Elisa.clase.inmuno
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- Pages: 58
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TECNICAS INMUNOENZIMATICAS
Se utilizan ENZIMAS como marcadores inmunoquímicos, que permiten detectar las uniones primarias antigeno-anticuerpo. Las enzimas son moléculas estables, económicas. Son fácilmente conjugables con anticuerpos o con antígenos.
Actúan como un sistema indicador de la presencia de inmunocomplejos al combinarse con sustratos de diversos tipos: cromogénicos. El producto de la reacción enzimática da lugar a una emisión de color, fluoresencia o quimioluminisencia.
La intensidad de la coloración o de la inmunofluoresencia es proporcional a la cantidad de elemento analizado presente en la muestra.
TECNICA DE ELISA ENZYMED LINKED INMUNOSORBENT ASSAY
HISTORIA
1966 Avrameas y Uriel concibieron la idea de marcar antígenos y anticuerpos con enzimas. 1966 Nekane, Pierce conjugaron enzimaticamente anticuerpos para localizar antígenos víricos en cortes de tejidos de animales.
1971, Engvall y Perlmann describieron el primer método de ELISA, como alternativa al radioinmunoanalisis (RIA), para titular inmunoglobulinas. 1974, Voller utilizó el método de la microplaca y sugirió su uso para cuantificar anticuerpos inducidos por enfermedades infecciosas.
1985, PRIMER KIT COMERCIAL PARA DETECTAR LA ENFERMEDAD DE AUJESZKY.
PRUEBA INMUNOSORBENTE LIGADA A ENZIMAS
Prueba de UNION PRIMARIA Se puede utilizar para detectar y cuantificar los inmunocomplejos mediante un marcador enzimático que actúa con un sustrato cromogénico adecuado. Se puede detectar antígeno.
El grado de transformación del sustrato incoloro a un producto coloreado se cuantifica objetivamente por espectrofotometría y es proporcional a la cantidad de inmunocomplejos formados.
VENTAJAS
Método sensible. Bajo costo. Fácil manejo. Permite desarrollar un gran número de muestras en un corto período de tiempo. Buen equilibrio entre sensibilidad y especificidad.
ETAPAS DE LA TECNICA ELISA MUESTRA CON ANTICUERPO O ANTIGENO
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO
CONJUGADO DE AG O AC CON ENZIMA
INCUBACION
LAVAR
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO
S U S T R A T O
I N C U B A R
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO Y CONJUGADO
LAVAR
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO Y CONJUGADO
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO Y CONJUGADO COLOREADO
COMPONENTES DEL KIT DE ELISA SOL. DILUYENTE SOL. STOP PLACA CON FOSITOS
SOL. SUBSTRATO
CONTROLES
CONJUGADO
MATERIALES Y EQUIPO PUNTAS DESCARTABLES
MICROPIPETAS
ESPECTROFOTOMETRO
RECOMENDACIONES
ANTES DE INICIAR LA PRUEBA… Trabajar en áreas que estén a 2025°C. Alejadas de aire acondicionado o corrientes de aire. Tener el inserto de la prueba a la mano.
Que todos los componentes del KIT alcancen una temperatura ambiente por lo menos 2 a 3 horas antes de iniciar la prueba. Homogenizar antes de utilizarlos !!! Tener en cuenta el número total de muestras a analizar. Llenar una hoja de resultados y control con la posición de las muestras en la placa de poliestireno.
Realizar los cálculos previos de solución de lavado a preparar. Tener el equipo necesario listo y en buen estado (puntas de micropipetas, micropipetas adecuadas, material de laboratorio) El agua para reconstituir la solución de lavado concentrada debe ser destilada y estéril. Que la solución de lavado no presente cristales de precipitación.
RECOMENDACIONES
MANTENER UN CONTROL ESTRICTO DEL TIEMPO EN CADA INCUBACIÓN Y RESPETARLO!!!! Colocar la cantidad exacta de reactivo y muestra a analizar. No deben haber burbujas de aire en las puntas ni en los fositos de la placa.
MUESTRAS A ANALIZAR
SUERO
LECHE
MUESTRAS
No utilizar muestras de sangre hemolizadas o lipemicas. Se deben mantener de 2 a 4 °C no mas de 3 a 5 días. Se pueden mantener durante periodos prolongados si se trasvasa el suero y se almacena a temperatura de congelacion o a -20 °C.
Se deben utilizar a temperatura ambiente. Se deben homogenizar utilizando el vortex o manualmente por lo menos 5 veces.
MODO CORRECTO DE UTILIZAR LA MICROPIPETA
TIPOS INDIRECTO
DIRECTO
ELISA TIPO SANDWICH O DE CAPTURA DE ANTIGENO
DOT ELISA
INDIRECTO DETECCION DE DE ANTICUERPOS
COMPETITIVO
ELISA INDIRECTO DETECCION DE ANTICUERPOS
La reacción se lleva a cabo en los fositos de la placa, donde se adsorbe el antigeno conocido, con el suero problema.
