Pruebas Bioquimicas Micro

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA Nombre: Emmily Lozano Curso: Sexto semestre Fecha: 19/10/2019 PRUEBAS BIOQUÍMICAS 1. OXIDASA Principio: la oxidasa en presencia de O2, citocromo C y un reactivo para oxidasa (oxalato de dimetil-pfenilendiamina) oxida el reactivo a un compuesto coloreado – indofenol. Procedimiento: Discos de oxidasa -Discos húmedos impregnados con H2O destilada estéril – caja petri -Colonias de un medio sólido Resultados: color rosado a púrpura en segundos. 2. TSI – AZÚCAR TRIPLE Y HIERRO Principio: capacidad de fermentar glucosa, lactosa y sacarosa, producir gas y ácido sulfhídrico (H2S). Tiosulfato de sodio (Fe3+) y H2S – Sulfuro de Hidrogeno (negro) Indicador: Rojo fenol (ácido-amarillo) (alcalino-rojo) Color del medio: rojo Inoculación: picar el fondo y extender sobre la superficie del medio. Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC Resultados: 1.- Pico 2.- Pico ácido/fondo 3.- Pico 4.- La presencia de 5.- El alcalino/fondo ácido ácido (pico alcalino/fondo burbujas, o ruptura ennegrecimiento del (pico rojo/fondo amarillo/fondo alcalino (pico del medio de cultivo, medio indica que el amarillo): el amarillo): el rojo/fondo rojo): el indica que el microorganismo microorganismo microorganismo microorganismo es microorganismo produce ácido solamente fermenta fermenta glucosa, no fermentador de produce gas a partir sulfhídrico la glucosa. lactosa y/o sacarosa. azúcares. de Glucosa K/A A/A K/K

3. SIMMONS CITRATO Principio: capacidad para utilizar citrato como única fuente de carbono y fosfatos de amonio como única fuente de nitrógeno, produciendo alcalinidad. Indicador: azul de bromotimol (ácido-amarillo - no se observa) (alcalino-azul de Prusia oscuro). Color del medio: verde. Inoculación: extender sobre la superficie del medio. Incubación: 24 a 48 horas a 35-37ºC. Resultados:

+Positivo: Crecimiento con intenso -Negativo: sin crecimiento y/o color azul en el pico de flauta. En ningún cambio en el color verde. algunas especies que se sabe que son Citrato positivo: Crecimiento de colonias pero sin cambio de color del medio – falta de tiempo de incubación 24h. 4. UREA Principio: capacidad para hidrolizar la urea en dos moléculas de amoniaco por acción de la ureasa con alcalinidad resultante. Indicador: Rojo fenol (ácido-amarillo) (alcalino-rosado rojo). Color del medio: amarillo-naranja. Inoculación: Líquido: inóculo denso y agitar con suavidad. Sólido: estriar Incubación: 6 (Proteus spp.) 18 y 24h (algunas cepas de Klebsiella spp., Enterobacter spp.) a 35-37ºC. Resultados: -Negativo: amarillo o amarillo pálido + Positivo: Color rosado-rojo en todo el medio (líquido o sólido), Color rosado-rojo solo en pico de flauta. Rosado intenso y rápido – Proteusspp. Rosado débil – Klebsiella pneumoniae

5. MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA) MOVILIDAD INDOL Principio: ver la movilidad de las Principio: capacidad del bacterias que contienen flagelos. microorganismo de separar indol a Existen bacterias móviles que partir del triptófano. El indoles producen variantes inmóviles. detectado por el uso de un reactivo. Color del medio: morado-lila Reactivo: R. de Ehrlich(Alcohol (semisólido) etílico) – xileno o éter Inoculación: punción con aguja de R. de Kovacs (Alcohol amílico) inoculación- verticalmente Color del reactivo: amarillo pálido Incubación: 18 y 24h a 35-37ºC Modo de uso: R. de Kovacs 3-5 gotas de reactivo y agitar el tubo con Resultados: + Positivo: Microorganismos que suavidad. migran desde la línea de siembra y Incubación: 24 a 48 horas a 37ºC difunden en el medio, produciendo Resultados: turbidez en todo el tubo. +Positivo: En segundos aparece un -Negativo: crecimiento solo a lo anillo rojo o fucsia brillante. largo de la línea de inoculación, -Negativo: No hay ningún anillo. resto del medio permanece claro. Aparece una capa del color del reactivo (amarillo). Variable: color anaranjado (escatol precursor del indol).

