Tp Bi514 Physiologie Vegetale (2005-2006)

TP Licence Biochimie

IBFA LICENCE 3 Physiologie Intégrée (Bi514)

Travaux pratiques MANIPULATION A ETUDE DES HEMICELLULOSES ET DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO β - GLUCANASES ETUDE DE L’ACTIVITE PECTINE METHYLESTERASE MANIPULATION B DOSAGE DE L'AMIDON ET DU GLUCOSE ETUDE DES INVERTASES SOLUBLES DOSAGE DE L'ASCORBATE ET DU DEHYDROASCORBATE

Hordeum vulgare L. Enseignante: Annette BERTRAND, Unité Mixte de Recherche INRA-UCBN EVA « Ecophysiologie Végétale, Agronomie et nutrition N, C, S » (Bâtiment IRBA, Campus 1) http://www.rennes.inra.fr/umreva/

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Préambule

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L’objectif de ces deux séances de TP est de comparer deux types de tissus foliaires : des tissus jeunes en croissance, non (ou peu) photosynthétiquement actifs et des tissus adultes matures, photosynthétiquement très actifs. Ces deux types de tissus sont respectivement des puits (importateurs nets de carbone) et des sources (exportateurs nets de carbone) pour le carbone. Cette comparaison se fera sur une poacée, l’orge (Hordeum vulgare). Chez les poacées, les feuilles s’allongent presque exclusivement longitudinalement, le méristème foliaire est situé à la base de la feuille. Les nouvelles feuilles apparaissent successivement entourées par les feuilles adultes. Lorsqu’une feuille atteint sa maturité, elle se dissocie en gaine foliaire (partie inférieure) et en limbe foliaire (partie supérieure) séparées par la ligule (Figure 1).

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Lors de ces manipulations, le limbe des feuilles adultes (tissu mature, source de carbone) sera comparé à la base des feuilles en croissance (puits pour le carbone). Chez ces deux types de tissus seront comparés : - Les activités endo- et exo-β-glucanases. Manip A - L’activité pectine methylestérase - Les teneurs en protéines - Les teneurs en amidon et en glucose Manip B - Les activités invertasiques solubles acides et alcalines. - Les teneurs en ascorbate et dehydroascorbate Un compte-rendu par binôme sera demandé à l’issu des deux séances de TP (à rendre pour le 9 novembre, dernier délai) qui comprendra : - une introduction incluant les objectifs des manipulations effectuées (quelques lignes) - Les principes succincts des méthodes utilisées pour répondre à ces objectifs (2 pages maximum) - Les résultats brut obtenus (2 pages maximum)

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Les calculs détaillés (4 pages maximum) Un tableau récapitulatif de l’ensemble des résultats obtenus (voir modèle page suivante) Une discussion des différents résultats obtenus (2 pages maximum) Une conclusion (quelques lignes)

feuille en croissance limbe foliaire ligule

zone de croissance foliaire de la feuille en croissance

feuille adulte

gaine foliaire

racines

Figure 1 : représentation schématique d’une talle de Poacée.

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Limbes matures activités endo- et exo-βglucanases. (µmol.h-1.g MF-1)

Base des feuilles en croissance

Endo Exo

Activité pectine methylestérase (µmol.h-1.g MF-1) Teneur en protéines (mg.g MF-1) Teneur en amidon (mg.g MF-1) Teneur en glucose (mg.g MF-1) Activités invertasiques Neutre solubles Acide (µmol.h-1.g MF-1)

Manipulation A

Manipulation B

Teneur en ascorbate (mg.g MF-1) Teneur en dehydroascorbate (mg.g MF-1) Rapport Ascorbate/Dehydroascorbate Ce tableau est un modèle pour la rédaction du compte-rendu mais il peut également vous servir à cocher progressivement les différentes analyses au fur et à mesure que vous les effectuez.

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MANIPULATION A

Etude des enzymes impliquées dans la dégradation des hémicelluloses pariétales. A.I. DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO β GLUCANASES. A.II. ETUDE DE LA PECTINE METHYLESTERASE A.III. DOSAGE DES PROTEINES

INTRODUCTION La microscopie photonique a permis de distinguer plusieurs régions dans la paroi. Vue perspective d'une paroi disséquée montrant les différents niveaux - La lamelle moyenne est la formation la plus périphérique de la paroi, elle forme un ciment constitué de polysaccharides acides, les pectines. Cette enveloppe hydrophile polyanionique conditionne la cohésion intercellulaire. - Les niveaux plus internes de parois sont renforcés par une charpente cellulosique. Ces territoires pariétaux apparaissent comme autant de coques concentriques et individuelles pour chaque cellule, dans lesquelles on distingue deux phases de composés polysaccharidiques : une phase cristalline discontinue : la cellulose. Celleci apparaît chez les végétaux supérieurs sous forme de microfibrilles élémentaires de diamètre compris entre 30 et 40 Å et agencées en faisceaux. On distingue la paroi primaire; il s'agit d'un réseau hydraté (jusqu'à 80% d'eau dont la matière sèche renferme en majeure partie des polysaccharides (80-90%) associée à des protéines (10-15%) et des ions minéraux notamment du calcium. Les hémicelluloses représentent un fort pourcentage des polysaccharides et la charpente fibrillaire est relativement lâche. La paroi primaire est la seule enveloppe fibrillaire des cellules jeunes et en croissance. La propriété caractéristique est donc la plasticité. Lorsque la croissance cesse, des assises nouvelles (appelées S1, S2, S3 dans le cas des cellules du bois du tilleul) sont élaborées: elles constituent la paroi secondaire inextensible. Cette paroi est peu hydratée (20 % ou moins d'eau). La charpente fibrillaire y est toujours compacte, la cellulose y est hautement cristalline. Signalons cependant que certaines parois secondaires ont une architecture fibrillaire non constituée de cellulose, mais d'hémicellulose. Le cas est fréquent chez les algues et les champignons. Il se rencontre aussi chez les plantes supérieures, en particulier dans les cellules de l'albumen de graines qui stockent dans la paroi des polysaccharides de réserve (hémicelluloses).