La actividad enzimática sobre el sustrato apropiado, añadido al final de la reacción, se revela por cambio de color cuantificable por espectrofotometría, la intensidad es proporcional a la cantidad de antiinmunoglobulina marcada captada, que a su vez es proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero problema.
ELISA COMPETITIVO
Puede utilizarse para la determinación de anticuerpos o de antigenos.
ANTICUERPOS
Se establece una competencia entre los anticuerpos del suero problema y UN ANTICUERPO SECUNDARIO (conjugado).
La muestra se incuba con el antigeno conocido para la formación de los inmunocomplejos. Luego se agrega el conjugado que contiene un anticuerpo especifico secundario MARCADO ENZIMATICAMENTE.
Este anticuerpo se unirá a el antigeno libre del fosito. (SUEROS NEGATIVOS)
Esta reacción es la que se colorea.
POR LO TANTO LAS MUESTRAS POSITIVAS NO TOMAN NINGUN COLOR PORQUE LA ENZIMA NO SE LIGA AL COMPLEJO ANTIGENO ANTICUERPO QUE SE FORMÓ.
Cuanta mas inmunoglobulina haya en la muestra menos antigeno habrá quedado disponible para unirse a los anticuerpos secundarios.
La adición del anticuerpo marcado especifico y su reacción con el sustrato revela la existencia o no de antigeno libre, en una relación inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpos presente en la muestra.
ELISA DIRECTO
CAPTURA DE ANTIGENO SANDWICH
En la placa de poliestireno se encuentra el anticuerpo especifico para detectar el antigeno en la muestra.
La solución de conjugado contiene la enzima ligada con un segundo anticuerpo especifico conocido que se une por otro epitopo al antigeno.
El antigeno queda capturado en una especie de SANDWICH. El cambio de color al agregar el sustrato demostrara la presencia del antigeno. La intensidad de la reacción cromática se relaciona directamente con la cantidad de antigeno.
DOT ELISA
El complejo antigeno anticuerpo se visualiza como PUNTOS (DOT) de color sobre una membrana de nitrocelulosa. Es una técnica cualitativa. Es sencillo. No necesita de equipo de lectura. Pueden ser directas o indirectas.
Posee controles positivos y negativos. Es de un solo paso. Se puede utilizar diferentes muestras para el análisis.
Se utilizan ENZIMAS como marcadores inmunoquímicos, que permiten detectar las uniones primarias antigeno-anticuerpo. Las enzimas son moléculas estables, económicas. Son fácilmente conjugables con anticuerpos o con antígenos.
Actúan como un sistema indicador de la presencia de inmunocomplejos al combinarse con sustratos de diversos tipos: cromogénicos. El producto de la reacción enzimática da lugar a una emisión de color, fluoresencia o quimioluminisencia.
La intensidad de la coloración o de la inmunofluoresencia es proporcional a la cantidad de elemento analizado presente en la muestra.
TECNICA DE ELISA ENZYMED LINKED INMUNOSORBENT ASSAY
HISTORIA
1966 Avrameas y Uriel concibieron la idea de marcar antígenos y anticuerpos con enzimas. 1966 Nekane, Pierce conjugaron enzimaticamente anticuerpos para localizar antígenos víricos en cortes de tejidos de animales.
1971, Engvall y Perlmann describieron el primer método de ELISA, como alternativa al radioinmunoanalisis (RIA), para titular inmunoglobulinas. 1974, Voller utilizó el método de la microplaca y sugirió su uso para cuantificar anticuerpos inducidos por enfermedades infecciosas.
1985, PRIMER KIT COMERCIAL PARA DETECTAR LA ENFERMEDAD DE AUJESZKY.
PRUEBA INMUNOSORBENTE LIGADA A ENZIMAS
Prueba de UNION PRIMARIA Se puede utilizar para detectar y cuantificar los inmunocomplejos mediante un marcador enzimático que actúa con un sustrato cromogénico adecuado. Se puede detectar antígeno.
El grado de transformación del sustrato incoloro a un producto coloreado se cuantifica objetivamente por espectrofotometría y es proporcional a la cantidad de inmunocomplejos formados.
VENTAJAS
Método sensible. Bajo costo. Fácil manejo. Permite desarrollar un gran número de muestras en un corto período de tiempo. Buen equilibrio entre sensibilidad y especificidad.