6. LIA (AGAR LISINA HIERRO)

ORNITINA Principio: capacidad del microorganismo para descarboxilarun aminoácido (ornitina– ornitina descarboxilasa) y formar una amina produciendo alcalinidad del medio. Indicador: purpura de bromocresol (ácido-amarillo) (alcalino-púrpura). Color del medio: purpura Incubación: 24 a 48 horas a 37ºC. Resultados: +Positivo: Color del medio: púrpura -Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final.

Principio: capacidad del microorganismo para descarboxilar un aminoácido (LISINA) y formar una amina (Cadaverina) produciendo alcalinidad del medio. Produce gas y ácido sulfhídrico (H2S). Desaminación de la lisina esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico Tiosulfato de sodio (Fe3+) y H2S – Sulfuro de Hidrogeno (negro) Indicador: purpura de bromocresol (ácido-amarillo) (alcalino-púrpura) Color del medio: purpura Inoculación: punción y estriado en pico de flauta Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC Resultados: 1.- Decarboxilación de la lisina: 2.- Desaminación de la lisina: 3.- Producción de ácido sulfhídrico +Positivo: Pico violeta/fondo Pico rojizo/fondo amarillo. Esto Positivo: Ennegrecimiento del violeta. sucede con cepas del género medio -Negativo: Pico violeta/fondo Proteus, Providencia y alguna 4.- Producción de gas amarillo cepas de Morganella spp.

7. FENILALANINA AGAR Principio: capacidad del microorganismo para desaminar (fenilalanina deaminasa) la fenilalanina (ac. Fenilpirúvico) produciendo acidez del medio. Reactivo: Cloruro férrico 10% Color del medio: amarillo pálido Color del reactivo: amarillo Inoculación: estriado en pico de flauta Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC Modo de uso: Cloruro férrico 5 gotas al tubo inclinado – esperar 1 a 5 min. Resultados: +Positivo: desarrollo de color verde -Negativo: sin cambios de color. pálido a intenso en el pico de flauta El medio permanece amarillo y en el líquido de condensación. debido al color del reactivo cloruro férrico.

8. VOGES PROSKAUER (VP) Principio: Identificación de organismos que fermentar la glucosa, pero rápidamente convierten los productos ácidos en acetoina y 2,3-butanodiol. Al añadir los reactivos de VP la acetoina (si está presente) es convertida a diacetil, que reacciona con los nucleótidos de guanidina de la peptona para producir un color rojo. Reactivo: alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto e hidróxido de potasio al 40%. Color del medio: amarillo claro Color del reactivo: ligeramente pardo o cobre Inoculación: suspender las colonias en el caldo Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC Modo de uso: Añadir 0,6 ml de alfa naftol y 0.2 ml de hidróxido de potasio. No agitar el tubo. Dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Resultados:

+ Positivo: Desarrollo de un color -Negativo: Sin cambio de color rojo en pocos minutos. después de la adición del reactivo.

9. ROJO DE METILO (RM) Principio: Identificación de organismos que fermentar la glucosa, con generación de productos ácidos (ác. Láctico, ác. Acético y ác. Succínico) que confieren un pH bajo al caldo de cultivo. Al adicionar rojo de metilo en un medio ácido se identifica una coloración roja. Reactivo: rojo de metilo al 0.04 % Color del medio: amarillo claro Color del reactivo: amarillo claro Inoculación: suspender las colonias en el caldo Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC Modo de uso: Añadir 5 gotas rojo de metilo. NO agitar el tubo. Observar la coloración. Resultados: +Positivo: Desarrollo de un color -Negativo: Sin cambio de color rojo en pocos minutos. después de la adición del reactivo.

