Unidad 3 Reacciones Antigeno-anticuerpo

UNIDAD 3 INTERACCIONES ANTÍGENO - ANTICUERPO (Ag-Ac). GENERALIDADES:

Los anticuerpos por medio de sus sitios de unión o paratopos, se unen entre una multitud de determinantes antigénicos o epítopos a aquellos que le son complementarios, en una reacción denominada antígeno-anticuerpo, este fenómeno se puede dar tanto “in vivo” como “in vitro. Como consecuencia de la reacción antígeno-anticuerpo, las moléculas del antígeno pierden su carácter tóxico o bien los microorganismos con moléculas antigénicas son destruidos o son más fácilmente fagocitados. A la región del antígeno reconocida por un anticuerpo se le denomina epítopo o determinante antigénico. Un antígeno puede presentar un número variable de epítopos de estructura única o repetitiva. La complejidad estructural de las proteínas favorece que éstas presenten por lo general un número elevado de epítopos distintos, mientras que los ácidos nucleicos y los polisacáridos, dada su repetitividad estructural, poseen un número escaso de epítopos diferentes. El número de epítopos presentes en los antígenos determina la valencia del Ag. Generalmente una molécula de Ag tiene varios epítopos por lo que es multivalente. En el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tienen solo 2 paratopos (bivalentes), la IgM cuenta con diez paratopos (decavalente) y la IgAs secretoria cuenta con 4 paratopos tetravalente).

Existen diferentes tipos de reacción antígeno-anticuerpo: Como resultado de la reacción se pueden observar diferentes fenómenos lo que permite clasificar las reacciones antígeno-anticuerpo en: • Reacción de precipitación; cuando los antígenos son macromoléculas solubles con varios epitopos multivalentes, los anticuerpos por lo menos bivalentes, al unirse a ellos, forman complejos tridimensionales insolubles que precipitan.

• Reacción de aglutinación; se produce al reaccionar los anticuerpos con moléculas de antígenos cuyos epítopos situados en la superficie de bacterias o de otras células, dan como resultado que las células formen agregados que sedimentan con facilidad. A estos antígenos se les denomina aglutinógenos, también llamados antígenos formes o particulados y a los anticuerpos aglutinas. • Reacción de neutralización; van dirigidas a la detección de anticuerpos capaces de bloquear los epítopos críticos del patógeno, se efectúa principalmente en los virus y consiste en la disminución de la capacidad infectante del virus cuando se unen los anticuerpos con los determinantes antigénicos de la cápsula vírica, también de toxinas. • Reacción de opsonización; los microorganismos y partículas antigénicas se fagocitan más ávidamente si existen anticuerpos en su superficie. La unión de los anticuerpos produce un aumento de la adherencia del complejo antígeno-anticuerpo a la superficie de los fagocitos para su fagocitosis. Los microorganismos recubiertos de anticuerpos están opsonizados. • Reacciones de citólisis con fijación de complemento; se basa en la capacidad del complemento para unirse a los complejos antígenoanticuerpo que están en la superficie de células o bacterias, dando como resultado la lisis de estas. •

Reacciones de floculación.

•

Reacciones con reactivos marcados

Características de la reacción antígeno-anticuerpo:

Especificidad Capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno (a su epítopo) que lo estimuló. La unión dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias mínimas a pesar de su similitud.

Rapidez La velocidad con que ocurre la primera etapa de la reacción Ag-Ac es del orden de milésimas de segundo, y está limitada únicamente por la difusión. La segunda etapa, que es más larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interacción, tales como precipitación, aglutinación, neutralización, etc.

Espontanea La reacción Ag-Ac no requiere energía adicional para efectuarse.

Reversibilidad Dado que la reacción se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporción de Ag-Ac, el pH y la fuerza iónica.

