Fish Metoda.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA Fluorescence in situ hybridization (FISH) je otkrivena 1977. godine ali je implementirana kao metoda tek 1988. godine FISH se sastoji iz nekoliko faza, a po principu izvođenja slična je Southern blot analizi.

DNA fragment koji sadrži genski lokus koji želimo analizirati se označava fluorescentno konjugiranim nukleotidnim supstratom ili molekulom koja se zatim detektuje fluorescentno označenim antitijelom.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA Hibridizacija se odvija na metafaznim hromozomima ili na hromatinu u interfazi, na nukleusima koji su fiksirani na mikroskopskom staklu. Kada se dvolančana DNA zagrije, komplementarni lanci se razdvajaju (denaturišu) i nastaju jednolančane DNA. Pri prikladnim uslovima, razdvojene komplementarne regije DNA se mogu spojiti i ponovo formirati dvolančanu molekulu. Ovaj proces renaturacije naziva se hibridizacija. U slučaju FISH, uzorak (npr. tumorsko tkivo) hibridizira sa označenom probom.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA DNA probe su komercijalno dostupne: • Mogu biti direktno označene fluorohromom (proba za direktno označavanje) •Označene haptenom (proba za indirektno označavanje). Hapteni se koriste jer mogu reagovati sa antitijelima. Najčešće korišteni hapteni su biotin i digoksigenin. Antitijela korištena u FISH protokolu imaju za sebe vezan fluorescentni biljeg tako da se mogu detektovati pod fluorescentnim mikroskopom.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA Ciljna DNA može biti porijeklom iz: •Citogenetičkog uzorka •Formalin-fiksiranog tkiva Priprema citogenetičkog uzorka Klasična FISH analiza uključuje pripremu kratkotrajne kulture ćelija (uglavnom ćelija periferne krvi, kožnih fibroblasta, amniocita, tumorskih biopsija i kultura određenih ćelijskih linija-imortalizovane ćelijske linije).

Kratkotrajna kultura je potrebna da bi se dobila jedra u interfazi i metafazi. Ćelije koje podliježu diobi u kulturi se tretiraju kolcemidom, koji je inhibitor diobenog vretena. Na taj način se ćelije zaustavljaju u metafazi kada se hromozomi najbolje vide.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA

Amniocenteza

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA Priprema citogenetičkog uzorka

Ćelije se zatim talože centrifugiranjem i resuspendiraju u hipotoničnoj otopini NaCl (0.075 M).Tretman hipotoničnom otopinom će izazvati bubrenje ćelije. Ponavljana fiksacija sa metanol:voda = 3:1 fiksativom omogućuje održavanje ćelije u takvom stanju sve dok se ne postavi na mikroskopsko staklo. Uspješna priprema uzorka na mikroskopskom staklu podrazumijeva da su hromozomi, nakon prethodno navedenog tretmana razdvojeni i sa minimumom citoplazmatskog ostatka. U kontaktu sa staklom, nabubrena membrana jedra puca i hromozomi se oslobađaju.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA Priprema citogenetičkog uzorka

Mikroskopski uzorci se obično tretiraju proteazama, kao što je pepsin ili proteaza K da bi se uklonio citoplazmatski talog, koji bi mogao otežati pristup probe molekuli DNA. Ovaj tretman također umanjuje pozadinski odziv koji može nastati inkubacijom uzorka sa antitijelima (u indirektnoj metodi označavanja). Nakon tretmana proteazom, mikroskopski preparati se kratko isperu PBS-om (Phosphate buffer saline) a zatim prolaze dehidraciju kroz alkoholnu seriju (70%, 90% i 100%) i suše na zraku.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA Priprema citogenetičkog uzorka

Mikroskopski preparati zatim podliježu koraku denaturacije u 70% formamid/2×SSC otopini 2 min na 72°C. Korištenje formamida omogućuje denaturaciju DNA na nižoj temperaturi. Mikroskopski preparati se odmah stavljaju u seriju 70% do 100% etanola, da bi se održali u jednolančanom, denaturisanom stanju. Preparati se zatim suše i spremni su za hibridizaciju sa denaturisanom, označenom DNA probom.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA Priprema i denaturacija označene DNA probe

Označena DNA proba se otapa u hibridizacijskom puferu koji se sastoji od 50–60% formamida/2× SSC i 10% dekstran sulfata. Kao i DNA uzorka i DNA probe mora biti denaturisana. To se postiže toplotnom denaturacijom probe 5 min na 75°C. Denaturisana proba se postavlja preko mikroskopskog stakla sa denaturisanim uzorkom i ostavlja preko noći da bi se omogućila hibridizacija.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA CITOGENETIČKOG UZORKA Ispiranje nevezanog materijala

