Cursuri Microbiologie

INTRODUCERE IN MICROBIOLOGIE Dr. Carmen Costache

Medicina - obiective diagnosticul  tratamentul  prevenirea bolilor umane => 

 cunoaşterea etiologiei (cauza) şi  patogeniei (mecanismul de producere)

MICROBIOLOGIA studiul microorganismelor  Microorganisme 

 invizibile cu ochiul liber



Lumea microorganismelor: diversă  organisme celulare: – monocelulare: protozoare, fungi şi bacterii – pluricelulare: helminţi

 STRUCTURI acelulare: virusurile, viroizi, prioni,

PARTICULARITĂŢILE MICROORGANISMELOR 1.ubiquitare  2.agenţi etiologici 

 bolile infecţioase: nu se transmit de la o persoană la alta (ex. panaritiu, furuncul).  bolile infecto - contagioase: se transmit de la o persoană la alta.



3.lume model în cercetări fundamentale

PARTICULARITĂŢILE MICROORGANISMELOR 

4.model simplu de diferenţiere celulară.  sporulare  germinare

PARTICULARITĂŢILE MICROORGANISMELOR 

5.celule ancestrale

PARTICULARITĂŢILE MICROORGANISMELOR 

6.armă biologică

To help protect your privacy, PowerPoint has blocked automatic download of this picture.

PARTICULARITĂŢILE MICROORGANISMELOR

PARTICULARITĂŢILE MICROORGANISMELOR 

7.competitoare al omului pentru supremaţie biologica  variola eradicata 1977-1978;

 HIV: 1981-1982

“Microorganisme=Microbi = Germeni“

   

BACTERII VIRUSURI FUNGI PARAZITI TOTAL DIFERITI INTRE EI !! STRUCTURA DIAGNOSTIC TRATAMENT

Incadrare Regn protista: alge, protozoare  Regn Myceta: fungi  Regn Prokariota (Monera): bacterii 

 Archaebacerii  Cianobacterii  Eubacterii = bacteriile adevarate

Bacteriile = prokariote 

celula prokariota ≠ celula eukariota – Structura (morfologie) – Functie  Metabolism  Multiplicare



Virusurile – NU sunt celule – sunt structuri acelulare

Bacteriile = prokariote Corpul uman/animal = eukariote

DIFERENŢIERE ÎNTRE CELULE DE TIP EUKARIOT ŞI PROKARIOT Nucleu 

nucleu adevărat:  nucleoli,  membrana nucleară.

echivalent nuclear, nucleoid  nu prezintă 

 nucleoli,  mb. nucleară

Materialul genetic =genom. Eukariote  ADN

– cz, – mitocondrial, – cloroplastelor

   

elemente transpozabile (mobile) uneori plasmide. Cz = perechi Cz = ADN + histone

Prokariote  Material genetic cromozomial extracrozomial.  Cz = moleculă dublu catenară de ADN circulară => un singur cromozom.  Extra-cz  plasmide  bacteriofagi



informaţie genetică neesenţială pentru supravieţuirea şi multiplicarea bacteriilor,

ORGANIZAREA CITOPLASMEI compartimentată.  organite => 

– ribozomi 80 S,  su 60 S  Su 40 S

Necompartimentată, (mezozomi).  Ribozomi 70 S 

 50 S (Large)  30 S (Small).

MEMBRANA CITOPLASMATICĂ 

complexa

nu există steroli,  excepţie 

 Mycoplasma

ÎNVELIŞURILE CELULARE lipsesc învelişurile celulare  Există la 

 levuri  plante,  sunt bogate în celuloză.



perete celular, – responsabil de menţinerea formei

rigiditate,  are peptidiglican (mureină). 

MULTIPLICARE sexualitate.  primeşte o dublă informaţie genetică de la parentali  care se reasociază în meioză. 

divizarea asexuală  Amitotică  sciziparitale sau fiziune binară.  Informatia = Haploidä. 

MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

Microscopia optică

 evidenţierea formei,  Dimensiunilor

– 900-1000 X. – 0,2 - 2µm 2-20 mm



Microscopia electronică  Evidentierea structurii bacteriilor.



Morfologia => preparate microscopice:

 preparat nativ,  frotiu efectuate din:

– produse patologice – cultură bacteriană pură.

Frotiul - preparat microscopic colorat, Informaţii:  forma  dimensiunile  dispoziţia bacteriilor,  afinitatea tinctorialä,  prezenţa structurilor facultative,  numar (prod.patol.)

Frotiul - preparat microscopic colorat, Forme fundamentale  sferă - coci (1µ)  Cilindru, bastonas - bacili (3-7µ);  cilindru helicoidal – forma spiralată

COCI Dispoziţia rezultä în urma diviziunii  diplo: diplococi  Pneumococi: – coci Gram pozitivi, – ovoizi cu aspect de flacăre de lumînare (diviziune pe verticală),

 Neisserii: – coci Gram negativi – cu aspect reniform, concav –convex (diviziune pe orizontală),

tetrade: Micrococi: 4 coci reuniţi  octade: Sarcina: 8 coci.  lanţuri: Streptococi.  grămezi: Stafilococi 

BACILI Capete bacililor pot fi:  rotunjite la Enterobacterii – b.coli şi alţi bacili Gram negativi  ascuţite la Fusobacterium – bacili Gram negativi  drepte – bacilii din genul Bacillus (bacili Gram pozitivi) Grosimea cilindrului poate fi diferită: deformaţi prin endospori, incluzii  Endosporii nu se colorează în coloraţia Gram = zone necolorate, albe, sferice, – endospori cu diam. < decât diam. f. vegetative, Bacillus (bacili Gram pozitivi) – endospori cu diam. > decât diam.f.vegetative, Clostridium, Gram pozitivi.  terminal, Clostridium tetani  subterminal-rachetă de tenis: Clostridium botulinicum  central-bărcuţă sau de fus: Clostridium septicum, sporogenes

BACILI Dispoziţia în frotiu:  bacili izolaţi:

– Enterobacterii: bacil colii (bacili Gram negativi)



diplobacili:



streptobacili:



bacili uniţi la capete:



bacili dispuşi în palisade:

– Bacilul cărbunos în frotiurile efectuate din produs patologic – Bacillus (bacili Gram pozitivi): Bacil subtilis, bacil cereus, bacil cărbunos (în frotiurile din cultură pură). – Mycobacterium tuberculosis – aspect de majuscule (X, Y, W) – Corynebacterium diphteriae – aspect de litere chinezeşti (bacili încurbaţi, deformaţi la capete Gram pozitivi). – Bacili pseudodifterici (bacili Gram pozitivi)

COCOBACILI 

bacili scurţi, subţiri,  1,5 - 2µ lungime  0,6 - 0,8µ lăţime

Gram negativi.  Ex: 

– Haemophyllus, – Brucella, – Bordetella

FORME SPIRALATE BACILI ÎNCURBAŢI: număr mic de ture de spiră  Vibrion holeric – bacil încurbat mobil, – aspect de virgulă, – Gram negativ 

Campylobacter – 2 bacili încurbaţi uniţi la capete, aspect de literă S



Helicobacter – mai mulţi bacili încurbaţi uniţi la capete (2-5) – produc gastrite, ulcer duodenal

FORME SPIRALATE Spirochete: bacterii spiralate  lungi 5 - 10µ,  Subţiri 0,2 - 0,3 µ,  mobile prin aparat locomotor; 

– Ex. Treponema pallidum, Leptospira, Borrellia 

Spirili: bacterii spiralate rigide, neimplicate în patologia umană;

Forma: menţinută datorita peretelui celular. Bacterii fără perete celular : Mycoplasma culturi vechi 48-72 ore = pleomorfismul bacterian  Bacterii necolorabile prin coloratia Gram =>   

– Bacterii spiralate

 Treponema pallidum, Leptospira, Borrellia  Necesita coloraţii speciale: Fontana, Burri, Giemsa

– genul Mycobacteria

 coloraţia Ziehl – Neelsen

– Bacterii intracelulare:

 Rickettsia, Chlamydia  coloraţia Giemsa, Machiavello, Giemenez



Treponema pallidum – Burri

Fontana

genul Mycobacteria coloraţia Ziehl – Neelsen

Chlamydii, Rickettii



Giemsa,



Macchiavello

Gimenez

Taxonomie

clasificare, nomenclatura, identificare 

Clasificare – Diviziuni bacteriene = unitati taxonomice

– phyllum - clase - ordine - familii – genuri/triburi – specii



Specia = unitatea de baza a clasificarii – ~ Reflecta proprietate – Var – Tip (biotip, serotip)



Nomenclatura: latinizata (reguli internationale) – proprietati – Ex. Mycobacterium tuberculosis  ordinele – ales  familiile - aceae  Triburi/genuri – eae



Identificare – importanta practica a clasificarii

IDENTIFICAREA 

Deosebeste – Microorganismele “bune” – “Rele” = patogene



Proprietati specifice  Morfologice  De cultura



izolare si identificare  agent cauzator = etiologic al unei imbolnaviri

CLASIFICAREA BACTERIILOR 

Clasificarea Linné – nu după înrudirea naturală ci după unele proprietăţi fenotipice:  structura peretelui celular,  afinitatea morfotinctorială,  proprietăţi metabolice,  rezistenţa la diverse condiţii de mediu

 

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology International Commission of Bacterial Systematic 1980



Adansoniana – numerica  Prezenta/absenta: pigmenti, enzime  Complicata  statistica



Filogenetica – 1980 – Tehnici moleculare si genetice  hybridizarea acizilor nucleici  Analiza secventelor ARN-ului ribozomal (rRNA)

– inrudirea evolutiva

Peretele celular => 4 divizii editia 9-a 

I. Gracillicutes – Bacterii Gram negative – Grup 1: Spirochete:

 Treponema, Borrelia, Leptospira

– Grup 2: Aerobe/micro-aerofile, mobile, helicoidale  Cam pylobacter, Helicobacter

– Grup 3:

 Bacterii incurbate, imobile sau rar mobile

– Group 4: Aerobe/ micro-aerofile, bacili si coci:     

Bordetella Brucella, Francisella Legionella, Moraxella Neisseria, P seudom onas Bacteroides

I. Gracillicutes – Bacterii Gram negative 

Grup 5: bacili facultativ anaerobi – – – – –

Escherichia, K lebsiella P roteus, P rovidencia Salm onella, Shigella Yersinia, Vibrio Haem ophilus, Pasteurella



Grup 6: bacili incurbati sau helicoidali, anaerobi

 

Group 7: bacterii reducatoare de sulf Group 8: coci anaerobi

– Fusobacterium



Group 9: Rickettsiae and Chlamydiae:



Grup 10-16 - fara importanta medicala

– Rick ettsia – Chlam ydia – Cox iella

II. Firmicutes: bacterii Gram pozitive 

Grup 17:



Grup 18: bacili formatori de endospori:



Grup 19: bacili nesporulati



Grup 20: bacili neregulati, nesporulati :



Grup 21: Mycobacteria: Mycobacterium Grup 22-29: Actinomycete:



– – – –

Enterococcus Peptostreptococcus Staphylococcus Streptococcus

– Bacillus – Clostridium

– Listeria – ClasaThallobacteria – Actinomyces – Corynebacterium

– Nocardia, Streptomyces, Rhodococcus

III. Tenericutes Bacterii fara perete celular 

Group 30: – M ycoplasm a, Ureaplasm a



IV. Mendosicutes: – Archaebacteria

GRUPE DE HAZARD

  

RISC INFECŢIOS: 4 grupe gradul de pericol la locul de muncă. Criterii    

patogenitatea pentru om risc pentru personalul de laborator transmisie în colectivităţi exista – profilaxie – tratament corespunzător

I. Microorganisme care nu par a determina boli umane  II. Microorganisme care: 

    

pot cauza boli umane prezintä risc pentru personalul de laborator nu par a se răspândi în colectivitate există măsuri de profilaxie, tratament

Bacterii: Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Campylobacter, Clostridium botulinicum şi alte clostridii, Bacil difteric, Enterobacter,

Eschericia coli, Stafilococ aureus, Streptococ, Treponema pallidum, Klebsiella, Mycobacterii netuberculoase, Proteus, Vibrio holeric, Shigella. 

Virusuri: Adenovirus, Coronavirus, Herpesvirus, virusuri Coxackie, Echo, virusul hepatitei A, virusuri poliomielitice, Rhinovirus, Rotavirus, virusul rubeolei, virus gripal, Paramyxovirus



III. Microorganisme care:    



determină boli severe prezintä risc serios pentru personalul de laborator prezintä risc de răspândire în colectivităţi există profilaxie şi tratament corespunzător

Bacterii: Bacil cărbunos, Brucella, Chlamydia psittaci, bacilul TBC, bacilul leprei, Rickettsii,

Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A,B,C.



Virusuri: CMV, Bunyavirusuri, Hepatita B,D, Enterovirus, HIV, Virusul rabic



IV. Microorganisme care:  determină boli serioase la om  prezintä risc serios pentru personalul de laborator  prezintä risc crescut de răspândire în colectivităţi  nu au profilaxie şi tratament eficient



Virusuri: Arenavirusuri (virusurile Lassa, Junin, Machupo), Bunyavirusuri (v. febrei de Crimeea Congo), Filoviridae (virusurile Ebola, Marburg); Poxviridae (virusul variolei)



Produsele patologice  nu se cunoaşte conţinutul microbian  trebuie prelucrate cu respectarea normelor de protecţie.

Morfologie bacteriana Dr. Carmen Costache

STRUCTURA 1.Structuri obligatorii:  Nucleoid,  Citoplasma,  Membrană citoplasmatică,  Perete celular

2.Structuri facultative * neesenţiale pentru multiplicare * conferä proprietäţi de patogenitatea  Capsulă, Glicocalix;  Pili comuni, pili de sex,  Flageli (Cili),  Spori

NUCLEOID 

nu are – nucleoli, – membrana nucleară.