ETAPAS DE LA TECNICA ELISA MUESTRA CON ANTICUERPO O ANTIGENO
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO
CONJUGADO DE AG O AC CON ENZIMA
INCUBACION
LAVAR
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO
S U S T R A T O
I N C U B A R
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO Y CONJUGADO
LAVAR
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO Y CONJUGADO
FOSITO TAPIZADO CON ANTIGENO O ANTICUERPO Y CONJUGADO COLOREADO
COMPONENTES DEL KIT DE ELISA SOL. DILUYENTE SOL. STOP PLACA CON FOSITOS
SOL. SUBSTRATO
CONTROLES
CONJUGADO
MATERIALES Y EQUIPO PUNTAS DESCARTABLES
MICROPIPETAS
ESPECTROFOTOMETRO
RECOMENDACIONES
ANTES DE INICIAR LA PRUEBA… Trabajar en áreas que estén a 2025°C. Alejadas de aire acondicionado o corrientes de aire. Tener el inserto de la prueba a la mano.
Que todos los componentes del KIT alcancen una temperatura ambiente por lo menos 2 a 3 horas antes de iniciar la prueba. Homogenizar antes de utilizarlos !!! Tener en cuenta el número total de muestras a analizar. Llenar una hoja de resultados y control con la posición de las muestras en la placa de poliestireno.
Realizar los cálculos previos de solución de lavado a preparar. Tener el equipo necesario listo y en buen estado (puntas de micropipetas, micropipetas adecuadas, material de laboratorio) El agua para reconstituir la solución de lavado concentrada debe ser destilada y estéril. Que la solución de lavado no presente cristales de precipitación.
RECOMENDACIONES
MANTENER UN CONTROL ESTRICTO DEL TIEMPO EN CADA INCUBACIÓN Y RESPETARLO!!!! Colocar la cantidad exacta de reactivo y muestra a analizar. No deben haber burbujas de aire en las puntas ni en los fositos de la placa.
MUESTRAS A ANALIZAR
SUERO
LECHE
MUESTRAS
No utilizar muestras de sangre hemolizadas o lipemicas. Se deben mantener de 2 a 4 °C no mas de 3 a 5 días. Se pueden mantener durante periodos prolongados si se trasvasa el suero y se almacena a temperatura de congelacion o a -20 °C.
Se deben utilizar a temperatura ambiente. Se deben homogenizar utilizando el vortex o manualmente por lo menos 5 veces.
MODO CORRECTO DE UTILIZAR LA MICROPIPETA
TIPOS INDIRECTO
DIRECTO
ELISA TIPO SANDWICH O DE CAPTURA DE ANTIGENO
DOT ELISA
INDIRECTO DETECCION DE DE ANTICUERPOS
COMPETITIVO
ELISA INDIRECTO DETECCION DE ANTICUERPOS
La reacción se lleva a cabo en los fositos de la placa, donde se adsorbe el antigeno conocido, con el suero problema.
La actividad enzimática sobre el sustrato apropiado, añadido al final de la reacción, se revela por cambio de color cuantificable por espectrofotometría, la intensidad es proporcional a la cantidad de antiinmunoglobulina marcada captada, que a su vez es proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero problema.
ELISA COMPETITIVO
Puede utilizarse para la determinación de anticuerpos o de antigenos.
ANTICUERPOS
Se establece una competencia entre los anticuerpos del suero problema y UN ANTICUERPO SECUNDARIO (conjugado).
La muestra se incuba con el antigeno conocido para la formación de los inmunocomplejos. Luego se agrega el conjugado que contiene un anticuerpo especifico secundario MARCADO ENZIMATICAMENTE.
Este anticuerpo se unirá a el antigeno libre del fosito. (SUEROS NEGATIVOS)
Esta reacción es la que se colorea.
POR LO TANTO LAS MUESTRAS POSITIVAS NO TOMAN NINGUN COLOR PORQUE LA ENZIMA NO SE LIGA AL COMPLEJO ANTIGENO ANTICUERPO QUE SE FORMÓ.
Cuanta mas inmunoglobulina haya en la muestra menos antigeno habrá quedado disponible para unirse a los anticuerpos secundarios.
La adición del anticuerpo marcado especifico y su reacción con el sustrato revela la existencia o no de antigeno libre, en una relación inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpos presente en la muestra.
ELISA DIRECTO
CAPTURA DE ANTIGENO SANDWICH
En la placa de poliestireno se encuentra el anticuerpo especifico para detectar el antigeno en la muestra.
La solución de conjugado contiene la enzima ligada con un segundo anticuerpo especifico conocido que se une por otro epitopo al antigeno.
El antigeno queda capturado en una especie de SANDWICH. El cambio de color al agregar el sustrato demostrara la presencia del antigeno. La intensidad de la reacción cromática se relaciona directamente con la cantidad de antigeno.
DOT ELISA
El complejo antigeno anticuerpo se visualiza como PUNTOS (DOT) de color sobre una membrana de nitrocelulosa. Es una técnica cualitativa. Es sencillo. No necesita de equipo de lectura. Pueden ser directas o indirectas.
Posee controles positivos y negativos. Es de un solo paso. Se puede utilizar diferentes muestras para el análisis.
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