Figure 1 : Vue perspective d'une paroi disséquée montrant les différents niveaux

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TP Licence 3 (Bi514) - LA CELLULOSE (β - 1, 4 glucane) : b-

La cellulose est un homoglucane homogène et linéaire, elle est constituée de β-

β - glucanes : homopolysaccharide sucres : glucose liaison : β - 1, 3 et β - 1, 4 degrés de polymérisation <30 (laminarine) 40 - 350 (lichenan) - LES PECTINES Les substances pectiques sont des macromolécules de nature glucidique, d'origine exclusivement végétale, composées essentiellement d'acides galacturoniques.

D-glucose liés par les carbones 1 et 4. Deux motifs de β-D-glucose constituent le cellobiose qui se répète le long des chaînes sans ramification latérale. Figure 2 : Détail d'une molécule de β - 1, 4 glucane Le nombre d'unités glucose dans une microfibrille de cellulose varie entre 15 et 15000, avec une valeur moyenne d'environ 3000. Les chaînes de cellulose sont couplées ensemble par des liaisons hydrogènes établies entre les fonctions hydroxyles libres d'un glucose et un atome d'oxygène d'un motif d'une chaîne voisine.

Le terme de substance pectique est le terme générique. Les composés pectiques sont constitués par des acides galacturoniques liés en α - 1, 4. Cette chaîne forme l'acide polygalacturonique ou acide pectique ; elle possède une extrémité réductrice. Acide polyuronique (pectines) a) Chaîne d'unités acides galacturoniques b) Fonction acide estérifiée par un groupement méthyle.

- LES HEMICELLULOSES Certains auteurs englobent sous le terme d'hémicellulose tous les polysaccharides pariétaux autres que la cellulose et que les composées pectiques présents dans la paroi cellulaire des plantes terrestres. Il existe de nombreux types d'hémicellulose. La plupart sont des hétéropolymères, certains peuvent être constitués de 5 à 6 sucres différents. Les hémicelluloses présentent une structure ramifiée à l'exception du cas particulier des β- glucanes (tableau ci-dessous). HEMICELLULOSES a-

type : hétéropolysaccharide type de chaîne : ramifié chaîne principale sucres : xylose, mannose, galactose liaison : β - 1, 4 chaîne secondaire sucres : acide méthyl-glucuronique, arabinose, glucose, galactose liaison : α - 1, 2 ; β - 1, 3 ; β - 1-4 ; β - 1, 6 degrés de polymérisation : 150-200

Figure 3 : Détail d’une molécule d’acide polygalacturonique On connaît seulement quelques types de substances pectiques possédant une structure aussi simple. Elles présentent, en général, une structure plus complexe résultant de la substitution de certains groupes sur la chaîne principale. Les fonctions acides sont souvent neutralisées : on note en effet la présence d'ions monovalents ou divalents tels que K+, Na+, Ca2+. Ces fonctions peuvent aussi être estérifiées par du méthanol (CH3OH); le degré de méthylation (DM) est défini comme le nombre de

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TP Licence 3 (Bi514) fonctions carboxyliques estérifiées par le méthanol pour 100 fonctions carboxyliques. Ce paramètre est à la base d'une classification des substances pectiques : si leur DM est compris entre 5 et 45-50%, elles font partie des pectines faiblement méthylées (pectines FM), si leur DM est supérieur à 50%, elles constituent les pectines hautement méthylées (pectines HM). Dans la nature, les pectines sont le plus souvent hautement méthylées. D'autres sucres, tel que le rhamnose, peuvent entrer dans la composition des substances pectiques.

A-I- DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO β 1,3 GLUCANASES L'analyse des parois primaires isolées montre la présence de systèmes enzymatiques variés, parmi lesquels certains interviennent dans les échanges et la mobilisation des réserves (invertase), d'autres dans les processus d'oxydo-réduction (malate deshydrogénase, acide ascorbique oxydase) et tout un ensemble de βglucanases catalysant la rupture des polysaccharides au niveau des liaisons β - 1, 3 et β - 1, 4. Il existe également des pectinases et des pectine-méthylestérases (manipulations 2 et 3). Au cours de ce TP, nous étudierons les activités endo et exo β - 1, 3 glucanases. 1 - Caractéristiques des β-1, 3 glucanase (EC 3.2.1.6) Les β - 1, 3 glucanases assurent l'hydrolyse de la liaison β - 1, 3 des chaînes de β - 1, 3 glucanes. Certains sont des exoglucanases intervenant aux extrémités des chaînes (côté non réducteur) qu'elles raccourcissent en libérant du glucose, d'autres sont des endoglucanases qui agissent à l'intérieur des chaînes en libérant des molécules de β - 1, 3 glucane plus courtes que les molécules originelles. Figure 4 : Détail d'une molécule de β - 1, 3 glucane (laminarine)

Ces enzymes interviennent dans de nombreux processus physiologiques: division cellulaire, embryogénèse, maturation des fruits, germination, mobilisation des réserves. Elles font également partie des protéines PR (Pathogenesis Related Protéines) qui interviennent dans la défense des plantes contre les pathogènes de deux façon: - elles dégradent les parois cellulaires de pathogènes. - elles libèrent, à partir des parois de la plante, des oligosaccharides qui peuvent agir comme éliciteurs pour les réactions de défense. Les β - 1, 3 glucanases sont liées à la trame pariétale par des liaisons ioniques faibles et la majorité est éluée par des solutions salines (NaCl) . Leur activité est très généralement stimulée en milieu acide (pH optimum compris entre 4 et 6). Ces enzymes hydrolysent en particulier la laminarine, homopolysaccharide de réserve constitué de molécules de glucose reliés en β - 1, 3. Chez les végétaux supérieurs, le glucono lactone est inhibiteur des activités exo β - 1, 3 glucanases. Cet inhibiteur compétitif sera utilisé dans ce TP afin de distinguer les activités endo des activités exo β - 1, 3 glucanases. 2 - détermination des activités β - 1, 3 glucanases de feuilles d'orge 2.1. - Extraction des β-1,3 glucanases (Endo + Exo) 2 x 1 g de tissu foliaire frais (limbe mature et base de feuille en croissance) sont broyés au mortier à 4°C en présence de 4 ml de tampon acétate de sodium 100 mM pH = 5,0 additionné de NaCl à 600 mM (tampon d’extraction). Les broyats sont recueillis directement dans le tube à centrifuger et le mortier est rincé avec 4 mL du tampon d’extraction. Les broyats sont centrifugés pendant 10 minutes à 5000 RPM (centrifugeuse réfrigérée). Les surnageants sont complétés à 10 ml avec le tampon d'extraction (dans une éprouvette de 10 ml) et conservés dans la glace. 2.2.-Purification partielle de l'extrait enzymatique d'Orge par chromatographie sur colonne PD - 10 (Pharmacia) Le gel de Sephadex de la colonne PD-10 est constitué par un réseau de mailles à base de dextranes dans lesquelles les molécules pénètrent plus ou moins selon leur taille. Les grosses molécules (supérieures à 5 000 D) sont éluées en premier. Les autres molécules (dont le NaCl et le glucose) seront retardées car, rentrant dans les mailles du réseau, elles empruntent un chemin plus long.

