Revista De Farmacologia De Chile 2012 V 5 N2 Septiembre

   

 

 

  Panel de Editores:    La  Revista  de  Farmacología  de  Chile  tiene  un  panel  de  editores  conformado  por  connotados  farmacólogos nacionales que son miembros de la Sociedad de Farmacología de Chile y académicos de las  principales universidades chilenas.   

Comité Editorial:     Dr. Ramón Sotomayor‐Zárate, Editor en Jefe  Dr. Pablo Jara Picas, Co‐Editor  Dr. Hernán E. Lara         Dra. Viviana Noriega        Dr. Juan Carlos Prieto         Dra. Jacqueline Sepúlveda       Dr. Juan Pablo G. Huidobro‐Toro            

 

Dra. Katia Gysling     Dra. Inés Ruiz       Dr. Iván Saavedra S.     Dr. Alfonso Paredes V.   Dr. Rodrigo Castillo P.   Dra. Gabriela Díaz‐Véliz   Dr. Patricio Iturriaga‐Vásquez 

     

Dra. Myriam Orellana     Dra. María Elena Quintanilla   Dra. Teresa Pelissier S.    Dr. Javier Puente     Dr. Luis Quiñones     Dr. Patricio Saéz‐Briones   Dra. Coralia Rivas     Dr. Leonel Rojo      Dra. Lutske Tampier     Dra. Gladys Tapia     Dra. M. Antonieta Valenzuela   Dra. M. Araceli Valle     Dr. Luis Videla       Dr. Raúl Vinet       Dr. Bruce K. Cassels    Dr. Sergio Mora    

                               

     

 

Evaluadores Asociados:     Dr. Hugo F. Miranda     Dra. María Eugenia Letelier   Dr. Frederick Ahumada    Dr. Gonzalo Bustos O.    Dr. Raúl Corrales V.     Dr. Guillermo Díaz‐Araya   Dra. Verónica Donoso     Dr. Mario Faúndez     Dra. Jenny Fiedler     Dr. Miguel Reyes‐Parada   Dr. Yedy Israel       Dr. Ricardo Maccioni     Dra. Verónica Kramer     Dr. Sergio Lavandero     Dr. Juan Diego Maya     Dr. Antonio Morello          

                               

                               

                           

    Revista de Farmacología de Chile  Derechos Reservados Sociedad de Farmacología de Chile  ISSN 0718‐8811  versión impresa  ISSN 0718‐882X  versión digital    Todos los derechos reservados. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en sistema  alguno de tarjetas perforadas  o transmitida por otro medio ‐electrónico, mecánico, fotocopiador, registrador, etcétera‐ sin permiso previo por escrito del comité editorial.    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 1   

 

   

 

 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 2   

 

 

EDITORIAL 

   

 

Ramón Sotomayor‐Zárate, Ph.D  Editor en Jefe      Durante en año 2012, la Revista de Farmacología de Chile cumple 4 años de publicaciones seriadas. Sin duda es un  esfuerzo  muy  gratificante  que  nos  ha  permitido  mantenernos  como  órgano  nacional  de  la  difusión  de  la  farmacología.     Este esfuerzo no ha estado exento de dificultades, ya que durante los dos primeros años de la revista el número de  trabajos recibidos no eran suficientes para publicar más de un número por año. En la actualidad hemos logrado la  edición  de  volúmenes  temáticos  que  cuentan  con  artículos  originales  de  investigación  y  revisión,  que  nos  han  permitido  publicar  2  a  3  números  por  año.  En  este  enorme  esfuerzo  han  participado  destacados  científicos  nacionales  e  internacionales  que  han  enviado  manuscritos  a  publicar  en  los  números  de  Farmacología  Clínica,  Neurofarmacología y ahora de Fitofarmacología. Sin embargo, si queremos en un futuro que nuestra revista este  indexada  en  catálogos  electrónicos  como  Scielo  debemos  duplicar  este  esfuerzo,  ya  que  el  número  mínimo  de  artículos es de 40 publicados por año.    En representación del comité editorial de la Revista de Farmacología de Chile agradezco enormemente el esfuerzo  desplegado  para  la  edición  del  segundo  número  del  año  2012  y  solo  me  queda  invitarlos  nuevamente  a  enviar  artículos o proponer unidades temáticas específicas para próximas publicaciones. 

 

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EDITORIAL DE FITOFARMACOLOGÍA

   

 

    María Eugenia Letelier, MSc.  Editor Asociado 

    El desarrollo de la fitoterapia  se ha focalizado por décadas en la búsqueda de principios activos aislados presentes  en plantas. Este planteamiento está basado en  la presunción que una planta tiene uno o muy pocos compuestos  que determinan sus efectos terapéuticos. Sin embargo, los sistemas de medicina tradicional más antiguos como la  medicina China y la Ayurvédica  o también, la Fitoterapia Europea y la medicina nativa Latinoamericana, creen que  los  distintos  compuestos  presentes  en  las  plantas  actúan  sinérgicamente.    Por  lo  tanto,  extractos  totales  o  preparados polivalentes herbales presentarían mayor eficacia terapéutica que los principios activos aislados.    Actualmente  existe  un  interés  creciente  por  el  desarrollo  de  fitofármacos  en  base  a  extractos  totales  a  nivel  mundial. Algunas razones que permiten explicar este crecimiento se mencionan a continuación:    1.  Se  han  realizado  grandes  esfuerzos  económicos  y  de  tiempo  para  aislar  y  caracterizar  diferentes  compuestos de plantas y los resultados terapéuticos han sido sólo moderados.   2.  Las patologías en general son multifactoriales. Esto implica que diferentes dianas farmacológicas pueden  ser cubiertas para mejorar la eficacia terapéutica. La asociación de fármacos antioxidantes, al tratamiento  de enfermedades neurodegenerativas es un ejemplo.   3.  Fitofármacos  están  siendo  también  evaluados  en  su  capacidad  de  disminuir  reacciones  adversas  de  fármacos sintéticos, mejorando también de esta  forma la eficacia terapéutica de los fármacos sintéticos.  4.  El  desarrollo  de  las  nuevas  tecnologías  “ómicas”  como  métodos  de  alto  rendimiento  abre  nuevas  posibilidades  para  evaluar  mezclas  de  compuestos  previamente  aislados,  como  también  de  extractos  totales. Así, estas técnicas permitirán estandarizar preparados herbales polivalentes, como también definir  los mecanismos de acción de los mismos, debilidades que han permanecido en el tiempo, impidiendo la  validación de la acción terapéutica de este tipo de fitofármacos, por falta de estudios clínicos.     Latinoamérica es el continente que posee la mayor diversidad   de plantas medicinales y Chile, en forma especial,  un alto endemismo. Sin embargo, las plantas han sido escasamente exploradas, aunque ellas representan  una gran  fuente potencial de fármacos. Si a esto le sumamos la necesidad imperiosa de cubrir las necesidades de salud de  nuestra  población  tercermundista,  todo  está  dado  para  que  aunemos  fuerzas  y  lideremos  el  desarrollo  de  fitofármacos.     Finalmente, gracias a la directiva de la Sociedad de Farmacología de Chile, como también al Comité  Editor de la  Revista  de  Farmacología    por  su  iniciativa  de  editar  un  número  especial  de  productos  naturales.  Un  sincero  agradecimiento  también  a  todos  los  profesionales  que  han  contribuido  con  sus  trabajos  a  hacer  efectiva  esta  iniciativa. La diversidad de temas tratados mostrará a los lectores cuan grande es el camino que falta por recorrer y  la necesidad que existe de formar equipos multidisciplinarios para enfrentar este desafío.                         

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CONTENIDO 

   

 

Revista de Farmacología de Chile  AÑO 2012 VOLUMEN 5 NÚMERO 1    COLUMNA DE OPINIÓN:    LEGISLACIÓN EN CHILE SOBRE FITOFÁRMACOS Y PLANTAS MEDICINALES   Mirtha Parada V.    ARTÍCULOS ORIGINALES:    SAFETY PROFILE AND WOUND HEALING PROPERTIES OF A STANDARDIZED Buddleja globosa Hope (MATICO)  EXTRACT IN SPRAGUE‐DAWLEY RATS   María Eugenia Letelier y cols.    USO DE MODELOS ANIMALES EN EL ESTUDIO DE PLANTAS MEDICINALES CON PROPIEDADES ANSIOLÍTICAS Y  ANTIDEPRESIVAS.  Gabriela Díaz‐Véliz y Sergio Mora.    ESTUDIO DE UN EXTRACTO ESTANDARIZADO DE MAQUI RICO EN DELFINIDINAS EN EL MANTENIMIENTO DEL  BALANCE DE GLUCOSA.  Evelyn Jara y cols.    ARTÍCULOS DE REVISIÓN:    POLIFENOLES CON EFECTO ANTI‐HELICOBACTER PYLORI: FUENTES DE OBTENCIÓN Y SU POTENCIAL UTILIZACIÓN  EN FITOMEDICAMENTOS, NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES  Edgar R. Pastene y cols.    COMPUESTOS  NEUROACTIVOS  OBTENIDOS  DESDE  FUENTES  NATURALES:  CARACTERIZACIÓN  FARMACOLÓGICA DE NEUROMODULADORES DEL SNC.  Jorge Fuentealba Arcos y cols.    AVANCES EN LAS INVESTIGACIONES FARMACOLÓGICAS Y TOXICOLÓGICAS CON EL EXTRACTO ACUOSO DE LA  CORTEZA DEL ÁRBOL DE MANGO (Mangifera indica L.)  Gabino Garrido y Marisela Valdés.    MAQUI (Aristotelia chilensis): UN NUTRACÉUTICO CHILENO DE RELEVANCIA MEDICINAL  Jorge R. Alonso   

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COLUMNA DE OPINIÓN 

 

  LEGISLACIÓN EN CHILE SOBRE FITOFÁRMACOS Y PLANTAS MEDICINALES     Mirtha Parada V., Ph.D (c).   Subdepartamento de Registro, Agencia Nacional de Medicamentos, Instituto de Salud Pública de Chile 

    INTRODUCCIÓN:     Las plantas medicinales son un viejo recurso terapéutico y  han  sido  usadas  como  fuente  de  preparados  medicamentosos, actualmente se sabe que esta práctica se  debe  a  la  presencia  de  principios  activos  o  constituyentes  con acción terapéutica que están presentes en ellas.     El  hombre  prehistórico  observaba  el  comportamiento  instintivo de los animales a la hora de curar sus heridas o  paliar sus enfermedades, también aprendió a distinguir las  especies  comestibles  y  las  tóxicas,  para  luego  diferenciar  entre las plantas que poseían efectos medicinales y las que  no,  es  así  como  al  hombre  de  Neanderthal  se  le  encontraron  en  sus  pertenecías  granos  de  polen  de  seis  distintas especies vegetales con propiedades medicinales y  en  América  los  primeros  indicios  del  uso  de  plantas  medicinales  se  localiza  en  Monteverde,  sitio  arqueológico  ubicado  a  36  Km  de  Puerto  Montt,  donde  se  encontró  vestigios  de  boldo,  una  especie  no  endémica  del  lugar,  lo  que indica el conocimiento terapéutico de las plantas.     En Chile antes de la llegada de los españoles, los mapuches  dentro  de  sus  elementos  terapéuticos  usaban  las  hierbas  medicinales, y tenían conocimiento de más de 200 plantas  con  propiedades  terapéuticas.  de  la  época  como  la  mejor  botica  de  ese  entonces  en  Santiago,  fabricaba  un  gran  número  de  preparados  con  plantas  medicinales,  de  estos  un porcentaje considerable con plantas autóctonas        

         

chilenas, lo que consta en el catastro elaborado en el año  1772  por  el  hermano  José  Zeitler  quien  se  quedó  por  un  periodo en la farmacia luego de la expulsión de los jesuitas.    En  la  época  de  la  colonia  la  botica  de  los  jesuitas,  inaugurada  en  el  año  1647,  referida  por  los  historiadores  En la actualidad, las plantas medicinales de uso más común  en Chile reconocen como origen las fuentes nativas usadas  por  los  mapuches  principalmente  y  especies  asilvestradas  traídas  por  los  europeos  y  constituyen  un  importante  recurso terapéutico.    MARCO REGULATORIO    Tanto  en  los  países  desarrollados  como  los  que  están  en  vías de desarrollo el uso de medicamentos elaborados con  plantas  medicinales  muestra  un  crecimiento  acelerado  en  estos  últimos  años.Estas  plantas  son  empleadas  como  materia  prima  por  una  amplia  gama  de  empresas  que  utilizan  con  menor  o  mayor  grado  de  industrialización  los  compuestos  que  se  derivan  de  ellas.  Es  así  como  se  elaboran  infusiones,  aceites,  extractos,  polvos,  fragancias,  productos  para  el  cuidado  personal,  suplementos  dietéticos, alimentos funcionales, fitofármacos y productos  de uso industrial y de aplicación en la agricultura. Se estima  que el 30% de los fármacos que se comercializan y el 40%  de  los  que  se  encuentran  en  pruebas  clínicas,  son  derivados de plantas medicinales.      