Requisitos para que la reacción antígeno-anticuerpo se produzca: En la interacción “in vitro” de un antígeno con un anticuerpo se distinguen dos etapas: 1.La reacción primaria, no observable que depende de la adecuada complementariedad de encaje, podrán unirse a los anticuerpos solo aquellos antígenos con epitopos que se ajusten al sitio de combinación o paratopo del anticuerpo. La distancia entre Ag y Ac es muy pequeña en el punto de unión, lo que incrementa la fuerza de esa unión. Epítopo y paratopo han de tener estructuras complementarias que encajan entre sí. Una vez que se forma el complejo antígeno-anticuerpo, las fuerzas que lo mantienen unido interacciones no covalentes, son interacciones interatómicas débiles que mantienen al antígeno y al anticuerpo en un contacto muy cercano, capaz de desarrollar fuerzas que estabilizan la unión del complejo y entre ellas están: puentes de hidrógeno, electrostáticas débiles (no iónicas), de van der Waals e hidrofóbicas, lo que hace posible disociar un complejo ya formado. La asociación y disociación del complejo antígeno-anticuerpo se rige por la ley de acción de masas: K1 Ag +Ab

AgAb K2

K = k1/k2 =

AgAb ___________ Ab Ag

Donde: Ag = antígeno Ab = anticuerpo K1 = constante de asociación K2 = constante de disociación K = constante de equilibrio o afinidad intrínseca de la reacción y refleja la fuerza de unión entre el antígeno y el anticuerpo. Mientras mayor sea K la velocidad de asociación de la reacción será mayor, es decir, serán mayores las cantidades que se formarán del complejo antígeno-anticuerpo y la velocidad de disociación será más lenta. La constante de equilibrio K en la reacción se afecta por las concentraciones de antígeno y anticuerpo, y por condiciones fisicoquímicas tales como pH, temperatura, fuerza iónica y tiempo de incubación. La alteración de estas últimas condiciones puede producir aumento o disminución de la sensibilidad de esta reacción. AFINIDAD: La afinidad de un anticuerpo (Ac) concreto (p. ej., cuando usamos un anticuerpo monoclonal) por un epitopo (H) es la suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre un paratopo del anticuerpo y el correspondiente epitopo. Por lo tanto es la fuerza de reacción entre un solo determinante antigénico y un solo sitio de reconocimiento de un anticuerpo.

AVIDEZ: El total de fuerzas de unión entre un Ag y un anticuerpo. Dicho de otra forma es la fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de los determinantes individuales de ese Ag, su valor es mucho mayor que la suma de afinidades. Cinética de la reacción Ag-Ac Durante la maduración de la respuesta humoral de producción de Ac se produce no sólo una selección de Ac con mayor afinidad (selección termodinámica), sino con mayor rapidez (selección cinética). Esta primera etapa de la reacción antígeno – anticuerpo denominada: “Reconocimiento y recombinación de Ag y Ac “, en ella los Ag y Ac se unen rápidamente (casi instantáneamente) formando complejos primarios, que aún siguen siendo solubles. Dentro de ciertos límites, casi no se ve

influenciada por factores tales como la temperatura, pH, fuerza iónica y la concentración de los reactantes.

2.La reacción secundaria, caracterizada por la agregación de los complejos no visibles formando puentes entre ellos para crear una estructura de enrejado que da lugar a fenómenos visibles cuyas características dependen en gran parte de las características físicas del antígeno, pero también de la clase de inmunoglobulina que participa en la reacción y de la concentración de Ag y Ac. Esta segunda etapa de la reacción antígeno – anticuerpo se denominada: “AGREGACIÓN”, los complejos primarios se van agregando, aumenta el peso molecular y entonces se observara el resultado dependiendo si el antígeno es soluble o partículado como precipitación o aglutinación, formándose un enrejado tipo cristal en donde cada molécula de Ag y Ac ocupa un lugar determinado. Esta 2ª etapa es mas tardada puede durar de minutos a horas y es muy dependiente de la temperatura, pH, fuerza iónica y concentración de Ag y Ac. Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas. La etapa 2ª solo se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes.

“In vivo” la reacción Ag-Ac puede generar reacciones terciarias, como es el caso de la necrosis en la reacción de Arthus, los fenómenos vasógenos de la anafilaxia por la liberación de histamina, etc, los cuales son fenómenos biológicos colaterales.

FACTORES QUE AFECTAN ANTICUERPO:

Y MODIFICAN LA REACCION ANTIGENO

pH: De este factor depende el estado iónico de grupos importantes que participan en la interacción, como son los radicales amino (-NH3) y carboxilo (-COO). Aunque la reacción Ag-Ac la podemos observar en un intervalo amplio de pH, se considera que el óptimo está entre 6.8 a 8.6, en la práctica las técnicas de rutina deben trabajarse a un pH alrededor de 7,0.