10. NITRATO Con esta prueba se investiga la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos convirtiéndolos en nitritos o en nitrógeno, es decir se estudia la presencia de nitrato reductasa y nitrito reductasa. Se utiliza el medio de cultivo caldo nitratos. Para revelar la presencia de nitritos en el medio se emplearán dos reactivos: reactivo A (ácido sulfamínico al 0.8% en ácido acético glacial 5N) y reactivo B (α-naftilamina al 0.5% en ácido acético glacial 5N) que se añadirán tras la incubación. 11. CATALASA La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva. 12. SIM Principio: Es un agar semisólido y diferencial, especialmente diseñado para ayudar a la identificación de algunas bacterias, principalmente de la familia Enterobacteriaceae. Está compuesto por tripteína, peptona, sulfato de hierro, sulfato de amonio, tiosulfato de sodio y agar. Este medio permite la ejecución de tres importantes pruebas: la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), la formación de indol y la motilidad, de allí proviene el acrónimo SIM. SULFURO DE HIDROGENO INDOL. MOTILIDAD Las bacterias capaces de formar sulfuro de hidrógeno tomarán el azufre del tiosulfato de sodio. Una vez formado el H2S -gas incoloro-, este reacciona con la sal de hierro presente en el medio, formando sulfuro ferroso, claramente visible (precipitado negro). Las bacterias que no forman H2S, dejan el medio del color original (beige).

La triptofanasa es una enzima es la encargada de clivar al aminoácido triptófano, con la consecuente formación de indol (sustancia incolora), ácido pirúvico y amonio. Para evidenciar se necesita de (reactivo de Ehrlich o reactivo de Kovac´s), calquiera de los dos reacciona con el indol, formando una sustancia de color rojo-fucsia en forma de anillo en la superficie del agar. Si el anillo color fucsia aparece la prueba de indol se interpreta como positiva.

Es una prueba para observar si existe o no movimiento bacteriano. Las bacterias que poseen flagelos son las que dan esta prueba positiva. Una prueba positiva se pondrá en evidencia cuando se observe turbidez, tanto en el inóculo inicial, como alrededor de este. En tanto que, las bacterias no móviles solo se desarrollan en el trayecto del inóculo inicial.

CUADRO DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE BACTERIAS

Oxidasa

Catalasa

SIMMONS CITRATO

UREA

Movilidad

Indol

Ornitina descarboxilasa

PICO / BASE

Lisina descarboxilasa

Fenilalanina Agar

NITRATO

SULFURO H2S

INDOL

Motilidad

PICO

BASE

GAS

H2S

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Escherichia coli

-

+

-

-

+

+

(+)

K/K

(+)

-

+

-

+

+

-

+

A

A

+

-

Klebsiella pneumoniae

-

+

+

+

-

-

-

K/K

+

-

+

-

-

-

+

(-)

A

A

+

-

Klebsiella oxytoca

-

+

+

+

-

+

-

K/K

+

-

+

-

+

-

+

-

A

A

+

-

-

+

+

-

+

-

+

K/K

+

-

+

-

-

+

+

-

A

A

+

-

-

+

+

(+)

+

+

+

K/A

-

-

+

-

+

+

-

+

A

A

+

+

-

+

+

+

+

-

+

R/A

-

+

+

+

-

+

(-)

+

K

A

+

+

-

+

+

-

+

-

+

K/K

+

-

+

-

-

+

+

-

KoA

A

-

-

MIO BACTERIAS

Enterobacter aerogenes Citrobacter diversus Proteus mirabilis Serratia marcesens

LIA

SIM

TSI VP

RM

ANTÍGENOS Variación en los antígenos de superficie. Una forma de evadir la acción de los anticuerpos del hospedero es cambiar de un tipo de fimbria a otra, por lo tanto los anticuerpos preformados no se unen a la nueva fimbria formada. La bacteria también cambia otras proteínas de superficie que pueden servir como blanco para los anticuerpos. Algunas bacterias encapsuladas están compuestas de polisacáridos que no desencadenan la formación de anticuerpos porque dichos polisacáridos se parecen mucho a carbohidratos que son ubicuos en los tejidos del hospedero (ácido siálico y ácido hialurónico). FACTORES QUE PROMUEVEN LA COLONIZACIÓN E INVASIÓN AL HOSPEDERO Factor Comentario Adhesinas fimbriales Se encuentra en bacterias gramnegativas y grampositivas y sirve para la adherencia Adhesinas no fimbriales En bacterias gramnegativas y grampositivas, su función es la adherencia Internalización en células M Invasividad Movilidad y quimiotáxis Colonización y permanencia en el hospedero IgA proteasa Disminuye la viscosidad del moco Sideróforos Ayuda a sobrevivir a la bacteria Cápsula Antifagocítica y factor de diseminación Variación antigénica Evasión de la respuesta inmune Antígenos bacterianos Antígeno O: antígenos polisacáridos. Esta infectado por bacterias Gram-negativas, los lipopolisacaridos de la pared celular se unen a un receptor de tipo Toll, y asi inducen la producción de una mezcla de citoquinas. • Dado que estas citoquinas son toxicas, los lipopolisacaridos bacterianos también se denominan endotoxinas Antígeno F o K: (Cápsula) Los pilis y las fimbrias son proyecciones cortas que cubren la superficie de algunas bacterias Gram-negativas. Los anticuerpos frente a las fimbrias tienen una función protectora, dado que evita que las bacterias se fijen a las superficies del organismo. Antígeno H: antígenos flagelares.