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  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 7   

 

 

    En el mundo en general se están haciendo esfuerzos para  legislar  en  torno  al  tema  y  armonizar  criterios  en  la  regulación  de  los  Fitofármacos.  Por  ejemplo,  durante  una  reunión  de  la  Red  Iberoamericana  de  Productos  Fitofarmacéuticos  (RIPROFITO),  en  Guatemala  en  el  año  1996,  se  reconoció  la  necesidad  de  recopilar  las  dispersas  legislaciones  iberoamericanas  sobre  estos  productos  culminando  con  una  obra  que  reunió  normativas  de  15  países.     Por  otro  lado,  en  Europa,  la  Comunidad  Europea  ha  elaborado  en  estos  últimos  años  una  reglamentación  armonizada  para  los  fitofármacos  y  los  productos  naturales.    En  Chile  se  han  realizado  actividades  que  agrupan  a  entidades  del  ámbito  privado‐productivo,  académico  e  institucional  en  relación  a  las  estrategias  a  seguir  en  la  producción de las plantas medicinales y a la regulación de  los productos que de ella derivan. El FIA (Fundación para la  Innovación  Agraria)  agrupó  a  distintos  sectores  con  el  objetivo  de  establecer  un  vínculo  permanente  que  permitiera  una  coordinación  y  articulación  regional  de  los  sectores productivo, académico, industrial y público. Por su  parte  el  Ministerio  de  Salud  ha  promovido  los  cambios  reglamentarios  para  garantizar  el  uso  racional  de  los  medicamentos elaborados con plantas medicinales.     En  estos  últimos  años  los  reglamentos  han  sido  modificados  y  complementados  de  acuerdo  a  los  requerimientos  actuales.  Por  ejemplo  el  Reglamento  del  Sistema  Nacional  de  Control  de  Productos  Farmacéuticos  D.S.  Nº  1876/95,  fue  modificado  en  1999  por  el  DS  Nº  855/98  creando  la  categoría  de  Producto  Farmacéutico  Complementarios,  decreto  que  fue  posteriormente  derogado  y  reemplazado  por  el  D.S.  Nº  286  de  2001  que  modificó el DS 1876/95 y creó la categoría de fitofármaco.  Actualmente  el D.S.  1876  ha  sido  reemplazado por  el  D.S.  Nº 3/10, que entra en vigencia el 26 de Diciembre de 2011  (que  aprueba  el  Reglamento  del  Sistema  Nacional  de  Control  de  Productos  Farmacéuticos  de  Uso  Humano),  donde  se  incluyen  las  definiciones  de  fitofármacos  y  los  requisitos  para  su  regulación,  siendo  el  Instituto  de  Salud  Pública quien las debe aplicar.     El  Instituto  de  Salud  Pública  de  Chile  (ISP)  es  la  entidad  gubernamental  encargada  de  implementar  los  cambios  reglamentarios,  ya  que  se  trata  de  un  servicio  público  funcionalmente  descentralizado,  que  posee  autonomía  de  gestión  y  está  dotado  de  personalidad  jurídica  y  de  patrimonio propio. Depende del Ministerio de Salud para la  aprobación de sus políticas, normas y planes generales de  actividades, así como en la supervisión de su ejecución.     

DEFINICIONES  Y  REQUISITOS  PARA  REGISTRO  DE  FITOFÁRMACOS Y PLANTAS MEDICINALES DS N° 3/10:    En  el  artículo  10º  se  hace  referencia  a  las  especialidades  farmacéuticas,  de  acuerdo  a  su  naturaleza,  la  letra  d)  de  este artículo se refiere a los fitofármacos.     El artículo 14º de este decreto define a los fitofármacos.    Cuadro 1: Definición de Fitofármaco 

  Artículo  14º:  Son  fitofármacos,  aquellas  especialidades  farmacéuticas  cuyos  ingredientes  activos  provienen  de  las  partes  aéreas  o  subterráneas  de  plantas  u  otro  material  vegetal  y  están  debidamente estandarizados 

  El artículo 27º hace mención a los medicamentos herbarios  tradicionales cuya definición se detalla en el cuadro 2.    Cuadro 2: Definición de Medicamentos Herbarios Tradicionales 

  Artículo  27º:  Se  entenderá  por  medicamentos  herbarios  tradicionales,  aquellos  constituidos  por  las  plantas  o  partes  de  plantas,  frescas  o  desecadas,  enteras  o  trituradas,  envasadas  y  etiquetadas  artesanalmente  y  rotuladas  con  la  denominación  utilizada por la costumbre popular en el ámbito de las tradiciones  culturales  chilenas,  que  hayan  sido  reconocidas  en  la  respectiva  norma técnica aprobada por decreto supremo del Ministerio, a la  que alude en el párrafo siguiente. Se entenderán registrados para  los efectos de su libre venta y distribución, por el sólo hecho que  la SEREMI competente haya autorizado el establecimiento donde  se almacenan, elaboran, fraccionan  o envasan  o se realizan otras  actividades  propias  de  su  procedimiento,  debiendo  cumplir  las  siguientes condiciones:     a.  Deberán estar en un listado contenido en una norma técnica  aprobada por decreto supremo del Ministerio, dictada en uso  de  sus  atribuciones  legales  técnico  normativas,  la  que  señalará la denominación, propiedades terapéuticas y usos de  cada  una  de  ellas,  debiendo  ser  empleadas  como  auxiliares  sintomáticos.     b.  Estar  envasadas  artesanalmente  como  especies  vegetales  aisladas, no mezcladas.    c.  Consignar  en  sus  rótulos  sólo  aquellas  propiedades  reconocidas en el decreto aludido precedentemente 

  En el cuadro 3 se aprecia el listado de plantas autorizadas  como  medicamentos  herbarios  tradicionales  mediante  resoluciones exentas N° 522 y 190, de fechas 16 de agosto  de 2007 y 31 de marzo de 2008, respectivamente.       

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 8   

 

 

    Cuadro 3: Listado de Medicamentos Herbarios Tradicionales   

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60.

Acaena splendens Hook. Et Arn.  Acantholippia deserticola (Phil.) Moldenke  Achillea millefolium L.  Agathosma betulina (Bergius)Pill.  Aloe barbadensis Mill.  Aloysia citrodora Paláu  Arctium lappa L.  Aristotelia chilensis (Mol.)Stuntz  Arnica montana L.  Artemisia absinthium L.   Bauhinia forficata Link subsp. pruinosa   (J.Vogel)  Fortunato et Wunderlin  Betula pendula Roth   Borago officinalis L.  Buddleja globosa Hope   Calceolaria thyrsiflora Grah.  Calendula officinalis L.  Capsella bursa‐pastoris (L.) Medik.  Chenopodium chilense Schrad.  Centaurium cachanlahuen B.L. Rob.  Cestrum parqui L’Herit.  Cichorium intybus L.  Citrus aurantium L.   Crataegus monogyna Jacq.  Cuscuta chilensis Ker‐Gawl.  Cynara scolymus L.    Drimys winteri J.R. et G. Forster   Durvillea antarctica (Chamissso)Arito   Ecballium elaterium (L.) A. Rich.  Elytrigia repens (L.)Nevski   Ephedra chilensis K. Presl  Equisetum bogotense Kunth  Eucalyptus globulus Labill.  Fabiana imbricata R.et P.  Flaveria bidentis (L.) O. Kuntze  Foeniculum vulgare Mill.  Fuchsia magellanica Lam.  Fumaria officinalis L.   Geum chiloense Balb. ex Ser.  Gunnera tinctoria (Mol.) Mirb.  Haplopappus baylahuen Remy   Hypericum perforatum L.  Juglans regia L.  Juniperus communis L.   Lampaya medicinalis F. Phil.  Laretia acaulis (Cav.) Gill. et Hook.   Lavandula angustifolia Mill.  Libertia sessiliflora (Poepp.) Skottsb.   Linum usitatissimum L.   Lomatia hirsuta (Lam.) Diels ex Macbr.   Luma chequen (Mol.) A.Gray  Malva sylvestris L.  Margyricarpus pinnatus Kuntze  Marrubium vulgare L.  Matricaria recutita L.  Maytenus boaria Mol.   Melissa officinalis L.  Mentha x piperita     Mentha pulegium L.  Morus nigra L.  Muehlenbeckia hastulata I.M.Johnst. 

61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104.

Ocimum basilicum L.   Olea europaea L.   Otholobium glandulosum (L.)Grimes     Paspalum vaginatum Swartz   Persea americana Mill.   Petasites fragrans (Vill.)C.Presl   Peumus boldus Mol.   Pimpinella anisum L.   Pinus radiata D.Don   Plantago lanceolata L.   Plantago major L.   Polypodium feuillei Bertero   Porlieria chilensis Johnst.    Pseudognaphalium viravira (Mol.) A. Anderb.    Punica granatum L.   Quillaja saponaria Mol.   Quinchamalium chilense Mol.    Rhamnus frangula L.   Ribes cucullatum H. et A.    Rosa moschata Herrm.   Rosmarinus officinalis L.   Rumex conglomeratus Murria.   Ruta chalepensis L.   Salix humboldtiana Willd.    Salvia officinalis L.   Sambucus nigra L.   Schinus areira L.    Senecio fistulosus Poepp. ex Less.    Senna alexandrina Miller   Senna stipulacea (Aiton)Irv. et Barneby   Solanum ligustrinum Lodd.   Spartium junceum L.   Tanacetum parthenium (L.)Sch.Bip.   Taraxacum officinale agg.Weber    Thymus vulgaris L.   Tilia cordata Mill.   Trigonella foenum‐graecum L.   Tristerix tetrandrus Mart   Tropaelum majus L.   Urtica dioica L.   Valeriana officinalis L.    Verbascum thapsus L.   Verbena litoralis H.B.K      Zea mayz L. 

   

Además en el párrafo segundo de los requisitos del registro  sanitario,  artículo  28º,  se  señala:  “Las  solicitudes  de  registro  sanitario  deberán  ser  presentadas  ante  el  Instituto,  cumpliendo  con  los  requisitos  generales  y  especiales que se determinan en este Título. Los requisitos  generales  de  registro  comprenden  aspectos  administrativos,  de  información  técnica,  de  calidad  farmacéutica y de seguridad y eficacia clínica del producto  farmacéutico  a  registrar,  que  son  de  común  aplicación  a  todos  los  registros;  por  su  parte,  los  requisitos  especiales  derivan  de  la  naturaleza  de  ellos  y  de  cuya  procedencia  y  veracidad  debe  responsabilizarse  el  profesional  que  suscribe la solicitud”.  

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    Por  su  parte  el  artículo  40º  menciona  los  requisitos  especiales  que  deberán  cumplir  los  fitofármacos,  se  describen en el cuadro 4.    Cuadro 4: Requisitos especiales para fitofármacos.   

Artículo  40°:  Para  el  registro  de  fitofármacos  atendida  su  naturaleza, se tendrán en consideración las siguientes precisiones:    a. La  seguridad  deberá  ser  avalada  con  la  presentación  de  estudios pre‐clínicos, toxicológicos en animales y clínicos fase  I,  mientras  que  la  eficacia  debe  ser  avalada  con  estudios  clínicos  fase  II  y  III.  En  los  casos  en  que  exista  información  proveniente de literatura oficial de los diferentes organismos  internacionales o extranjeros, tales como OMS, FDA o EMEA;  al momento de solicitar un registro sanitario, esta se aceptará  como válida en reemplazo de la anterior.    b.  Las solicitudes de registro deberán ceñirse a lo establecido en  los requisitos generales del registro, con las siguientes reglas  especiales:   b.1.  No  se  requerirá  la  presentación  de  estudios  de  equivalencia  terapéutica  al  momento  de  su  registro  o  en  sus  posteriores modificaciones.  b.2.  Se  deberá  incluir  la  descripción  del  proceso  de  fabricación.  b.3.  Su  denominación  genérica  corresponderá  a  la  denominación taxonómica botánica del vegetal que aporta el  o los ingredientes activos.  b.4.  La  expresión  de  su  fórmula  cuali‐cuantitativa  deberá  incluir:  el  tipo  de  preparación  vegetal  empleada,  tales  como  extracto  seco,  extracto  fluido,  extracto  blando,  polvo  u  otro;  seguido de la o las partes del vegetal que se emplean, más su  nombre  científico  con  su  concentración  y  su  equivalencia  en  un marcador vegetal, cuando corresponda.  b.5.  No  podrán  incluir  sustancias  estupefacientes  o  psicotrópicas, ni mezclas con medicamentos alopáticos.  b.6. La identidad y pureza de los componentes se establecerá  de  acuerdo  con  lo  que  dispongan  las  farmacopeas  o  las  fuentes  de  información  científica  internacionales  o  extranjeras,  debiendo  presentarse  la  correspondiente  validación de la metodología analítica propuesta.  b.7. La metodología analítica para la evaluación del producto  terminado  así  como  sus  materias  primas  deberá  aparecer  en  alguna de las farmacopeas oficialmente aceptadas en nuestro  país  o  en  fuentes  de  información  científica  extranjeras  o  se  deberá  presentar  la  correspondiente  validación  de  la  metodología analítica propuesta.  b.8.  Deberán  cumplir  con  las  especificaciones  de  producto  terminado de acuerdo a la forma farmacéutica en que ellos se  presenten, sin embargo podrá exceptuarse la valoración del o  los  principios  activos  en  el  producto  terminado,  reemplazándose  ésta  por  la  valoración  del  marcador  vegetal  específico.  b.9.  No  se  considerarán  fitofármacos  los  productos  que  contienen principios activos aislados o sintéticos, aunque sean  preparados de materia prima de origen vegetal. 