Temperatura: acelera la reacción debido a un incremento de la difusión y el movimiento de las moléculas. Se considera que esto es válido hasta los 56°C, ya que a mayor temperatura comienza a haber desnaturalización. Los anticuerpos de la clase IgM son más reactivos a bajas temperaturas (427 °C), mientras que los de la clase IgG lo son a 37 °C. Por este motivo, las técnicas de detección de anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de 2237 °C ó 30-37 °C. Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de 37 °C, no se consideran clínicamente significativos. Algunos anticuerpos de la clase IgM pueden activar el complemento a temperaturas por debajo de 30 °C. Los anticuerpos clínicamente significativos son aquellos que tienen actividad in vivo que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 °C. Fuerza iónica (): Corresponde a la concentración de iones presentes en el medio de reacción (electrolitos) los cuales son necesarios. En una solución salina normal los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de las moléculas de antígeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas opuestas. Este recubrimiento dificulta la unión del anticuerpo con el antígeno y se reduce al disminuir la fuerza iónica del medio donde tiene lugar la reacción, por lo general cuando la concentración salina del medio de reacción disminuye, la velocidad de captación del anticuerpo aumenta. Se requieren  bajas (intervalo óptimo 0.01 – 0.1), a altas  los grupos iónicos son neutralizados y por tanto se reduce la afinidad. Tiempo de incubación: los anticuerpos de los diversos grupos sanguíneos tienen diferentes tiempos para alcanzar el equilibrio, en esto interviene de manera significativa la clase de inmunoglobulina y la forma en que se une con su antígeno específico. Estudios con eritrocitos suspendidos en suero o solución salina han demostrado que del 100 % de anticuerpos RhD que se fijan, aproximadamente el 25 % lo hace en los primeros 15 minutos y el 75 % restante lo hace durante la primera hora. La adición de varios agentes potenciadores, por ejemplo disminución de la fuerza iónica, puede aumentar la cantidad de anticuerpos fijados durante los primeros 15 minutos, y con esto disminuir el tiempo de incubación necesario para alcanzar el equilibrio. Concentración de antígeno y anticuerpo: la velocidad de formación del complejo antígeno-anticuerpo varía con el número de moléculas de anticuerpo presentes en el medio y con el número de sitios antigénicos presentes en cada antígeno. La concentración de Ag y Ac deben ser equivalentes para que la reacción pueda llevarse a cabo hasta la segunda etapa.

Si hay exceso de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA, donde el antígeno y el anticuerpo no están en concentraciones equivalentes, por lo tanto no se puede llegar a la agregación de los complejos primarios. El efecto de la concentración puede ser observado si se hacen reaccionar cantidades variables del Ag con una concentración constante de Ac y graficando el producto formado, se aprecia que en la zona de equivalencia todos los epitopos están ocupados con todos los paratopos disponibles:

[Ac] = constante

[pp]

Exceso de Ac

PREZONA

concentración equivalente Ag-Ab EQUIVALENCIA

Exceso de Ag

POSTZONA [Ag]

Las zonas correspondientes a la pre-zona y post-zona no se encuentran en concentraciones equivalentes, por lo tanto solo hay formación de complejos primarios no visibles y solo en la zona de equivalencia los antígenos y anticuerpos están en concentraciones equivalentes donde ya se agregaron los complejos primarios para dar paso a la formación del producto se puede observar un precipitado o una aglutinación. CONSIDERACIONES PRÁCTICAS GENERALES. Debe considerarse que la formación de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los Ac y de la multivalencia de los Ag, por lo tanto, los Ag o haptenos simples que sólo tengan un determinante antigénico NO dan reacciones secundarias; así mismo, el Ag y el Ac deben estar en

proporciones adecuadas, ya que el exceso de cualquiera de ellos lleva a la solubilidad del agregado y la no formación de los agregados.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN Cuando se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas, extractos de tejidos heterólogos, extractos vegetales, proteínas humanas o de otras especies, al estar en presencia de sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac que posteriormente se insolubilizan, dando como resultado una reacción de PRECIPITACIÓN. Esta propiedad tiene muchas aplicaciones para la investigación y valoración de Ag y Ac

Ag soluble +

Ac

Ag - Ac (PRECIPITADO)

DEFINICIÓN: Cuando se mezclan en cantidades adecuadas un Ag soluble con su Ac correspondiente (principalmente de clase IgG) se forma un inmunoprecipitado.