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Préparation des colonnes : Il est indispensable de suivre scrupuleusement les instructions ci-dessous : - Enlever le bouchon supérieur et éliminer l'excès de liquide de conservation. - Déboucher l'extrémité inférieure de la colonne - Equilibrer la colonne avec approximativement 25 ml de tampon acétate 100 mM, pH = 5,0 (tampon d’élution). Ne jamais laisser la partie supérieure du gel complètement à sec. Chromatographie de l'extrait foliaire d'Orge : - Appliquer 2,5 ml de l'extrait de β - 1, 3 glucanases au sommet de la colonne et jeter l'effluent. - Eluer les protéines avec 3,5 ml de tampon acétate 100 mM, pH = 5,0 (tampon d’élution). Le facteur de dilution de l'extrait enzymatique initial est donc égal à 1,4. - Rincer ensuite la colonne avec 25 mL d’eau distillée. 2.3.-Mesure des activités endo et exo β - 1, 3 glucanases Le substrat utilisé est la laminarine et la mesure des activités enzymatique est réalisée en dosant la quantité de fonctions réductrices libérées. L'incubation est réalisée en présence ou en absence de gluconolactone qui est un inhibiteur des exo β 1, 3 glucanases. En présence de gluconolactone, la quantité de fonctions réductrices libérées correspond à l'activité des endo β - 1, 3 glucanases. En l'absence de gluconolactone, la quantité de fonctions réductrices libérées correspond à l'activité des endo β - 1, 3 glucanases et des exo β - 1, 3 glucanases. Préparer 8 tubes à hémolyse de la façon suivante: Activité endo-glucanase (4 tubes) Milieu d'incubation "endoglucanase" 0,6 mL (avec gluconolactone) Milieu d'incubation "exoglucanase" Extrait enzymatique 0,4 mL partiellement purifié Témoins "essais enzymatiques" (2 tubes*) (2 tubes*)

Activités endo+exoglucanases (4 tubes) 0,6 mL 0,4 mL "essais enzymatiques" (2 tubes*)

Témoins (2 tubes*)

45 min à 40°C puis 5 min à 100°C

5 min 100°C

45 min à 40°C puis 5 min à 100°C

5 min 100°C

*1 tube pour le l’extrait de limbe mature et 1 tube pour l’extrait de base de feuille en croissance.

Composition des milieux d'incubation: - Incubation endoglucanase: tampon acétate de Na 100 mM, pH = 5,0 contenant 7,5 mM de glucono lactone et de la laminarine à 0,666% (P/V). - Incubation exoglucanase: tampon acétate de Na 100 mM, pH = 5,0 contenant de la laminarine à 0,666% (P/V). Les témoins permettent de connaître la quantité de fonctions réductrices initialement présentes dans chacun des cas. Après, l'incubation, l'arrêt de la réaction enzymatique est assuré par chauffage à 100°C (bain-marie bouillant) pendant 5 minutes. L'activité est déterminée par la mesure des fonctions réductrices libérées. 2.4- Mesure des fonctions réductrices apparues par action des endo et des exo β, 1-3 glucanases (Méthode de Nelson). Ce dosage est basé sur la réduction du sulfate de cuivre par les fonctions réductrices des sucres réducteurs. Le cuivre précipité réagit avec l'arsénomolybdate en donnant une coloration bleue dont on mesure l'intensité à 520 nm au spectrophotomètre. Préparation de la gamme d'étalonnage: la courbe étalon (concentrations 0, 20, 40, 60, 80 µg.ml-1) est réalisée par dilutions successives d'une solution mère de glucose à 1 g.L-1 en utilisant des fioles jaugées de 50 ml. Dosage: - Diluer 10 fois le contenu des tubes des essais enzymatiques et 4 fois le contenu des tubes témoins. - Mélanger 50 ml de réactif A et 2 ml de réactif B. - Prélever 1 ml de la solution à doser (essai enzymatique, témoin ou solutions étalons) et ajouter 1 ml du mélange A+B. - Porter 20 minutes au bain-marie bouillant. - Refroidir et ajouter dans chaque tube 1 ml de solution d’arsénomolybdate. - Ajouter 5 mL d’eau dustillée - Faire la lecture de la densité optique (DO) au spectrophotomètre à 520 nm (coloration stable).

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2.5. - Expression des activités enzymatiques Les activités enzymatiques endo- et exo-β1,3glucanases sont calculées en µmol de fonctions réductrices formées (exprimée en µmol h-1 g-1 MF). MMglucose = 180 g.mol-1 Remarque: ne pas oublier que la mesure porte sur 0,4 ml d'enzyme d'un extrait dilué 1,4 fois par chromatographie.