Se evidenţiază: – prin coloraţii speciale:  coloraţia Feulgen,  acridin orange;

– microscopia electronică (aspect fibrilar).

NUCLEOID 

Un singur cromozom = o moleculă dublu catenară de ADN circulară – 50-65 bucle supraspiralizate, pliată, răsucită, – fibrilar, de arici sau ghem – legat de membrana citoplasmatică prin mezozomi

 



Informaţia genetică - haploidă (gene pentru un caracter într-un singur exemplar). contact direct între ADN şi ARN, important pentru transcrierea şi traducerea inf.genetice sediul de acţiune al unor AB:  Quinolone  Nitrofurani, imidazoli  Rifamicine

NUCLEOID 

studii recente => Cz lineari  Borrellia burgdorferi,  Streptomyces spp



Nr. copii de AND/cz la un moment dat  Depind de stadiul ciclului celular

Material genetic extracromozomial autonom sau integrat în cz bacterian  Plasmidele  Bacteriofagii 

Material genetic extracromozomial 

Plasmidele – molecule de ADN circulare. – se pot transmite de la o bacterie la alta = conjugarea bacteriană – Codifica nr variabil de gene  virulenta.



Feuelgen pozitiv

Material genetic extracromozomial Bacteriofagii  Structuri virale  infecteaza bacteriile.  2 tipuri:  litici, capabili de replicare => liza bacteriei  lizogeni (temperaţi) – – se pot integra în cz. = profag => proprietăţi noi: ex. producerea unor toxine.

CITOPLASMA BACTERIILOR necompartimentată,  fără organite: 

 reticul endoplasmatic,  aparat Golgi,  mitocondrii,



2 zone distincte – Periferica, amorfa – Interna (nucleoidul)

CITOPLASMA BACTERIILOR 

1.Ribozomi: mii, 70 S

 subunităţile : 50 S (Large) şi 30 S (Small)

– sediul sintezei proteice – ţinta de acţiune a unor antibiotice => inhiba selectiv sinteza proteica bacteriana dar nu si cea eukariota !

  

Chloramfenicol, Erithromicina (M) Clindamicin,

 

Tetracicline Aminoglicozide

50 S

30 S

CITOPLASMA BACTERIILOR 

2.Granule/Incluzii: – masă lichidă de substanţe nutritive, – delimitate de membrană – Colorate specific de anumiti coloranti  Ex. Volutina = corpuscul metacromatic (albastru de metilen=> rosu)

CITOPLASMA BACTERIILOR 

3. ARN în cantitate mare, – reprezentat de r ARN (9%), m ARN, t ARN.



4. Molecule: 3000 – 4000 molecule diferite; – apă, săruri minerale, ioni, acizi nucleici



5. Incluzii: material nutritiv de rezervă, – format în condiţii nefavorabile de mediu



6. Plasmide

MEMBRANA CITOPLASMATICA strat subţire (10 -20 nm)  sub peretele celular => greu de evidenţiat. Structura membranei citoplasmatice  modelul mozaicului Singer: 

– masă fosfolipidică, – plutesc insule de proteine,  dispuse spre interior, exterior  sau în masa fosfolipidică.



model dinamic => reciclată permanent.

MEMBRANA CITOPLASMATICA Prelungiri în citoplasmă:  1. Mezozomi  Rol: – diviziunea bacteriilor; – replicare ADN-ului; – formarea endosporilor  

2. Oxizomi: prelungiri scurte Rol: – procesele bioenergetice la bacteriile capabile de respiraţie:  aerobe,  aerob anaerobe facultative,  microaerofile.

FUNCŢIILE MEMBRANEI CITOPLASMATICE



1. Permeabilitate selectivă şi transport de substanţe: – transport pasiv = difuzia simplă, substanţe cu GM mică – transportul activ  contra gradient de concentraţie,  cu consum de energie

FUNCŢIILE MEMBRANEI CITOPLASMATICE 

2. Funcţie bioenergetică: – sediul transportului de electroni, a fosforilării oxidative (Oxizomii).

3. Funcţie biosintetică: precursori PC  4. Sediul enzimelor hidrolazice 

– hidrolizează polimeri organici: proteine, zaharuri, lipide în nutrienţi, care pot pătrunde în bacterie.

FUNCŢIILE MEMBRANEI CITOPLASMATICE 

5.Ţinta de acţiune pentru detergenţi şi antibiotice (bactericid.)

FUNCŢIILE MEMBRANEI CITOPLASMATICE 

6. Replicarea ADN cromozomial, plasmidic: – prin mezozomii septali



7. Sediul motorului ciliar

FUNCŢIILE MEMBRANEI CITOPLASMATICE 

8. Import de macromolecule – ex. fragment de ADN, de la bacterii donatoare = transformare

FUNCŢIILE MEMBRANEI CITOPLASMATICE 

9. Sediul receptorilor chemotactici: – deplasarea spre substanţele nutritive

PERETELE CELULAR BACTERIAN      

prezent la majoritatea bacteriilor, cu excepţia genului Mycoplasma. PERETELE CELULAR LA BACTERII GRAM POZITIVE gros (15- 50 nm), dar simplu structurat: straturi suprapuse de peptidoglican (40) şi acizi teichoici ataşaţi 1.Acizi teichoici sunt heteropolimeri repetitivi, Rol - aderarea bacteriilor de celulele epiteliale ale mucoaselor – ex. streptococ ß hemolitic.



- antigene de suprafaţă - captarea unor nutrienţi: ex. Mg. 2.Polizaharide de perete 3.Proteine de perete



Lipidele sunt în cantitate mică (<1%);

  

 (excepţional-ex proteina A a Stafilococului aureus

– excepţie Mycobacterium,

PERETELE CELULAR LA BACTERII GRAM NEGATIVE  

subţire (10 -15 nm) dar complex structurat 1. Peptidoglicanul :  1- 2 straturi de peptidoglican, bidimensional

 

2. Stratul lipoproteic Formează un schelet 3. Membrana externă – masă fosfolipidică fluidă, în care înoată proteine.  Proteinele majore (70%) şi minore (30%) – Proteine majore: Porine, Nonporine

 Proteine minore (Outer membrane proteins - OMP) – NBP (nutrient binding protein), – PBP (penicillin binding protein), – FeBP (siderofor)

PERETELE CELULAR LA BACTERII GRAM NEGATIVE  

4. Lipopolizaharidul (LPZ) Lipidul A – este endotoxina bacteriilor Gram negative – responsabilă de fenomenele toxice:  febră, diaree, greţuri, vărsături, scăderea tensiunii arteriale,  şoc endotoxic şi deces.



Componenta polizaharidică internă (core, sâmbure polizaharidic): – structurä comună la bacteriile Gram negative



Lanţurile oligozaharidice laterale: – proemină la suprafaţa bacteriei, ca spini şi sunt în număr mare – este antigenul O, responsabil de specificitate

PERETELE CELULAR LA BACTERII GRAM NEGATIVE 

5. Spatiul periplasmic – între membrana externă şi membrana citoplasmatică. – Deţine oligozaharide şi protein-enzime:  distrugerea bacteriilor bătrâne/moarte -autoliza  scindează substanţele nutritive cu G.M. mare, (polimeri organici) în monomeri: nutrienţi care pot pătrunde în bacterie.

FUNCŢIILE PERETELUI CELULAR      

1. Menţine forma 2. delimitarea bacteriilor în 2 grupe Gram. 3. responsabil de acido - alcoolorezistenţă, 4. creşterea şi diviziunea bacteriilor - primer pentru propria sinteză 6. Intervine în nutriţia bacteriană 7. Intervine în metabolismul bacterian, – sită moleculară – transportor de ioni – import şi export de proteine



8. Este o barieră selectivă şi are rol protector.

FORMATIUNI FACULTATIVE 

Conferă bacteriilor proprietăţi importante în natură

– aderenţa, – rezistenţă la fagocitoză ( unele fiind factori de patogenitate.)

CAPSULA  strat amorf de înveliş  3 structuri :  Capsula microscopică :poate înconjura 1-2 bacterii.

– Ex. Pneumococi, Meningococi, Hemofili, Bacilul cărbunos, Klebsiella, Clostridium perfringers.



Microcapsulă: antigenul K / antigen Vi la Salmonella.



Stratul mucos produs doar în condiţii naturale =>patogene

– se evidenţiază doar în microscopie electronică – poate înconjura doar parţial peretele celular.

Capsula se evidenţiază 1. În frotiuri prin:  coloraţii negative, – nu colorează capsula, – vizibilă ca un halou alb în jurul bacteriilor:  coloraţia Gram (prod. patologic),  Burri (culturi pure)

coloraţii pozitive: coloraţia Muir 2. Prin reacţii antigen - anticorp: reacţia de precipitare şi reacţia de umflare a capsulei 3. După aspectul coloniilor pe medii de cultură: foarte mucoase 

CAPSULA

Compoziţie chimică 

polizaharidică, – majoritatea bacteriilor capsulate (Pneumococ, Meningococ, Hemofili).



polipeptidică: – polimer al acidului D - Glutamic, la bacilul cărbunos.



proteică – Yersinia pestis,

polimer de acid hialuronic la Streptococ β - hemolitic. Rol  1. antigen bacterian.  2. factor de patogenitate bacterian: 

 se opune fagocitării bacteriilor.

GLICOCALIXUL strat de suprafaţă sintetizat de bacterii în mediul lor natural.  structurat,  fibre polizaharidice lungi (dextran sau levan)  se poate evidenţia doar în microscopie electronică Rol  1.adezina polizaharidică  2.factor de colonizare 

– Ex. Mutanul ( Streptococus mutans) - aderă de smalţul dentar cu formarea cariei dentare. Bacteriile produc metaboliţi acizi, care atacă smalţul dentar.

PILII COMUNI (FIMBRII) 

Pleacă din membrana citoplasmică, străbat PC

formaţiuni filamentoase, tubulare scurte  număr mare (aproximativ 100 - 200 pili).  natură proteică (pileină ).  determinism cromozomial 

– mai rar determinism plasmidic. 

întâlniţi la bacteriile Gram negative

PILII Rol  1. adezinele proteice ale bacteriilor: 

– aderarea nespecifică pe suprafeţe inerte, – aderarea specifică pe mucoase, epitelii, endotelii, hematii, fagocite. 

2. factor de patogenitate – Gonococii, E. coli- (ETEC),



3. antigene – posibilitatea modificarea structurii antigenice

PILII DE SEX formaţiuni tubulare lungi  număr mic (1-4 )  prezenţi la bacteriile G negative  au determinism extracromozomial (plasmidic)  Rol: conjugarea bacteriană 

FLAGELI (CILI) 

formaţiuni tubulare lungi

 aprox. 20 µm lungime/20 nm lăţime.



organite de locomoţie ale bacteriilor Structură proteică = flagelină Ultrasctructura la ME:



Evidentierea cililor :

 

– corpuscul bazal ş – cilindru proteic (filament axial). – în preparate microscopice:

 coloraţii speciale  indirect în preparate native (mobilitatea bacteriană) .

– pe medii de cultură, prin însămânţarea bacteriilor prin înţepare:  bacteriile imobile se dezvoltă doar pe traiectul de înţepare,  cele mobile se dezvoltă în tot mediul.

Rol:  1. mobilitate, spre locurile unde există atractanţi: 

– chimiotaxie (deplasarea spre substanţe chimice); – fototaxie (deplasare spre locurile cu lumină); etc 

2.antigen bacterian - antigenul “H”,  Weil - Felix a evidenţiat la Proteus,  însămânţată într-un punct dintr-un mediu, se dezvoltă pe tot mediul sub forma unor văluri concentrice (hauch).

SPORII forme de rezistenţă - condiţii nefavorabile de temperatură, nutriţie, pH, oxigen,  formă primitivă de diferenţiere celulară la bacterii.  Sporularea: 

–



iniţial endospori ulteior - spori liberi = exospori

Germinare

– Revenire la forma vegetativă când întâlnesc condiţii favorabile



Evidenţierea sporilor

– coloraţii negative: Gram (formaţiuni ovalare, necolorate, în interiorul bacteriilor). – coloraţii pozitive: verde – malachit şi safranină



Ultrastructura sporilor (ME) din interior spre exterior: – – – –

  

Protoplastul sporal Peretele sporal Cortexul Învelişurile sporale si exosporium

Rol: 1. identificarea bacteriilor. 2.alegerea metodelor de sterilizare şi dezinfecţie capabile să distrugă sporii

SPORI

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

I. Pentru unele boli infecţioase, examenul microscopic = singura posibilitate diagnostică. Ex. Sifilis - Treponema pallidum,  nu există posibilitatea de a izola, cultiva => evidenţierea şi identificarea în preparat nativ sau în frotiuri prin coloraţii speciale (impregnarea argentică) = forma spiralată.

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

II. Pentru alte boli infectioase, există posibilitatea cultivării şi izolării agentului etiologic, dar examenul microscopic oferă informaţii preţioase. – gonoree - Neisseria gonnorhoeae (gonococ)  imaginea microscopică: PMN, diplococi intra şi extracelulari.

– tuberculoză, bacilul Koch se dezvoltă lent,  frotiu din produs patologic: evidenţierea de bacili acido alcoolorezistenţi prin coloraţia Ziehl - Neelsen,

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ III. Pentru alte boli infecţioase- informaţii orientative. Frotiu din puroi, colorat Gram:  coci Gram pozitivi dispuşi în grămezi - infecţie stafilococică  coci Gram pozitivi, dispuşi în lanţuri - infecţie streptococică  diplobacili Gram pozitivi, capsulaţi - etiologie cărbunoasă  bacili G pozitivi deformaţi - tetanos ( Clostridium tetani)  bacili G negativi capsulaţi - Klebsiella Frotiu din spută:  diplococi Gram pozitivi capsulaţi - pneumonie pneumococică  bacili Gram negativi capsulaţi – Klebsiella pn. Frotiu din LCR:  diplococi G negativi - etiologie meningococică.  diplococi G pozitivi capsulaţi - etiologie pneumococicä 

Morfologie bacteriana FORMATIUNI FACULTATIVE Dr. Carmen Costache

FORMATIUNI FACULTATIVE 

Conferă bacteriilor proprietăţi importante în natură

– aderenţa, – rezistenţă la fagocitoză ( unele fiind factori de patogenitate.)