El efecto de “no precipitación” producido por falta de concentraciones equivalentes de antígeno o anticuerpo (fenómeno de zona) puede ser disminuido o evitado haciendo diluciones seriadas del reactivo desconocido (generalmente el Ag), o realizando la reacción en el seno de un gel de agar por difusión del Ag y/o el Ac. Las reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas o cuantitativas y se pueden realizar en medio líquido y semisólido. Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones:  La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar  La formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interfase o Ascoli)  La difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin)  La doble difusión unidimensional en agar (modificación a la técnica de Oudin)

 La difusión radial simple en agar (RID) (técnica de Mancini, Carbonara y Hermans)  La doble difusión radial en gel de agar (DDR) (técnica de Ouchterlony) Y las técnicas que combinan difusión en geles de agar con procedimientos electroforéticos como:  La inmunoelectroforesis (IEF) (técnica de Grabar y Williams)  La electroinmunodifusión (EID) (técnica de Laurell).  La electroforesis bidimensional

PRÁCTICA No. 1

CURVA DE PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA EN CAPILAR. MARCO TEÓRICO La precipitación en medio líquido se puede realizar en tubos de ensayo o capilares, mezclando el Ag soluble con su Ac específico y la cantidad de precipitado formado varía según la proporción de los reactivos. Si se dispone una serie de tubos conteniendo una cantidad constante de anticuerpo y cantidades crecientes del Ag soluble, se puede observarse que al ir aumentando la cantidad de éste el precipitado formado alcanza un máximo y posteriormente comienza a disminuir aunque la cantidad de Ag aumente. De manera semicuantitativa se puede estimar la cantidad de precipitado formado expresándolo en milímetros lineales. Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de Ag agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado (en mm), se obtiene una curva, generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres zonas: A. B. C.

Zona de exceso de anticuerpo: Las moléculas de Ag están saturadas y no hay agregación, en esta zona el sobrenadante contiene Ac libre. Zona de equivalencia: el precipitado es máximo, el sobrenadante no contiene ni Ag ni Ac libres. Zona de exceso de antígeno: Solo hay formación de complejos primarios pero no agregados por falta de Ac; el sobrenadante contiene Ag libre. pp

[Ac] = cte

A. PREZONA (Exceso de Ac) B

B. ZONA DE EQUIVALENCIA A

C

C. POSTZONA (Exceso de Ag) [Ag]

Un análisis cuantitativo se puede realizar determinando el N proteico en el precipitado cuando el Ag es un polisacárido. Si el antígeno es proteico pero tiene un grupo químico que sirve como marca, como el DNP-ASB (dinitrofenol-albúmina sérica bovina) se puede determinar la cantidad de Ac en el precipitado por lectura espectrofotométrica a 360 nm para el Ag y a 280 nm para la cantidad total de proteína. La cantidad de Ac se obtiene mediante la siguiente operación: Cant. de proteína – Cant. de Ag = Cant. de Ac.

Sí el Ag es proteico y no tiene alguna marca, por ejemplo ovoalbúmina, la cantidad de Ac en el precipitado se puede determinar haciendo los cálculos con valores obtenidos en la zona de equivalencia: Proteína en pp – Ag añadido = Ac en pp. MATERIAL: 1 ml Solución de Ag de concentración conocida: Albúmina sérica humana (ASH) 1 000 mg/dl 0.6 ml Ac específico: Suero anti-ASH 5 ml Solución salina isotónica (SSI) 12 Tubos capilares de 100 x 1.6 mm 10 Tubos de ensayo de 12 x 75 mm 2 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 3 Pipetas de 1 ml (1/10) 1 Gradilla par tubos de ensaye 1 Gradilla de plastilina para capilares Papel absorbente Lápiz graso o marcador indeleble TÉCNICA: 1. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador. 2. En los tubos de ensayo debidamente rotulados (2 a 10), realizar diluciones seriadas (2X) de la solución de antígeno (ASH) con SSI: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 y 1:512. Para ello:  Colocar 0.5 ml de SSI en cada uno de los tubos  Al tubo 2 agregar 0.5 ml de la solución de ASH, mezclar con la misma pipeta (dilución 1:2).  Pasar 0.5 ml del tubo al tubo 3. Mezclar. (dilución 1:4).  Repetir el procedimiento hasta el tubo 10 (diluciones 1:8 a 1:512) 3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de antisuero (anti-ASH) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y manteniendo el dedo índice en el extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente. 4. Quitando el dedo índice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad la solución de antígeno sin diluir (1:1) de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente. 5. Tapando con el dedo índice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las soluciones por inversiones repetidas o moviendo el líquido de un lado al otro y rotando el capilar simultáneamente varias veces. 6. Con el dedo índice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el líquido dentro del capilar y, colocando el dedo índice en un extremo.