       

TEXTOS  OFICIALES  UTILIZADOS  EN  EL  PROCESO  DE  EVALUACIÓN DEL REGISTRO SANITARIO:     En  el  proceso  de  evaluación  del  Registro  Sanitario  se  ocupan  diversos  textos  considerados  oficiales  y  que  dan  cuenta  de  diferentes  aspectos  importantes  a  tener  en  consideración a la hora de evaluar un registro sanitario de  esta  naturaleza  y  asegurar  de  este  modo  que  cumpla  los  requisitos de calidad, seguridad y eficacia.     Monografías de calidad:   Farmacopeas:  En  la  que  se  encuentra  la  definición  química,  características,  identificación,  ensayos,  valoración, conservación.    Monografías de eficacia y seguridad  Comisión E: La que describe definición, composición,  indicación  de  uso,  contraindicaciones,  efectos  adversos,  interacciones,  posología,  método  de  administración, acción.    Monografías de eficacia y farmacología / toxicología  Monografías  ESCOP:  Donde  aparecen  advertencias,  precauciones, otras formas de interacción, embarazo  y  lactancia,  sobredosis,  propiedades  farmacológicas,  estudios clínicos, farmacocinética, toxicidad.    Monografías  de  calidad,  eficacia  y  farmacología  /  toxicología  Monografías  de  la  OMS:  La  finalidad  de  estas  monografías  es  favorecer  la  armonización  en  el  uso  de  los  fitofármacos  en  lo  referente  a  niveles  de  seguridad, eficacia y control de calidad      CLASIFICACIÓN DE LOS FITOFÁRMACOS    Todo registro sanitario, debe tener un número y una letra  que  permita  distinguir  la  categoría  a  la  que  pertenece,  es  así como los fitofármacos deben clasificarse de la siguiente  manera:  N‐Nº  correlativo/año  registro:  distinguirá  exclusivamente a fitofármacos.     

BIBLIOGRAFÍA:    1.    2.    3. 

  4. 

Código Sanitario, D.F.L. Nº 725/68.  Reglamento  de  Farmacias,  Droguerías,  Almacenes  Farmacéuticos  Botiquines y  Depósitos autorizados, D.S. Nº 466 de 1984.  Reglamento  del  Sistema  Nacional  de  Control  de  Productos  Farmacéuticos,  Alimentos  de  Uso  Médico  y  Cosméticos,  D.S.  Nº  1.876/95.  Reglamento  del  sistema  nacional  de  Control  de  los  productos  farmacéuticos de uso humano, DS N°3/10. 

 

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    5.    6.    7.    8. 

  9. 

Fundación para la Innovación Agraria (FIA), “Como producir y procesar  plantas medicinales y aromáticas de calidad”, año 2003. 

10.  SANDOVAL  M.,  CARMEN.  Desarrollo  de  los  Estudios  de  Farmacia  en  Concepción (Chile), Anal. Real Academia Nacional Farmacéutica, 2002    11.  The Complete German Commission E Monographs, Therapeutic Guide  to  Herbal  Medicines,  Blumrnthal,  Americal  Botanical  Council  Austin,  Texas, 1998    12.  Colegio Químico Farmacéutico y Bioquímico de Chile A.G., Historia de  una profesión 1942 – 60 años, año 2002.    13.  Monte  Verde:  Un  asentamiento  humano  del  pleistoceno  tardío  en  el  sur. de Chile, Santiago, LOM Ediciones, ISBN 956‐282‐659‐7, 2004.    14.  Farga C, Lastra J. Plantas Medicinales de uso común en Chile, PAESMI,  1988. 

Modificación  de  los  Decretos  Supremos  Nºs  1.876/95,  977/96  y  855/98.  Resolución exenta N° 522/07 y 190/08  Fundación  para  la  Innovación  Agraria,  “Agenda  para  la  Innovación  Agraria, requerimientos y acciones de Innovación para un conjunto de  15 cadenas productivas y temas de agricultura”, año 2006.  WHO Monographs on Selected Medicinal Plants – Volume I, II, Geneve,  World Health Organization, 2002. 

         

       

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ARTÍCULO ORIGINAL 

   

  SAFETY PROFILE AND WOUND HEALING PROPERTIES OF A STANDARDIZED Buddleja globosa  Hope (MATICO) EXTRACT IN SPRAGUE‐DAWLEY RATS    

  María Eugenia Letelier , Rodrigo Jones , Carolina López1, Karina Palma1, Paula Aracena1,2, Iván  Razmilic3, Ximena Polanco4, Hermine Vogel5    1

1

 

1

 Laboratory of Pharmacology and Toxicology A, Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, Facultad de Ciencias Químicas y  Farmacéuticas, Universidad de Chile, Santiago, Chile.  2  Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepción, Chile.  3  Institute of Chemistry of Natural Resources, Universidad de Talca, Talca, Chile.  4  Laboratorios Ximena Polanco, Santiago, Chile.  5  Department of Horticulture, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Talca, Talca, Chile.       

ABSTRACT  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

Buddleja globosa Hope (matico) is a Chilean plant used by native medicine mainly in the treatment of wound healing and as an  anti‐inflammatory  agent.  We  have  developed  a  standardized  hydroalcoholic  extract  from  matico  leaves,  in  terms  of  total  polyphenolic content. This extract may be useful in accelerating the wound healing process. To this end, we studied the in vivo  effects of this extract in a rat model, in terms of general homeostasis. Data showed that oral treatment of adult male Sprague‐ Dawley rats with this extract, for up to 12 days, did not alter their hemogram and clinical chemistry parameters. In addition, we  showed that topical treatment with the same extract was able to accelerate wound healing in these animals, most likely through  shortening the inflammatory stage of the healing process. Altogether, our data demonstrate that local effects of this particular  standardized matico extract are likely to retain their wound healing properties while not altering the general homeostasis of the  animals. We discuss these results in terms of the possible pharmacological applications of this extract.   

Keywords: Buddleja – Safety – Rats, Sprague‐Dawley – Wound Healing  Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

    INTRODUCTION     Buddleja  globosa  Hope  (matico)  is  a  widely  used  plant  in  Chilean  traditional  medicine,  mainly  due  to  its  anti‐ inflammatory  and  wound  healing  properties  (1‐4).  In  vitro  studies report that active principles found in extracts from  matico leaves display antioxidant activity. Noteworthy, this  antioxidant  activity  appears  to  be  correlated  with  the  content of polyphenols of these extracts (5, 6).     Since  oxidative  stress  is  a  hallmark  of  inflammatory  processes  (7),  the  anti‐inflammatory  activity  displayed  by  matico  extracts  may  be  explained  in  terms  of  their  antioxidant activity.    

       

Also,  these  extracts  have  been  reported  to  promote  fibroblast proliferation in vitro (4), which in addition to the  antioxidant  activity,  may  account  for  the  wound  healing  properties associated with these extracts.    There  are  several  studies  showing  the  therapeutic  potential  of  matico  extracts  (1,  4,  8‐13).  On  the  basis  of  these  studies,  it  is  possible  to  apply  such  therapeutic  potential  of  matico  extracts  to  the  treatment  of  diverse  pathologies.  Nonetheless,  development  of  phytodrugs  based on these extracts first requires the use of an extract  obtained  through  a  standardized  process,  in  order  to  obtain reproducible data. 

    ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐  Corresponding  author:  María  Eugenia  Letelier,  MSc.  Laboratory  of  Pharmacology  and  Toxicology  A,  Department  of  Pharmacological  and  Toxicological  Chemistry,  Facultad  de  Ciencias  Químicas  y  Farmacéuticas,  Universidad  de  Chile.  Sergio  Livingstone  Pohlhammer  1007,  Independencia,  Santiago,  Chile  8380492.  Tel:  56‐2‐ 9782885, Fax: 56‐2‐9782996, E‐mail: [email protected]   

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 13   

 

    We  have  obtained  a  standardized  hydroalcoholic  extract  from  matico  leaves,  using  a  vegetable  drug  that  displays  reproducible  total  polyphenol  content  (14,  15).  We  have  also shown that this matico extract behaves as an in vitro  antioxidant:  i)  inhibiting  oxygen  consumption  elicited  by  Cu2+/ascorbate, a superoxide anion generating system (6),  and  ii)  preventing  lipid  peroxidation  and  thiol  loss  in  rat  2+ liver  microsomes  exposed  to  Cu /ascorbate  (6).  In  the  present work, we conducted an in vivo study to assess the  effects of this matico extract on the general homeostasis of  a  rat  model.  To  this  end,  adult  male  Sprague‐Dawley  rats  were subjected to an acute treatment (up to 12 days) with  the  extract,  administered  in  three  oral  doses  per  day.  General homeostasis of the animals was followed in terms  of  hemogram  and  clinical  chemistry  data.  Our  study  showed  that  this  extract  failed  to  elicit  alterations  of  the  general animal homeostasis.    To  evaluate  that  this  matico  extract  still  exhibited  therapeutic potential, we assessed its ability to accelerate  the  wound  healing  process  in  vivo.  With  this  purpose,  we  used a skin wound model in Sprague‐Dawley rats to assess  the  effect  of  topical  treatment  with  this  matico  extract  in  wound  healing  time.  Animals  topically  treated  with  this  extract  significantly  decreased  the  wound  healing  time,  in  comparison with those that did not receive treatment. This  effect  was  apparently  due  to  a  shortening  of  the  inflammatory  stage,  as  assessed  by  COX‐2  levels,  and  the  acceleration of cellular proliferation rate, as evaluated with  a  proliferation  marker  (Ki‐67).  We  discuss  the  possible  relationship  between  the  antioxidant  properties  of  this  extract and the observed in vivo benefits.      MATERIAL AND METHODS    1. Material. Extracts from Buddleja globosa Hope (matico)  leaves  were  provided  by  the  plant‐based  pharmaceutical  laboratory, Laboratorios Ximena Polanco (Chile). Extraction  process  details  are  proprietary  information  of  the  company.  General  chemical  and  organoleptic  characteristics  of  these  extracts  are  shown  in  Table  1.  Folin‐Ciocalteu´s  reagent  and  catechin  were  from  Sigma‐ Aldrich (USA). Rabbit antibodies against rat and human Ki‐ 67  and  COX‐2  were  from  Affinity  BioReagents  (USA).  All  other reagents were of the best grade available.    2.  Determination  of  total  polyphenols.  The  total  polyphenol  content  of  the  extract  was  determined  as  previously described (5), using catechin as a standard.    3. Animals. Male Sprague‐Dawley rats (200‐230g) were fed  with  normal  pellet  diet  and  water  ad  libitum,  in  a  12:12  light/dark  cycle  at  21°C.  Animals  were  maintained  in  the  vivarium  of  the  Facultad  de  Ciencias  Químicas  y  Farmacéuticas,  Universidad  de  Chile.  All  procedures  were 

  performed according to the “Guide for the Care and Use of  Laboratory Animals” (NRC, USA).    4.  Acute  toxicity  protocol.  Dosage  of  the  matico  extract  was  calculated  from  proprietary  information  of  Laboratorios  Ximena  Polanco.  Doses  were  diluted  in  deionized  water  for  oral  delivery  per  gavage.  Rats  were  distributed into 2 experimental groups: Control (deionized  water) and matico extract (three daily doses of 18.4µmol‐ equivalents  catechin/Kg).  Animals  were  treated  with  the  extract for up to 12 days. At different stages of treatment  (detailed  in  the  text),  rats  from  each  group  were  anaesthetized with ether and sacrificed by exsanguination  through  cardiac  puncture.  Blood  samples  were  used  for  hemogram  and  clinical  chemistry.  This  protocol  was  approved  by  the  Bioethical  Committee  of  the  Facultad  de  Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile.     5.  Wound  healing  protocol.  Rats  were  distributed  in  2  experimental  groups:  Control  (untreated)  and  Experimental  (matico  extract).  Animals  were  anesthetized  with  i.p.  ketamine  and  xylazine  (90  and  10mg/Kg,  respectively) and a 1cm skin incision was performed with a  #4  blade  in  the  dorso‐cervical  area  of  each  animal.  The  Experimental Group was treated topically with the matico  extract,  in  a  dose  of  18.4µmol‐equivalents  catechin/Kg,  every  8  hours  for  up  to  7  days.  At  different  stages  of  treatment  (detailed  in  the  text),  rats  were  sacrificed  by  decapitation  and  skin  biopsies  were  obtained  for  histochemical  and  immunohistochemical  analysis.  This  protocol was approved by the Bioethical Committee of the  Facultad  de  Ciencias  Químicas  y  Farmacéuticas,  Universidad de Chile.     6.  Hemogram  study.  Hemogram  parameters  were  determined  at  the  Clinical  Laboratory  Centro  Médico  Baquedano  (Chile).  Parameters  analyzed  were  red  blood  cell  count  (RBC),  hematocrit,  hemoglobin,  mean  corpuscular  volume  (MCV),  mean  corpuscular  hemoglobin  (MCH),  mean  corpuscular  hemoglobin  concentration  (MCHC),  and  white  blood  cell,  lymphocyte  and  platelet  counts.    7.  Clinical  chemistry  study.  Clinical  chemistry  parameters  were determined at the Clinical Laboratory Centro Médico  Baquedano  (Chile).  Parameters  analyzed  were:  calcium,  phosphorus,  glucose,  blood  ureic  nitrogen,  cholesterol,  total  protein,  albumin,  total  bilirubin,  acid  phosphatase  (AP),  lactate  dehydrogenase  (LDH),  and  glutamyl  oxaloacetic transaminase (GOT).    8.  Histomorphological  analyses.  Hematoxylin‐eosin  staining  and  analyses  were  performed  in  skin  biopsies.  These  samples  were  also  used  to  measure  epidermal  thickness at the wound area.      Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 14 

 

 

