras su congelación. El mecanismo preciso para la criopreservación convencional (congelación lenta) óptima ha sido establecido tras el estudio de los efectos producidos por diferentes protocolos de congelación y descongelación. La mayoría de las células deben ser enfriadas lentamente, de -1 a 3 ºC/min., en el caso de los embriones se controlan curvas de congelación de - 0.3 a - 0.5 ºC/min, y descongeladas rápidamente para alcanzar el máximo de viabilidad. La tasa de enfriamiento (velocidad a la que disminuye la temperatura), debe ser optimizada para dar tiempo a que el agua intracelular salga al exterior de la célula, y consiguientemente, reducir la cantidad de hielo intracelular formado. Existen congeladores controlados por programas con los que se consiguen perfiles de enfriamiento individuales, alcanzando una viabilidad máxima durante el proceso de criopreservación. Todos estos procesos tienen cierto grado de efectos lesivos sobre el material biológico que se está criopreservando. Se ha reportado que cuando disminuye la temperatura y el agua se congela en el espacio extracelular, tanto el estrés osmótico producido, como el incremento en las concentraciones de los solutos intracelulares, pueden dar lugar a daños irreversibles. Por lo tanto, no necesariamente es el hielo el que directamente causa el daño, sino que éste puede ser producido de modo indirecto. Existe el llamado "efecto de solución", que es el daño que puede producir la solución de congelación en las células debido a las diferencias osmóticas a que éstas son expuestas. Por otro lado, el “efecto de congelación", es el daño celular debido a las bajas temperaturas que se alcanzan y a la formación de cristales de hielo. En todo proceso de criopreservación, la temperatura y el tiempo de exposición son dos factores fundamentales que hay que controlar. El principio básico de la congelación de embriones, es la de inducir una deshidratación parcial a fin de evitar la formación de cristales que lesionen las estructuras citoplasmáticas. Este evento se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelación. En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores: Permeables o intracelulares Son de bajo peso molecular (menor a 100), Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 12 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma.

Impermeables o extracelulares Estos son de alto peso molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sacarosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares, estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el crioprotector las células de los embriones. Los crioprotectores mas comúnmente utilizados en la actualidad en los procedimientos tradicionales de congelación lenta son. El Glicerol y Etilenglicol El glicerol (G) que se emplea para la congelación de embriones debe tener una concentración de 1.4 Molar (M) o estar al 10% en una solución de fosfato buferado salino (PBS), en combinación de albúmina sérica bovina al 0.4% (BSA). El Etilenglicol se utiliza a una concentración de 1.5 M. El procedimiento de congelación tradicional consiste en: A). La exposición de los embriones al medio de congelación (glicerol o etilenglicol) debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 °C) en un solo paso, de 10 a 30 minutos de duración. Este período incluye el envasado de los embriones en pajillas de punto 0.5 ó 0.25 ml (el empajillado convencional se realiza depositando una columna de medio de trasferencia, aire, columna de medio de congelación con el embrión, aire, columna de medio de transferencia, aire y sellado de la pajilla), previamente identificadas de acuerdo a los criterios empleados por la Sociedad Internacional en Trasferencia de Embriones (IETS pos sus siglas en ingles). El envasado permite realizar más rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o "seeding". B). Las pajillas deben ser colocadas en un equipo de congelación a – 6 ó -7 °C durante 2 a 5 minutos para equilibrar la temperatura de las pajillas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la pajilla con un objeto metálico o un hisopo enfriado en nitrógeno líquido (NL2), en la parte superior de la columna donde se localiza el embrión; el agente refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido alcohol o etanol enfriado dependiendo del equipo de congelación disponible. El no inducir la cristalización conduce la formación de cristales de hielo bajo un estado de súper enfriamiento y a una elevación repentina de temperatura (se genera calor latente de –10 a –15 ºC), resultando en un severo trauma físico que puede dañar las células. Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de estabilización o equilibrio) y luego se desciende a una velocidad de entre 0.3 a 0.5 °C hasta -30 ó -35 C para establecer un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular, en este momento las pajillas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en nitrógeno líquido.