7.

8. 9.

10. 11.

Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalización de los reactivos por contacto con ésta. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para cada uno de los capilares correspondientes a las otras diluciones de Ag (de 1:2 a 1:512). Incluir los siguientes testigos: a) Un capilar llenado hasta la segunda marca con solución de Ag sin diluir. b) Un capilar llenado hasta la segunda marca con antisuero. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente ó 48 h en refrigeración. Medir la cantidad de precipitado en milímetros en cada capilar. Si el precipitado es difuso o está fraccionado, centrifugar los capilares 1 min a 1000 rpm colocándolos dentro de los tubos de ensayo de 13 X 100 mm o en una centrífuga para hematocrito. NOTA: Cuidar que al sacar cada uno de los capilares de la plastilina queden tapados con la misma en su parte inferior.

RESULTADOS: Con los datos obtenidos complementar la siguiente tabla y construir la curva de precipitación, graficando concentración de Ag (abscisas) contra la cantidad de precipitado formado, expresado en mm (ordenadas). CAPILAR

DILUCION DEL Ag

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1.1 0

11 Control de Ag 12 Control de Ac [ASH] = 1000 mg/dl

[Ag] mg/dl

PRECIPITACIÓN (mm)

PRÁCTICA No. 2

MEZCLA DE ANTÍGENO Y ANTICUERPO Prueba de Identidad a Sueros de Uso Terapéutico Determinación del Origen de Manchas de Sangre

MARCO TEÓRICO. La precipitación por simple mezcla de Ag y Ac puede llevarse a cabo en capilar o en tubos de ensayo, cuando se utilizan estos últimos suele acelerarse la reacción con temperatura (50 – 55° C). Las ventajas que ofrece la metodología es la economía, la facilidad de interpretación y el poco equipo requerido, y la desventaja principal es el riesgo de caer fácilmente en fenómeno de zona cuando no se prueban diluciones. Entre las aplicaciones de esta técnica se pueden mencionar las pruebas de peritaje para la identificación de manchas de sangre y de semen, así como en alimentos en la determinación de la especie de que proceden las carnes y derivados, así como en la investigación del origen de sueros inmunes y para estudiar las relaciones filogenéticas de las especies y la zoofilia y antropofilia de vectores. Esta técnica será ejemplificada con la investigación del origen de muestras de antitoxinas, determinación que se realiza como prueba de Identidad a sueros inmunes o con la identificación del origen de manchas de sangre. MATERIAL: 100 l Muestras de antitoxina tetánica o papel filtro con manchas de sangre. 50 l De cada suero antiespecie: anti-equino, anti-humano, anti-bovino, etc. 2 ó 4 Tubos capilares 1 x 9 mm 1 Gradilla de plastilina Papel absorbente TÉCNICA: Para la prueba de identidad de sueros de uso terapéutico llevar a cabo todos los pasos incluyendo los incisos (a) del paso 1 y 8. Para la identificación de manchas de sangre también realizar todos los pasos pero ahora incluir los incisos (b) del paso 1 y 8. 1a. Si es necesario, eliminar partículas en suspensión de los sueros y las muestras por centrifugación a 2000 rpm, 2 min. 1b. Colocar pequeños fragmentos de la mancha de sangre en un tubo de ensayo y extraer con 2 ml de solución salina isotónica. 2. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador.

3.

4.

5.

6. 7.

8a. 8b. 9.

Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de suero (anti-humano) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y manteniendo el dedo índice en el extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente para no contaminar la muestra problema. Quitando el dedo índice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad un volumen igual de la muestra de antitoxina problema o del extracto de la mancha de sangre, de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente. Tapando con el dedo índice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las soluciones por inversiones repetidas o moviendo el líquido de un lado al otro y rotando el capilar simultáneamente varias veces. Con el dedo índice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el líquido dentro del capilar y, colocando el dedo índice en un extremo. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalización de los reactivos por contacto con ésta. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para el otro capilar pero ahora utilizar como Ac el suero anti-equino. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para los otros capilares pero ahora utilizando los otros sueros antiespecie. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente ó 48 h en refrigeración.