CAPSULA  strat amorf de înveliş  3 structuri :  Capsula microscopică : poate înconjura 1-2 bacterii.

– Ex. Pneumococi, Meningococi, Hemofili, Bacilul cărbunos, Klebsiella, Clostridium perfringers.



Microcapsulă: antigenul K / antigen Vi la Salmonella.



Stratul mucos produs doar în condiţii naturale =>patogene

– se evidenţiază doar în microscopie electronică – poate înconjura doar parţial peretele celular.

Capsula se evidenţiază 1. În frotiuri prin:  coloraţii negative, – nu colorează capsula, – vizibilă ca un halou alb în jurul bacteriilor:  coloraţia Gram (prod. patologic),  Burri (culturi pure)

coloraţii pozitive: coloraţia Muir 2. Prin reacţii antigen - anticorp: reacţia de precipitare şi reacţia de umflare a capsulei 3. După aspectul coloniilor pe medii de cultură: foarte mucoase 

CAPSULA

Compoziţie chimică 

polizaharidică, – majoritatea bacteriilor capsulate (Pneumococ, Meningococ, Hemofili).



polipeptidică: – polimer al acidului D - Glutamic, la bacilul cărbunos.



proteică – Yersinia pestis,

polimer de acid hialuronic la Streptococ β - hemolitic. Rol  1. antigen bacterian.  2. factor de patogenitate bacterian: 

 se opune fagocitării bacteriilor.

GLICOCALIXUL strat de suprafaţă sintetizat de bacterii în mediul lor natural.  structurat,  fibre polizaharidice lungi (dextran sau levan)  se poate evidenţia doar în microscopie electronică Rol  1.adezina polizaharidică  2.factor de colonizare 

– Ex. Mutanul ( Streptococus mutans) - aderă de smalţul dentar cu formarea cariei dentare. Bacteriile produc metaboliţi acizi, care atacă smalţul dentar.

PILII COMUNI (FIMBRII) 

Pleacă din membrana citoplasmică, străbat PC

formaţiuni filamentoase, tubulare scurte  număr mare (aproximativ 100 - 200 pili).  natură proteică (pileină ).  determinism cromozomial 

– mai rar determinism plasmidic. 

întâlniţi la bacteriile Gram negative

PILII Rol  1. adezinele proteice ale bacteriilor: 

– aderarea nespecifică pe suprafeţe inerte, – aderarea specifică pe mucoase, epitelii, endotelii, hematii, fagocite. 

2. factor de patogenitate – Gonococii, E. coli- (ETEC),



3. antigene – posibilitatea modificarea structurii antigenice

PILII DE SEX formaţiuni tubulare lungi  număr mic (1-4 )  prezenţi la bacteriile G negative  au determinism extracromozomial (plasmidic)  Rol: conjugarea bacteriană 

FLAGELI (CILI) 

formaţiuni tubulare lungi

 aprox. 20 µm lungime/20 nm lăţime.



organite de locomoţie ale bacteriilor Structură proteică = flagelină Ultrasctructura la ME:



Evidentierea cililor :

 

– corpuscul bazal ş – cilindru proteic (filament axial). – în preparate microscopice:

 coloraţii speciale  indirect în preparate native (mobilitatea bacteriană) .

– pe medii de cultură, prin însămânţarea bacteriilor prin înţepare:  bacteriile imobile se dezvoltă doar pe traiectul de înţepare,  cele mobile se dezvoltă în tot mediul.

Rol:  1. mobilitate, spre locurile unde există atractanţi: 

– chimiotaxie (deplasarea spre substanţe chimice); – fototaxie (deplasare spre locurile cu lumină); etc 

2.antigen bacterian - antigenul “H”,  Weil - Felix a evidenţiat la Proteus,  însămânţată într-un punct dintr-un mediu, se dezvoltă pe tot mediul sub forma unor văluri concentrice (hauch).

SPORII   

forme de rezistenţă - condiţii nefavorabile de temperatură, nutriţie, pH, oxigen, formă primitivă de diferenţiere celulară la bacterii. Sporularea: – iniţial endospori ulteior - spori liberi = exospori



Germinare – Revenire la forma vegetativă când întâlnesc condiţii favorabile

SPORII 

Evidenţierea sporilor



Ultrastructura sporilor (ME) din interior spre exterior:

– coloraţii negative: Gram (formaţiuni ovalare, necolorate, în interiorul bacteriilor). – coloraţii pozitive: verde – malachit şi safranină – – – –

Protoplastul sporal Peretele sporal Cortexul Învelişurile sporale si exosporium

SPORII Rol: 1. Forma de rezistenţă pentru bacterii 2. identificarea bacteriilor. 3. alegerea metodelor de sterilizare şi dezinfecţie capabile să distrugă sporii



IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ Unele boli infecţioase - examenul microscopic = singura posibilitate diagnostică.

Ex. Sifilis - Treponema pallidum  NU creşte pe mediile de cultură => evidenţierea şi identificarea în preparat nativ sau în frotiuri

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ Unele boli infectioase - examenul microscopic oferă informaţii preţioase

– gonoree - Neisseria

gennorhoeae (gonococ)

 imaginea microscopică: diplococi intra şi extracelulari.

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ Unele boli infectioase - examenul microscopic oferă informaţii preţioase

- tuberculoză, bacilul Koch se dezvoltă lent

 frotiu din produs patologic: bacili acido – alcoolorezistenţi, coloraţia Ziehl - Neelsen

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ Unele boli infecţioaseinformaţii orientative. Frotiu din puroi, colorat Gram:  coci Gram pozitivi dispuşi în grămezi - infecţie stafilococică

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

Unele boli infecţioaseinformaţii orientative.

Frotiu din puroi, colorat Gram:  coci Gram pozitivi, dispuşi în lanţuri infecţie streptococică

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

Unele boli infecţioaseinformaţii orientative.

Frotiu din spută:  diplococi Gram pozitivi capsulaţi - pneumonie pneumococică

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

Unele boli infecţioase- informaţii orientative.

Frotiu din spută:  bacili Gram negativi capsulaţi – Klebsiella

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

Unele boli infecţioase- informaţii orientative.

Frotiu din LCR:  diplococi G negativi - etiologie meningococică.

IMPORTANŢA CUNOŞTINŢELOR DE MORFOLOGIE BACTERIANĂ 

Unele boli infecţioase- informaţii orientative.

Frotiu din LCR:  diplococi G pozitivi capsulaţi - etiologie pneumococică.

Metabolism bacterian Dr. Carmen Costache

METABOLISM BACTERIAN Planul cursului



Definiţie,



– Anabolism, – Catabolism 

Efectul factorilor fizici asupra dezvoltării bacteriene – – – – –

Efectul Efectul Efectul Efectul Efectul

temperaturii pH-ului presiunii osmotice radiaţiilor deshidratării

Efectul unor substanţe chimice – O2

 Clasificare

– CO2    

Nutriţia bacteriană Bacteriile de importanţă medicală Metabolismul energetic bacterian Curba de multiplicare (creştere) a bacteriilor

Metabolism bacterian 

Definiţie: – Suma tuturor proceselor chimice

1. Anabolism: Sinteza de compuşi complecşi, cu consum energetic. 2. Catabolism: - descompunerea compuşilor complecşi - producere de energie

Efectul factorilor fizici asupra dezvoltării bacteriene Efectul temperaturii  dezvoltare bacteriană –

– – –

izvoarele cu apă fierbinte din Yellowstone National Park 120˚C. Soluţii apose până la -20˚C, Gheţari din Antarctica, Congelatoare casnice: 0 ˚C.

Clasificarea bacteriilor în funcţie de temperatura de creştere Microorganisme: limite de T, definite prin 3 valori: T min, T o, T max   

T min = < NU se dezvoltă T o = creştere şi multiplicare optimă T max= > NU se pot dezvolta, mor

Clasificarea bacteriilor=f(T)   

Criofile Mezofile Termofile

Criofile (fără importanţă medicală)  T : 0 – 20˚C  To: 10-15˚C  Mări, oceane, soluri reci, frigidere Termofile (fără importanţă medicală)  T: 45-90˚C  T o: 60-70˚C  Soluri calde, izvoare termale Mezofile - importanţă medicală !!!  T o aproape de 37˚C  T: 20-45˚C

Efectul temperaturii asupra dezvoltării bacteriene 

Ingheţarea => – stoparea multiplicării unor bacterii DAR – multe din ele nu sunt omorâte la temperaturile din congelatoarele casnice !



Investigarea unei epidemii de toxinfecţie alimentară salmonelozică: – Ingheţată contaminată cu Salmonella – luni de zile inghetata – încă avea bacterii vii



In laboratoare bacteriile (tulpini de referinţă, tulpini izolate de la pacienţi) – păstrate pentru studii ulterioare în frigidere/congelatoare.

Efectul pH-ului asupra bacteriilor   

pH = concentraţia ionilor de hidrogen, [H+] pH optim = neutru (6,8-7) Limite: 6-8 – bulion nutritiv: pH = 6,8 !



Acidofile: preferă pH acid – Helicobacter pylori



Alcalifile: preferă mediile alcaline – Vibrio cholerae: pH > 8

Efectul presiunii osmotice asupra bacteriilor Apa sărată - hipertonă => ucide multe microorganisme.  Majoritatea: soluţii izotone  NaCl – există în natură (concentraţii variabile) 

Clasificarea bacteriilor în funcţie de concentraţia de sare tolerată 

Halotolerante = concentraţii moderate de sare

ex. Staphylococcus creşte pe mediu cu

7,5% NaCl (Chapman = mediu selectiv) 

Halofile = necesită 15-30% NaCl

Efectul presiunii osmotice asupra bacteriilor 





Saramura: folosită pentru conservarea alimentelor DAR Stafilococi- halotoleranţi=> contaminare => “stricarea” alimentelor Levurile şi mucegaiurile tolerează presiuni osmotice crescute => cresc pe carne, gemuri, etc.

Efectul radiaţiilor asupra bacteriilor 

UV, gamma – bactericide

 Bacterii din aer  Suprafeţe, inclusiv suprafaţa apei  Instrumentar medical (raze gamma)



Mecanism

– Energia radiantă => nucleoproteine =>dimeri de timină – lezare celulară => moarte – Penetrare redusă => aplicaţie limitată în sterilizare

Efectul desicaţiei (deshidratarea, uscarea)

Desicaţia = letală pentru bacterii  Practic: conservarea alimentelor 

Efectul desicaţiei (deshidratarea, uscarea) 

Revers: persistenta microorganismelor in picaturi mici de apa (aerosoli) => afectiuni cu poarta de intrare respiratorie !

Efectul unor substanţe chimice asupra bacteriilor  

Dezinfecţia: efectul substanţelor chimice folosite pe suprafeţe Antisepsia: efectul sustanţelor chimice folosite pentru decontaminarea ţesuturilor.

Molecule chimice folosite de bacterii pentru creştere şi dezvoltare: CO2 and O2

CO2 - bacterii capneice

– 5-10% CO2 – termostate cu atmosferă de CO2  E.g. Neisseria gonorrheae (gonococci)

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor

Obligat aerobe = strict aerobe  Obligat anaerobe = strict anaerobe  Aerob facultativ anaerobe  Microaerofile  Anaerob-aerotolerante 

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor Obligat aerobe   

Oxigenul molecur (O2) indispensabil pentru creştere Acceptorul final de electroni în lanţul respirator: oxigenul Respiraţie => energie – Ex. Mycobacterium tuberculosis; genul Bacillus

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor Obligat anaerobe  

O2 = toxic fermentaţie => energie – Ex. Clostridium spp.

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor Aerobe facultativ anaerobe  

Cresc în prezenţa SAU absenţa O2 respiratie (aerobă, anaerobă) sau fermentaţie => energie – Ex. Enterobacteriile

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor Microaerofile Necesită O2 – conc.< conc. atmosferică O2 în concentraţia atmosferică = toxic  Respiraţie => energie  Ex. Neisseria spp. (gonococci, meningococci)  

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor

Anaerob-aerotolerante

pot creşte în prezenţa O2 DAR  Fermentaţie => energie  Ex. Streptococcus  Toate organismele care cresc în prezenţa O2 au superoxid dismutază. 

Clasificarea bacteriilor în funcţie de efectul oxigenului asupra lor

Obligat anaerobe (Clostridium) – NU au

– superoxid dismutază – catalază şi/sau peroxidază, => sunt supuse acţiunii radicalilor liberi rezultaţi în prezenţa oxigenului, pe care nu au cum să îi neutralizeze => efect letal asupra bacteriilor

Acţiunea superoxid dismutazei, catalazei şi peroxidazei • neutralizează radicalii de oxigen care sunt generaţi inevitabil în prezenţa O2 în orice sistem viu.

Nutriţia bacteriană Sursa de energie Sursa de C:



bacterii chimioorganotrofe – substanţe chimice organice



bacteriile fototrofe - lumina bacterii chimiotrofe – reacţii chimice de oxidoreducere bacterii chimiolitotrofe – substanţe chimice anorganice

Bacterii C autotrofe:  CO2  fără importanţă medicală.

Bacterii C heterotrofe  

Substanţe chimice organice Importanţă medicală

 

Substante chimice organice:

Saruri, microelemente

Apa

Nutriţia bacteriană 

Bacterii prototrofe: multiplicare pe un mediu sintetic minimal (sălbatice)



Bacterii auxotrofe – – – –

selectate în evoluţie au pierdut 1-2 căi metabolice nu se multiplica pe medii sintetice minimale necesită factori de creştere ~ vitamine bacteriene (Nu pot fi sintetizaţi de bacterii)

 ex. vitamine propriu-zise: K, B (B1, B2, B6, B12))  extract de drojdie  sânge pentru bacterii pretenţioase nutritiv (streptococi, gonococi, meningococi)  Factor X, V pentru hemofili



Bacteriile paratrofe

– parazitism intracelular: Rickettsia, Chlamydia.