    9.  Immunohistochemical  analysis.  COX‐2  and  Ki‐67  staining  (chromogenic  detection)  and  analyses  were  performed  in  skin  biopsies.  Analysis  for  positive  cells  was  performed  in  the  wound  area  (proximal  staining)  and  about 400μm from the wound area (distal staining). Distal  staining  was  used  as  an  internal  control  for  basal  COX‐2  and Ki‐67 staining.    10. Statistical Analyses. Results were analyzed on the basis  of  the  normal  distribution  of  data  from  Control  rats  for  each  parameter,  which  was  confirmed  by  D’Agostino  &  Pearson  normality  test.  Differences  between  control  ranges  for  each  hemogram  and  clinical  chemistry  parameter  and  ranges  obtained  by  each  treatment  were  analyzed  by  Wilcoxon  Signed  Rank  tests.  Analyses  of  immunochemical  markers  were  performed  using  two‐way  ANOVA  with  Bonferroni  post‐test.  All  described  statistical  analyses  were  performed  using  GraphPad  Prism  5.0.  Significances were set at a 95% confidence level.    RESULTS    1.  Effects  of  orally  administered  matico  extract  on  hemogram and clinical chemistry.     Throughout  the  entire  treatment  with  the  matico  extract,  all hemogram parameters remained unchanged and within  normal  (control)  ranges,  as  assessed  by  Wilcoxon  Signed  Rank  tests  (p>0.05).  Table  2  summarizes  these  findings,  including hemogram data found at the end of each study.  Most  clinical  chemistry  parameters  also  remained  unchanged throughout all treatments (p>0.05). These data  are summarized in Table 3, which includes results obtained  at  the  end  of  each  study.  According  to  Wilcoxon  Signed  Rank  tests,  plasma  lactate  dehydrogenase  (LDH)  and  aspartate  aminotransferase  (GOT)  were  significantly  decreased  (p<0.05,  Table  3)  following  treatment  with  the  matico extract.    2.   Wound healing study    2.1.  Macroscopic  observations  and  tissue  morphology.  Macroscopic  progression  of  the  wound  healing  process  during  the  7‐day  protocol  employed  is  shown  in  Figure  1.  Wound healing of animals treated topically with the matico  extract appears to progress at a higher speed than that of  untreated  animals  (Figure  1).  Skin  biopsies  were  obtained  at  different  stages  of  the  protocol  for  histomorphological  and  immunohistochemical  analyses  in  order  to  further  assess differences between untreated and treated animals.  Figure 2 shows  hematoxylin‐eosin staining daily images of  skin  biopsies.  This  staining  demonstrated  that  there  is  a  significant  increase  in  fibroblast  infiltration  in  the  animals  treated topically with the extract (arrowheads in Figure 2).  This  leads  to  an  acceleration  of  the  wound  healing  that  is  evident even at the first day of the process. 

  Table 1. Characterization of the matico extract 

    2.2. Immunohistochemical analyses.   We used COX‐2 as an inflammation marker and Ki‐67 as a  proliferation marker. To evaluate changes in levels of these  markers,  the  values  displayed  at  400µm  from  the  wound  area (distal) were used as basal expression levels. Figure 3  (COX‐2)  and  Figure  4  (Ki‐67)  show  the  difference  in  expression between the proximal (at the wound) and distal  areas.  COX‐2  levels  displayed  a  peak  that  was  reached  at  24  hours  following  wounding  the  animals  undergoing  treatment  with  the  matico  extract.  This  COX‐2  peak  was  reached  at  48  hours  in  the  case  of  animals  without  treatment (Figure 3). Noteworthy, COX‐2 levels at the end  of the study with the matico extract was significantly lower  (p<0.05) than that of untreated animals (p<0.05). Figure 4  shows  that  Ki‐67  positive  nuclei  also  display  peaks  at  24  and  48  hours  for  treated  and  untreated  animals,  respectively.  Finally,  we  measured  epidermis  thickness  in  animals treated or not with the matico extract. As shown in  Figure 5, thickness of the epidermal layer increased in time  following  wounding  of  the  animals,  reaching  a  maximum  after  2  or  3  days  in  the  cases  of  treated  or  untreated  animals, respectively.   

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 15   

 

 

    Table 2. Hemogram data following treatment of rats  with a standardized matico extract.   

Table 3. Clinical chemistry data following treatment of rats  with a standardized matico extract. 

 

 

    Data were obtained from blood samples of 4‐12 rats per group following  treatment  of  animals  with  the  matico  extract  for  12  days,  as  detailed  in  Material  and  Methods.  Ranges  presented  correspond  to  the  95%  confidence intervals for each parameter. RBC: Red blood cells; MCV: mean  corpuscular  volume;  MCH:  mean  corpuscular  hemoglobin;  MCHC:  mean  corpuscular  hemoglobin  concentration;  ESR:  erythrocyte  sedimentation  rate. p values were obtained from Wilcoxon Signed‐Rank analyses for each  parameter. 

    DISCUSSION    In  order  to  propose  the  use  of  an  herbal  extract  as  a  therapeutic strategy, several steps must be taken to ensure  the  safety  and  efficacy  of  such  extract.  Matico  extracts  have  been  widely  used  by  Chilean  traditional  medicine  in  anti‐inflammatory  and  wound  healing  therapies.  We  have  standardized  a  hydroalcoholic  extract  from  matico  leaves,  in  terms  of  total  polyphenol  content.  This  extract  displays  reproducible antioxidant properties in biological systems in  vitro, as we have previously described (6).  The present work was aimed to establish the safety of oral  treatment with this matico extract, using an acute toxicity  rat  model.  To  this  end,  we  assessed  general  animal  homeostasis,  by  evaluating  hemogram  and  clinical  chemistry  at  different  stages  of  a  12‐day  treatment.  Noteworthy,  we  used  a  high  dose  of  extract  (55.2µmol‐ equivalents  of  catechin/Kg/day),  considering  proprietary  information from the manufacturer.     

Data were obtained from serum samples of 4‐12 rats per group following  treatment  with  the  extract  for  12  days,  as  detailed  in  Material  and  Methods.  Ranges  presented  correspond  to  the  95%  confidence  intervals  for  each  parameter.  AP:  alkaline  phosphatase;  LDH:  lactate  dehydrogenase; GOT: aspartate aminotransferase. p values were obtained  from  Wilcoxon  Signed‐Rank  analyses  for  each  parameter.  *p<0.05  compared to control. 

  This  treatment  led  to  negligible  changes  in  general  homeostasis,  with  the  exception  of  a  decrease  in  plasma  activities  of  LDH  and  GOT.  These  activities  are  usually  considered  as  markers  of  hepatic  damage,  due  to  their  release  to  the  blood  stream  from  damaged  tissue.  Thus,  their  decrease  may  be  the  consequence  of  hepatoprotection  provided  by  this  matico  extract.  It  is  possible  this  protection  is  the  result  of  the  antioxidant  activity  of  this  extract,  as  it  has  been  shown  for  other  herbal  extracts  displaying  activities  as  hepatoprotectors  (16, 17). We are currently testing this hypothesis.     We  also  assessed  whether  the  matico  extract  retained  its  therapeutic  properties.  To  this  end,  we  evaluated  its  wound  healing  properties  in  a  rat  model  when  topically  administered. We found no evident adverse effects on the  skin  of  animals  topically  treated  with  the  extract.  Moreover,  the  extract  led  to  acceleration  of  the  wound  healing process that was evident not only macroscopically  but  also  in  terms  of  tissue  morphology,  and  inflammation  and  proliferation  markers.  Taken  together,  our  data  show  that  the  hydroalcoholic  matico  extract  most  likely  led  to  the  acceleration  of  the  inflammatory  phase,  which  was  accompanied  with  an  acceleration  of  the  proliferation    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 16 

 

 

 

    phase  of  wound  healing.  This  process  may  be  associated  with  the  redox  state  of  the  skin  tissue,  since  defects  in  wound  repair  of  skin  tissue,  usually  leading  to  keloid  formation,  have  been  associated  to  excessive  or  uncontrolled  oxidative  stress  (18).  Our  data  show  that  untreated  animals  displayed  delayed  wound  repair,  as   

assessed  by  measuring  epidermal  thickness.  Taken  together,  these  results  may  indicate  that  the  antioxidant  nature  of  the  matico  extract  is  likely  minimizing  oxidative  stress  processes  during  wound  healing,  which  leads  to  a  faster repair of the skin.     

Figure 1. Effect of the matico extract on the macroscopic progression of skin wound healing. 

 

  Animals  subjected  to  a  skin  wound  protocol  were  treated  topically  with  the  standardized  matico  extract  in  three  daily  doses,  as  detailed  in  Material  and  Methods. Representative photo images (n=4) of untreated (top row) and treated (bottom row) animals are shown, taken at the beginning (Initial) and 2 or 7 days  of the treatment. 

  In  summary,  the  standardized  hydroalcoholic  matico  extract  was  found  to  be  safe  and  retained  its  wound  healing  properties  in  a  rat  model.  The  extract  appears  to  be  safe  when  orally  or  topically  administered,  even  at  a  dose higher than that recommended by the manufacturer.  This is of particular relevance for herbal extracts, which are  mainly administered either orally or topically in traditional                 

medicine.  Moreover,  it  is  very  possible  that  the  mechanisms underlying these properties are associated to  its  high  content  of  polyphenols,  compounds  of  acknowledged  antioxidant  activity.  This  local  effect  of  the  matico  extract  can  be  exploited  for  the  treatment  other  conditions for which matico extracts have been employed  for millennia, such as a local anti‐inflammatory agent. 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 17   

 

 

   

Figure 2. Effect of the matico extract on the skin tissue morphology during the progression of wound healing. 

Skin  biopsies  from  animals  subjected  to  the  wound  healing  protocol  were  stained  with  hematoxylin‐eosin  for  analysis  of  tissue  morphology,  as  detailed  in  Material and Methods. Representative images (n=4) of untreated (top row) and treated (bottom row) of stained biopsies are shown, at different stages of the  treatment, as depicted at the top. Arrowheads indicate the sites were cellular proliferation can be observed at the wound region. 

      Figure 3. Effect of the matico extract on skin COX‐2 levels during the  progression of wound healing. 

  Figure 4. Effect of the matico extract on skin Ki‐67 levels during the  progression of wound healing.   

 

    Skin  biopsies  were  obtained  at  different  stages  of  the  wound  healing  protocol  and  stained  with  a  COX‐2  antibody,  as  detailed  in  Material  and  Methods. Presence of COX‐2 positive cells was recorded at the wound site  (proximal  region)  or  at  400 m  from  the  wound  site  (distal  region).  Data  represent  the  fold  change  in  the  difference  of  COX‐2  positive  cells  (proximal minus distal regions), considering the difference observed at the  beginning of the treatment as the unit. Data correspond to the mean of at  least  4  independent  experiments  ±  SEM.  *p<0.05  compared  to  samples  from untreated animals, as evaluated by two‐way ANOVA and Bonferroni  post‐test. 

 

  Skin  biopsies  were  obtained  at  different  stages  of  the  wound  healing  protocol  and  stained  with  a  Ki‐67  antibody,  as  detailed  in  Material  and  Methods. Presence of Ki‐67 positive nuclei was recorded at the wound site  (proximal  region)  or  at  400 m  from  the  wound  site  (distal  region).  Data  represent  the  fold  change  in  the  difference  of  Ki‐67  positive  nuclei  (proximal minus distal regions), considering the difference observed at the  beginning of the treatment as the unit. Data correspond to the mean of at  least  4  independent  experiments  ±  SEM.  *p<0.05  compared  to  samples  from untreated animals, as evaluated by two‐way ANOVA and Bonferroni  post‐test. 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 18   

 

   

  5.   LETELIER  ME,  CORTES  JF,  LEPE  AM,  JARA  JA,  MOLINA‐BERRIOS  A,  RODRIGUEZ C et al. Evaluation of the antioxidant properties and effects  on the biotransformation of commercial herbal preparations using rat  liver endoplasmic reticulum. Bol Latinoam Caribe Plantas Med Aromat.  2009; 8:110‐120. 

Figure 5. Effect of the matico extract on epidermal thickness during the  progression of wound healing. 

6.   LETELIER  ME,  MOLINA‐BERRIOS  A,  CORTES‐TRONCOSO  J,  JARA‐ SANDOVAL J, HOLST M, PALMA K et al. DPPH and oxygen free radicals  as pro‐oxidant of biomolecules. Toxicol In Vitro 2008; 22:279‐286.  7.   DE  LA  VILLEHUCHET  AM,  BRACK  M,  DREYFUS  G,  OUSSAR  Y,  BONNEFONT‐ROUSSELOT  D,  CHAPMAN  MJ  et  al.  A  machine‐learning  approach to the prediction of oxidative stress in chronic inflammatory  disease. Redox Rep. 2009; 14:23‐33.  8.   BACKHOUSE N, DELPORTE C, APABLAZA C, FARIAS M, GOITY L, ARRAU  S, et al. Antinociceptive activity of Buddleja globosa (matico) in several  models of pain. J Ethnopharmacol. 2008: 119:160‐165.        Skin  biopsies  were  obtained  at  different  stages  of  the  wound  healing  protocol  and  stained  with  hematoxylin‐eosin,  as  in  Figure  2.  Data  represent the fold change in the difference skin thickness (proximal minus  distal regions), considering the difference observed at the beginning of the  treatment  as  the  unit.  Data  correspond  to  the  mean  of  at  least  4  independent  experiments  ±  SEM.  *p<0.05  compared  to  samples  from  untreated animals, as evaluated by two‐way ANOVA and Bonferroni post‐ test.     