RESULTADOS: Leer los resultados observando en cual de los capilares se observa precipitación. Determinar el origen de la muestra de antitoxina utilizada o la especie de donde procede la mancha de sangre.

PRÁCTICA No. 3

DOBLE DIFUSIÓN EN PLACA (OUCHTERLONY) Identificación de fracciones antigénicas presentes en suero humano

MARCO TEÓRICO. Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles. Esta difusión está limitada por la concentración del gel, así como por el peso molecular y tamaño de las moléculas de Ag y Ac. Empleando soportes que tienen como base agar disuelto en una solución amortiguadora, los antígenos y/o anticuerpos pueden migrar y al encontrarse en concentraciones equivalentes, formar el inmunoprecipitado, evitando así el efecto indeseable del fenómeno de zona. La velocidad de la difusión de ambas moléculas es directamente proporcional a la concentración e inversamente proporcional al peso molecular (Ley de Fick). Otros soportes que pueden ser utilizados son: pectinas, alginatos, poliacrilamida y tiras de acetato de celulosa gelatinizado. En la técnica de Ouchterlony, el Ag y el Ac se colocan en pozos hechos en una placa de gel de agar, a partir de ellos ambos reactivos difunden radialmente y al encontrase en concentraciones equivalentes forman una o varias bandas de precipitación dependiendo del número de sistemas Ag-Ac presentes. Cuando se prueba un Ag constituido por una mezcla de fracciones antigénicas frente a una mezcla de Ac, se forman varias bandas y cada una corresponde a una fracción antigénica diferente. Aumentando el número de perforaciones se pueden probar varios sistemas simultáneamente y según las formas de las bandas obtenidas se puede determinar si los antígenos analizados son idénticos (cuando las líneas de precipitación confluyen), diferentes (cuando las líneas se cruzan) ó relacionados (cuando las líneas se unen parcialmente) (ver esquema). Ag

Ag

Ac

IDENTIDAD

Ag

Ag

Ac

IDENTIDAD PARCIAL

Ag

Ag

Ac

NO IDENTIDAD

Esta técnica es muy útil para determinar la homogeneidad de antígenos y anticuerpos purificados, así como para buscar impurezas en un sistema.

MATERIAL: Antígenos: Suero humano (SH), Albúmina sérica humana (ASH), IgG humana purificada, suero bovino (SB), suero murino. Anticuerpo: Suero antihumano, 1 Tubo de 13 x 100 mm con 3 ml de agar noble al 1.5% en SSI 1 Tubo de 13 x 100 mm con 2 ml de agar noble al 0.3% para sellar 1 Portaobjetos 1 Hisopo 1 Nivelador de gota 1 Placa de vidrio 1 Cámara húmeda (caja Petri con papel filtro húmedo) 1 Vaso de precipitado de 250 ml 1 Tripié con tela de alambre 1 Mechero 1 Horadador de 2 mm de diámetro 1 Plantilla de una horadación central y seis periféricas. 5 Capilares Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 ml adaptado con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm. TÉCNICA: 1. Barnizar los portaobjetos lavados y desengrasados con agar al 0.3% fundido con ayuda del hisopo. 2. Colocar los portaobjetos barnizados sobre una superficie perfectamente nivelada y verter sobre cada uno el contenido del tubo con agar al 1.5% fundido (3 ml). 3. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente. 4. Con el horadador practicar 7 cortes en forma de roseta: uno central y 6 periféricos, usando la plantilla o un papel con el esquema de las perforaciones debajo del portaobjetos. (ver el esquema) 1

2

6

3 5

5.

4

Extraer el gel de agar de los cortes mediante el equipo de succión haciendo un ligero vacío o con la aguja de una jeringa.

6. 7.

8.

Colocar con un capilar en la horadación central suero antihumano hasta llenar el pocito, sin derramar su contenido. Con capilares individuales tomar cada reactivo biológico, colocar en los pozos de la periferia ordenados en el sentido de las manecillas del reloj: en los pozos 1 y 6 suero humano; en el 2 ASH, en el 3 suero bovino, en el 4 suero murino, en el 5 IgG humana purificada. Introducir el portaobjetos en la cámara húmeda, cerrarla e incubar de 18 a 24 h a temperatura ambiente ó 48 h a 4° C.