METABOLISMUL ENERGETIC BACTERIAN 

2 modalităţi principale de producere a energiei: – respiraţia – fermentaţia

1. Respiraţia (metabolism energetic respirator)  lanţ transportor de electroni; fosforilare oxidativă = aerobă  lanţ transportor de electroni, fosforilare anoxibiotică = anaerobă 2. Fermentaţia (metabolism energetic fermentativ)

După natura produşilor rezultaţi => diferite tipuri de fermentaţie

Alcoolicǎ  Lacticǎ  acidǎ mixtǎ  Acetoinicǎ  Propionicǎ  Butiricǎ 

Tipuri de fermentaţie 

Fermentaţia alcoolicǎ => alcool etilic;

– la drojdii, levuri (Sacharomyces cerrevisiae) => fermentaţia vinului, berii.

Tipuri de fermentaţie 

Fermentaţia lacticǎ => acid lactic – Ex: streptococi, lactobacili

Normal flora of the vagina = lactobacilli

Tipuri de fermentaţie 

Fermentaţia acidǎ mixtǎ => acid lactic, succinic, formic – Enterobacterii – evidenţiata prin reacţia roşu metil.



Fermentaţia acetoinicǎ: acumulare de acetoină şi butilen-glicol – Klebsiella – evidenţiata prin r. Voges – Proskauer.

Tipuri de fermentaţie 

Fermentaţia propionicǎ => acid propionic – Corynebacterium, Neisserria



Fermentaţia butiricǎ => acid butiric, acid caproic, acid amilic. – Clostridium şi alţi anaerobi.

Aplicabilitate practică => diagnosticul de laborator (identificarea bacteriilor – reacţii chimice) ! Reacţia Voges – Proskauer 

Reacţia roşu metil

CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR



temperatură şi nutriţie – optime =>

– bacteriile cresc şi se divid.



parental => 2 celule fiice identice – cu parentalul – identice între ele.

 

Creşterea şi diviziunea unei celule = ciclul celular Creşterea şi multiplicarea unei populaţii bacteriene = curba de creştere.

Curba de multiplicare (creştere) a bacteriilor 

În mediu de cultură lichid.

Perioadele (fazele) curbei de creştere:  Faza de latenţă - lag  Faza de multiplicare logaritmică - log  Faza staţionară  Faza de declin

Curba de multiplicare (creştere) a bacteriilor 

Faza de latenţă (lag)  numărul bacteriilor = nr. Bacteriilor inoculate  NU se divid  cresc în volum  sunt în stare de adaptare metabolică  sunt induse enzimele necesare degradării substratului



Faza de multiplicare logaritmică (log)  nr. bacteriilor creşte în progresie geometrică  sunt tinere, active metabolic  sunt sensibile la acţiunea AB, factorilor fizici şi chimici  utilizate la prepararea de antigene bacteriene, vaccinuri.

Curba de multiplicare (creştere) a bacteriilor 

Faza de încetinire a ritmului de multiplicare – sfârşitul perioadei logaritmice – consum substanţe nutritive, O2 – acumulare toxice => supravieţuire



Faza staţionară

 Număr constant  reprogramată activitatea metabolică  sintetizează proteine de supravieţuire  sporularea  devin mai rezistente la AB.

Curba de multiplicare (creştere) a bacteriilor 

Faza de declin

 Bacteriile mor cu o rată ridicată  modificate morfologic: bătrâne (perete celular gros), forme aberante, globuloase  starea fiziologică de rezistenţă la stres  rezistente la acţiunea factorilor fizici, chimici, la antibiotice.

Importanţa cunoaşterii metabolismului bacterian 

Clasificarea

 Identificarea bacteriilor



Utilizarea bacteriilor: – – – – –

preparare vaccinuri, obţinerea de antigene bacteriene, în industria alimentară (lactate, pâine, alcool), în cercetarea fundamentală mediu.

Multiplicarea bacteriilor pe mediul solid => o colonie.  Colonie = populaţie bacteriană pură din punct de vedere genetic deoarece provine de la un singur parental.

GENETICĂ BACTERIANĂ I

Dr. Carmen Costache

Planul capitolului • Ereditatea = Metabolismul ADN-ului bacterian • Variabilitatea – Mutaţia – Transfer de material genetic

• Rolul materialulul genetic extracromozomial

Planul cursului

EREDITATEA - Metabolismul ADN-ului • Introducere - Dogma centrala • Structura ADN • Codul genetic – Genotip – Fenotip

• Materialul genetic la bacterii

– Cromozomial – Extracromozomial (Plasmide, Bacteriofagi)

• Replicarea ADN • • • •

– Repararea leziunilor ADN

Transcriere Traducere Gene Operoni

INTRODUCERE • Toate organismsmele – au materialul genetic reprezentat de ADN si ARN (Avery,1944, pneumococ) – folosesc aceleasi nucleotide • purine: – Adenina (A), – Guanina (G);

• pirimidinice:

– Citozina (C), – Timina (T) – Uracil (U)

Genetica= Ereditate + variabilitate • Ereditatea – Conservarea şi transmiterea fidelă a caracterelor unei specii la descendenţi – Stabilitatea f (ADN ) ~ metabolismul ADN

• • • •

replicarea semiconservativă repararea leziunilor ADN, restricţie şi modificare transcrierea traducerea informaţiei genetice în proteine.

• Genotipul = totalitatea informaţiei genetice • Exprimarea fenotipică: • informaţie genetice-ADN => ARN => proteine

reproducere asexuala:

Fiziune binara

Dogma centrala • ADN-ul este depozitarul informatiei genetice transcrisa in ARN si apoi in proteine la nivelul ribozomilor (Avery 1944, pneumococ)

• Exceptie: retrovirusurile - Reverse Transcriptaza: ARN => ADN

Variabilitatea •

Modificare caractere fenotipice microorganism –

• •

• •

deosebesc descendenţii de parental descendenţii între ei.

Stă la baza evoluţiei Se produce prin modificări în genotip, – – –

• • • •

la nivel molecular. Verticale: Mutatie Transferului orizontal al ADN-ului: transformare, transpozitie, transductie, conjugare

STRUCTURA ADN

şi modelul replicării semiconservative (Watson &Crick 1953) • Chimic = acid nucleic – schelet zahăr - fosfat,

• 2 catene polinucleotidice => dublu-helix – 5’ -> 3’ – 3’-> 5’

– baze azotate

• • • •

• purinice adenină, guanină • pirimidinice (timină, citozină ) • legături de H, pe baza complementarităţi: (A=T; C=G).

Perechile de baze succesive => dublu helix ARN Zahar: riboza Uracil <= Timina

STRUCTURA ADN

ADN • Functional (unitati de informatie genetica) – codon (ex. CCA) => gene => loci => Genom • Uman: perechi de baze 3.3 x 109 ~ 21.000 gene • Bacterii ~ – perechi de baze: ½ mil-5 mil – 1000-5000 gene

STRUCTURA ADN - Codul genetic • Ordinea bazelor azotate în molecula de ADN • Codon • secvenţă de 3 baze azotate-nucleotide (ex.CCA), • specifică un anumit amino acid. • 4 nucleotide, (4 3) = 64 codoni, •

– 61 specifică aminoacizi – 3 = codoni stop TAA, TAG Degenerat – Ex. Prolina (Pro) CCA, CCC, CCG, CCT

Exprimare fenotipica a informatiei genetice: • ADN => ARN => AA - proteine

Genotip => Fenotip • Genotip = informatia codificata

stocata in ADN , mostenita, transmisa

descendentilor

– “instructiuni” Limbaj codificat = codul genetic – copiat – diviziune celulara – control • Formare de macromolecule proteice, • Reglarea metabolismului.

• Fenotip = manifestarea fizica a acestei informatii

STRUCTURA ADN • Molecula de ADN – –

continuă din punct de vedere chimic. Segmentată- funcţional = genă. • structurale • reglatoare • secvenţe semnal.

A) Cromozomial - nucleoid B) Extra-cromozomial • • •

Plasmide Bacteriofagi (fagi) Transpozoni

• Repliconi: Nucleoid, plasmide, fagi

A. Plasmide 1. Portiuni mici de ADN dublu catenare, circulare 2. Repliconi (independent de cz) 3. 2 - 30 gene • Plasmide conjugante – F factor – pilul de sex – R factor - multiple drug resistance (MDR plasmid); – Hfr – integrate in cz = recombinare frecventa => prin conjugare => raspandire

• The above is from

http://www.biosci.uga.edu/almanac/bio_103/notes/may_30.html.

structura bacteriofagi

• Structure of phage T4

B. Bacteriofagi • 1. ØXl74 – primul secventializat • 2. litic => bacterioliza – Fara incorporarea ADN-ului exogen

• 3. lizogenic => profag - persistenta – Trigger => bacterioliza

REPLICAREA ADN • diviziunea • etape: iniţiere, alungire, terminare. • despiralizarea moleculei superhelicoidale • • • •

de ADN, • realizată de ADN giraza (topoizomeraza 2). punct de origine - zona „ori” , 1-2 furci de replicare. direcţia 5' - 3'. „ter”, 180°, faţă de punctul „ori”.

• Replicarea ADN cromozomial şi plasmidic: • bidirecţională • semiconservativă • catenă parentală + catenă progenă

REPARAREA LEZIUNILOR ADN

• erori de replicare • ADN polimeraza

– funcţie de corectare şi exonucleazică – verifică complementaritatea bazelor inserate şi îndepărtează bazele incorect inserate

REPARAREA LEZIUNILOR ADN • Există sisteme de reparare: – – – – –

constituitive sau inductibile (SOS) prerepliactive, replicative, postreplicative fidele, infidele (ex.SOS) directe ( act. direct pe leziune), indirecte (prin excizie)

REPARAREA LEZIUNILOR ADN

• • • •

Sistemul S.O.S (save our sequence) codificat de un complex de gene, normal represate. leziuni ADN necorectate => se activează. infidel supravieţuirea bacteriilor modificate morfologic şi funcţional

Sistemul de modificare si restrictie

• 2 enzime complementare – E de moficare => metilarea nucleotidelor – Endonucleaze de restrictie: taie materialul nerecunoscut

• Prezervarea ADN-ului original • Folosite in ingineria genetica

• Gena insulinei umaneHuman insulin gene • Gena hormonului de crestere • Prepararea antigenelor

Sistemul de modificare si restrictie

Metilarea Marcarea catenei parentale Gruparile metil adougate dupa replicare

 Endonucleazele de restrictie Taie ADN-ul in fragmente Actiune site-specifica fiecarei endonucleaze in parte

Molecule santinela => distrug ADN (ex. Viral) ADN-ul metilat este rezistent la restrictie

TRANSCRIEREA INFORMAŢIEI GENETICE

• gene structurale => mARN • tradusă => lanţ polipeptidic – aproape concomitent – la nivelul ribozomilor

• Etape:

– iniţierea, – alungirea mARN-ului – terminarea transcrierii.

TRANSCRIEREA INFORMAŢIEI GENETICE • Etape: – iniţierea, – alungirea mARN-ului – terminarea transcrierii.

• Iniţierea transcrierii:

– ARN polimeraza, – recunoaşterea promoterului: ataşează, despiralizează ADN. • Alungirea m ARN-ului: • copiată o singură catenă a ADN-ului: catena pozitivă sau catena sens

TRADUCEREA INFORMAŢIEI GENETICE = sinteza proteinelor, la nivelul ribozomilor. • Etape: – Iniţierea – Alungirea – Terminarea

TRADUCEREA INFORMAŢIEI GENETICE • operonul = unitatea de transcriere a informaţiei genetice Structura operonului • gene structurale • alăturate, • codifică protein - enzime, implicate în aceaşi cale metabolică. • secvenţe semnal: – promoter, operator, activator;

•

• Promoterul-dispus înaintea genelor structurale • secvenţa semnal de care se prinde ARN polimeraza. gena reglatoare:

– la distanţă faţă de genele structurale – nu face parte din operon, dar codifică proteina reglatoare

TRADUCEREA INFORMAŢIEI GENETICE • operoni

– constitutivi – inductibili: operonii catabolici, pentru enzimele căilor degradative, – represibili: operonii anabolici, pentru enzimele căilor anabolice

• Reglaţi prin mecanisme de control pozitiv şi negativ. • Biosinteza protein - enzimelor la bacterii este reglată prin: – inducţie, – represie.