9.   HOUGHTON  PJ.  Ethnopharmacology  of  some  Buddleja  species.  J  Ethnopharmacol. 1984; 11:293‐308.  10.   LIAO  YH,  HOUGHTON  PJ,  HOULT  JR.  Novel  and  known  constituents  from  Buddleja  species  and  their  activity  against  leukocyte  eicosanoid  generation. J Nat Prod. 1999; 62:1241‐1245.  11.   MENSAH  AY,  HOUGHTON  PJ,  BLOOMFIELD  S,  VLIETINCK  A,  VANDEN  BERGHE  D.  Known  and  novel  terpenes  from  Buddleja  globosa  displaying  selective  antifungal  activity  against  dermatophytes  J  Nat  Prod. 2000; 63:1210‐1213.  12.   MENSAH AY, SAMPSON J, HOUGHTON PJ, HYLANDS PJ, WESTBROOK J,  DUNN  M  et  al.  Effects  of  Buddleja  globosa  leaf  and  its  constituents  relevant to wound healing. J Ethnopharmacol. 2001; 77:219‐226. 

ACKNOWLEDGMENTS  This  work  was  supported  by  the  Agricultural  Innovation  Fund grant #FIA‐ES‐C‐2005‐1‐A‐042.  

13.   PARDO F, PERICH F, VILLARROEL L, TORRES R. Isolation of verbascoside,  an  antimicrobial  constituent  of  Buddleja  globosa  leaves.  J  Ethnopharmacol. 1993; 39:221‐222. 

The authors declare no conflicts of interest. 

14.   VOGEL  H,  RAZMILIC  I,  POLANCO  X,  LETELIER  ME.  Effect  of  different  provenances  and  production  conditions  on  antioxidant  properties  in  Buddleja  globosa  leaves.  Bol  Latinoam  Caribe  Plantas  Med  Aromat.  2010; 9:333‐342. 

  REFERENCES:  1.   BACKHOUSE N, ROSALES L, APABLAZA C, GOITY L, ERAZO S, NEGRETE R  et  al.  Analgesic,  anti‐inflammatory  and  antioxidant  properties  of  Buddleja globosa, Buddlejaceae, J Ethnopharmacol. 2008; 116:263‐269. 

15.   VOGEL  H,  JELDRES  P,  RAZMILIC  I,  DOLL  U.  Morphological  characters,  yields  and  active  principles  in  wild  and  cultivated  accessions  of  the  Chilean  medicinal  plant  Buddleja  globosa  Hope.  Indust  Crops  Prod.  2011; 34:1322‐1326. 

2.   DOLL  U,  VOGEL  H,  JELDRES  P,  MUÑOZ  M.  Estudios  de  Propagación  Vegetativa  en  Matico  (Buddleja  globosa).  Ciencia  e  Investigación  Agraria:  Revista  Latinoamericana  de  Ciencias  de  la  Agricultura  2003;  30:211‐216. 

16.  VOGEL H, GONZALEZ M, FAINI F, RAZMILIC I, RODRIGUEZ J, MARTIN JS  et  al.  Antioxidant  properties  and  TLC  characterization  of  four  Chilean  Haplopappus‐species  known  as  bailahuen.  J  Ethnopharmacol.  2005;  97:97‐100. 

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4.   HOUGHTON  PJ,  HYLANDS  PJ,  MENSAH  AY,  HENSEL  A,  DETERS  AM.  In  vitro tests and ethnopharmacological investigations: wound healing as  an example. J Ethnopharmacol. 2005; 100:100‐107. 

18.   BLAŽIĆ TM, BRAJAC I. Defective induction of senescence during wound  healing is a possible mechanism of keloid formation. Med Hypotheses.  2006; 66:649‐652. 

 

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ARTÍCULO ORIGINAL 

 

    USO DE MODELOS ANIMALES EN EL ESTUDIO DE PLANTAS MEDICINALES CON PROPIEDADES  ANSIOLÍTICAS Y ANTIDEPRESIVAS.  (The use of animal models in the study of the anxiolytic and antidepressant properties of  medicinal plants)    

    Gabriela Díaz‐Véliz, M.Sc., M.Ed. y Sergio Mora, Q.F.       

Laboratorio de Farmacología del Comportamiento. Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de  Medicina. Universidad de Chile.     

RESUMEN  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

La limitada eficacia de los fármacos actualmente en uso para tratar algunos trastornos de ansiedad y depresión ha despertado el  interés en  la búsqueda de nuevas herramientas terapéuticas en el campo  de las plantas medicinales,  usadas como tales en  le  medicina  popular.  En  el  presente  trabajo  se  evaluaron  las  propiedades  tipo  ansiolítico  y/o  tipo  antidepresivo  de  tres  plantas  autóctonas  de  Latinoamérica,  recurriendo  a  la  aplicación  de  modelos  de  ansiedad  y  depresión  en  ratas.  La  administración  intraperitoneal  de  Annona  muricata  provocó  efectos  ansiolíticos  y  antidepresivos,  Salvia  elegans  produjo  efectos  sedantes  y  antidepresivos, mientras que Acantolippia deserticola demostró propiedades ansiolíticas. Los resultados permiten validar el uso  popular de las plantas estudiadas.   

Palabras Claves: ansiedad, depresión, plantas medicinales, modelos animales, laberinto en cruz elevado, natación forzada.    Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

  INTRODUCCIÓN     La  ansiedad  y  la  depresión  son  consideradas  estados  emocionales normales que contribuyen a la adaptación y la  supervivencia.  Sin  embargo,  constituyen  también  los  trastornos psiquiátricos más frecuentes en la población. Se  estima  que  más  del  20%  de  los  adultos  sufren  de  estos  trastornos en algún periodo de sus vidas (Buller, B., 2001).     La  Organización  Mundial  de  la  Salud  (WHO,  1999)  ha  predicho que, en el año 2020, la depresión se convertirá en  la  segunda  causa  de  muerte  prematura  o  incapacidad  laboral.  A  mediados  del  siglo  XX,  gracias  a  numerosos  descubrimientos  científicos,  fue  posible  disponer  de  fármacos  de  acción  más  selectiva  sobre  ansiedad  y  depresión  patológicas,  lo  cual  permitió  mejorar  significativamente  la  calidad  de  vida  de  los  pacientes  psiquiátricos.       

      Sin  embargo,  después  del  gran  entusiasmo  original,  la  medicina  basada  en  evidencia  se  ha  enfrentado  a  muchas  desilusiones.  Aproximadamente  dos  tercios  de  los  pacientes  ansiosos  o  deprimidos  responden  a  los  tratamientos  disponibles  en  la  actualidad  aunque  la  magnitud de la mejoría no siempre es satisfactoria. En los  últimos 20 años no se han obtenido fármacos más eficaces  que  las  benzodiacepinas  o  los  antidepresivos  inhibidores  selectivos de la recaptación de serotonina.   En  el  campo  del  tratamiento  de  la  ansiedad,  las  benzodiacepinas,  usadas  como  tratamiento  de  primera  elección  en  estados  de  ansiedad  aguda,  fallan  en  estados  de  ansiedad  crónica  y  han  sido  paulatinamente  desplazadas  por  los  antidepresivos  que  no  solo  son  eficaces  en  el  tratamiento  de  la  depresión  sino  que  también  en  el  tratamiento  a  largo  plazo  de  trastornos  de  ansiedad. 

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    Debido  a  la  limitada  eficacia,  acompañada  de  numerosas  reacciones  adversas,  de  los  fármacos  ansiolíticos  y  antidepresivos  actualmente  en  uso,  ha  surgido  la  necesidad  de  desarrollar  medicamentos  más  nuevos,  más  eficaces  y  mejor  tolerados.    Esto  ha  llevado  a  que,  en  los  años  recientes,  se  haya  reactivado  el  interés  en  los  productos  herbarios  como  medicinas  alternativas  o  complementarias  en  el  tratamiento  de  trastornos  psiquiátricos. Existe la sensación que algunas de las drogas  naturales  que  fueron  injusta  e  innecesariamente  desechadas  han  vuelto  lentamente  (Babic,  D.,  2007).  La  medicina  popular  de  muchas  regiones  del  mundo  ha  recurrido  desde  siempre  a  las  plantas  medicinales  para  aliviar  trastornos  afectivos  o  emocionales.  Además,  la  búsqueda  y  desarrollo  de  nuevas  terapias  de  trastornos  psiquiátricos  basadas  en  plantas  medicinales  ha  progresado  significativamente  en  las  últimas  décadas  (Zhang, Z.J., 2004). Esto se ha visto reflejado en el creciente  número de productos herbáceos que han sido introducidos  en la práctica psiquiátrica y en  el gran número de plantas  medicinales  cuyo  potencial  terapéutico  ha  sido  demostrado  en  una  variedad  de  modelos  experimentales  de psicopatologías (Zhang, Z.J., 2004).  La utilización de los  modelos  animales  ha  servido  no  solo  como  método  de  tamizaje  de  plantas  potencialmente  eficaces  y  seguras,  sino que también permite validar científicamente el uso en  medicina popular de estos productos.  En  nuestro  laboratorio  de  Farmacología  del  Comportamiento,  hemos  estado  interesados  en  verificar  las potenciales propiedades ansiolíticas y/o antidepresivas  de  plantas  medicinales  autóctonas  de  Latinoamérica,  recurriendo  a  la  aplicación  de  modelos  animales  previamente  validados  en  la  literatura  científica.  En  el  presente estudio se muestran los resultados obtenidos con  tres  extractos  hidroalcohólicos  de  plantas  de  diferente  procedencia  geográfica:  Annona  muricata  (Costa  Rica),  Salvia elegans (México) y Acantholippia desertícola (Chile).    MATERIALES Y MÉTODOS  1. Plantas empleadas:   1.1.  Annona  muricata  (Annonaceae),  “guanabana”  o  “graviola”,  es  un  árbol  de  hoja  perenne  endémico  del  Caribe,  México,  Centro  y  Sudamérica,  estrechamente  relacionado  con  la  chirimoya.  En  los  últimos  años,  el  extracto  de  guanábana  ha  sido  ampliamente  aclamado  como  posible  agente  anticancerígeno  (Monografía  Graviola).  Recientes  estudios  apoyan  los  efectos  antitumorogénicos  y  antimetastásicos  de  esta  planta  (Torres,  M.P.,  2012;  George,  V.C.,  2012).  Los  frutos  y  las  hojas  de  Annona  muricata  son  usados  en  medicina  tradicional por sus propiedades tranquilizantes y sedantes. 

  Además, se ha sugerido que el fruto de esta planta posee  efectos  antidepresivos  posiblemente  inducidos  por  alcaloides  isoquinolínicos  agonistas  de  receptores  5HT1A  (Hasrat, J.A., 1997).  1.2  Salvia  elegans  (Lamiaceae),  “mirto”,  “perritos  rojos”,  “limoncillo”  o  “flor  del  cerro”,  es  un  arbusto  perenne  nativo  de  México  ampliamente  usado  en  medicina  tradicional.  Sus  partes  aéreas  se  emplean  para  aliviar  trastornos  del  sistema  nervioso  central  y  se  le  denomina  como  “tónico  del  sistema  nervioso  para  liberar  estrés  y  tensión” (Aguilar, A., 1994).  1.3  Acantholippia  desertícola  (Verbenaceae),  “rica‐rica”,  es  un  arbusto  menor  muy  aromático  que  crece  abundantemente en el norte de Chile (2800‐4000 msm). En  los  pueblos  altiplánicos  (San  Pedro  de  Atacama,  Toconao,  Socaire)  se  utilizan  sus  ramas  y  hojas  para  tratar  dolores  estomacales,  problemas  renales  y  trastornos  circulatorios  (MHT).  Diversas  especies  del  genero  Acantholippia  han  sido  usados  en  medicina  popular  por  sus  efectos  analgésicos,  antiinflamatorios  y  afrodisiacos  (Gómez,  R.,  1991).  Estudios  preliminares  sugieren  propiedades  ansiolíticas  del  infuso  de  A.  desertícola  y  de  sus  aceites  esenciales (Leoncini., R., 2006).  2.  Animales:  En  los  experimentos  conductuales  se  utilizaron  ratas  Sprague  Dawley  machos  (200‐250  g  de  peso)  procedentes  del  Bioterio  del  Programa  de  Fisiopatología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de  Chile.  Estos  animales  fueron  mantenidos  en  grupos  de  6  por caja con libre acceso a comida y agua, temperatura de  22 ± 1 C y ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas. El protocolo  experimental  fue  aprobado  por  el  Comité  de  Bioética  en  Investigación  Animal  de  la  Facultad  de  Medicina,  Universidad de Chile.  3. Tratamiento: Los extractos liofilizados de A. muricata, S.  elegans  y  A.  desertícola  fueron  disueltos  en  agua  bidestilada  y  administrados  a  las  ratas  por  vía  intraperitoneal  (ip)  en  dosis  de  12,5,  25  y  50  mg/kg.  Diazepam,  1  mg/kg  ip,  fue  usado  como  ansiolítico  de  referencia  (control  positivo),  mientras  que  fluoxetina,  10  mg/kg  ip,  e  imipramina,  12,5  mg/kg  ip,  fueron  utilizados  como  antidepresivos  de  referencia.  Se  administró  agua  bidestilada (1 ml/kg) como control negativo.  4. Ensayos conductuales  4.1  Monitoreo  de  la  actividad  motora  espontánea.  El  registro de la actividad motora espontánea es fundamental  para  tener  una  primera  aproximación  de  los  eventuales  efectos  conductuales  de  una  droga  desconocida.  Esto  permite  evaluar  la  respuesta  del  animal  al  ser  expuesto  a  un  ambiente  desconocido  donde,  según  el  tratamiento  o  estado  basal,  puede  desarrollar  hipo  o  hipermotilidad.    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 22 

 

 

 