C). La descongelación se realiza de manera rápida, los embriones empajillados son sacados del termo de almacenamiento y expuestos al medio ambiente durante 10 segundos, inmediatamente después son sumergidos en agua a 30 ó 35°C durante 25–30 segundos. Este procedimiento es el empleado para embriones criopreservados en G, los embriones conservados en EG se descongelan a 25 ó 30 °C durante 15 a 20 segundos. Una de las mayores ventajas de los embriones congelados con EG es el de poder ser transferidos de manera directa a las receptoras, sin la necesidad de utilizar diluyentes para su descongelación ni el microscopio para observar los embriones. Hay dos métodos para descongelar los embriones cuando son congelados en glicerol, esto es con la finalidad de que la hidratación del embrión se realice de manera paulatina para evitar el “choque osmótico”. 1) Tres pasos, se utiliza medio que contiene PBS+BSA+Sacarosa y glicerol en diferentes concentraciones. En cada uno de los medios el embrión debe permanecer durante 5 min. Posteriormente es depositado en el medio de mantenimiento hasta su transferencia. Medio 1: PBS+BSA+Sacarosa + 6% glicerol Medio 2: PBS+BSA+Sacarosa + 3% glicerol Medio 3: PBS+BSA+Sacarosa Medio de mantenimiento PBS+BSA 2) Descongelación en un paso Medio 1: PBS+Sacarosa 0.25% Medio de mantenimiento PBS+BSA Los embriones de calidad 1 y 2 según la clasificación de la IETS son los destinados a ser congelados. La fertilidad lograda de acuerdo a la calidad y grado de desarrollo (mórula o blastocisto) de los embriones congelados en G ó EG es muy controversial, en algunos trabajos se reportan diferencias significativas en los porcentajes de gestación, mientras que otros investigadores no han encontrado diferencias. Los porcentajes de gestaciones logrados en la actualidad con embriones congelados producidos in vivo en bovinos oscilan en el rango del 40 al 50% y con embriones obtenidos in vitro es de un 15 a un 30%. VITRIFICACIÓN El máximo daño en el embrión durante el enfriamiento ocurre de -15 a -16 ºC debido a la fase de transición de la membrana lipídica. Esta fase se ve afectada por la fusión de los liposomas afectando el termo comportamiento de las membranas en la transición de líquido a hielo y la velocidad de penetración de los crioprotectores. El daño celular incluye pérdida de microvellosidades, disrupción de la membrana plasmática, cambios mitocondriales, hinchamiento del retículo endoplásmico, pérdida de uniones entre células así como fractura de zona pelúcida. Estas alteraciones se pueden presentar en un alto grado en los procedimientos de congelación lenta. Con el ultra enfriamiento (se logran temperaturas de -1000 a -2000 ºC/min) obtenido con la vitrificación estos daños se pueden evitar de manera importante. La

vitrificación es un metodo de enfriamiento rápido, con descenso brusco de temperatura, tras el tiempo de equilibrio de los embriones en los medios a temperatura ambiente, estas células son sumergidas directamente en nitrógeno líquido. No hay tiempo para la deshidratación. Se fundamenta en que estos medios poseen unas concentraciones altas de crioprotectores (molaridad entre 4 y 7), que hace imposible la formación de cristales de hielo. Se produce una sobresaturación, y el paso a un estado altamente viscoso similar al vidrio (vítreo, de ahí su nombre), que sin llegar a sólido reduce el movimiento molecular casi totalmente. El mejoramiento del proceso de la vitrificación con el método Open Pulled Straw (OPS), ha proporcionado altas tasas de gestación. La vitrificación se realiza a temperatura ambiente y el procedimiento planteado por Seidel and Walter 2006, donde se utiliza la pajilla para conservar el embrión con el medio comercial de Syngro- Bioniche es el siguiente: A). Se lavan 2 veces, clasifican según criterio de la IETS y se mantienen los embriones en el medio H (Medio base: Syngro-Bioniche 0.1% alcohol polivinilico) B). Posteriormente los embriones se colocan en 0.5 ml del medio V1 durante 3 minutos (5 M de Etilenglicol + medio base) C). Se depositan los embriones en gotas de 15µ del medio V2 (7 M de Etilenglicol, 18% de Ficoll 70, 0.5 M de galactosa + medio base) por 45 segundos. D). Los embriones se cargan en pajillas de 0.25 ml identificadas según la IETS. Se carga un 1cm del medio D, 0.5 cm de aire, 7 cm de medio D, 0.5cm de aire, gota del medio V2 con los embriones, 0.5 cm aire y al final 1cm de medio D y se sella la pajilla. E). Las pajillas se coloca en un goblens suspendido sobre nitrógeno líquido previamente a la introducción de la pajilla. La pajilla se mantiene en vapores de nitrógeno líquido durante 1 minuto y luego es introducido directamente al nitrógeno. Todo este proceso tiene una duración de 10 min. Calentamiento o revitalización Las pajillas se exponen 8 segundos en el aire 15 segundos en baño María a 35 ó 37 ºC Los embriones pueden ser transferidos directamente o colocados en medio Hepes-Talp + 10 % suero fetal o BSA (Sero Albumina Bovina), para su evaluación y posterior transferencia. Existen una gran variedad de protocolos para vitrificar embriones en las diversas especies, por el momento no hay uno estandarizado para bovinos, la mayoría de estos varían en la concentración de los crioprotectores, material de almacén del embrión. El método OPS y el de la pajilla de 0.25 ml son los más utilizados en bovinos, en algunos estudios han logrado un 40 a 70 % de gestaciones

con embriones producidos in vivo e in vitro arriba del 40 %. Otra de las ventajas que brinda esta técnica en bovinos, es que no se requiere de equipo de congelación para realizarlo. El resultado de la vitrificación está condicionado previamente por la calidad del embrión y el estado de desarrollo embrionario. Cuando se vitrifican embriones de calidades 1 y 2 se obtienen mejores resultados que con aquellos de calidad regular. La etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación de embriones es mórula compacta a blastocisto expandido, siendo más sensibles a las bajas temperaturas los embriones producidos in vitro. LITERATURA CONSULTADA 1.

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