Cinetica Enzimatica

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza EXPERIMENTO 1 “CINÉTICA ENZIMÁTICA” PROFESORA MÓDULO BIOLOGÍA MOLÉCULAR:

CATALINA MACHUCA RODRÍGUEZ

EQUIPO SIETE    

LÓPEZ NOBLECÍAS SILVIA GABRIELA LÓPEZ CABRERA MIGUEL ÁNGEL CASTILLO BANDA TANIA MARTÍNEZ REYES LOURDES NOEMÍ

CINÉTICA ENZIMÁTICA Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que los catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la reacción. El mecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la reacción es reduciendo la energía libre de activación requerida para transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio. La actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La cinética enzimática estudia la velocidad de reacción, los factores que la modifican y el mecanismo de la misma. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la misma son: concentración de sustrato, concentración de la enzima, pH, temperatura, fuerza iónica, inhibidores. Leono Michaelis y Maud Menten en 1913 propusieron un modelo clásico para el estudio de la cinética enzimática. Este modelo consiste en graficar la velocidad de la actividad enzimática y la concentración del sustrato. Esta representación gráfica permite determinar la constante de Michaelis-Menten (KM) al interpolar la mitad de la velocidad máxima (VMAX). La catalasa utiliza una molécula de peróxido de hidrogeno (H2O2) como sustrato donador de electrones y otra molécula de como oxidante o aceptor de electrones. La catalasa esta contenida en los peroxisomas de eritrocitos, medula osea, mucosas, riñón e hígado, su función es la descomposición del H2O2 formado por acción de las oxidasas. El objetivo es cuantificar la actividad enzimática catalasa, valorando cuanto sustrato puede degradar en “x” tiempo, utilizando titulación Redox, estudiando los factores que modifican la reacción como, concentración y PH. Lo primero será hacer los cálculos para la preparación de permanganato de potasio (KMnO4) a 0.05N. Ácido sulfúrico a 2N y H2O2 0.01N. La solución de KMnO4 se debe valorar con un patrón primario reductor tal como el Na2C2O4 anhidro.

PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE KMNO4 Pesar en la balanza granataria la cantidad de Na2C2O4 anhidro con la mayor exactitud posible y colocarla en un matraz Erlenmeyer en cualquier cantidad de agua, agregar 1.0mL de H2SO4 calentar a punto de ebullición y valorar con el KMnO4 contenido en la bureta, regulando las cantidades de KMnO4 agregando de modo que esta reaccione completamente antes de agregar una nueva porción. Se toma como punto final cuando aparece un color rosado persistente (30 segundos). Repetir dos o más valoraciones.

Para la preparación de la enzima, a un litro de agua destilada enfriada en hielo se le agregara un mililitro de sangre, mezclando invirtiendo suavemente el recipiente dos veces y mantener la solución en hielo. Se enumeraran los matraces para la determinación del volumen enzimático, adicionando H2O2 y H2O. En el caso de los matraces impares se agregara el H2SO4 al tiempo cero antes de añadir la enzima, en los matraces restantes se agregara primero la enzima en lugar del acido, inmediatamente contabilice el tiempo de reacción, mezclando suavemente. Después de cinco minutos agregue el ácido, mezcle bien y titule con KMnO4 Graficar el numero de moles de H2O2 descompuestos por minuto en función del volumen de enzima empleado.

SUSTANCIA OXIDANTE KMNO4 Dónde:

H2O2

Catalasa

H202 + H2O

PREPARACIÓN DE PERMANGANATO MnO4. 0.5 N.

KMnO4 + H2O2 + H2HSO4 ---------------- K2SO4 + H2O + O2 + MnSO4 2MnO4 + 3H2SO4 + 5H2O2 ----------------- K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2

158 g/mol 5

= 31.4 --- 1N --- 1000 Ml = 1.57g --- 0.05 N --- 1000ml

= 1.57g ---- 1000ml = 0.78.5---- 500ml

VALORACIÓN DE PERMANGANATO C/ OXALATO DE SODIO (MnO4 / NaC2O4) 5C2O4 + 2MnO4 + 16H ------------ 2Mn+ 10CO2 + 8H2O

KMnO4:

C1V1 = C2V2 Dónde: C1 = Es la concentración inicial de tu solución V1 = Es el volumen de esa solución que estas tomando C2 = Es la concentración final, después de diluir (Nuestra incógnita) V2 = Es el volumen final de tu solución

C1 H2O2 = X2 C1=

C2V2 V1.