    Treinta  minutos  después  de  la  inyección  ip,  cada  rata  fue  colocada en una caja de acrílico  transparente (30 cm x 30  cm x 30 cm) al interior de una cámara aislada de sonido. La  caja se colocó sobre una plataforma de actividad (Lafayette  Instruments  Co.,  USA)  conectada  a  un  amplificador  y  un  contador electromecánico que registraba la motilidad total  del animal. El periodo de observación total fue de 30 min,  durante el cual se anotó la conducta cada 5 min para tener  un registro de la evolución de la actividad motora a través  del  tiempo.  Los  resultados  se  expresan  como  numero  de  cuentas durante los 30 min de observación.  4.2 Modelo Animal de Ansiedad laberinto en cruz elevado.  Este  ensayo  ha  sido  ampliamente  validado  para  medir  ansiedad en roedores (Pellow S., 1985; Lister, R.G., 1987).  Se  basa  en  la  aversión  que  sienten  estos  animales  por  los  espacios  abiertos  y  en  altura.  Se  utiliza  un  aparato  en  forma  de  cruz,  formado  por  dos  brazos  abiertos  (50  cm  x  10 cm), dos brazos cerrados (50 cm x 10 cm x 40 cm) y una  plataforma  central  (10  cm  x  10  cm),  dispuesto  de  tal  manera que los brazos del mismo tipo se oponen entre si.  El  laberinto,  construido  en  acrílico  negro,  está  situado  a  una altura de 70 cm desde el piso.  Una hora después de la  inyección  ip,  cada  animal  fue  colocado  en  el  centro  del  laberinto,  enfrentado  a  uno  de  los  brazos  cerrados.  Durante 5 minutos se registra el número de entradas a los  brazos  abiertos  y  cerrados  del  laberinto  y  el  tiempo  de  permanencia  en  cada  uno  de  estos  brazos  (Pellow,  S.,  1986). La entrada a cada brazo se define como el momento  en  que  el  animal  coloca  las  cuatro  patas  en  el  brazo  respectivo. Los resultados se expresan como porcentaje de  entradas  a  los  brazos  abiertos  y  porcentaje  de  tiempo  de  permanencia en estos brazos. El aumento de la exploración  y  la  mayor  permanencia  en  los  brazos  abiertos  se  consideran  como  reflejo  de  una  actividad  farmacológica  tipo ansiolítica.  4.3  Modelo  Animal  de  Depresión  de  Natación  Forzada.  Este  es,  probablemente,  el  modelo  farmacológico  más  utilizado  para  evaluar  actividad  antidepresiva  (Cryan,  J.F.,  2002).  Se  basa  en  el  principio  de  la  desesperanza  aprendida,  que  establece  que  todo  organismo  que  es  sometido a un evento estresante que no puede controlar y  del  cual  no  puede  escapar  desarrolla,  inicialmente,  ansiedad y posteriormente, si el evento se mantiene en el  tiempo, depresión. Cuando los roedores son colocados en  un cilindro con agua, al cabo de cierto tiempo desarrollan  inmovilidad  la  cual  reflejaría  la  cesación  de  la  conducta  orientada  al  escape.  El  método  fue  originalmente  desarrollado  por  Porsolt  (1977)  y  modificado  por  Lucky  (1997).  El  aparato  consiste  en  un  cilindro  de  acrílico  transparente  (50  cm  de  alto  x 20  cm  de diámetro)  que  se  completa  hasta  los  30  cm  de  altura  con  agua  a  temperatura ambiente (25°C). Habitualmente el ensayo se  realiza  en  dos  días;  durante  el  primero,  se  realiza  el  entrenamiento  o  aprendizaje,  en  el  que  cada  animal  es 

colocado durante 15 minutos en el cilindro, 24 horas antes  del  ensayo  de  natación.  La  droga  a  ensayar  se  administra   en tres ocasiones: inmediatamente después del periodo de  entrenamiento  de  15  minutos,  6  y  0,5  horas  antes  del  ensayo  de  natación.  Este  último  tiene  una  duración  de  5  minutos, tiempo en el cual un observador entrenado mide  la  duración  en  segundos  de  la  conducta  de  escalamiento,  definida  como  el  movimiento  hacia  delante  de  las  patas  anteriores sobre las paredes de la cámara, la conducta de  natación, definida como el movimiento de desplazamiento  en  la  cámara  de  natación,  incluyendo  el  cruce  de  un  cuadrante  a  otro  y  la  inmovilidad,  considerada  cuando  el  animal no hace mayores intentos por escapar, excepto los  movimientos necesarios para mantener el hocico fuera del  agua.  Los  resultados  se  expresan  en  términos  de  porcentajes de tiempo gastados en escalamiento, natación  e  inmovilidad.  Los  aumentos  en  la  duración    de  las  conductas  activas,  escalamiento  y  natación,  y  la  consiguiente  disminución  del  tiempo  de  inmovilidad  son  considerados como perfiles consistentes con un efecto tipo  antidepresivo (Cryan, J.F., 2002).  5.  Estadística:  Los  datos  se  expresan  como  el  promedio  ±  error  estándar  (ES)  de  8  a  11  ratas  por  cada  dosis  inyectada. Las comparaciones estadísticas entre grupos se  hicieron  aplicando  un  ensayo  de  ANOVA  seguido  del  ensayo  a  posteriori  de  Newman‐Keuls.  Las  diferencias  fueron  consideradas  significativas  cuando  p  fue  igual  o  menor de 0,05.  Tabla 1. Actividad motora espontánea 

  Los  datos  corresponden  al  promedio  ±  ES  de  8‐11  ratas  en  cada  dosis  inyectada.  *  p<0,001  comparado  con  los  controles  inyectados  con  agua  (ANOVA seguido de Newman‐Keuls para comparaciones múltiples). 

  RESULTADOS  Actividad  motora  espontánea:  En  la  Tabla  1  se  muestran  los  efectos  de  la  administración  de  los  extractos  de  A.  desertícola,  A.  muricata  y  S.  elegans,  sobre  la  actividad  motora espontánea de la rata, comparada con el solvente  (agua bidestilada). Todas las dosis de S. elegans produjeron  una  significativa  disminución  de  la  actividad  motora  sin  que se estableciera una relación dosis efecto. Por su parte,  los  extractos  de  A.  desertícola  y  A.  muricata  solo  produjeron  una  disminución  significativa  de  la  motilidad  con la administración de la dosis más alta (50 mg/kg).    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 23 

 

 

 

    Exploración del laberinto en cruz elevado: En la figura 1 se  presentan los efectos de A. Muricata y A desertícola en el  ensayo  del  laberinto  en  cruz  elevado  (LCE).  Ambos  extractos  aumentaron  la  exploración  y  la  permanencia  en  los  brazos  abiertos  del  LCE.  Todas  las  dosis  administradas  produjeron  efectos  significativos  sobre  estos  parámetros  conductuales  y  no  se  apreciaron  diferencias  significativas  con  respecto  a  los  efectos  inducidos  por  diazepam  1  mg/kg.  Respecto  al  extracto  de  S.  elegans,  éste  no  indujo  efectos significativos sobre la exploración del LCE.    Figura 1. 

Ensayo de natación forzada: En Tabla 2 se pueden apreciar  los  efectos  de  los  extractos  de  las  plantas  estudiadas,  fluoxetina e imipramina sobre la duración de las conductas  activas,  escalamiento  y  natación,  y  sobre  el  tiempo  de  inmovilidad en el ensayo de natación forzada. Los extractos  de  A.  muricata  y  S.  elegans  produjeron  una  disminución  significativa del tiempo de inmovilidad, de manera similar a  fluoxetina  e  imipramina,  acompañada  de  un  aumento  significativo  de  la  conducta  de  natación,  semejante  al  inducido por fluoxetina. La conducta de escalamiento, que  aumentó  con  imipramina,  no  fue  modificada  significativamente  por  ninguno  de  los  extractos.  Además,  se  observa  que  el  extracto  de  A.  desertícola  no  produjo  efectos  significativos  sobre  ninguna  de  las  conductas  relacionadas con el ensayo de natación forzada.        Tabla 2. Ensayo de nado forzado para evaluar efecto antidepresivo.    

    Ensayo  de  Laberinto  en  Cruz  Elevado  para  evaluar  efecto  ansiolítico.  Efecto  de  los  extractos  de  plantas  y  diazepam  sobre  el  porcentaje  de  entradas  a  los  brazos  abiertos  del  laberinto  y  sobre  el  porcentaje  de  tiempo de permanencia en ellos. Los datos corresponden al promedio ± ES  de  8‐11  ratas  en  cada  dosis  inyectada.  *  p<0,05  comparado  con  los  controles  inyectados  con  agua  (ANOVA  seguido  de  Newman‐Keuls  para  comparaciones múltiples). 

  Los  datos  corresponden  al  promedio  ±  ES  de  8‐11  ratas  en  cada  dosis  inyectada.  *  p<0,05  comparado  con  los  controles  inyectados  con  agua  (ANOVA seguido de Newman‐Keuls para comparaciones múltiples). 

 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 24   

 

    DISCUSIÓN  En  el  presente  estudio  se  investigaron  los  efectos  de  tres  extractos  de  hojas  provenientes  de  plantas  autóctonas  de  Latinoamérica  utilizadas  en  medicina  popular  por  sus  propiedades  tranquilizantes  y  antidepresivas,  Annona  muricata, Acantholippia desertícola y Salvia elegans.    Los  resultados  del  monitoreo  de  la  actividad  motora  espontánea  mostraron  marcados  efectos  depresores  en  ratas,  después  de  la  administración  aguda  de  dosis  únicas  de  12,5,  25  y  50  mg/kg  del  extracto  de  S.  elegans,  demostrando el notable efecto sedante de esta planta. En  cambio,  los  extractos  de  A.  desertícola  y  A.  muricata  disminuyeron  significativamente  la  motilidad  solo  con  la  dosis más alta utilizada, es decir 50 mg/kg.     A  pesar  de  sus  significativos  efectos  sedantes,  el  extracto  de  S.  elegans  no  demostró  efectos  tipo  ansiolítico  en  el  modelo  del  laberinto  en  cruz  elevado,  mientras  que  los  extractos  de  A.  muricata  y  A.  desertícola  aumentaron  significativamente tanto las entradas como la permanencia  en los brazos abiertos del laberinto aun luego de dosis que  carecían  de  efecto  depresor  sobre  la  actividad  motora.  Estos  datos  sugieren  que  el  modelo  animal  de  ansiedad  utilizado  en  este  estudio,  el  laberinto  en  cruz  elevado,  es  capaz  de discriminar  entre efectos  sedantes  y ansiolíticos.  Desconocemos  el  mecanismo  por  el  cual  se  producen  los  efectos  ansiolíticos  de  estas  plantas;  sin  embargo,  considerando  que  el  laberinto  en  cruz  ha  demostrado  ser  un  buen  modelo  para  evaluar  ansiolíticos  benzodiacepínicos,  como  diazepam,  podríamos  sugerir  la  mediación del aminoácido GABA en dichos efectos.    El  modelo  de  depresión  utilizado  en  este  trabajo,  la  natación  forzada,  permitió  identificar  efectos  tipo  antidepresivo  luego  de  la  administración  de  los  extractos  de  A.  muricata  y  S.  elegans.  Todas  las  dosis  de  ambos  extractos  disminuyeron  el  tiempo  de  inmovilidad  y,  simultáneamente, aumentaron la conducta de natación sin  afectar la conducta de escalamiento. El perfil de los efectos  conductuales  de  los  extractos  en  el  ensayo  de  natación  forzada  es  compatible  con  el  perfil  del  antidepresivo  de  referencia  fluoxetina.  En  efecto,  tal  como  había  sido  observado anteriormente (Page M.E. 1999), la disminución  de la inmovilidad inducida por fluoxetina era acompañada  por un aumento de la natación,  mientras que la conducta  de  escalamiento  no  fue  afectada  por  esta  droga.  Se  ha  demostrado  que  la  natación  en  la  rata  es  una  conducta  sensible  a  fármacos  serotoninérgicos,  tales  como  fluoxetina,  inhibidor  selectivo  de  la  recaptación  de  serotonina. En cambio, la conducta de escalamiento es más  sensible  a  fármacos  con  acción  selectiva  sobre  la  transmisión  catecolaminérgica,  tales  como  los  antidepresivos  tricíclicos  del  tipo  imipramina  (Detke,  M.J.,  1995;  Cryan,  J.F.,  2000).  En  consecuencia,  el  modelo  de 