A-II. ETUDE D'UNE ENZYME DEMETHYLANTE : la pectine méthylestérase Comme la polygalacturonase, la pectine méthylestérase intervient dans la maturation des fruits et la croissance cellulaire. La pectine méthylestérase permet la réaction suivante :

Peser 2 x 2 g de tissus foliaires (limbes matures et bases de feuilles en croissance) et découper en petits morceaux. Les échantillons foliaires sont broyés dans un mortier placé dans la glace à 4°C, avec 1 ml de NaCl 0,2 M (toutes les opérations doivent être réalisées à 4°C). Ajouter 9 ml de NaCl 0,2 M en fin de broyage. Le broyat est versé dans un bécher de 50 ml, le mortier est rincé successivement deux fois avec 5 ml de NaCl 0,2 M, les liquides de rinçage sont ajoutés au broyat. Ce fin broyat constitue l'extrait enzymatique : il s'agit d'une suspension, l'enzyme fixée sur les parois n'étant pratiquement pas solubilisé dans nos conditions d'extraction. Conserver cet extrait enzymatique à 4°C. 2. Incubation à pH constant L'activité enzymatique est quantifiée par une mesure du pH en fonction du temps. Dans un bécher de 150 ml, 50 ml d'une solution de pectine à 0,25% (substrat) dans du NaCl 0,2 M, sont stabilisés à 30°C et le pH est ajusté à 7,60 avec de la soude 0,1 M puis 0,01 M. La mesure du pH doit être faite en agitant doucement la solution. Puis le broyat est placé en agitation dans un bain thermostaté à 30°C. Après équilibre thermique et sous agitation, le pH est amené à une valeur de 7,60 avec de la soude 0,1 M puis 0,01 M. Au temps initial T0, toujours à 30°C, le broyat est versé dans le substrat sous agitation. A partir de ce moment, maintenir le pH à la valeur 7,60 en versant de la soude 0,01M. Noter la quantité de soude consommée au bout de 15 minutes.

N et N+n étant le nombre de fonctions acides non estérifiées dans la pectine au début et à la fin de la réaction. L'enzyme s'attaque d'abord aux groupements méthyls voisins des groupements carboxyles libres puis l'hydrolyse se poursuit le long de la chaîne polysaccharidique en libérant des molécules de méthanol. Il y a donc apparition de méthanol dans le milieu avec démasquage de la fonction acide. Les mesures électrométriques de pH se font avec rapidité et précision, il est donc préférable de détecter les changements de pH dans le milieu réactionnel plutôt que de tenter le dosage de faibles quantités de méthanol. 1. Extraction de l'enzyme à partir du matériel végétal

Expression des résultats : - L'activité enzymatique est exprimée en µmol. de soude par heure pour 1 g de MF.

A-III. EXTRACTION ET DOSAGE DES PROTEINES Dans le cas particulier des protéines pariétales, insoluble dans nos conditions expérimentales, il est nécessaire d'utiliser une extraction à la soude 1N avant un dosage colorimétrique par la méthode de Lowry. Cette extraction à la soude permet d’obtenir les protéines solubles et les protéines insolubles.

Cette extraction est à faire deux fois pour obtenir deux extraits enzymatiques qui serviront respectivement à l'incubation à pH variable et à l'incubation à pH constant.

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a- Extraction : Peser 2 x 2 g de tissu foliaire (limbes matures et bases de feuilles en croissance), les broyer dans 1 ml de soude 1M. A la fin du broyage 3 ml de soude sont ajoutés. Laisser en contact pendant 1h30 (au minimum) à la température ambiante. Transvaser le broyat dans un tube à centrifuger et rincer le mortier et le pilon soigneusement avec 2 x 1 mL de soude 1M. Le très fin broyat obtenu est centrifugé 10 minutes à 4000 RPM, puis le surnageant recueilli est amené à 10 ml dans une éprouvette (avec NaOH 1M) Le dosage est réalisé sur une partie aliquote après avoir dilué 10 fois et 20 fois l'extrait. b- Dosage colorimétrique : Les protéines donnent en présence des réactifs de Lowry et de Folin, une coloration bleue caractéristique. La coloration finale résulte : - de la réaction du biuret qui se produit avec le réactif de Lowry (cuivre en milieu alcalin). - de la réduction des acides phosphotungstique et phosphomolybdique (réactif de Folin) par la tyrosine et le tryphophane des protéines. Dans la gamme de concentrations données, l'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de protéines présentes dans la solution. La protéine choisie comme référence est la sérum-albumine. On l'utilise pour réaliser la courbe étalon. Préparation des solutions étalons de sérum-albumine : A partir d'une solution de sérum-albumine à 1 g.1-1, réaliser des solutions à 50 µg.ml-1, 100 µg.ml-1, 150 µg.ml-1, 300 µg.ml-1 dans des jaugés de 50 ml. Dosage (répéter deux fois chaque mesure): Dans un petit tube verser : - 0,6 ml de solution de sérum-albumine ou 0,6 ml d’échantillon - 3 ml de réactif C de Lowry Le réactif C de Lowry est obtenu en mélangeant 50 ml de réactif A et 1 ml de réactif B. Attendre 10 minutes. Faire un blanc en remplaçant les 0,6 ml de sérumalbumine par 0,6 ml d’eau. - Ajouter 0,3 ml de réactif de Folin - Mélanger par retournement et attendre 30 minutes - Faire la lecture au colorimètre à 640 nm. Calculer la quantité de protéines extraites en mg.gMF-1

PLAN DE TRAVAIL MANIPULATION A Binômes 1 et 2 : 1. Extraction et purification partielle des β - 1, 3 glucanases par chromatographie. * Extraction des feuilles d'Orge * Conditionnement des colonnes de Sephadex G-25 * Purification partielle. 2. Mise en route simultanée des incubations de l'extrait enzymatique destinées à la mesure des activités endo et exo β glucanases (45min d'incubation) 3. Extraction des protéines et de la pectine methylestérase. 4. Etude de l’activité pectine methylestérase à pH constant (2 x 15 min). 5. Stopper les incubations pour les activités endo et exo β - 1, 3 glucanases. 6. Préparer les solutions étalons de glucose destinées à la mesure des fonctions réductrices apparues. 7. Préparation des solutions étalons de albumine sérique bovine. 8. Faire le dosage des fonctions réductrices (méthode de Nelson) (activités β - 1, 3 glucanases) 9. Faire le dosage des protéines (45 min) Binômes 3 et 4 : 1. Extraction des protéines et de la pectine methylestérase. 2. Etude de l’activité pectine methylestérase à pH constant (2 x 15 min). 3. Extraction et purification partielle des β - 1, 3 glucanases par chromatographie. * Extraction des feuilles d'Orge * Conditionnement des colonnes de Sephadex G-25 * Purification partielle. 4. Mise en route simultanée des incubations de l'extrait enzymatique destinées à la mesure des activités endo et exo β glucanases (45min d'incubation) 5. Préparation des solutions étalons de albumine sérique bovine. 6. Stopper les incubations pour les activités endo et exo β - 1, 3 glucanases. 7. Préparer les solutions étalons de glucose destinées à la mesure des fonctions réductrices apparues. 8. Faire le dosage des fonctions réductrices (méthode de Nelson) (activités β - 1, 3 glucanases) 9. Faire le dosage des protéines (45 min)