Operon model Francois Jacob and Jacques Monod

•

Structure of a typical operon. Image from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH Freeman (www.whfreeman.com)

Operonul lactozei • Gene structurale – β-Galactozidaza ( Gal => Glu + Lac – β-Galactozid permeaza (transport activ Lac) – β-Galactozid transacetilaza

Operonul lactozei • Gena reglatoare => proteina reglatoare • Allosterica • Locus activ

– recunoaste secvente semnal – Interactioneaza cu ADN

• Locus efector - leaga efectori (zaharuri, aa) ⇒modificare allosterica ⇒Modificarea afinitatii pentru operator ⇒ Se prinde pe ADN ⇒ Se desprinde de pe ADN

⇒ codifica proteina represoare

Operonul lactozei (catabolic, inductibil). Gene exprimate doar in prezenta lactozei (inductor)

• Represor: legat de operator ( regiune adiacenta genelor structurale) ⇒Nu se realizeaza transcrierea - control negativ

• Inductor = Lac: se leaga de repressor => “il tine ocupat” • Are loc transcrierea ⇒inductie prin control negativ (inductibil)

Operonul lactozei

Operonul lactozei • Control pozitiv prin proteina CAP – Dependenta de cAMP – fenomenul de diauxie Monod • Glu – represie catabolica operon Lac – http://www.youtube.com/watch?v=T9Wszg7F hxE

Operoni Biosintetici (represibili) Operonul Triptofanului • Gene structurale: 5 => 3 enzime • Secvente semnal – promoter – operator

• Gena reglatoare => represor • Control – Negativ – Atenuare

Operonul Triptofanului • Control negativ – Nu Trp • => represorul nu represeaza operatorul • => operatorul transcrie genele structurale • => se sintetizeaza Trp – Trp in mediu = co-repressor • Trp legat de represor => modificare conformatie • Se leaga de operator • Impiedica functionarea ARN polimerazei => stop sinteza

Operonul Triptofanului • Control prin atenuare = atenuarea

transcrierii in functie de cantitatea de Trp din mediu • <iframe width="420" height="315" src="http://www.youtube.com/embed/SiO AQ-VjQQY" frameborder="0" allowfullscreen>

GENETICĂ BACTERIANĂ II

Dr. Carmen Costache

Planul capitolului • Ereditatea = Metabolismul ADN-ului bacterian • Variabilitatea – Mutaţia – Transfer de material genetic

• Rolul materialulul genetic extracromozomial

Planul cursului VARIABILITATEA

Mutatia • Definitie, • Proprietati • Mecanism molecular • Tipuri de mutatii • Tipuri de mutante • Soarta mutantelor in natura

Variabilitatea • = modificare caractere fenotipice microorganisme

– deosebesc • descendenţii de parental • descendenţii între ei. – stă la baza evoluţiei – se produce prin modificări în genotip, la nivel molecular.

MUTAŢIA – definitie

• Modificare a unui caracter fenotipic

– modificări în secvenţa de nucleotide • cromozomul bacterian, • plasmide. – spontană – bruscă – transmisibilă la descendenţi

• Rezultatul: Mutant

(fenotip diferit de parentali ) =>multiplicare => clone mutante

MUTAŢIA – proprietati • Rata mutaţiei: o celulă din 1 milion - 10 milioane

•

– Constanta: specie, caracter – Probabilitatea 2 mutaţii concomitente: 10-12 pana la 10-14, • imposibil - ordinul de multiplicare a bacteriilor este de 109. Frecventa – Proportia de mutantii din populatie – F (rata, viteza mx, etapa multiplicarii)

Rata mutatiei – Frecventa mutatiei

Momentul e important !

Momentul este important ! • perioada logaritmica – Numar mare de descendenti ai celulei mutante

• in perioada stationara

– Numarul descendentilor mutanti mai mic – DAR rata mutatiei este crescuta. – Sistem SOS • Proteine de supravietuire (defecte) • Predispune la mutatii pentru diverse caractere

Caracterul spontan al mutatiei • Nu se datoreşte factorilor de mediu, • DAR mediu = rol de selectare

• Testul insamantarii replicative (Lederberg) • S- streptomicina => R- streptomicina

• Testul fluctuatiei (Luria Delbruck) • S- bacteriofag => R-bacteriofag

Testul insamantarii replicative (Lederberg)

Testul fluctuatiei (Luria Delbruck) • •

A) Daca mutatia ar aparea sub influenta factorilor de mediu, in fiecare placa ar fi aproximativ acelasi numar de celule mutante. B) Daca mutatia ar aparea spontan in timpul diviziunii celulare anterioare insamintarii pe placa, numarul de clone mutante va fi foarte variabil intre placi.

Tipuri de mutatii • Criterii de clasificare – Modificarile la nivelul genotipului – mecanismele moleculare ale mutatiei – Efectul asupra secventei de nucleotide – Efectul asupra polipeptidului codificat – Efectul asupra fenotipului

Tipuri de mutatii Mecanismele moleculare ale mutatiei

• Substitutii de baze azotate;

– O pereche de baze azotate (bp) substituita de alta A=T cu C=G

• Deletii de baze azotate • Aditii de baze azotate • Inversii de baze azotate

– Cel putin 2 bp isi schimba pozitia cu 180°.

• Cauza:

– defecte de replicare, – reparatii insuficiente/incorecte

Tipuri de mutatii Mecanismele moleculare ale mutatiei Substitutia • tranzitie,

– purinica  purinica – Pirimidinica  pirimidinica

• transversion

– purinica  pirimidinica

• Datorata

– tautomerismului

• corect : A-T, G-C • gresit :T-G or A-C

– replicare eronata ADN

Tipuri de mutatii Mecanismele moleculare ale mutatiei - amplitudine • punctiforme, • extinse • Punctiforme predominant – – – –

Substitutie micro-deletii micro-aditii Afectata o pb,

– – – –

macroaditie, macrodeletie inversie Mai multe pb.

• Exinse,

TIPURI DE MUTAŢII

Efectul asupra polipeptidului codificat • Mutaţii tăcute

=> codoni cu acelaşi sens => neexprimată fenotipic.

• Mutaţii sens schimbat

=> alţi codoni => alţi aminoacizi.

– Consecinţa diferită, după localizarea aminoacidului în structura proteinei.

• Mutatii cadru “frameshift” • Mutaţii non sens => codoni stop. – pot fi letale pentru bacterie.

TIPURI DE MUTAŢII

Efectul asupra polipeptidului codificat Mutatii cadru “frameshift

• initial : AUG–UUU–CAU–AGU–GGU – – – – –

AUG → N Formil Metionine UUU → Fenil Alanine CAU → Histidine Microdeletie: C AGU → Serine GGU → Glycine

• modificata: AUG–UUU–AUA–GUG–GUG; – – – –

AUG → N Formyl Methionine UUU → Phenyl Alanine AUA → Isoleucine GUG → Valine

TIPURI DE MUTAŢII

Efectul asupra fenotipului • Comparând fenotipul mutantului cu cel al bacteriei parentale:

• 1. Mutaţii înainte: dobândesc proprietăţi noi faţă de parental

• 2. Mutaţii înapoi

– Revers mutaţie: revenirea la fenotipul bacteriei sălbatice-rar – Supresoare (intragenica, intergenica)

• 3. Mutaţiile condiţionat letale - dirijate (ex. mutaţii termo - sensibile).

TIPURI DE MUTANTE • • • • • • • • • •

Mutante morfologice Mutante de cultură Mutante metabolice Mutante antigenice Mutante de patogenitate: Mutante de rezistenţă la antibiotice Mutante de rezistenţă la bacteriofagi litici Mutante duble: • bacterii acapsulate devin nepatogene Mutante tăcute (silenţioase) Mutante condiţionat letale:

TIPURI DE MUTANTE • Mutante de patogenitate: – patogenitate crescută, care se răspândesc în populaţie – patogenitate scăzută, folosite la prepararea vaccinurilor.

TIPURI DE MUTANTE • Mutante condiţionat letale:

– ex. mutantele termo-sensibile, ale virusurilor gripale, folosite pentru prepararea vaccinului antigripal – – Proteina - AA schimbat • functioneaza normal la 32°C dar nu la 37°C (alterarea configuratiei la T crescuta).

• vaccin experimental

– 37°C => cannot infect the lungs and cause pneumonia, but – 32°C (nose) replicate and induce immunity

TIPURI DE MUTANTE • Mutante de rezistenţă la antibiotice prin modificarea :

– proteinei de transport a antibioticului în bacterie, – a ţintei de acţiune; – a afinităţii enzimei de inactivare a AB: • ex. modificarea β lactamazelor (penicilinaze, cefalosporinaze), care inactivează β lactaminele conduce la dobândirea rezistenţei bacteriilor la β lactamine (peniciline, cefalosporine); – modificări cantitative: ex. β lactamazele devin din inductibile, constitutive.

TIPURI DE MUTANTE Mutante de rezistenţă la antibiotice

TIPURI DE MUTANTE Mutante de rezistenţă la antibiotice

Soarta mutantelor in natura • tulpină, clonă nouă – eliminată – se multiplică paralel cu tulpina parentală – se multiplică excesiv faţă de tulpina parentală • (condiţii de mediu favorabile clonei modificate şi nefavorabile tulpinii parentale (ex. mediu cu antibiotic).

GENETICĂ BACTERIANĂ III

Dr. Carmen Costache

Planul capitolului  Ereditatea = Metabolismul ADN-ului bacterian

• Variabilitatea √ Mutaţia

– Transfer de material genetic • Conjugare • Transformare • Transductie • Transpozitie (TGE)

• Rolul materialulul genetic extracromozomial

Planul cursului • Conjugare

• Plasmide

• Transformarea • ADN liber

• Transductie

• Bacteriofagi

• Transpozitie

• Transpozoni = elemente genetice mobile (TGE)

CONJUGAREA BACTERIANA

• = transfer de material genetic (plasmidic,

•

cromozomial) între bacterii donatoare (D) şi receptoare (R) prin: – pili de sex G(-) – feromoni G(+) Plasmide – minicromozomi

Plasmide • Gene de control a replicării proprii • Gene de interacţiune cu alte molecule de ADN

– plasmide episomale: capabile să existe autonom şi/sau integrat. – recombinare situs specifică

• Sistem genetic de fertilitate sau de transfer – plasmide conjugante: au operonul “Tra” – plasmide neconjugante nu au operon “Tra”

• Gene pentru proprietăţi fenotipice bacteriene: gene structurale

– rezistenţă la antibiotice, la săruri de metale grele (plumb, mercur, argint, arsen), la detergenţi, radiaţii, bacteriofagi, colicine – structuri bacteriene: ex. pili la tulpini enteropatogene – proprietäţi metabolice – codificä factorii de patogenitate

• invazivitate • toxine bacteriene ex.

Plasmide • criptice,

– nu codifică caracter bacterian, – intervin în transfer de material genetic

• Importante: plasmidele F, R, col. • Plasmidele F

– Episomale, criptice – Recombinare omoloaga – se poate integra în cromozomul bacterian –rar • o bacterie din 105 bacterii F+. • Rezultă o bacterie Hfr

CONJUGAREA BACTERIANA

• Plasmidele R (de rezistenţă la AB)

• •

– se transmit epidemic în populaţiile bacteriene. – pe verticală – pe orizontală - conjugare bacteriană, între specii / genuri diferite: – ex. de la bacil coli la bacil dizenteric Conjugarea R+-R– mecanismul primordial de dobândire a rezistenţei faţă de antibiotice, la Gram negative – rezistenţa în bloc faţă de antibiotice – Bacteriile multiplu rezistente la antibiotice se selectează - mediul spitalicesc

Plasmide • Plasmidele „col” – gene pentru sinteza de colicine - bacteriocine

• Bacteriocinele

– proteine de tip antibiotic – B.producătoare sunt imune – menţinerea microbiocenozelor normale ale organismului

Conjugarea la bacteriile Gram pozitive

• feromoni de sex – produsi de bacterii receptoare – Structura chimica - peptidică – Efect afrodisiac

• proteine de ataşare

– Produsi de bacteriile donatoare

Transformarea • transfer de ADN liber – de la o bacterie donatoare (D)- exogenot – la o bacterie receptoare (R) - endogenot

• natural

– autoliza bacteriilor

• artificial

– extracţie chimică

• fenomen rar întâlnit în natură

Transformarea

Griffith - 1928 virulenţa pneumococilor

Transformarea • Proteinele „rec. A”

• găsirea zonei de omologie între exo şi endogenot, • ruperea în anumite poziţii şi • reunirea catenelor,

• Consecinţă: integrarea

• endogenotul primeşte de la exogenot genă activă pentru capsulă

• bacterii Gram pozitive si negative • fungi

Transformarea • starea de competenţă – acceptă fragmentul de ADN, – Tranzitorie – 5-15 minute

• proteinä de competenţă

– alterezä suprafaţa bacteriei receptoare

Etapele transformării • Absorbţia

– fragmentului de ADN pe suprafaţa celulei receptoare

• Penetrarea

– ADN-ului în bacteria receptoare

• Eclipsă

– Taiere, unire ADn exogenot-endogenot

• Mecanism

– recombinare omoloaga, – doar între celule ale aceleaşi specii sau specii strâns înrudite

Rolul natural al transformării • m odificarea structurii antigenice a

pililor gonococilor şi evoluţia cronică a gonoreei (uretrita gonococicä)

TRANSDUCTIA

BACTERIOFAGI • entităţi infecţioase acelulare • Virusuri ale bacteriilor.

• Structura:

• o moleculă de acid nucleic, • protejată de proteine - capsida.

• multiplicare => doar prin

utilizarea maşinăriei de sinteză a celulei parazitate (bacteria)

Bacteriofagi Formă : • lineari - cilindrică • filamentoşi • icosaedrici • Bacteriofagii cu cap şi coadă ROL: • Transducţia

• transfer de material genetic prin bacteriofagi

• Conversia lizogenă

• conferirea unor proprietăţi bacteriene

TRANSDUCTIA • generalizată : – orice fragment al cromozomului bacterian.