  natación  forzada  permite  sugerir  la  participación  de  mecanismos  serotoninérgicos  en  los  efectos  tipo  antidepresivos  de  A.  muricata  y  S.  elegans,  aunque,  obviamente,  se  requieren  otro  tipo  de  estudios  para  confirmar  este  mecanismo  de  acción.  En  nuestro  laboratorio  hemos  demostrado  los  posibles  efectos  antidepresivos de otras plantas aplicando el mismo ensayo  de  natación  forzada.  Por  ejemplo  Casimiroa  edulis  (Rutaceae) cuyo efecto anti‐inmovilidad va acompañado de  aumento  del  escalamiento  y  no  de  la  natación  (Mora,  S.,  2005a) y Aloysia polystachya (Verbenaceae) que, junto con  disminuir  la  inmovilidad,  aumenta  la  duración  de  las  dos  conductas  activas,  escalamiento  y  natación  (Mora,  S.,  2005b).    En  conclusión,  la  aplicación  de  modelos  animales  nos  ha  permitido identificar las propiedades psicotrópicas de tres  plantas medicinales de uso muy frecuente en la población  y, en consecuencia, validar en forma objetiva su uso en el  tratamiento de trastornos emocionales como la ansiedad y  la  depresión.  Salvia  elegans  parece  poseer  potentes  efectos  sedantes  y  antidepresivos,  mientras  que,  Acantholippia  desertícola  demostró  interesantes  propiedades  tipo  ansiolítico  en  dosis  que  no  provocan  sedación  y,  finalmente,  Annona  muricata  resultó  activa  como  ansiolítico  y  como  antidepresivo,  incluso  en  dosis  que  no  deprimen  la  actividad  motora.  Sin  duda,  se  requieren  mayores  estudios  preclínicos  para  confirmar  o  extender  estos  resultado  y  para  evaluar  el  riesgo  de  potenciales reacciones adversas en humanos.     En la literatura científica se han descrito numerosas plantas  usadas  en  medicina  popular  como  ansiolíticos  o  antidepresivos.  Además,  un  porcentaje  importante  de  la  población  recurre  a  estos  productos  para  aliviar  síntomas  psiquiátricos  con  la  creencia  que  por  ser  “naturales”  son  alternativas  más  seguras  que  los  medicamentos  psicotrópicos  comúnmente  usados.  Sin  embargo,  las  plantas  pueden  producir  reacciones  adversas  potencialmente  graves  o  interactuar  con  otros  medicamentos.  Probablemente,  con  la  excepción  del  Hypericum  perforatum  (hierba  de  San  Juan)  para  tratar  la  depresión,  Ginkgo  biloba,  utilizado  para  deterioros  orgánicos  cerebrales  y  Piper  methysticum  (Kava‐kava),  usado  como  ansiolítico,  se  considera  que  la  actual  evidencia científica es insuficiente para asegurar la eficacia  y  la  seguridad  en  las  demás  especies  informadas  (Medina  E.).  En  muchos  casos  se  continúan  realizando  investigaciones  farmacológicas  y  clínicas  que  deberían  aumentar  nuestro  conocimiento  en  este  ámbito  y  permitirán  obtener  nuevas  herramientas  terapéuticas  que  substituyan o complementen los fármacos actualmente en  uso  para  tratar  los  trastornos  psiquiátricos.  Quizás,  en  un  futuro  no  tan  lejanos,  el  uso  de  plantas  medicinales  en  Psiquiatría no será visto como algo excepcional.    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 25 

 

 

 

    BIBLIOGRAFÍA:   

 

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  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 26   

 

 

   

ARTÍCULO ORIGINAL 

    ESTUDIO DE UN EXTRACTO ESTANDARIZADO DE MAQUI RICO EN DELFINIDINAS EN EL  MANTENIMIENTO DEL BALANCE DE GLUCOSA.  (Studies of a standardized extract of Maqui fruit rich in delphinidins in the maintenance of  glucose balance)    

    1 1 Evelyn Jara ,Ph.D, Jorge Hidalgo ,M.D.,  Carlos Flores2,Ph.D,  Moisés Pérez3 B.Q.,  Alejandro  Yáñez3,Ph.D, Angélica Hidalgo1,Ph.D,  Luis Quiñones4,Ph.D,  Juan Luis Hancke1,Ph.D,  Rafael  Burgos1,M.V.,M.Sc     

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 Instituto de Farmacología y Morfofisiología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.  Centro de Estudios Científicos (CECS), Avenida Arturo  3 4 Prat 514, Valdivia 5110466, Chile.  Instituto de Bioquímica y Microbiología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.  CQF, Centro de  Investigaciones Farmacológicas y Toxicológicas ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.   

  RESUMEN  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

Las antocianinas son polifenoles con actividad antioxidante, a las cuales se les ha atribuido una serie de actividades biológicas  beneficiosas para la salud humana, las cuales incluyen prevención o reducción del riesgo de enfermedad cardiovascular, diabetes  mellitus  (DM),  artritis  y  cáncer.  En  este  trabajo  se  muestra  que  un  extracto  estandarizado  de  Maqui  rico  en  delfinidinas,  disminuye  los  niveles  basales  de  glucosa  sanguínea  después  de  4  meses  de  tratamiento  en  un  modelo  de  ratas  diabéticas  inducido  por  inyección  de  estreptozotocina  (STZ).  Igualmente,  este  extracto  fue  capaz  de  aumentar  la  sensibilidad  a  glucosa  cuando fue sometido a evaluación en una prueba de tolerancia a la glucosa en ratas diabéticas. Además, en un estudio piloto  fase  I,  el  extracto  rico  en  delfinidinas  disminuyó  la  glucosa  postprandial  y  la  insulina  en  pacientes  con  tolerancia  a  la  glucosa  alterada, modificando la forma de las curvas de insulina y glucosa, sugiriendo su uso potencial para pacientes prediabéticos, así  como en enfermedades asociadas al metabolismo de carbohidratos. Finalmente, delfinidina, la principal molécula presente en el  extracto  estandarizado  de  Maqui,  inhibió  el  transporte  de  glucosa  dependiente  de  sodio  (Na+),  lo  cual  explicaría  en  parte  la  disminución de la concentración de glucosa sanguínea en ratas diabéticas inducidas con STZ y en pacientes prediabéticos.   

Palabras Claves: Antocianinas, Diabetes Mellitus, Test de Tolerancia  a la Glucosa.    Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

 

INTRODUCCIÓN  

   

 

La investigación sobre la composición y actividad biológica  de frutas y vegetales ha establecido que la ingesta de éstas  posee un gran impacto sobre la salud humana, bienestar y  la  prevención  de  varias  enfermedades  [1].  Estas  últimas  incluyen  enfermedades  cardiovasculares,  neurodegenerativas y otras asociadas con envejecimiento,  obesidad  y  ciertos  tipos  de  cáncer,  como  esofagial  y  digestivo [2]. Aunque muchas frutas y vegetales contienen  micro  y  macro  nutrientes  que  incluyen  vitaminas,   

minerales,  folato  y  fibra,  sus  propiedades  biológicas  son  principalmente  debido  al  alto  contenido  de  polifenoles  presentes  en  ellas.  Éstos,  están  constituidos  por  flavonoides  (antocianinas,  flavonoles  y  flavonoides),  taninas  condensadas  (proantocianidinas),  taninas  hidrolizables (elagitaninos y galotaninos) y ácidos fenólicos  [3].  Dentro  de  los  polifenoles,  son  las  antocianinas  las  cuales  han  demostrado  poderosos  efectos  antioxidantes,  anticarcinogénicos y antiinflamatorios [4–7]. 

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  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 27   

 

 

    Los  compuestos  fenólicos  presentes  en  berries  son  bien  conocidos  por  su  capacidad  antioxidante  [8].  De  hecho,  éstos  pueden  regular  la  actividad  de  enzimas  que  metabolizan  y  modulan  receptores  nucleares,  expresión  génica  y  vías  de  señalización,  así  como  la  reparación  del  daño  oxidativo  del  DNA  [8,9].  Aunque  las  acciones  de  los  berries  han  sido  estudiadas  in  vitro,  sus  polifenoles  son  pobremente  absorbidos  [10,11].  Sin  embargo,  éstos  pueden  ser  metabolizados  y  convertidos  por  la  microflora  del  colon  en  otras  moléculas  relacionadas  que  pueden  persistir in vivo y acumularse en los tejidos, contribuyendo  entonces  a  los  diferentes  efectos  biológicos  antes  mencionados [12].  Aristotelia  chilensis  es  una  planta  cuyo  fruto  es  considerado  un  potente  antioxidante  natural  [13].  A.  chilensis  se  ubica  geográficamente  desde  la  IV  a  la  XI  región,  hasta  los  2.500  m.s.n.m.,  también  en  el  archipiélago  de  Juan  Fernández  y  Argentina.  Habita  en  lugares  con  suelo  rico  en  materia  orgánica,  siendo  una  especie  colonizadora  de  lugares  abiertos.  Muchas  veces  forma  comunidades  puras  las  que  reciben  el  nombre  de  macales. A. chilensis pertenece a la familia Elaeocarpaceae  y  es  comúnmente  conocida  como  ‘‘maqui,’’  ‘‘clon,’’  ‘‘queldron,’’ y ‘‘koelon. Esta fruta contiene más pulpa que  otras  bayas  de  esta  región,  y  su  sabor  es  descrito  como  astringente  pero  fresco.  Tanto  las  hojas,  como  los  frutos  comestibles  de  A.  chilensis  se  han  utilizado  para  el  tratamiento de diversas dolencias como dolor de garganta,  úlceras, fiebre, hemorroides, inflamación, diarrea, lesiones,  migrañas  y  para  la  cura  de  cicatrices  [14,  15,  16].  Los  araucanos  fabricaban  chicha  del  jugo  fermentado,  el  cual  también  era  utilizado  como  elemento  colorante  para  dar  tinte  a  vinos.  Durante  los  últimos  años,  se  han  realizado  algunas investigaciones del fruto encontrándose en el jugo  o la fracción fenólica propiedades antioxidantes,  pudiendo  ser    útil  como  anti‐aterogénico  [13].  Las  antocianinas  presentes  en  el  fruto  de  maqui  constituyen  el  0.2%  y  han  sido  asociadas  a  una  gran  capacidad  antioxidante.  En  el  fruto  han  sido  reconocidos  ocho  pigmentos  correspondientes  a  3‐glucósidos,  3,5‐diglucósidos,  3‐ sambubiósidos  y  3‐sambubiósido‐5‐glucósidos  de  delfinidina  y  cianidina,  siendo  la  principal  antocianina  delfinidina  3‐sambubiósido‐5‐glucósido  (34%  de  antocianinas  totales).  El  promedio  total  de  contenido  de  antocianinas  es  137.6  +/‐  0.4mg/100g  de  fruta  fresca  (211.9 +/‐ 0.6 mg/100g de fruta seca) [17].   El  jugo  de  maqui  puede  inhibir  la  oxidación  de  la  lipoproteína de baja densidad (LDL) y proteger a las células  endoteliales  contra  el  estrés  oxidativo  intracelular,  siendo  considerado  útil  como  anti‐aterogénico  [13].  Extractos  metabólicos  de  los  frutos  de  maqui,  han  mostrado  un  efecto  protector  preventivo  en  estudios  in  vivo  de  isquemia/reperfusión en corazón de ratas, que se atribuye  a  la  reducción  de  la  oxidación  lipídica  y  estrés  oxidativo 

[18].  Recientemente,  la  administración  oral  de  antocianinas  y  delfinidina  3‐sambubiósido‐5‐glucósido,  redujeron  de  manera  dosis  dependiente  los  niveles  de  glucosa  sanguínea  en  ayunas  en  un  modelo  de  ratones  obesos C57BL/6J, y disminuyó la producción de glucosa en  células de hígado de rata. El compuesto puro también fue  capaz de incrementar la captación de glucosa en miotubos  L6 [19].  En  el  presente  artículo,  describimos  el  efecto  de  un  extracto estandarizado de Maqui, conteniendo un 25% de  delfinidinas  totales  en  el  mantenimiento  del  balance  de  glucosa  en  un  modelo  de  ratas  diabéticas  y  pacientes  prediabéticos.    MATERIALES Y MÉTODOS  1. Extracto de Maqui  El  extracto  de  Maqui  (Aristotelia  chilensis)  fue  fabricado  y  proporcionado  por  Indena  SpA,  Italia.  El  extracto  fue  estandarizado a un mínimo de 35% de antocianinas totales  y  un  25%  de  delfinidinas  totales.  Delfinidina  (>98%)    fue  obtenida desde Extrasynthase (Lyon, France).  2. Estudios en animales  2.1 Inducción de diabetes por inyección de STZ:   La diabetes fue inducida mediante una inyección única de  STZ (Calbiochem, Darmstadt, Germany) disuelta en tampón  citrato  (pH  4.5)  en  una  dosis  de  55  mg/Kg  en  Rattus  norvegicus  machos  (250‐300  grs).  Los  animales  controles  normales (CN, n = 5) fueron mantenidos en ayunas durante  la  noche  e  inyectados  con  tampón  citrato  como  vehículo.  Los animales diabéticos fueron divididos en dos grupos. El  Grupo  I  (n=5)  fue  analizado  16  semanas  después  de  la  inducción  de  diabetes.  El  Grupo  II  fue  estudiado  después  de  16  semanas  de  inducida  la  diabetes  y  luego  de  la  administración  de    20  mg/Kg  (n=5)  de  extracto  de  Maqui.  Todos los animales fueron alimentados con dieta estándar  de  laboratorio  y  agua  ad  libitum.  Los  animales  fueron  proporcionados  por  la  Pontificia  Universidad  Católica  de  Chile  y  fueron  mantenidos  en  un  ciclo  de  12  horas  luz‐ oscuridad a 22 ºC.    2.2.  Test de Tolerancia a la Glucosa:   El Test de Tolerancia Oral a la Glucosa (OGTT) fue realizado  30 minutos después del tratamiento con extracto de Maqui  en ratas controles normales y en ratas diabéticas inducidas  por inyección de STZ. La glucosa (2,0 g/kg de peso corporal)  fue  administrada  vía  inyección  intraperitoneal  después  de  12  hrs  de  ayuno.  La  glucosa  sanguínea  fue  determinada  a  los 0, 30, 60, 120 y 240 minutos después del cambio de la  concentración de glucosa utilizando el método enzimático  de glucosa oxidasa (Wiener lab) a 490 nm.    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 28 

 

 