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MANIPULATION B

Dosage de l’amidon, du glucose et de l’ascorbate. Mesure des activités invertasiques solubles. I. DETERMINATION DES TENEURS EN AMIDON ET GLUCOSE II. DETERMINATION DES ACTIVITES INVERTASIQUES SOLUBLES III. DETERMINATION DES TENEURS EN ASCORBATE ET DEHYDROASCORBATE B. I. DETERMINATION DES TENEURS EN AMIDON ET EN GLUCOSE L'amidon est la principale substance glucidique synthétisée sous forme de réserve par les végétaux supérieurs à partir de l'énergie solaire. Il constitue une source énergétique indispensable à l'alimentation des êtres vivants. L'hydrolyse acide complète de l'amidon libère 98 à 99 % de D-glucose. C'est donc un polymère du D-glucose. Les unités de glucoses sont reliées entre elles principalement par des liaisons α − 1, 4 et par 4 à 5 % de liaisons α − 1, 6. L'amidon est hétérogène, il est formé de deux constituants principaux : l'amylose, macromolécule linéaire et l'amylopectine, macromolécule ramifiée. La solubilisation des grains d'amidon dans le DMSO présente l'avantage d'éliminer les lipides et les acides gras constituants mineurs du grain d'amidon.

Principe des dosages : Dans un premier temps, les glucides solubles sont séparés de l’amidon par extraction à l’eau chaude. Après centrifugation, le surnageant est conservé pour le dosage du glucose et le culot est utilisé pour l’extraction de l’amidon. L’amidon est ensuite solubilisé grâce au DMSO (diméthylsulfoxyde ; stocké sous la hotte) puis hydrolysé en D-glucose par l’ α-amylase à pH 7,0 et par l’amyloglucosidase (AGS) à pH 4,5. Le glucose formé est oxydé par la glucose oxydase. L’H2O2 produit par la réaction sert à oxyder le 4-aminoantipyrine (incolore) grâce à la peroxydase. Il se forme un produit coloré en rouge, le 4-aminoantipyrine oxydé, qui absorbe à 510 nm. Amidon + (n-1) H2O n D-Glucose + 2 H2O + O2 H2O2+ 4-aminoantipyrine

AGS + α-amylase Glucose oxydase peroxydase

n D-Glucose acide gluconique + 2 H2O2 4-aminoantipyrine oxydée + H2O

1- Préparation des échantillons : 1.1- Séparation de l’amidon et des glucides solubles dans l’eau : Peser 2 x 2 g de tissus foliaires (limbes matures et bases de feuilles en croissance) et découper en petits morceaux. Broyer les échantillons dans un mortier en présence de 4 mL d’eau distillée. Transvaser le broyat dans un erlenmeyer et rincer le mortier avec quelques mL d’eau distillée. Compléter le volume de l’extrait à 20 mL environ dans l’erlenmeyer. Placer les erlenmeyers sur une plaque chauffante et maintenir une douce ébullition pendant 15 min en recouvrant les erlenmeyers avec du papier d’aluminium. Bien surveiller l’ébullition pour ne pas laisser déborder l’extrait. Laisser refroidir et transvaser les extraits dans des tubes à centrifuger. Centrifuger à 5000 RPM pendant 10 min. Transvaser le surnageant dans une éprouvette et ajuster le volume à 20 mL avec de l’eau. Conserver précieusement cet extrait soluble pour le dosage ultérieur du glucose. 1.2- Solubilisation et hydrolyse de l’amidon

Détail d'une molécule d'amidon

- Transvaser le culot dans un tube à essai muni d’un bouchon à vis à l’aide d’une spatule. Mouiller les culots avec 0,2 ml d’éthanol à 80%, mélanger au vortex. Puis ajouter 2 ml de diméthyl sulfoxyde (DMSO), mélanger au vortex. Mettre les tubes au bain-marie bouillant pendant 5 minutes. - Dans chacun des tubes, ajouter 3 ml d’ α-amylase résistante à la chaleur, préparée dans le tampon MOPS (50 mM, pH 7,0). Agiter vigoureusement au vortex.

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TP Licence 3 (Bi514) Incuber les tubes dans un bain-marie bouillant pendant 6 minutes : il est essentiel de mélanger vigoureusement le contenu des tubes toutes les deux minutes. - Ajouter 4 ml de tampon acétate de sodium (200 mM, pH 4,5), puis 0,1 ml d’amyloglucosidase. Agiter les tubes au vortex et incuber à 50°C pendant 30 minutes. - Transférer le contenu des tubes dans un tube à centrifuger et centrifuger 5 min à 3000 rpm. Transvaser le surnageant dans une éprouvette et ajuster le volume à 10 mL. Cette solution constitue l’extrait d’amidon hydrolysé. 1.3- Dosage du glucose dans l’extrait soluble et dans l’extrait d’amidon hydrolysé - Effectuer deux fois chaque dosage pour chacun des extraits (4 extraits) et le standard de glucose (glucose à 1 g.L-1), et une fois pour le blanc. - Prélever 0,1 ml de solution pour chaque échantillon, 0,1 ml de solution de glucose à 1 g.l-1 pour le standard glucose et 0,1 ml d’eau pour le blanc. Transférer dans un tube à hémolyse. - Ajouter 3 ml de réactif GOPOD (glucose oxydase, péroxydase et 4-aminoantipyrine) et incuber les tubes à 50°C pendant 15 minutes. - lire l’absorbance à 510 nm en utilisant le blanc pour faire le zéro. - Si la DO est supérieur à 1, diluer l’extrait et recommencer le dosage. 3- Calculs : Calculer la concentration en glucose dans chaque tube, par comparaison avec le résultat obtenu pour le standard de glucose. En déduire la quantité de glucose présent dans chaque extrait soluble (volume 20 mL au total) et dans chaque extrait d’amidon hydrolysé (volume 10 mL au total). Avec le résultat obtenu pour l’extrait d’amidon hydrolysé, calculer la quantité d’amidon en mg contenue dans chaque culot en sachant que 180 mg de glucose libre correspond à 162 mg de résidu glucosyl présent dans l’amidon de départ. Déterminer la teneur en glucose et la teneur en amidon en mg par g de matière fraîche pour chaque échantillon.