• prin bacteriofagi litici • recombinare omoloagă

• localizată (specifică): • doar anumite gene, •

alăturate bf. în cz. bacterian. prin bf. temperaţi:

– ex. bacteriofagul λ al E. coli

• recombinare situs specifică • Profag – Excizia incompletă => – genom fagic defectiv

TRANSDUCŢIA

Conversia lizogena • • • •

proprietăţi fenotipice prin bacteriofag temperat transmisibilă la descendenţi Factorii de patogenitate - tox ine bacteriene :

• toxina difterică - bacteriofagul β tox, la bacilul difteric • eritrotoxina - toxina scarlatinoasă, la streptococul β hemolitic • fibrinolizina stafilococică • toxina Shiga-like, la bacilul coli (asemănătoare toxinei bacilului difteric shiga)

Recombinarea • Omoloaga • Situs specifica • Situs nespecifica (ilegitima)

Recombinarea - In timpul trasnferului de material genetic

Recombinarea • Omoloaga: noul ADN inlocuieste ADN-ul existent

– Depinde de proteina “rec A” – Intre secvente identice sau foarte asemanatoare de ADN Mecanismul molecular: - Taiere - Replicare segmentara a ADN-ului - Unirea catenelor noi de cele vechi - Rezolvarea: reunirea capetelor prin ligaze Efect: detectabil / nedetectabil

Recombinare omoloaga • apare in transformare – Ex. Variatia antigenica pili – gonococci

• integrarea plasmidelor F în cromozomul bacterian - conjugare • cointegrarea plamidelor

Recombinarea- Situs specifica • Intre molecule

– diferite de ADN – care au in comun o secventa de 10-20 nucleotide • Ex cz + plasmida ; cz + fag

• Rezultatul:

– Secvente repetitive directe (repetitii directe), – Secvente repetitive inversate (repetari inversate) => inversie

• Inversia => modificarea antigenului H la enterici (variatia de faza)

• Transpoziţia

– altă consecinţă a recombinării situs specifice

Recombinarea • Situs nespecifica (nelegitima) • Insertii / deletii – ambele • Pl + cz; Bf + cz

TRANSPOZIŢIA (Vezi curs TGE)

ROLUL MATERIALULUL GENETIC EXTRACROMOZOMIAL

• variabilitate a caracterelor bacteriene, • proprietăţi noi,

• patogenitatea bacteriană, • modificarea structurii antigenice, • dobândirea unor proprietăţi metabolice, • rezistenţa la antibiotice/alţi factori antibacterieni

PATOGENITATE BACTERIANĂ A. Toxine bacteriene • 1. Codificate de bacteriofagii tem peraţi : – – – – –

toxina difterică codificată de bacteriofagul β tox, la bacilul difteric eritrotoxina - toxina scarlatinoasă, la streptococul β hemolitic fibrinolizina stafilococică enterotoxina stafilococică toxina Shiga-like, la bacilul coli

• 2. Codificate de plasm ide : – – – – –

toxina exfoliativă a stafilococilor toxina bacilului cărbunos toxina bacilului tetanic hemolizina bacilului coli enterotoxina tulpinilor enterotoxigene de E. coli

PATOGENITATE BACTERIANĂ B. Adezine bacteriene - plasm ide , • proprietatea de aderare specifică de epitelii, mucoase, prin pili de aderare,

– tulpinile enteropatogene ale bacilului coli, care aderä prin pili de mucoasa duodenojejunală, – tulpinile uropatogene ale bacilului coli, care aderă de mucoasa urinară.

C. Invazivitate bacteriană- plasm ide, • capacitatea de invazie şi de colonizare a epiteliilor:

– ex. invazia epiteliului colic de către bacilul dizenteric – tulpini enteroinvazive de E. coli (EIEC).

REZISTENŢA LA ACŢIUNEA UNOR FACTORI DE MEDIU

• Plasm idele capacitatea de rezistenţă în diverse condiţii •

de mediu: a) Rezistenţă la antibiotice

– există peste 60 plasmide cu gene de rezistenţă la β lactamine;

• b) Rezistenţă la săruri de metale grele

– (Plumb, mercur, argint, arsen), utilizate ca antiseptice, rezultând bacterii rezistente la antiseptice;

• c) Rezistenţa la detergenţi; la radiaţii; la bacteriofagi; la colicine

TRANSPOZITIA ELEMENTE GENETICE MOBILE

JUMPING GENES TRANSPOSABLE GENETIC ELEMENTS (TGE) Dr. Carmen Costache

Planul cursului • TGE – Definitie • TGE – clasificare • Transpozitia

– Definitie – Nespecifica/Situs-specifica

• Transpozoni

– Clasificare, exemple

• Integroni • Retroni • Rolul materialului extracromozomial

TGE • Segmente mobile de ADN • Responsabile de •

transpozitie Dependente de un replicon – Lipsite de fgm“ori”

• La capete au – ITR (inverted terminal repeats) – Structura de atasare • 5-9 bp

TGE - clasificare • 1) Transpozoni (Tn) • 2) Integroni – Zone de ADN care primesc fgm de ADN, gene

• 3) Retropozoni (retroni) – – – –

Fragmente mobilizabile de ADN Transcrise prin ARN Au ADN reverse transcriptaza. ARN-ADN hibrid

reverse transcriptase

Transpozitia

• Mutarea TGE – Pe aceasi molecula ADN • in pozitii diferite – Intre molecule de ADN diferite • Cromozom bacterian  plasmida • Cromozom bacterian  bacteriofag

Transpozitie Nespecifica / Site specifica ilegitima / legitima • ITR scurte • ITR lungi • Zona tinta de atasare: • Zona tinta de atasare: •

oriunde Transpozon inserat in zone diferite ale moleculei de ADN.

• •

specifica transpozon inserat doar in zone specifice ale moleculei de ADN, Recombinare situs specifica.

Transpozoni (Tn):

3 clase

• Clasa I : “Cut & Paste” (nereplicativa) – Tn Simpli = Secvente de insertie -IS – Tn compusi

• Clasa II : “Copy & Paste” (replicativa)

•

– Gena transpozaza – cointegrat-rezolvaza – 2 IS – Gene de rezistenta antibiotice Clasa III : “Copy & Paste”(replicativa) – Bacteriofagii mutatori

Clasa I : Secvente de insertie -IS • 800-1400 bp • IS = ITR + gena transpozaza + ITR

•

– Secvente de nucleotide identice sau f.asemanatoare – Implicate in integrarea in ADN receptor. Efect: mutatie

Clasa I: Transpozoni Compusi Domenii: • 1 – la fiecare capat ITR • 2 – gena transpozaza • 3 – gene structurale – Rezistenta la antibiotice "r" • Kanamicinä, Cloramfenicol, β Lactamine, Sulfamide – Factori de patogenitate • e.g.: toxine - enterotoxină

Exemple de Transpozoni de rezistenta la antibiotice

• • • •

Kanamicina = K Tn Chlormafenicol = Tn 9 β-lactamine: Amp transposon: AmpR Tetraciclina: Tc transposon: TcR

Transpozoni Clasa II • Copy & Paste = transpozitie replicativa

• E: cointegrat-rezolvaza • fuziunea a 2 plasmide, una dintre • • •

acestea deţinănd un transpozon Replicare 2 plasmide separate Fiecare are transpozon – Cu gene de rezistenta

• Plasmidele R = colectie de Tn cu gene “r”

Transpozoni Clasa III = bacteriofag mutator (Mu)

• Capacitate mare de transpozitie replicativa. • ~ 100 copii • => mutatii cu frecventa ridicata – Inactivarea genei – Activarea genei alaturate – Deletii – Insertii

Integroni • Secventa de ADN stabila – Pe plasmide – Pe cromozom

achizitioneaza Tn (gene “r”)



  

Integreaza in casete gene de rezistenta pentru diferite tipuri de antibiotice Prin recombinare site-specifica 3 tipuri de integraze Casetele de gene cu gene de R la AB exista autonom in citoplasma.

• Casetele de gene => – Mecanism pentru Rezistenta multipla la antibiotice,

Mechanisms of antibiotic resistance

Retronii (retropozoni) • • • •

secvente de ADN care codifica o revers transcriptaza HIV = structura de retropozon (si alte retrovirusuri) Asociate frecvent cu ADN profag Exista la multe bacterii

Efectele revers transcriptiei • Introducerea unui ADN “modificat” • Defecte punctiforme dar potential • • •

semnificative Responsabile pentru schimbari importante in genomul prokariot Generarea multor copii de secvente de ADN modificat Cresc frecventa mutatiilor spontane

HIV si alte retrovirusuri • Au structura de retroni. • RT = revers transcriptaza • LTR = long terminal repeats (repetari terminale lungi)

ROLUL MATERIALULUL GENETIC EXTRACROMOZOMIAL

• variabilitatea caracterelor bacteriene, • proprietăţi noi:

• patogenitatea bacteriană, • modificarea structurii antigenice, • dobândirea unor proprietăţi metabolice, • rezistenţa la antibiotice/alţi factori antibacterieni

PATOGENITATE BACTERIANĂ A. Toxine bacteriene • 1. Codificate de bacteriofagii tem peraţi : – – – – –

toxina difterică codificată de bacteriofagul β tox, la bacilul difteric eritrotoxina - toxina scarlatinoasă, la streptococul β hemolitic fibrinolizina stafilococică enterotoxina stafilococică toxina Shiga-like, la bacilul coli

• 2. Codificate de plasm ide : – – – – –

toxina exfoliativă a stafilococilor toxina bacilului cărbunos toxina bacilului tetanic hemolizina bacilului coli enterotoxina tulpinilor enterotoxigene de E. coli

PATOGENITATE BACTERIANĂ B. Adezine bacteriene - plasm ide ,

• aderare specifică de epitelii, mucoase, prin pili de aderare: – tulpinile enteropatogene ale bacilului coli

• aderä prin pili de mucoasa duodenojejunală,

– tulpinile uropatogene ale bacilului coli,

• aderă de mucoasa urinară.

C. Invazivitate bacteriană - plasm ide, • capacitatea de invazie şi de colonizare a epiteliilor:

– ex. invazia epiteliului colic de către bacilul dizenteric – tulpini enteroinvazive de E. coli (EIEC).

REZISTENŢA LA ACŢIUNEA UNOR FACTORI DE MEDIU

Plasm idele capacitatea de rezistenţă în diverse condiţii de

•

mediu: Rezistenţă la antibiotice

– există peste 60 plasmide cu gene de rezistenţă la β lactamine;

• Rezistenţă la săruri de metale grele

– Plumb, mercur, argint, arsen - utilizate ca antiseptice,

• Rezistenţa la detergenţi; la radiaţii; la bacteriofagi; la colicine

Patogenitate bacteriană Dr. Carmen Costache

Patogenitate bacteriană Planul cursului • Patogenitate – definitie, proprietati • Virulenţa – DL 100%, DL 50% • Relaţia microorganism – organismul uman – Flora normală (microbiocenoza) – Clasificarea patogenetica a microorganismelor

• • • •

Postulatele lui Koch/Postulate moleculare Microorganismele şi patogeneza Evitarea mecanismelor de apărare a gazdei Producerea infecţiei – Exotoxine – Endotoxine

PATOGENITATE BACTERIANĂ = capacitatea unui microorganism de a produce o boală infecţioasă. • Relatia: gen sau specie microbiană  specie animală • o specie bacteriană → îmbolnăvire la o anumită specie • Clasificare/nomenclatura – infecţii la animale - zoonoze; – infecţii umane - antroponoze • ex. gonoree, sifilis, febra tifoidă

– infecţii la animale transmisibile la om - antropozoonoze • ex. leptospiroze, bruceloză.

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Virulenţa

• apreciere cantitativă a patogenităţii • determinată în condiţii de laborator • efectul microorganismului sau a unui produs al acestuia – în vivo, pe animale de laborator sau – în vitro, pe culturi de celule.

• Se determină cantitatea cea mai mică de microorganism sau produs, care produce îmbolnăvire sau moarte pe sistemul de testare biologic. • Doza letală (DL) 100% = cantitatea cea mai mică de microorganisme, sau de produs bacterian, capabilă să cauzeze moartea tuturor animalelor inoculate.

• în practică: DL 50% (diferenţe mari legate de nivelul rezistenţei naturale a animalelor inoculate).

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Virulenţa

• Pasteur: posibilitatea de atenuare a virulenţei (Pasteurrella - bacilii holerei găinilor) – ulterior atenuarea virulenţei bacilului cărbunos => vaccinul anticărbunos. În cadrul unei specii bacteriene există: • tulpini cu virulenţa crescută: produc boli cu evoluţie clinică gravă; • tulpini cu virulenţa diminuată: produc forme uşoare de boală; • tulpini cu virulenţa atenuată: sunt utilizate în prepararea de vaccinuri.

PATOGENITATE BACTERIANĂ Microorganismele patogene produc boală când pătrund în organismul uman (pathos = boală; gennan = a produce). Prezenţa /creşterea microorganismelor NU determină întotdeauna boală !!!!

Relaţia microorganism – organismul uman Parazitism

•

obligatoriu

–

•

intracelular (ex. Chlamydia)

facultativ

–

•

in interiorul celulei, în afara celulei/ medii de cultură

ex. Staphylococcus, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella

•

Comensalism: flora normală (microbiocenoza) •

Origine:

– – –

mamă personal medical/mediu spitalicesc mediu înconjurător

Flora normală (microbiocenoza) • Microorganisme comensale = microorganisme care fac parte din flora normală • microorganisme rezidente • microorganisme tranzitorii

• Microbiocenoza = asociaţie bacterii/levuri – echilibru – Site-uri (habitate)

• cavitatea orală & tractul respirator superior (Nazofaringe) • intestin • piele • vagin • uretra

PATOGENITATE BACTERIANĂ Speciile microbiene patogene pot fi: 1. bacterii cu patogenitate certă (patogeni primari): – produc întotdeauna boală la pătrunderea în organismul uman. • • • •

Salmonella tiphy - febra tifoida; Yersinia pestis (pesta, ciuma); Shigella spp. (dizenteria bacilară) Treponema pallidum (sifilis);

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Speciile microbiene patogene pot fi:

• 2. Conditionat patogeni

– Produc imbolnaviri doar in anumite circumstanţe – uneori membri ai florei normale • Staphylococcus, • Candida spp.

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Bacterii condiţionat patogene –

Conditionarea/Oportunitatea: • • •

–

–

Bacterie: achiziţia de material genetic, care codifică factori de

patogenitate. • E.coli - tulpini enterotoxigene (ETEC), • tulpini enteroinvazive (EIEC);

Gazdă: •

–

bacterie, organismul uman, condiţiile de întâlnire dintre bacterie şi organismul uman.

leziuni preexistente: ex. persoane cu leziuni valvulare, la care Streptococi viridans pot ajunge în sânge (ex. după extracţii dentare) şi pot produce endocardită.

Circumstanţe de întâlnire bacterie- gazdă: • •

cantitatea mare de bacterii, bacteriile comensale ajung în alt situs decât habitatul lor natural, prin manopere medicale

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Speciile microbiene patogene pot fi:

3. Microorganisme oportuniste: – la persoanele imunocompetente => infecţii asimptomatice sau cu evoluţie clinică uşoară – la imunodeprimaţi => infecţii grave, uneori letale.