Sljedeći dan, nevezani materijal se mora ukloniti sa preparata. Ukoliko je korištena DNA proba konjugirana sa haptenom (indirektno označavanje), slijedi dodatak antitijela da bi se vizualizirao rezultat hibridizacije. U slučaju direktnog označavanja, potrebna je serija ispiranja da bi se uklonio višak nevezane probe.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA UZORKA IZ TKIVA FIKSIRANOG U FORMALINU Za mnoga ispitivanja nije moguće dobiti ćelije u metafazi diobe, pa nije moguća metafazna analiza. U ovom slučaju na raspolaganju su interfazna jedra, ali su potrebne specijalne tehnike za pripremu i analizu ovakvih uzoraka.

Kada klinička laboratorija primi komad ljudskog tkiva, uzorak tkiva se konzervira u fiksativu-formalinu a zatim se stavlja u tekući vosak koji će očvrsnuti u pravougaoni blok, prikladan za siječenje mikrotomom i mikroskopiju. Ovakvi parafinski blokovi su u širokoj upotrebi u patološkim laboratorijama jer se tkivo na ovaj način može čuvati za kasniju analizu. Parafinski kalupi se režu obično na slajdove debljine 5 um, postavljaju na mikroskopska stakla i tretiraju toplotom.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA UZORKA IZ TKIVA FIKSIRANOG U FORMALINU

Tkivni uzorci uklopljeni u parafinskim kalupima

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA UZORKA IZ TKIVA FIKSIRANOG U FORMALINU

Rezanje parafinskih kalupa mikrotomom

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA UZORKA IZ TKIVA FIKSIRANOG U FORMALINU Priprema tkiva fiksiranog u formalinu Prije nego što se proba koristi na tkivu, mora se ukloniti parafin da bi se omogućio pristup probe ciljnoj DNA. Nakon pripreme, mikroskopski slajdovi (preparati) se uranjaju u otopinu ksilena, više puta uz miješanje, da bi deparafinacija bila što efikasnija. Pored toga, ksilen se može više puta mijenjati. Zatim slijedi dehidracija kroz alkoholnu seriju (70%, 90%, 100%) i sušenje na zraku. Tkivo se zatim tretira proteazom, pepsinom ili proteazom K. Slajdovi ponovo prolaze dehidraciju u alkoholnoj seriji i sušenje na zraku. Slijedi dodavanje probe.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIPREMA UZORKA IZ TKIVA FIKSIRANOG U FORMALINU

Kodenaturacija ciljne DNA i označene DNA probe Na prethodno istretirano tkivo porijeklom iz parafinskog kalupa, dodaje se DNA proba, postavlja se pokrovno staklo a zatim se tako dobijeni preparat kodenaturiše na temperaturi 80°C, 10 min. Zatim slijedi hibridizacija preko noći na 37°C.

Ispiranje i detekcija probe

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIMJENA

FISH metodom može se utvrditi da li je hromozomski lokus/gen: • Prisutan u normalnom broju kopija (tj. dvije kopije po ćeliji) • Prisutan u većem broju kopija-amplificiran • Prisutan u manjem broju kopija • Pravilno postavljen na hromozomu-ukoliko nije pravilno postavljen smatra se translociranim.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIMJERI PROBA

Primjeri različitih tipova proba za FISH

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIMJENA Detekcija translokacija- Filadelfija hromozom t(9;22)(q34;q11) Filadelfija hromozom je specifična hromozomska abnormalnost u hroničnoj mijelogenoj leukemiji. Hromozomski defekt - translokacija u kojoj dva hromozoma, 9 i 22 razmjenjuju dijelove. Pošto se radi o recipročnoj translokaciji, nastaje produženi hromozom 9 i skraćeni hromozom 22. Na skraćenom hromozomu 22 nastaje fuzionirani gen BCR-Abl jer Abl gen sa hromozoma 9 (region q34) dospijeva u jukstapoziciju dijela gena BCR na hromozomu 22 (regija q11). Na skraćenom hromozomu 22 nalazi se fuzionirani onkogen BCR-Abl koji kodira bcr-abl fuzionirani protein.

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIMJENA Detekcija translokacija Filadelfija hromozom t(9;22)(q34;q11)

Rezultat FISH analize- bcr/abl pozitivni aranžman u metafazi

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA PRIMJENA

Humana ćelijska linija sa translokacijom između hromozoma 4 (crveni signal) i 6 (zeleni signal). Korištena metoda bojenja čitavog hromozoma. Hromozomska izmjena vidi se kao zeleni i crveni signal sa istog hromozoma.