Antigenos de la superficie celular: Antigeno ABO

BROTE CAUSADOS POR LA O157:H7 El serotipo O157:H7 ha causado más de 60 brotes de toxi infecciones alimentarias en los Estados Unidos. El consumo de hamburguesas y derivados cárnicos poco cocinados y contaminados explica la mayoría de éstos, aunque también se han descrito brotes producidos por el consumo de leche no higienizada en este país y en Canadá. La higiene deficiente, junto con la diseminación secundaria por contacto interpersonal, constituye otra vía de transmisión. En los últimos años, sin embargo, ha habido varios brotes producidos por el serotipo O157:H7 en los que se ha implicado a ciertos vehículos de infección poco frecuentes, entre los que se incluyen los alimentos ácidos, frutas, vegetales, yogur y agua. - E. coli productora de toxina Shiga es una bacteria que puede causar graves enfermedades a través de los alimentos. - El origen principal de los brotes de E. coli productora de toxina Shiga son los productos de carne picada cruda o poco cocinada, la leche cruda y las hortalizas contaminadas por materia fecal. Síntomas:       

Calambres abdominales y la diarrea, que puede progresar en algunos casos a diarrea sanguinolenta (colitis hemorrágica). Fiebre y vómitos. Síndrome hemolítico urémico (SHU). El SHU se caracteriza por una insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica y trombocitopenia (deficencia de plaquetas). El periodo de incubación varía entre tres y ocho días, con una mediana de tres a cuatro días. Los pacientes se recuperan en diez días. La tasa de letalidad es de 3%-5%. El SHU es la causa más común de insuficiencia renal aguda en los niños de corta edad. Complicaciones neurológicas (como convulsiones, accidente cerebrovascular y coma) en el 25% de los pacientes con SHU, así como secuelas renales crónicas, generalmente leves, en aproximadamente un 50% de los supervivientes.

CASOS: 1989 Missouri

1991

1993

2011

2018

El agua de consumo como la de uso recreativo pueden servir como vehículo para la transmisión de las infecciones por el E. coli O157:H7. Es el primer brote hídrico asociado con este microorganismo. Los ajustes de la cloración en el suministro de agua durante las reparaciones son, por tanto, decisivos en la prevención de brotes de origen hídrico. Se realizó el seguimiento al brote del serotipo O157:H7 que afectó a 23 personas, hasta llegar a implicar en el brote el consumo de sidra recién pisada. El serotipo O157:H7 pueden tolerar condiciones ácidas y que algunas cepas persisten en medios que tienen un pH incluso de 2, o en sidra enfriada (8 ºC) durante 10-31 días. Se sospechó que las manzanas caídas estaban contaminadas por estiércol. Serie de brotes en restaurantes que se relacionaron con otro alimento ácido, el serotipo O157:H7 tolera la acidez. La fuente de epidemiológia y otros datos apuntaban a la mayonesa o a salsas similares, si bien se sospechó que la manipulación de la mayonesa o la contaminación de la misma con caldos de carne o productos cárnicos podrá haber sido su origen. Las fresas de Oregón han causado el primer brote de Escherichia.coli (E.coli) descubierto en esta fruta en EE UU. La bacteria, de momento, ha causado la muerte de una anciana y hubo 16 infectados. Canadá External, y la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los EE. UU. External investigaron un brote multiestatal de infecciones por Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) productora de la toxina de Shiga encontrado en lechuga romana de las regiones de cultivo de la costa central del norte y del centro de California. Veinticinco personas enfermas fueron hospitalizadas, incluidas dos que presentaron síndrome urémico hemolítico, un tipo de insuficiencia renal. No se notificaron muertes.