1 Intento

C1 =

( 0.5N) (6ML)

= 0.58 N

5.1ml 2 Intento

C1=

C2V2 V1

3 Intento

C1=

C2V2 V1

= (0.5N) (6ML) = 0.53N 5.6ML

= (0.5N) (6ML)

= 0.52N

5.7ML X = 0.543 N

= V2

PREPARACIÓN DE ÁCIDO SÚLFURICO H2SO4

Densidad = 1.84 g/ml Pureza= 95%

H2= 1 X 2 = 2

64/ 98g

S = 32 X 1 = 32

98g/ 2 eq = H2SO4 = 49g

O= 16 X 4 =

2N = 98 /1.84 g/ml ---- 1000ml

= 53.26—2 N -- 1000ML

= 13.31 ML --- 95%

= 13.31 --- 2N --- 250ML

= 14.01 ML --- 100 %

PREPARACIÓN DE PERÓXIDO DE NITRÓGENO H2O2 1%

250ml 34g

=

34g 0.01N

H202 ---- 3.34g X 100ML

=

17.005 N --- 1N 0.17g ---- 0.01N

0.17g/1.4g/ml = 0.1214

EQUIPO, MATERIAL, Y MATERIAL BIOLÓGICO EXTRACCIÓN DE SANGRE PREPARACIÓN DE LA ENZIMA Vacutainer con heparina

Recipiente con hielo

Ligadura

Cloro

Recipientes

Etiquetas

Alcohol

Matraz Aforado

Sangre 1ml

Agua Destilada

EQUIPO, MATERIAL, Y MATERIAL BIOLÓGICO PREPARACIÓN DE PERMANGANATO DETERMINACIÓN DE PERMANGANATO Matraz Aforado 500ml

Pinzas para bureta

Vaso de Precipitados

Soporte Universal

Vidrio de reloj

Parrilla de calentamiento

Báscula Granataria

(2) Matraz 100ml

Bureta 50ml

EQUIPO, MATERIAL, DETERMINACIÓN DE VOL. ENZIMÁTICO Soporte Universal

Pinzas dobles para Bureta

Bureta 50 ml

Pipetas de 125 y 10ml

(10) Matraz Erlen Meyer

Embudo

Cronómetro REACTIVOS: Agua Oxigenada (H2O2) Ácido Sulfúrico 2N (H2SO4) Permanganato de Potasio 0.1N (KMnO4)

MÉTODO: 1).-A un litro de agua destilada enfriada en hielo adicionar 1 ml de sangre 2) Mezclar invirtiendo suavemente el recipiente dos veces. 3) Mantener la solución en hielo. 4).- Numerar los matraces, adicionar el H2O2 y H2O. 5).- En el caso de los matraces impares, adicionar el H2SO4 al tiempo cero antes de añadir la enzima. 6).- Para los matraces restantes adicione primero la enzima (no adicione el ácido), inmediatamente contabilice el tiempo de reacción, mezclando suavemente. 7).- Espere el tiempo indicado (1 minuto) y adicione el ácido, mezcle bien y titule con KMnO4. 8).- Adicionar el H2SO4 después de transcurrir el tiempo indicado, a partir de la adición de la enzima. 9).- Titular el H2O2 remanente en cada matraz. 10).- Graficar la cantidad de moles de H2O2 descompuestos en función del tiempo de incubación.

RESULTADOS:

MATRAZ

SUSTRATO

H2O

ÁCIDO

ENZIMA

ÁCIDO

GASTO KMnO4

10 10

TIEMPO MIN 5

1 2

2 2

13 13

1Ml -

1ML

1Ml 1Ml -

10 10 10 10

5 5

1ML 2.5ML

7 7

1Ml -

10 10

5

2.5ML

5 5

1Ml -

10 10

5

1ML

0ML- 1ML = 1ML 8.9ML-9.7ML= 0.8ML 1ML-3.2ML= 2.2ML 9.7ML-10.8ML=1ML 3.2ML-4.8ML=1.6ML 10.8ML10.9ML=0.1ML 4.8ML-6.5ML=1.7ML 10.9ML11.5ML=0.7ML 6.5ML-8.9ML=2.7ML 11.5ML=0.7ML

3 4 5 6

4 4 6 6

11 11 9 9

7 8

8 8

9 10

10 10

CONCENTRACIÓN DE PERÓXIDO 1. (0.5)(2)/(1.0)=1 2. (0.5)(2)/(0.8)=1.25 3. (0.5)(4)/(2.2)=0.90 4. (0.5)(4)/(1)=5 5. (0.5)(6)/(1.6)=1.87 6. (0.5)(6)/(0.1)=30 7. (0.5)(8)/(1.7)=2.35 8. (0.5)(8)/(0.7)=5.7 9. (0.5)(10)/(2.4)=2.08 10. (0.5)(10)/(0.7)=7.14

CONCLUSIONES: Se puede observar en la tabla de resultados, que en los matraces 1, 3, 5 ,7 y 9 donde no hubo tiempo mínimo y donde el ácido se agregó primeramente el gasto de KMnO4 fue mayor, esto indica que la enzima catalasa (sangre) se degrada más lento debido a la concentración de ácido y sustrato, tomando en cuenta que el volumen final más lento en la concentración fue de 2.7 ml en el gasto de KMnO4. Por otra parte se demostró que al darle tiempo a la enzima y una agregación mayor de ácido provocó en menor tiempo el equilibrio de PH en la reacción al hacerlo en 0.1 ml en el gasto de KMnO4. Podríamos decir que entre mayor volumen de ácido en la concentración más rápido actúa el catalizador en la transferencia de electrones dentro de la misma reacción.