B. II - MESURE DES ACTIVITES INVERTASIQUES SOLUBLES ACIDES ET ALCALINES. Le saccharose est le produit final majeur de la photosynthèse et la forme principale de transport des glucides chez la plupart des végétaux supérieurs. Le saccharose qui est importé vers les tissus non photosynthétiques est dirigé vers différentes voies métaboliques selon les activités physiologiques et les différents besoins métaboliques de ces tissus: glycolyse, synthèse de métabolites primaires et secondaires, synthèse de polymères glucidiques (amidon, fructanes, cellulose), de lipides et de polypeptides. Beaucoup de ces processus peuvent avoir lieu au même moment dans les mêmes cellules, ce qui implique l'existence de mécanismes de contrôle très fin. Dans ces cellules, l'utilisation du saccharose comme source de carbone et d'énergie dépend de son clivage en hexoses. Deux catégories d'enzymes participent à cette dégradation: la saccharose-synthase (SuSy) et les invertases. D'une façon très générale, la dégradation du saccharose par les invertases est associée à la croissance des cellules alors que l'action de la SuSy est reliée aux processus de biosynthèse (produits de stockage, parois,…). - La saccharose synthase (SuSy): c'est une glycotransférase cytosolique qui convertit, en présence d'UDP, le saccharose en UDP-glucose et fructose:

G-F

+

(saccharose)

UDP

(1)

UDP-glucose

+

fructose

(2)

L'action de cette enzyme est réversible mais elle fonctionne généralement dans le sens 1. - Les invertases: ce sont des hydrolases qui clivent le saccharose en deux monosaccharides:

G-F

+

H2O

glucose

+ fructose

Il existe deux catégories d'invertases: - les invertases insolubles: ce sont les invertases pariétales acides (pH optimal compris entre 4,5 et 5) qui sont liées aux parois par des liaisons ioniques. - les invertases solubles: ce sont des invertases intracellulaires, on distingue: - Les invertases cytosoliques, alcalines (pH opt 7,5 - 8). - Les invertases vacuolaires, acides (pH opt 4,5-5).

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TP Licence 3 (Bi514) Dans ce TP, nous nous intéressons à la mesure des activités invertasiques solubles, cytosoliques (alcalines) et vacuolaire (acides) dans les jeunes feuilles d'orge. Remarque : Invertase et inversion Comme toutes les molécules chirales, les sucres en solution ont l'aptitude de faire tourner d'un angle α le plan de polarisation de la lumière, soit vers la droite (molécule dextrogyre +), soit vers la gauche, molécule lévogyre -). Le fructose est beaucoup plus lévogyre (α=-91°) que le glucose n'est dextrogyre (+52,5°). Le mélange de fructose et glucose en quantités égales est donc lévogyre (-38,5°). Puisque le saccharose est dextrogyre (+66°), l'hydrolyse d'une solution de saccharose provoque l'inversion de l'activité optique de cette solution: c'est l'origine du nom invertase pour ces enzymes qui hydrolysent le saccharose. 1- Extraction des invertases solubles des feuilles d’orge L’extraction est réalisée sur 2 x 2 g de tissus foliaires (limbes matures et bases de feuilles en croissance). Broyer 2 g de matière fraîche dans un mortier à 5°C (sur de la glace) en présence de quartz et de 3 mL de tampon HEPES-NaOH pH 7 (tampon d'extraction contenant 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2,6 mM DTT et 10% d'éthylène glycol). Le broyat est transvasé dans un tube à centrifuger et le mortier est rincé avec 1 mL de tampon. Le broyat est centrifugé 10 min à 5000 RPM (centrifugeuse réfrigérée). Le surnageant est transvasé dans une éprouvette et le volume est complété à 5 mL avec le tampon d'extraction. 2-Purification partielle des extraits enzymatiques chromatographie sur colonne PD - 10 (Pharmacia)

d'Orge

par

Le gel de Sephadex de la colonne PD-10 est constitué par un réseau de mailles à base de dextranes dans lesquelles les molécules pénètrent plus ou moins selon leur taille. Les grosses molécules (supérieures à 5 000 D) sont éluées en premier. Les autres molécules (dont le NaCl et le glucose) seront retardées car, rentrant dans les mailles du réseau, elles empruntent un chemin plus long. Préparation de la colonne : Il est indispensable de suivre scrupuleusement les instructions ci-dessous : - Enlever le bouchon supérieur et éliminer l'excès de liquide de conservation. - Déboucher l'extrémité inférieure de la colonne - Equilibrer la colonne avec approximativement 25 ml de tampon d'extraction HEPES-NaOH pH 7 (ne jamais laisser la partie supérieure du gel complètement à sec).

Chromatographie de l'extrait foliaire d'Orge : - Appliquer 2,5 ml de l'extrait enzymatique au sommet de la colonne et jeter l'effluent. - Eluer les protéines avec 3,5 ml de tampon d'extraction HEPES-NaOH pH 7 (le facteur de dilution de l'extrait enzymatique initial est donc égal à 1,4). - Rincer la colonne avec 15 mL de tampon d’extraction. - Appliquer 2,5 ml du 2ème extrait enzymatique au sommet de la colonne et jeter l'effluent. - Eluer les protéines avec 3,5 ml de tampon d'extraction HEPES-NaOH pH - Rincer la colonne avec 25 mL d’eau distillée. 3- Incubations enzymatiques: 10 tubes à hémolyses sont préparés de la façon suivante (5 tubes pour chaque type d’extrait, base ou sommet de feuilles) : Témoin Invertase acide Invertase alcaline (1 tube) (2 tubes*) (2 tubes*) Extrait 200µL 200µL 200µL Tampon pH7 (1) 800µL Tampon pH4,8 (2) 800µL Tampon pH 8 (3) 800µL 5 min à 100°C 30 min à 30°C Puis 5 min à 100°C *1 tube pour le l’extrait de limbes matures et 1 tube pour l’extrait de bases de feuille en croissance.