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Bacterii saprofite • trăiesc în natură • ciclul natural al substanţelor • Descompunerea organismelor moarte – componente organice => substanţe chimice anorganice

PATOGENITATE BACTERIANĂ

Postulatele lui Koch

• 1. 2. 3.

4.

Un microorganism = agent etiologic dacă respectă postulatele lui Koch. Agentul etiologic al unei boli infecţioase trebuie să fie prezent în toate cazurile de boală. Agentul etiologic trebuie să poată fi izolat pe medii de cultură Agentul etiologic izolat şi menţinut în laborator în cultură pură trebuie să reproducă infecţia prin inocularea la animale de experienţă, de la care trebuie să fie reizolat pe mediu de cultură. Trecerea printr-o infecţie trebuie să conducă în organismul bolnav la instalarea unei imunităţi specifice faţă de agentul etiologic respectiv.

Postulate moleculare • Descriu factorii de virulenţă 1. Genele de virulenţă sau produşii acestora trebuie să fie prezenţi 2. Prezenţa genelor de virulenţă transformă un non-patogen într-un patogen 3. Genele de virulenţă trebuie să fie exprimate în timpul infecţiei 4. Anticorpii împotriva produşilor genelor de virulenţă sunt protectori.

Stagiile unei boli infecţioase

• Transmiterea: • Doza infectantă 10-106 organisme

• Perioada de incubaţie : variabilă • Perioada de stare • Convalescenţa: – vindecare – latenţă

Microorganismele şi patogeneza

Microorganismele şi patogeneza 1. Modalitatea de transmitere: – – – –

fecal-orală (holera) interumană (tuberculoza) de la animale (rabia) cu ajutorul unor vectori • Insecte artropode (pureci capuse) – ciuma, – boala Lyme

Microorganismele şi patogeneza Clinic= Perioada de incubatie 2. Aderenţa – Previne îndepărtarea rapidă – Frecvent aderă cu ajutorul pililor – Specificitate • Receptor prezent => infecţie • NU receptor => NU infecţie

Microorganismele şi patogeneza

Clinic = Perioada de incubatie 3. Colonizarea: multiplicarea şi continuarea infecţiei

– Competiţia cu flora normală – Factori de rezistenţă împotriva colonizării: • • • • •

bila pH-ul acid din stomac peristaltismul intestinal cilii tractului respirator IgA (anticorpi de la nivelul mucoaselor)

Microorganismele şi patogeneza Clinic: Perioada de stare 4. Afectarea gazdei • Invazivitate • Toxicitate

Interacţiunea bacteriilor cu mucoasele. (a) Asociere. (b) Adeziune. (c) Invazia.

Invazia = ruperea barierelor anatomice 1. Piele:  răni  insecte, vectori 2. Traversând mucoasele (ex. epiteliul celular intestinal)

Evitarea mecanismelor de apărare a gazdei

• 1. Ascunderea în celulele gazdei – intracelular: evitarea expunerii la anticorpi

• 2. Evitarea distrugerii de către complement

3. Evitare fagocitozei

Evitarea anticorpilor • 1.Variaţia antigenică • noi pili

• 2.IgA proteaze • Neisseria gonorrheae

• 3. Asemanatoare cu Ag proprii • capsula Streptococcus pyogenes = acid hialuronic, secretat şi de ţesuturile gazdei

Afectarea gazdei (producerea infecţiei)

• 1. Exotoxine – necesită colonizare anterioară (holera) – toxiinfecţii alimentare chiar şi în absenţa bacteriilor • Botulism • toxina Staphylococcus aureus

– Sunt ţinte pentru anticorpii neutralizanţi • Vaccin

Afectarea gazdei (producerea infecţiei)

• 2. Toxine care afectează membranele Hemolizine • Determină liză celulară: Streptolizina O Fosfolipaze • clivează lipidele membranare: Clostridium perfringens – gangrena gazoasă

• 3. Superantigene

Superantigene • Hiperstimulează sistemul imun

– Se leagă direct de antigenele de clasă II MHC – Activează limfocitele T

• Eliberează cantităţi importante de interleukine (1,2) – Determină şoc => Simptome de şoc toxic • febră, greaţă, diaree, vărsături • Insuficienţă de organe, colaps circulator – Cauză de sindrom şoc toxic (TSST) • Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Afectarea gazdei (producerea infecţiei)

• 4. Endotoxine • parte structurala a celulei bacteriane - LPS – doar la bacteriile Gram negative

ENDOTOXINE • • • • • • • •

În peretele celular al G(-) LPZ – Lipid A Cromozom Toxicitate scazută (MLD~100 μ) febră, şoc NU vaccin Stabile la 100°C pentru 1 h Sepsis

EXOTOXINE Secretate de unele G(+) şi G(-) Polipeptide Plasmide/bacteriofagi Toxicitate înaltă (MLD~ 1 μg) Efecte variate Anticorpi = antitoxine anatoxine => vaccin Distruse la 60°C (excepţie enterotoxina stafilococică) • Tetanos, botulism, difteria, etc.

• • • • • • • •

ENDOTOXINE • Mecanismul de acţiune - nespecific – acţionează identic

• activare a diverselor celule (monocitelor, macrofagelor, limfocitelor, plachetelor sanguine şi celulelor endoteliale) • stimulează producerea citokinelor proinflamatorii – febră, prin acţiunea pirogenului endogen ( IL1) – modificări vasculare: vasodilataţie, creştera permeabilităţii vasculare – în doze mari, endotoxina determină şoc toxic,

coagulare intravasculară diseminată, semne de suferinţă organică

•

Potential: în orice infecţie cu bacterii Gram negative

ENDOTOXINE

PATOGENITATE BACTERIANĂ A. Toxine bacteriene • 1. Toxine bacteriene codificate de bacteriofagii temperaţi: – – – – – –

toxina difterică codificată de bacteriofagul β tox, la bacilul difteric eritrotoxina - toxina scarlatinoasă, la streptococul β hemolitic fibrinolizina stafilococică enterotoxina stafilococică toxine, la bacterii din genul Clostridium toxina Shiga-like, la bacilul coli (asemănătoare toxinei b. dizenteric Shiga)

• 2. Toxine bacteriene codificate de plasmide: – – – – –

toxina exfoliativă a stafilococilor toxina bacilului cărbunos toxina bacilului tetanic hemolizina bacilului coli enterotoxina tulpinilor enterotoxigene de E. coli

Exotoxine • Toxin difterică <= Corynebacterium diphteriae • bacteriofag temperat • subunităţi A-B » B – legare » A - enzimă

• Acţiune: inhibă sinteza proteinelor • ADP- ribozilarea factorului de elongare • EF-2 bacteria≠ EF-2 uman (diphthamide)

Acţiune: Pseudomonas, E.coli, Vibrio cholerae, Bordetella pertussis

Exotoxine • Toxina tetanică <= Clostridium tetani • Neurotoxină (tetanospasmina) • Codată plasmidic

• Acţiune: previne eliberarea neurotransmiţătorului inhibitor glicina => spasm • răspândire: axon / sânge • Măduva spinării

Exotoxine • toxina botulinică <= Clostridium botulinum • Neurotoxină • Bacteriofag

• Acţiune: blocheză eliberarea acetilcolinei la nivelul sinapselor => paralizie • Cel mai toxic compus cunoscut • 2 subunităţi: legare – acţiune

Clostridium botulinum

Exotoxine Bacillus anthracis => 3 exotoxine • factorul edem = adenilat ciclază (AC) • factorul letal ???? • antigen protector

Streptococcus pyogenes • toxina eritrogenică • Responsibilă de erupţia din scarlatină

• Bacteriofag

Exotoxine E.coli enterotoxina termo-labilă • Codată plasmidic • activitate de adenilat-ciclază => creşte cAMP => – inhibarea absorbţiei Na – Pierderea de electroliţi (Cl) – Diaree apoasă • Aceeaşi acţiune a toxinelor V. cholerae, B. cerreus

Exotoxine Bordetella pertussis • Toxina pertusis inactiveaza inhibitorul adenilat-ciclazei => creste AC • Cresterea cAMP => celulele devin foarte sensibile la stimuli => Tuse convulsiva

Antibiotice Dr. Carmen Costache

Antibiotice Planul cursului • Definiţie

– Antibiotice vs Chimioterapice – Antibiotice vs Antiseptice

• Clasificare

– Spectru de acţiune – Tipuri de efect antibacterian • Combinatii de AB

• Farmacocinetica • Familii de antibiotice

– Mecanisme de acţiune

• Rezistenţa la antibiotice

Antibiotice / chimioterapice

• Antibioticele (AB): – substanţe naturale, cu efect antibacterian, produse de microorganisme. • Chimioterapicele (CH) : – substanţe chimice cu efect antibacterian. Datorită apariţiei rezistenţei bacteriene: => modificarea structurii antibioticelor de bază dintr-o familie, => derivaţii semisintetici ai antibioticelor. • AB/CH diferite după • provenienţa, • mod de producere, • dar au acelaşi efect.

Antibiotic Penicillin Cephalosporin Griseofulvin

Organisms Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Penicillium griseofulvum

Bacitracin

Bacillus subtilis

Polymyxin B

Bacillus polymyxa

Amphotericin B

Streptomyces nodosus

Erythromycin

Streptomyces erythreus

Neomycin

Streptomyces fradiae

Streptomycin

Streptomyces griseus

Tetracycline

Streptomyces rimosus

Vancomycin

Streptomyces orientalis

Gentamicin Rifamycin

Micromonospora purpurea Streptomyces mediterranei

Penicillium

Cephalosporium

Streptomyces griseus

Antibioterapia • origini: antibioza şi toxicitatea selectivă. • Antibioza – Pasteur: cultură cu 2 microorganisme – producerea unei substanţe de către una din ele => opreşte multiplicarea sau omoară cea de a 2-a bacterie.

• Toxicitatea selectivă: – fixarea selectivă, specifică a substanţelor de corpul bacterian. – nu se fixează şi nu este toxică asupra altei bacterii sau asupra celulelor umane (eukariote)

Dezinfectante\Antiseptice • substanţe cu efect antibacterian, • active în concentraţii mari • NU respectă principiul toxicităţii selective. • se utilizează doar extern => – îndepărtarea microorganismelor de pe suprafeţe

Indicele terapeutic • IT = Doza toxica/doza efectiva. • Cu cat IT mai mare, cu atat AB este mai bun !

Spectrul de acţiune al unui antibiotic • totalitatea genurilor şi speciilor bacteriene asupra cărora acţionează antibioticul: – – – – – –

coci Gram pozitivi şi negativi, bacili Gram pozitivi şi negativi, bacterii anaerobe, spirochete, Mycobacterii, bacteri cu patogenitate intracelulară: • Richettsia, Chlamydia, Mycoplasma.

Spectrul de acţiune al unui antibiotic • Spectru îngust => specie bacteriena • ex. antibioticele antistafilococice, Tuberculostatice • Spectru restrâns => număr mic de grupe, genuri bacteriene: – Ex. Acid nalidixic - activ doar pe bacili Gram

Antibiotic

Spectrum

Penicillin

Gram-positive bacteria

Bacitracin Vancomycin Polymyxin B Streptomycin

negativi

• Specru larg = active asupra majorităţii genurilor, speciilor bacteriene: • Spectru ultralarg: active asupra bacteriilor din mediul spitalicesc, multiplu rezistente la antibiotice.

Gram-positive bacteria Gram-positive bacteria Gram-negative bacteria Gram-negative bacteria

Erythromycin

Gram-positive negative cocci; some Gram negative bacilli

Neomycin

Broad-spectrum

Tetracycline

Broad-spectrum

Cephalosporin

Broad-spectrum

Gentamicin

Broad-spectrum

Rifamycin

Tuberculosis

Spectrul de acţiune al unui antibiotic

Efect antibacterian • Bacteriostatic: opresc multiplicarea • ex. Cicline (ex. Tetracicline), Cloramfenicol

• Bactericide: omoară bacteriile, în concentraţii mici; • ex. Aminozide

• Bacteristatice în concentraţii mici şi bactericide în concentraţii mari; • ex ß –lactamine

Combinatii de AB • Sinergism • Antagonism • Indiferenta

Farmacocinetica unui antibiotic • In vitro ≠ in vivo • Localizarea infectiei – Capacitatea AB de a ajunge la situsul infectiei • Influentata de cinetica AB = disponbilitatea biologica – Intracelular, puroi, bariera hematoencefalica

• Tipul infectiei • Inactivarea AB: – pH, – Tesut necrotic • Rezistenta bacteriei la AB exprimata in vivo (inductie)

Farmacocinetica unui antibiotic • pătrunderea antibioticelor în organism: – calea de administrare: orală – parenterală: intravenoasă, intramusculară, subcutanată • Infectii severe, sistemice

– Externa: crème, unguente, solutii (picaturi nazale, oftalmice)

• absorbţia antibioticelor: rapidă, lentă • metabolizarea antibioticelor

Farmacocinetica unui antibiotic • distribuţia în organism: în ţesuturi, organe, penetrarea barierei hematoencefalice, penetrarea intracelulară. • toxicitatea antibioticelor (hepatică, renală, medulară, nervoasă, etc) • calea de eliminare a antibioticelor: urinară, digestivă

Farmacocinetica unui antibiotic

Condiţii pentru un AB să fie activ • să ajungă la bacterie • să pătrundă în bacterie – să fie permeabilă pentru antibiotice – să dispună de un transportor pentru antibioticul respectiv

• să atingă ţinta de acţiune • să realizeze în bacterie o concentraţie optimă, care să inactiveze reversibil sau ireversibil ţinta de acţiune.

Tratamentul cu antibiotice

Familii de antibiotice • AB care au • structură chimică, • ţintă de acţiune • mecanism de acţiune comune.