ANEXOS: OXALATO DE SODIO Na2C2O4

CARACTERÍSTICAS El oxalato de sodio es un polvo blanco, cristalino, y sin olor, que se descompone a 250-270°C. Es ligeramente higroscópico y, por lo tanto, debe usarse con cuidado durante la desecación en el trabajo de laboratorio (química analítica) en la que la absorción de agua es importante. Al oxalato disódico se le llama con frecuencia oxalato de sodio. Ya que el ion poliatómico del oxalato tiene dos cargas negativas, no puede haber otro compuesto que consista de sodio y oxalato que no sea el oxalato disódico. En consecuencia, el prefijo "di" se elimina. Su solubilidad en agua es de 3,7 g/100 ml a 20°C y 63 g/100 ml a 100°C. Su pH es de 8 a una temperatura de 20°C en solución acuosa a concentración de 30 g/litro. Tiene una densidad de 2,34 g/cm3 y una densidad aparente de alrededor de 600 kg/m3.

PROPIEDADES QUÍMICAS Estable al secado Reacción lenta en temperatura ambiente Se calienta a 60° aumenta la al irse formando el ion manganeso (II) Catalizador; “Auto-catalítico” al reaccionar con Permanganato. Se recomienda una Solución Ácida cercana a 1.5N.

PERMANGANATO DE POTASIO KMnO4

CARACTERÍSTICAS El permanganato de potasio es un sólido cristalino púrpura, soluble en agua. Es no inflamable, sin embargo acelera la combustión de materiales inflamables y si este material se encuentra dividido finamente, puede producirse una explosión.

Es utilizado como reactivo en química orgánica, inorgánica y analítica; como blanqueador de resinas, ceras, grasas, aceites, algodón y seda; en teñido de lana y telas impresas; en el lavado de dióxido de carbono utilizado en fotografía y en purificación de agua. Se obtiene por oxidación electrolítica de mineral de manganeso. PROPIEDADES QUÍMICAS: Reacciona de manera explosiva con muchas sustancias como: ácido y anhídrido acético sin control de la temperatura; polvo de aluminio; nitrato de amonio; nitrato de glicerol y nitrocelulosa; dimetil-formamida; formaldehído; ácido clorhídrico; arsénico (polvo fino); fósforo (polvo fino); azúcares reductores; cloruro de potasio y ácido sulfúrico; residuos de lana y en caliente con polvo de titanio o azufre. El permanganato de potasio sólido se prende en presencia de los siguientes compuestos: dimetilsulfóxido, glicerol, compuestos nitro, aldehídos en general, acetil-acetona, ácido láctico, trietanolamina, manitol, eritrol, etilen glicol, ésteres de etilenglicol, 1,2-propanodiol, 3cloropropano-1,2-diol, hidroxilamina, ácido oxálico en polvo, polipropileno y diclorosilano. Lo mismo ocurre con alcoholes (metanol, etanol, isopropanol, pentanol o isopentanol) en presencia de ácido nítrico y disolución al 20 % de permanganato de potasio. Por otro lado, se ha informado de reacciones exotérmicas violentas de este compuesto con ácido fluorhídrico y con peróxido de hidrógeno. Con mezclas etanol y ácido sulfúrico y durante la oxidación de ter-alquilaminas en acetona y agua, las reacciones son violentas.

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO H2O2 PROPIEDADES QUÍMICAS Líquido incoloro bastante estable. Se comercializa como soluciones acuosas a concentraciones entre el 3 y el 90%. El contenido en H2O2 de dichas soluciones puede expresarse en porcentaje o en volúmenes. La expresión en volumen se refiere al contenido en oxígeno y se define como el número de veces que un determinado volumen de H2O2 lo contiene. Soluble en agua y en éter; insoluble en éter de petróleo.

REFERENCIAS: • • • •

Logan, S. R., Fundamentos de cinética química, Addison-Wesley Iberoamericana, Madrid, 1999 Stryer L. Berg J, Tymoczko J. “Bioquímica”. Reverte, 5º edición, 2003. Alberts Bruce et al, 2004. Biología Molecular de la Célula. Omega. Barcelona. 1465p. Hicks Gómez J. 2007. Bioquímica. Mc. Graw-Hill Interamericana. México. 887p.