Composition des tampons: - (1) Tampon pH 7: c'est le tampon d'extraction HEPES-NaOH, pH7. - (2) Tampon pH 4,8: tampon acétate de sodium 0,2 M contenant du saccharose à 50 mM. - (3) Tampon pH 8: tampon HEPES-NaOH 50 mM contenant du saccharose à 50 mM. - Les tubes "témoin" sont placés immédiatement pendant 5 min dans un bain-marie bouillant pour arrêter les réactions enzymatiques. - Les tubes correspondant aux essais enzymatiques sont placés pendant 30 min au bain-marie à 30°C. Après 30 min, les réactions enzymatiques sont stoppées en plaçant les tubes pendant 5 min au bain-marie bouillant.

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TP Licence 3 (Bi514) B. III- EXTRACTION ET DOSAGE DE L'ASCORBATE DEHYDROASCORBATE DANS LES FEUILLES D'ORGE.

4- Dosage du glucose libéré (méthode de Trinder à la glucose oxydase): Principe La détermination enzymatique, colorimétrique du glucose est basée sur le couple de réactions enzymatiques suivant : glucose oxydase

Glucose + H2O + O2

→

acide gluconique + H2O2 peroxydase

H2O2 + 4-aminoantipyrine (incolore) + p-hydroxybenzène sulfonate quinoéimine (rose) + H2O

→

L'intensité de la coloration rose, mesurée au spectrophotomètre à 505 nm, est proportionnelle à la concentration en glucose initiale. Méthode : - Prélever 50 µl de la solution à doser (témoins, essais enzymatiques, solutions étalons*) et les placer directement dans une cuve pour spectrophotomètre à volume réduit. - Ajouter 1 mL de réactif de Trinder (mélange de glucose oxydase, peroxydase, 4 aminoantipyridine et p-hydroxybenzène sulfonate). - Mélanger en retournant doucement (en bouchant avec un morceau de parafilm). - Après 15 minutes d'incubation à température ambiante, la D.O. des échantillons est mesurée au spectrophotomètre à 505 nm. - Refaire certains dosages après dilution si nécessaire. *La courbe étalon est réalisée par dilutions de la solution mère de glucose à 1g L-1 : préparer des solutions de 100; 200; 400 et 600 mg.L-1. La droite d’étalonnage passe par zéro. 5- Expression des activités enzymatiques L'activité invertasique est calculée dans chaque cas en mg de glucose formé par h-1 g-1 MF (Ne pas oublier que la mesure porte sur 0,2 ml d'enzyme d'un extrait dilué 1,4 fois par chromatographie). Calculer également l’activité invertasique en µmole.h-1.g-1MF (MMglucose = 180 g.mol-1). Comparer et discuter les résultats obtenus dans la base et le sommet des feuilles.

ET

DU

L'acide L-ascorbique (Vitamine C) est une vitamine importante pour l'alimentation humaine. Elle est abondante dans les tissus végétaux et est un produit majeur dérivé du métabolisme glucidique: les feuilles vertes peuvent contenir la même quantité d'ascorbate que de chlorophylle. Chez les végétaux, l'ascorbate a un rôle essentiel dans plusieurs processus physiologiques. Il intervient comme réducteur pour de nombreux radicaux libres. Il participe à la protection contre les stress oxydants: il intervient au niveau cellulaire dans la réduction de l'H2O2 en H2O via l'ascorbate peroxydase. L'ascorbate participe également à l'action des dioxygénases qui interviennent dans la biosynthèse de plusieurs hormones végétales et de nombreux métabolites secondaires. Il intervient aussi dans le contrôle du cycle cellulaire. La voie de synthèse de l'ascorbate n'est pas totalement établie mais il est maintenant admis que, chez les végétaux, cette synthèse dérive du glucose-6phosphate selon la voie suivante : D-

L-galacto 1,4 lactone

GDP-D-mannose

L-ascorbate

La dernière étape fait intervenir la L-galacto 1,4 lactone deshydrogénase qui est une enzyme mitochondriale. En tant qu'antioxydant, l'ascorbate réagit directement avec les radicaux libres (ions superoxydes, H2O2, radical tocopheroxyl,…) pour former du monodehydroascorbate (instable) et/ou du dehydroascorbate, sans catalyse enzymatique: CH2-OH

C

C

O

CH CH H2C

HO

O

O

O

C

OH

OH

CH-OH

C OH

Ascorbate

O

C

C

O

C O

HO

Monodehydroascorbate (forme instable)

CH CH H2C O

C HO

O

C C

OH

OH

Déhydroascorbate

Les formes oxydées de l'ascorbate (monodehydroascorbate et dehydroascorbate) sont recyclées en ascorbate par la monodehydroascorbate-reductase et la déhydroascorbate-reductase qui utilisent respectivement le NAD(P)H ou le glutathion

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TP Licence 3 (Bi514) comme réducteurs, dans le cadre du cycle Asada. Enfin, il est important de souligner que l'oxalate est un composé important issu du catabolisme de l'ascorbate.

¾

Dans ce TP, l'ascorbate et le dehydroascorbate seront dosés dans de jeunes feuilles d'orge. Le rapport ascorbate/(ascorbate + dehydroascorbate) renseigne sur le degré d'oxydation cellulaire et sur la capacité de régénération des formes oxydées des antioxydants solubles du tissu étudié. L’ascorbate total est en quantité importante et le rapport ascorbate/(ascorbate + dehydroascorbate) est élevé dans les tissus ayant une bonne capacité à se protéger contre les stress oxydants.