Tinta de actiune – nivel molecular

Structura/functie inactivata ireversibil/reversibil de catre AB

Ţinte ale antibioticelor • Perete celular: – ß Lactamine – Glicopeptide: Vancomicina, Teicoplanina • Ristocetina

– Fosfomicina, Cicloserina, Bacitracina,

• Membrana citoplasmatică: – Polipeptide ciclice: ex. Colistin, polimixina B – Gramicidina, Tirociclina, Defensine, L - Antibiotice

Ţinte ale antibioticelor • Acizi nucleici: – – – –

Quinolone, Imidazoli, Furani, Rifamicine

• Ribozomi: AB care inhibă sinteza proteică – 30 S: Aminoglicozide,Tetracicline, Spectinomicine – 50 S: grupul MLS , Fenicoli • Macrolide, Lincosamide, Sinergistine – Acid fusidic: factorul de elongare (EF)

Ţinte ale antibioticelor • Inhibǎ sinteza acidului folic: • Diaminopirimidine • inhiba folat reductaza: Trimetoprim • Pirimetamina

• Sulfonamide • Inhiba folat sintetaza: Sulfametoxazol

Asocierea Trimetoprim + Sulfametoxazol = Co-trim-oxazol (Biseptol) – Sulfone: Dapsone – PAS (acid paraaminosalicilic)

Familii de Antibiotice • • • • • • • • • • • • • •

β Lactamine, • grup Monobactam şi gamma (γ) Lactamine Aminoglicozide grup MLS: • Macrolide, Lincosamide, Sinergistine Tetraclicline Fenicoli Quinolone Sulfamide Polipeptide ciclice, Glicopeptide Sulfamide Imidazoli Furani Rifamicine Tuberculostatice AB neîncadrate în familii: •

Fosfomicina, Cicloserina, Novobiocina, Acid fusidic,

AB => peretele celular - ß Lactamine • inhibă sinteza peptidoglicanului – în faza de polimerizare.

• ţintă de acţiune: PBP-uri – inhibată funcţia enzimatică : transpeptidarea, transglicozidarea, carboxipeptidarea

• inelul ß lactam = analog structural al legăturii sterice D Ala - D Ala.

Rezistenţa la β-Lactamine 1. Modificarea permeabilităţii bacteriene 2. Modificarea ţintei (PBP) 3. Inactivarea prin β-lactamaze 1. Penicilinaze 2. Cefalosporinaze 3. BLSL 4. BLSE 4. Pompe de eflux

Familia β-Lactaminelor Grup I: Derivaţi ai acidului 6-aminopenicilinic 1. Penami (peniciline) 2. Carbapenemi 3. Oxapenami (Clavani)

Familia β-Lactamine Grup II - Cefalosporine derivati de acid 7 aminocefalosporanic Primele izolate din tulpini de Cephalosporium (fung filamentos) Aceeşi acţiune ca şi Penicilinele Diferite generatii

Familia β-Lactaminelor- Peniciline (Penami) a) peniciline cu spectru îngust (Penicilină G şi Penicilină V) coci Gram pozitivi şi negativ, bacili Gram + şi spirochete Penicilina G adm. parenterala Penicilina V administrare p.o. Reactii alergice ! Peniciline semiretard şi retard: Propicilina; Procain Penicilină = Efitard; Benzantin Penicilină = Moldamin

• b) peniciline rezistente la penicilinaze - Peniciline M • Meticilină • Oxacilină • Pentru tratamentul infecţiilor cu stafilococi. • MRSA = methicillin resistant Staphylococcus aureus

Familia β-Lactaminelor- Peniciline (Penami) c) peniciline cu spectru larg : Amino peniciline Ampicilină – şi bacili Gram negativi (NU Pseudomonas) Amoxicilină – şi unii bacili Gram negativi (NU Pseudomonas) Carboxy peniciline Carbenicilină, Ticarcilină şi bacili Gram negativi, inclusiv Pseudomonas Ureidopeniciline Piperacilină

Familia β-Lactaminelor- Peniciline (Penami) d) Inhibitori de β-lactamaze – penicilin sulfone

 Sulbactam,  Tazobactam

In combinaţie cu Peniciline cu spectru larg

• • •

Sulbactam + Ampicilină = Sultacilină (Unasyn) Sulbactam + Becampicilină = Sultamicillină; Tazobactam + Piperacilina = Tazocin

Familia β-Lactamine

2. Carbapenemi • Imipenem, Meropenem – –

Spectru larg de acţiune Bactericid, bacterii Gram + şi –, anaerobi.

• 3. Oxapenemi sau Clavami • acid clavulanic = inhibitor de β-lactamaze

– + peniciline cu spectru larg (Amoxicilină, Ticarcilină) – ex. Amoxicilină + acid clavulanic = Augmentin®

Familia β-Lactamine – Cefalosporine

Generaţia I Cefalexin, Cefalotin, Cefazolin Spectru îngust - E.coli, Klebsiella, Proteus şi Gram + coci sensibili la Oxacilină.

• Generaţia a II-a • Cefuroxim, Cefoxitin - Spectru extins bacterii Gram – , unii anaerobi

Familia β-Lactamine – Cefalosporine Generaţia a III-a Cefotaxim, Ceftazidim spectru larg, Enterobacteriaceae şi Pseudomonas aeruginosa

• Generaţia a IV-a Cefepime, Cefpirom - Spectru extins : Pseudomonas, alţi bacili Gram negativi, coci Gram pozitivi - Traversează bariera hemato-encefalică

Familia β-Lactamine - GRUP III

Grup III Monobactami - Aztreonam - Spectru îngust - Pseudomonas aeruginosa.

Familia γ LACTAMINE • asemănătoare ß lactaminelor. • Reprezentanţi: Pirazolidinon,

Alte AB => peretelui celular bacterian FOSFOMICINA • Spectru de acţiune: îngust,

– coci Gram + si MRSA, unii coci Gram (-). – bună difuzie în LCR.

• bacteriostatic.

BACITRACINĂ • Spectru de acţiune: îngust: doar pe bacteriile Gram pozitive. • Ţinta de acţiune: Bactoprenolul - inhibă reciclarea. • Toxicitate: crescută => Administrare: locală CICLOSERINĂ • Spectru de acţiune: Tuberculostatic

AB care acţionează la nivelul peretelui celular bacterian Glicopeptide: Vancomicină (activa pe MRSA), Teicoplanină

Polimixine • • • •

AB izolate din Bacillus polymyxa Polimixină B distrug membrana citoplasmatică  efect bactericid spectru îngust

• Doar bacterii Gram –, mai ales Pseudomonas aeruginosa

AB care acţionează la nivelul acizilor nucleici bacterieni Quinolone Imidazoli Furani Rifamicine

Quinolone • • • •

inhibă sinteza ADN bacterian bactericid Bacterii Gram + şi Gram – Acid nalidixic, Ciprofloxacină, Norfloxacină, Ofloxacină

Inhibarea sintezei ADN bacterian Nitrofurani

• Metronidazol

• Spectru larg • Bacteriostatic/bactericida – ~ doză • Nitrofurantoin, Furazolidon

• bactericid • bacterii anaerobe – Bacteroides fragilis – Clostridium • Protozoare: – Trichomonas vaginalis – amebiaza, – giardiaza

AB care inhibă sinteza proteică bacteriană • Ribozomi: sediul sintezei proteice – 30 S 50 S • Aminoglicozide, • Tetracicline, » Acid fusidic

grupul MLS Fenicoli

Aminoglicozide • • • •

bactericide spectru larg: bacili Gram negativi inhibirea sintezei proteice: subunitatea ribozomală 30 S Streptomicină, Kanamicină, Gentamicină, Amikacină

Tetracicline • • • • •

spectru larg, bacteriostatic inhibirea sintezei proteice: subunitatea ribozomală 30 S coci Gram + şi –, bacili Gram + Chlamydia, Mycoplasma şi Rickettsia

• Tetraciclină, Doxiciclină, Minociclină

Cloramfenicol • spectru larg • inhibirea sintezei proteice: subunitatea ribozomală 50 S • De elecţie pentru febra tifoidă (bacteriostatic pentru Salmonella) • Bactericid: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae şi Haemophilus influenzae • Efecte adverse numeroase

Macrolide • • • •

• •

inhibirea sintezei proteice: subunitatea ribozomală 50 S Spectru larg coci Gram (+) şi (–), bacili Gram (+) Mycoplasma, Legionella, Chlamydia, Campylobacter , Helicobacter pacienţi alergici la Penicilină Eritromicină, Azitromicină, Claritromicină

Lincosamine

• Acţionează pe subunitatea ribozomală 50 S • Clindamicină, Lincomicină • bacterii Gram + şi Gram – anaerobe: (Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis)

Oxazolidine • • •

Linezolid Spectru îngust DOAR bacterii G +, – VRE, MRSA

•

Subunitatea ribozomală 50 S

Antibiotice antituberculoase • • • • •

Rifampicină Izoniazidă Pirazinamidă Etambutol Streptomicină

AB care inhibă sinteza acidului folic

• Sulfamide, Trimetoprim

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice • Definiţie – Bacterii rezistente = bacteriile care supravieţuiesc la concentraţii mari de antibiotic, mult mai mari decât cele din organismul uman.

• Naturală • Dobândită

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice Naturală - caracter de specie 1. Absenţa ţintei de acţiune – Ex. Mycoplasma rezistentă la β-lactamine • NU are perete celular.

2. Impermeabilitatea bacteriei pentru antibiotic – Ex. Mycobacterium

Dobândită: când o tulpină bacteriană anterior sensibilă la un anumit antibiotic devine rezistentă • Caracter de tulpină • Ex. Staphylococcus aureus – anterior sensibil la Penicilină, – În prezent 90% dintre tulpinile de Sa = tulpini rezistente la Penicilină

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice

Mecanisme genetice

• Rezistenţa apare indiferent de antibiotic • rolul antibioticelor : selecţie a tulpinilor rezistente. • mecanisme cromozomiale – Mutaţii => mutante rezistente => clonă mutantă

TIPURI DE MUTANTE Mutante de rezistenţă la antibiotice

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice

Mecanisme genetice

• mecanisme extra-cromozomiale – Achiziţia de material genetic extracromozomial – Ex.” plasmide R “

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice

Mecanisme

• modificarea permeabilităţii bacteriene • modificarea transportului antibioticului in bacterie • modificarea ţintei • Enzime de inactivare a antibioticului • Activarea pompelor de eflux • Combinaţii ale acestor mecanisme.

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice

Antibiotic

Discovered

Introduced

Resistance

into Clinical

Identified

Use Penicillin

1940

1943

1940

Streptomycin

1944

1947

1947

Tetracycline

1948

1952

1956

Erythromycin

1952

1955

1956

Vancomycin

1956

1972

1987

Gentamycin

1963

1967

1970

Testarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice Antibiograma

• Determinarea sensibilitatii/rezistentei bacteriilor la antibiotice

• Efect bacteriostatic • Efect bactericid

Testarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice Antibiograma

• !!! Orice infectie bacteriana va fi tratata numai dupa identificarea bacteriei si efectuarea antibiogramei • Metode: »Metoda dilutiilor »Metoda difuzimetrica »E-test

Antibiograma Metoda dilutiilor • Medii de cultura lichide • Dilutii de antibiotic intr-un mediu de cultura favorabil dezvoltarii bacteriilor • Cantitati egale din cultura bacteriana testata • Incubare • Metoda de referinţă • Avantaj major: determinarea valorii concentraţie minime inhibitorii (CMI)

Antibiograma - Metoda diluţiilor Citire si interpretare Mediu de cultura clar, limpede tulbure Se stabileste CMI (concentraţia minimă inhibitorie) CMI – valoare diferită pentru fiecare bacterie şi antibiotic

Antibiograma Metoda dilutiilor !!!!! Reducerea timpului de citire al rezultatelor: Indicator de pH (virarea culorii mediului apare mai rapid decat tulburarea lui)

Antibiograma Metoda difuzimetrică  Medii de cultura solide - Mueller Hinton  AB depuse pe placa însămânţată cu tulpina bacteriană difuzează în mediu  Se măsoară DIAMETRUL ZONEI DE INHIBIŢIE (mm)  Rezultatul se compară cu tabele standard

Testarea sensibilităţii la antibiotice

Antibiograma prin metoda difuzimetrică Tehnica de lucru • După identificarea şi izolarea tulpinii bacteriene • Se însămânţează cultura bacteriană (se prepară în prealabil o suspensie bacteriană=> trebuie sa aiba o anumita densitate) • Se însămânţează “în pânză” • Pe suprafata placii se depun AB (rondele/ microcomprimate) • Termostat (24-48h) • Interpretare

Antibiograma prin metoda difuzimetrică Interpretarea rezultatelor

• Cu o rigla se masoara diametrul zonei de inhibitie a dezvoltarii bacteriene (exprimat in mm) • Se compara cu datele din tabelele standard • Rezultatele se exprima: » Sensibil (S) » Intermediar sensibil (IS) » Rezistent (R)

Antibiograma E-testul • Combina avantajele cele doua metode • Medii de cultura solide • Benzi impregnate cu AB în concentraţii descrescătoare • !!! Citire: locul în care zona de inhibitie intersectează banda = CMI

• Medii cu sange- pt. streptococi • Lowenstein-Jensenpt. bacilul TBC • Pt anaerobi

• !!Se pot studia efectele asocierilor de antibiotice

REZISTENŢA CLINICĂ = MULTIFACTORIALĂ

PACIENT -STATUS IMUNITAR -SITUSUL INFECTIEI -DISPOZITIVE MEDICALE -CONTROL INEFICIENT

MICROORGANISM

-REZISTENTA MICROBIOLOGICA -PRODUCEREA DE BIOFILM -DENSITATEA INOCULULUI

ESEC TERAPEUTIC

ANTIBIOTIC/CHIMIOTERAPIC

- ACTIUNE - POSOLOGIE - FARMACOCINETICA - INTERACTIUNI MEDICAMENTOASE

Rezistenţa bacteriilor la antibiotice