RESULTADOS: Leer los resultados, identificando bandas de identidad, no identidad e identidad parcial.

PRÁCTICA No. 4

INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (RID) (Mancini, Carbonara y Hermans) Cuantificación de Albúmina Sérica Humana MARCO TEÓRICO. Este método se aplica rutinariamente en Inmunología Clínica para la cuantificación de antígenos, fundamentalmente de las fracciones plasmáticas humanas, como son la albúmina sérica humana (ASH), las inmunoglobulinas G, A y M, los componentes C3 Y C4 del complemento, factores de coagulación, etc. Para llevarlo a cabo se emplea una placa de gel de agar purificado al que se incorpora el suero específico monovalente para la fracción que se desea cuantificar. En esta placa se practican horadaciones y en ellas se coloca un volumen medido con exactitud tanto de un estándar en tres dilaciones de concentración conocida, como de los sueros problema. Al difundirse de manera radial el Ag en el seno del agar que contiene el anticuerpo se va formando un halo de precipitación alrededor del pozo donde se colocó el Ag. El diámetro de la zona de precipitación es directamente proporcional a la concentración del Ag y por lo tanto los datos obtenidos en las reacciones de precipitación de los estándares sirven para trazar la curva de calibración de la placa de donde se obtiene la concentración del Ag presente en los sueros problema. El anticuerpo incorporado determina la sensibilidad de la placa. Esta técnica ofrece las ventajas de utilizar poca cantidad de reactivos, sencillez de manipulación e interpretación, alta sensibilidad y la opción de usar placas disponibles comercialmente; aunque tiene como desventaja que el tiempo para dar por terminada la prueba es largo. MATERIAL: 1.0 ml Suero anti-ASH 0.2 ml Suero problema diluido 1:10 50 l Soluciones estándares de ASH 1 Gradilla 1 Matraz Erlenmeyer de 100 ml 1 Tubo de 16 x 100 mm con tapón de hule 1 Pipeta graduada de 1 ml 1 Nivelador de gota 1 Placa de vidrio de 20 x 20 cm 1 Placa de plástico con tapa para RID 1 Horadador de 2 mm de diámetro 1 Micropipeta de 20 l o capilares calibrados de 5 l 1 Plantilla de 12 horadaciones para RID

1

Regleta para medición de halos para RID Puntas para micropipeta Platina calentadora con agitación Baño de agua a 56° C. Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 ml adaptado con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm

TÉCNICA: 1. Preparar una solución de agar noble al 2% en amortiguador PBS pH 7.2, fuerza iónica 0.075. Fundir a ebullición en la platina de calentamiento. 2. Pipetear 5 ml de la solución anterior en un tubo de ensayo previamente calentado en baño de agua a 56° C y mantener el tubo con gel a esa temperatura un tiempo, hasta que se estabilice. 3. Manteniendo el tubo dentro del baño de agua a 56º C, incorporar al gel de agar 1.0 ml de suero anti-ASH. 4. Tapar el tubo, sacarlo del baño y mezclar por inversión rápida, pero suavemente para evitar que se forme espuma. 5. Secar el tubo y verter el agar sobre la placa de plástico para RID, la cual ha sido previamente calentada “al vapor” sobre la platina caliente cubierta con un trapo húmedo (para no dañar la placa). 6. Homogeneizar con movimientos de rotación suave y en seguida dejar solidificar sobre la placa de vidrio perfectamente nivelada. 7. Haciendo uso de una plantilla, practicar 12 horadaciones en el gel con un perforador de 2 mm de diámetro interno. 8. Depositar en cada pozo 5 l de las soluciones estándares y problemas. Es conveniente que los 3 primeros pozos se ocupen con estándares y los demás con problemas.

11 10 9

12

1 2 3

8

4 7

9. 10.

6

5

Permitir que difunda el antígeno 48 h. Medir con la regleta para RID el diámetro del halo formado, esta regleta tiene marcadas líneas convergentes-divergentes, las cuales deben quedar dispuestas en forma tangente al halo y las marcas en líneas en cruz al centro. La línea vertical del centro del pozo da la medida del diámetro2.