- 0,2 mL de N- éthyl-maléimide (NEM 0,5 %) sont ajoutés pour neutraliser le DTT. Mélanger, laisser reposer 1 min, puis ajouter: - 1 mL de TCA. - 1 mL d'acide phosphorique 42 %. - 0,8 mL de 2,2'-dipyridyl. - 0,4 mL de FeCl3. !!!Attention!!!: au moment de l'ajout de FeCl3, le tube doit être en train d’être vortexé vigoureusement. Déposer le FeCl3 dans le tourbillon. ¾ Dans les 7 autres tubes à hémolyse, ajouter, dans l'ordre: - 0,2 mL de solution à doser : extrait foliaire (2 tubes), solutions étalons (4 tubes), ou blanc* (1 tube). - 0,6 mL de tampon phosphate de potassium 0,75 M à pH 8.5. - 0,2 mL d'eau distillée. - 1 mL de TCA. - 1 mL d'acide phosphorique 42 %. - 0,8 mL de 2,2'-dipyridyl. - 0,4 mL de FeCl3. !!!Attention!!!: au moment de l'ajout de FeCl3, le tube doit être en train d’être vortexé vigoureusement. Déposer le FeCl3 dans le tourbillon. *Le blanc est réalisé en remplaçant les 0,2 mL de solution à doser par 0,2 mL d'acide métaphosphorique. Placer les 9 tubes 20 min à 40°C. Lire l'absorbance à 525 nm. Calculer les teneurs en ascorbate et en dehydroascorbate dans chaque type de tissus foliaires (sommet et base de feuilles) en mg.g-1MF et déterminer le rapport ascorbate/(ascorbate + dehydroascorbate). Discuter les résultats.

1- Extraction de l'ascorbate et du déhydroascorbate 2 x 2 g de matière végétale fraîche (2 g de limbes matures et 2 g de base de feuilles en croissance) sont broyés à 5°C (sur de la glace) en présence de quartz dans un mortier contenant 3 mL d'acide métaphosphorique à 5%. Le broyat est transvasé dans un tube à centrifuger et le mortier est rincé avec 1 mL d'acide métaphosphorique. Le broyat est centrifugé 10 min à 5000 RPM. Le surnageant est transvasé dans une éprouvette et le volume est complété à 5 mL avec de l'acide métaphosphorique. 2- Dosage de l'ascorbate et du dehydroascorbate. Principe du dosage: L'ascorbate réduit le Fe3+ en Fe2+ qui se complexe alors avec le 2,2'-dipyridyl. Le composé ainsi formé absorbe à 525 nm. Le déhydroascorbate est réduit en ascorbate par le DTT. L'ascorbate ainsi produit est dosé comme précédemment décrit. Protocole (voir tableau page suivante pourle résumé du protocole): 1) Réduction du déhydroascorbate en ascorbate: - placer dans deux tubes à hémolyse, 0,2 mL d'extrait foliaire, 0,2 mL de DTT 10 mM et 0,4 mL de tampon phosphate de potassium à pH 8,5. -mélanger au vortex et laisser incuber 15 min à température ambiante. 2) Préparation des solutions étalons: Les solutions étalon sont préparées à partir d'une solution mère d'ascorbate à 1 g/L de la façon suivante: Flacon 1 (0,200 g.L-1): 0,5 mL de solution mère + 2,5 mL d'acide métaphosphorique. Flacon 2 (0,125 g.L-1): 0,5 mL de solution mère + 3,5 mL d'acide métaphosphorique. Flacon 3 (0,100 g.L-1): 0,5 mL de solution mère + 4,5 mL d'acide métaphosphorique. Flacon 4 (0,050 g.L-1): 0,5 mL de solution mère + 9,5 mL d'acide métaphosphorique. Mélanger chaque solution étalon.

Dans les deux tubes précédement préparés (réduction du déhydroascorbate), ajouter, dans l'ordre:

3) dosage de l'ascorbate: Préparer 9 tubes de la façon suivante (le protocole est rappelé dans la tableau page suivante) :

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TP Licence 3 (Bi514)

Réduction du déhydroascorbate en ascorbate

Neutralisation DTT Dosage l’ascorbate

du

de

Volume d’extrait (mL) DTT 10 M (mL) Tampon KP, pH 8,5 (mL)

NEM 0,5 % (mL) Eau distillée (mL) TCA (mL) Acide phosphorique 42 % (mL) 2,2’ dipyridil (mL) FeCl3 (mL)

Extraits 1

Extraits 2

2 tubes* 0 ,2

2 tubes* 0,2

Etalons blanc 5 tubes 0,2

0,2 0,4

0,6

0,6

-

-

0,2

0,2

1 1

1 1

1 1

0,8

0,8

0,8

15 min d’incubation à température ambiante 0,2 mL puis 1 min d’attente -

0,4

et

0,4 0,4 20 min à 40°C Lire la DO à 525 nm et 2 Etalons Extraits 1 Extraits et blanc sommet et base sommet base de de feuille feuilles *1 tube pour le l’extrait de limbes matures et 1 tube pour l’extrait de bases de feuilles en croissance.

PLAN DE TRAVAIL MANIPULATION B Binômes 5 et 6 : 1- Préparer les échantillons pour le dosage de l’amidon et des sucres solubles. (extraction des glucides solubles et solubilisation de l’amidon). 2- Réaliser l’extraction et l’hydrolyse enzymatique de l'amidon. 3- Extraction des protéines pour la mesure des activités invertasiques. 4- Faire le dosage du glucose dans les extraits solubles et dans les extraits d’amidon hydrolysé 5- Purification partielle des protéines pour les activités invertasiques. 6- Démarrer les incubations enzymatiques pour les activités invertasiques (30min). 7- Extraction de l'ascorbate et du dehydroascorbate. 8- Arrêt des incubations enzymatiques (invertases). 9- Dosage de l'ascorbate et du déhydroascorbate. 10- Préparer la gamme d'étalonnage pour le dosage du glucose libéré (activités invertases). 11- Dosage du glucose (activités invertases). Binômes 7 et 8 : 1- Extraction des protéines pour la mesure des activités invertasiques. 2- Purification partielle des protéines pour les activités invertasiques. 3- Démarrer les incubations enzymatiques pour les activités invertasiques (30min). 4- Préparer les échantillons pour le dosage de l’amidon et des sucres solubles. (extraction des glucides solubles et solubilisation de l’amidon). 5- Réaliser l’extraction et l’hydrolyse enzymatique de l'amidon. 6- Arrêt des incubations enzymatiques (invertases). 7- Faire le dosage du glucose dans les extraits solubles et dans les extraits d’amidon hydrolysé 8- Extraction de l'ascorbate et du dehydroascorbate. 9- Dosage de l'ascorbate et du déhydroascorbate. 10- Préparer la gamme d'étalonnage pour le dosage du glucose libéré(activités invertases). 11- Dosage du glucose (activités invertases).

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