RESULTADOS: Construir una curva de calibración con los resultados de los estándares de concentración conocida, graficando concentración (abscisas) vs diámetro2 (ordenadas), e interpolar los valores de diámetro2 de las muestras problemas. La recta formada no tiene origen en cero. Y el punto en que corta al eje de las ordenadas es una constante para la placa y depende de tres factores: el diámetro del pozo en que se colocaron los reactivos, la concentración del Ac incorporado y la altura del gel. Obtener la concentración de albúmina de las muestras problema. Es importante considerar el factor de dilución de los sueros problema al momento de calcular la concentración de éstos. Comparar los cantidades obtenidos con los valores de referencia para albúmina en suero y determinar si se encuentran alterados.

NEFELOMETRÍA DE RAYO LASER. MARCO TEÓRICO. La nefelometría es la medición de la luz que se ha dispersado del rayo principal de una fuente de transmisión de luz. No debe confundirse con turbidimetría, que es la medición de la disminución de la luz que pasa a través de una solución semiopaca o suspensión de material. En soluciones diluidas, la reacción de precipitación entre el Ag y el Ac producen incremento en la reflexión que se puede medir por la dispersión de una luz incidente. En turbidimetría la cantidad de luz absorbida es medida por un espectrofotómetro, mientras que en nefelometría la cantidad de luz dispersa es medida por un detector montado angularmente. La determinación nefelométrica de los Ags se lleva cabo por la adición de cantidades constantes de antisuero específico muy purificado a diversas cantidades de Ag; los reactantes se colocan frente a un rayo de luz y el grado de dispersión de la luz se mide como densidades ópticas. La medición precisa de los Ags se debe hacer en la rama ascendente de la curva de pp, en donde existe una relación lineal directa entre la concentración de Ag y D.O, por lo que para una determinación precisa de las soluciones con altas concentraciones de Ag las muestras deben diluirse. Los nefelómetros láser emplean un rayo láser de helio y neón como fuentes de luz (es mucho más potente) y diversos filtros electrónicos cerca del aparato de detección, lo que asegura una alta relación señal/ruido y un alto grado de sensibilidad. La nefelometría es un método rápido y simple para la cuantificación de Ags en líquidos biológicos, especialmente proteínas plasmáticas y componentes C3 y C4 de complemento, la desventaja es el alto costo del equipo y de los antisueros específicos.

CUESTINARIO. 1. Menciona una situación en la que sería conveniente colocar el Ag en el orificio central de un sistema de Ouchterlony y los anticuerpos en los orificios periféricos. 2. ¿Cuáles son las concentraciones séricas de inmunoglobulinas en adultos normales? 3. De 5 ejemplos de antígenos que pueden intervenir en reacciones de precipitación. 4. ¿Cuál es la razón de que concentraciones iguales de Ag y Ac no necesariamente formen redes de precipitación?

5.

¿Cómo afecta la fuerza iónica y el pH en la inmunoprecipitación?

6.

¿Qué relación existe entre el halo formado en RID y la concentración de Ac en el gel? ¿Cómo esperaría observar el halo de precipitación en un paciente con hipergammaglobulinemia al determinar la IgG y compararla con una persona sana? ¿Cómo influye la clase de inmunoglobulina en la velocidad de difusión?

7.

8.

BIBLIOGRAFÍA. Miller L., Ludke H., Peacock J., Tomar, R. MANUAL OF LABORATORY IMMUNOLOGY. 2nd Ed. Lea Febiger 1991. Hudson L., Hay F.C. PRACTICAL IMMUNOLOGY. 3rd Ed. Blackwell Scientific Publications. 1992. Paul W. E. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY. 3rd Ed. Raven Press. 1993. Harlow E., Lane D. ANTIBODIES, A LOABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. Coligan J. E., Kruisbeek A. M., Margulies D. H., Shevach E. M., Strober W. CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. John Wiley and Sons. 1992. Schneider W., Berndt H. INMUNOELECTROFORESIS. Ed. Panamericana. 1973. Stites D., Terr A. INMUNOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA. 7ª Ed. Manual Moderno. 1993. Benjamini E., S. Leskowitz. IMMUNOLOGY. A short course. 2nd Ed. Wiley-Liss. 1991. Margni. INMUNOLOGÍA E INMUNOQUÍMICA. 4ª Ed. Panamericana. 1989. Figueredo M. A., Alvarez R., Puch C. ANTÍGENOS, ANTICUERPOS Y SUS INTERACCIONES. Medicine 47:2999, 1988.