    3.  Estudios en humanos  Se utilizó un estudio aleatorio, doble ciego, controlado con  placebo, que fue aprobado por el Comité de Ética Científica  del  Servicio  de  Salud  Metropolitano  Occidente,  Ministerio  de  Salud  de  Chile,  incluyendo  un  seguro  médico  para  los  pacientes en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile,  Profesor José Joaquín Aguirre; Hospital San Juan de Dios. El  estudio  fue  realizado  en  el  Centro  de  Investigaciones  Farmacológicas  y  Toxicológicas  (IFT),  de  la  Facultad  de  Medicina de la Universidad de Chile (www.ift.cl). Todos los  pacientes  participantes  del  estudio  firmaron  un  consentimiento  informado.  Ninguno  de  ellos  fue  informado  de  su  código  de  grupo  asignado.  Los  médicos  participantes del estudio no manejaron los productos y no  conocieron  el  tratamiento  asignado  a  cada  paciente.  Dos  sobres conteniendo cada tratamiento por paciente fueron  asignados:  uno  de  ellos  fue  almacenado  en  caso  de  emergencia  por  el  Centro  de  Investigaciones  Farmacológicas  y  Toxicológicas,  y  otro  por  el  Investigador  principal.  Los  dos  sobres  permanecieron  sellados  hasta  el  día del análisis de los datos.  3.1.  Intervención y Procedimientos:   Se  reclutaron  12  pacientes  voluntarios  sanos  que  fueron  divididos en 2 grupos, con edades entre 18 y 55 años, que  no  recibieran  ninguna  terapia  farmacológica  aguda  ni  crónica,  un  índice  de  masa  corporal  (IMC)  inferior  a  30  Kg/m2, con glucosa plasmática en ayunas < 110 mg/dL y un  Test de Tolerancia a la Glucosa alterado (110 a 125 mg/dL),  registrado luego de 120 minutos tras la administración de  75 gramos de carbohidratos (cocinados con arroz grado 1)  [20‐24].    Los  pacientes  con  antecedentes  de  drogas  y/o  abuso  de  alcohol y fumadores (más de 3 cigarros cada 7 días) fueron  excluidos  del  estudio.  También  fueron  excluidos  del  estudio  los  pacientes  que  tomaban  suplementos  vitamínicos  7  días  antes  de  la  administración  de  los  productos  de  prueba,  aquellos  pacientes  con  un  cambio  reciente  en  sus  hábitos  alimenticios  o  de  ejercicio,  con  terapia  farmacológica  crónica  o  medicamentos  que  afectaran la actividad enzimática hepática 28 días antes al  inicio  del  estudio,  pacientes  con  alergia  a  algún  medicamento,  con  Diabetes  Mellitus  o  hospitalizados  durante  los  últimos  60  días  o  con  arritmia  o  cualquier  insuficiencia  renal  crónica  (creatinina  sanguínea  >  1,5  mg/dL).  Además,  fueron  excluidos  del  estudio  pacientes  con  alergia  al  maní  y  almendras  o  con  cualquier  otra  enfermedad crónica o limitante, incluyendo alcoholismo o  con cualquier otra enfermedad o condición que el médico  considerara  en  que  el  voluntario  no  cumplía  con  las  condiciones para participar en el ensayo.  Los pacientes cumplieron los criterios de inclusión y fueron  divididos aleatoriamente en el grupo tratado con extracto  de Maqui o placebo. La apariencia del producto de prueba 

  y  el  placebo  fueron  idénticos,  siendo  imposible  su  reconocimiento visual o a través de su aroma.  El éxito del  ensayo doble ciego fue validado antes de comenzar con el  estudio  en  un  grupo  de  10  voluntarios.  Al  finalizar  el  tratamiento, se  realizó una encuesta sencilla preguntando  a los participantes del estudio si reconocían haber recibido  el producto de prueba o el placebo.    En  cada  sesión,  los  pacientes  recibieron  un  vaso  de  agua  (250  mL)  conteniendo  el  placebo  o  200  mg  del  producto  disueltos en agua como dosis única después de un período  de  12  h  de  ayuno.  Posteriormente,  los  pacientes  fueron  cruzados  en  un  segundo  período  y  recibieron  el  producto  contrario. Cada vez, los grupos tratados con el producto y  el placebo recibieron una comida 30 minutos antes  de su  administración (definida como una cantidad fija de 75 g de  arroz  blanco  grado  1  cocido,  preparado  por  un  nutricionista). El estudio fue conducido durante 4 semanas.  El  período  de  lavado/intervalo  de  tiempo  entre  las  diferentes  administraciones  fue  de  6  días  (Sesión  1  =  Placebo;  Sesión  2  =  200  mg  extracto  de  Maqui).  Los  tratamientos y procedimientos empleados en los pacientes  estuvieron  en  conformidad  con  los  acuerdos  internacionales [25] y las buenas prácticas clínicas [26].    En  cada  sesión  se  obtuvieron  muestras  sanguíneas.  La  primera muestra fue tomada como línea base, 10 minutos  antes (tiempo ‐10) del tratamiento con extracto de Maqui  o  placebo  (tiempo  0);  la  segunda  muestra  fue  tomada  15  minutos después de la ingesta del producto (tiempo +15).  La  comida  fue  servida  30  minutos  después  de  la  administración de extracto de Maqui o placebo. La tercera  muestra  sanguínea  fue  obtenida  en  el  mismo  momento  (tiempo  +30).  A  continuación,  las  muestras  de  sangre  fueron tomadas consecutivamente a los tiempos, +60, +90,   +120  y  +180  minutos  después  de  la  administración  del  producto  o  placebo.  La  glucosa  sanguínea  fue  medida  en  plasma  por  el  método  enzimático  de  GOD‐PAP.  Mientras  tanto,  la  insulina  fue  medida  por  inmunoensayo  (MEIA,  Abbott).  Las  reacciones  adversas  fueron  evaluadas  por  un  médico  y  todas  las  observaciones  fueron  registradas  durante el tratamiento, las cuales fueron clasificadas como  pocas, moderadas o graves en un formulario asignado para  cada paciente con su estado general de salud.        4.  Manejo de ratones y aislamiento de tejidos    Los  ratones  C57Bl/6J  fueron  obtenidos  desde  Jackson  Laboratory  (Bar  Harbor,  ME,  USA).  Los  ratones  fueron  mantenidos en el Centro Libre de Patógenos para ratones  del  Centro  de  Estudios  Científicos  (CECS),  Valdivia,  Chile.  Previo a los experimentos, los ratones tuvieron libre acceso  al  agua  y  comida.  Los  animales  fueron  sacrificados  por  dislocación  cervical  de  acuerdo  a  las  regulaciones  de  IACUC. El yeyuno fue separado, abierto longitudinalmente    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 29 

 

 

    a  lo  largo  del  borde  mesentérico  y  lavado  con  tampón  fosfato salino (PBS).    4.1. Absorción  electrogénica  de  D‐glucosa  en  yeyuno  de  ratón:  Se  montaron  dos  secciones  de  yeyuno  de  ratón  en  Cámaras  de  Ussing,  los  cuales  fueron  mantenidos  en  tampón  Ussing  NaCl,  120  mM;  NaHCO3,  25  mM;  KH2PO4,  0,8 mM; MgCl2, 1,2 mM; CaCl2, 1,2 mM) suplementado con  10 mM de D‐glucosa en el lado seroso. La temperatura fue  mantenida  a  37°C  y  la  solución  fue  constantemente  gaseada  con  CO2  al  5%.  Una  vez  que  la  preparación  entregó un registro estable de los parámetros eléctricos, se  agregó  10  mM  de  D‐glucosa  al  lado  apical  de  la  preparación  para  estimular  el  transporte  de  D‐glucosa  acoplado a sodio (SGLT‐1). El efecto de delfinidina sobre el  transporte  de  glucosa  acoplado  a  sodio  fue  determinado  por la aplicación de esta molécula a una concentración de  50 µM en el lado mucoso de la preparación. La diferencia  de  potencial  eléctrico  transepitelial  (Vm)  fue  registrada  utilizando  un  amplificador  VCC  MC2  (Physiological  Instruments). Los valores de corriente de cortocircuito (Isc)  y  resistencia  transepitelial  (Rte)  fueron  calculados  a  partir  de los datos experimentales utilizando la ley de Ohm [27].  Los resultados fueron expresados como la intensidad de Isc  (µA/cm2).    5. Estadística    Para  establecer  las  diferencias  entre  los  parámetros  plasmáticos  de  cada  aplicado  a  los  voluntarios,  se  realizó  un  test  de  varianza  multifactorial  (ANOVA)  con  una  significancia  estadística  de  P≤0,05.  Los  parámetros  de  variación  considerados  en  el  estudio  fueron:  producto  administrado,  período  de  administración,  secuencia  y  efecto  residual. El  protocolo  siguió  las  recomendaciones  y  guía  de  la  FDA,  para  el  diseño  y  análisis  estadístico  del  estudio.    RESULTADOS  Extracto  de  maqui  disminuye  la  hiperglicemia  basal  en  ratas diabéticas después de 4 meses de tratamiento.     Recientemente,  la  atención  se  ha  centrado  en  los  constituyentes  de  la  dieta  que  pueden  ser  beneficiosos  para la prevención y el tratamiento de la diabetes. Aunque  hay  algunos  fármacos  que  han  sido  utilizados  como  regímenes  terapéuticos  para  las  enfermedades  metabólicas relacionadas a la obesidad, hay poca evidencia  de  que  los  factores  alimenticios  propios  puedan  ser  directamente beneficiosos para modular la sensibilidad a la  insulina [28].     

  Nosotros  observamos,  que  el  extracto  de  Maqui  rico  en  delfinidinas  disminuyó  significativamente  la  concentración  basal  de  glucosa  sanguínea  en  ratas  diabéticas  inducidas  por  inyección  de  STZ  con  respecto  al  grupo  de  animales  control  después  de  4  meses  de  tratamiento  con  una  concentración  de  extracto  de  Maqui  de  20  mg/kg  (Figura  1).  La  concentración  basal  de  glucosa  disminuyó  aproximadamente  4  veces  entre  el  grupo  de  ratas  control  (100,25 ± 11,6 mg/dL) y el grupo de ratas diabéticas (475 ±  91,3  mg/dL).  Por  otra  parte,  las  ratas  del  grupo  control  tratadas con extracto de Maqui no presentaron cambios en  la concentración de glucosa sanguínea (Figura 1).    Figura 1. Extracto de Maqui disminuye la hiperglicemia basal en ratas  diabéticas. 

  Ratas  diabéticas  inducidas  con  STZ  fueron  tratadas  con  20  mg/Kg  de  extracto de Maqui durante 4 meses y la concentración de glucosa en suero  fue  determinada  mediante  el  método  de  glucosa  oxidasa.  Los  resultados  son el promedio ± E.E., n = 5. *P< 0.001.       

Se realizó un Test de Tolerancia a la Glucosa, en el cual el  extracto de Maqui fue administrado 30 minutos antes de la  carga  de  glucosa  (2,0  g/kg  de  peso  corporal).  En  primer  lugar,  no  se  observaron  cambios  en  la  concentración  de  glucosa  sanguínea  de  ratas  control  normales  tratadas  con  20 mg/Kg de extracto de Maqui luego de la administración  de  glucosa  por  medio  de  inyección  intraperitoneal  (Figura  2A).  Sin  embargo,  se  pudo  observar  en  ratas  diabéticas  tratadas  con  20  mg/Kg  de  extracto  de  Maqui  una  disminución de los niveles de glucosa basales (Figura 2B).     Los  resultados  del  Test  de  Tolerancia  a  la  Glucosa  mostraron  claramente  que  el  extracto  de  Maqui  es  capaz  de  aliviar  la  resistencia  a  la  insulina  en  el  grupo  de  ratas  diabéticas.  La  disminución  de  la  glucosa  en  sangre  fue  significativamente  mayor  en  el  grupo  de  ratas  diabéticas  tratadas con el extracto de Maqui a los 240 minutos luego  de la administración de glucosa vía intraperitoneal (Figura    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 30 

 

 

    2B). Por otra parte, el peso corporal de las ratas diabéticas  tratadas con el extracto de Maqui no varió con respecto al  grupo  control,  durante  16  semanas  de  tratamiento  (Tabla  1).  Adicionalmente,  los  niveles  de  triglicéridos  en  ratas  diabéticas tratadas con extracto de Maqui se mantuvieron  sin cambios con respecto al grupo control diabético (datos  no mostrados). 

  Los  resultados  obtenidos  demuestran  que  el  extracto  de  Maqui es capaz de reducir la hiperglicemia basal y mejorar  la  capacidad  de  metabolizar  la  glucosa  en  ratas  con  diabetes tipo 2. En este sentido, se ha descrito que un alto  consumo  de  frutas  y  hortalizas,  principalmente  antocianinas  están  asociados  con  una  reducción  en  la  incidencia de este tipo de diabetes [29]. 

    Tabla 1. Peso corporal en ratas diabéticas tratadas con vehículo o extracto  de Maqui por 4 meses.   

Figura 2. Efecto del extracto de Maqui (EM) sobre los niveles de glucosa  postprandial en ratas control normales y ratas diabéticas. Test de  Tolerancia a la Glucosa. 

  Los valores son el promedio ± E.E., n = 5  

 

  (A). Niveles de glucosa sanguínea en ratas controles normal (CN) y en ratas  control  normales  tratadas  con  vehículo  o  con  20  mg/Kg  de  extracto  de  Maqui, respectivamente. (B) Niveles de glucosa en ratas diabéticas (RD) y  en ratas diabéticas tratadas con vehículo o con 20 mg/Kg de extracto de  Maqui, respectivamente. Los resultados son el promedio ± E.E., n = 5. **P<  0.01.  E  and  G  indican  la  administración  de  extracto  y  glucosa,  respectivamente. 

  El  extracto  de  Maqui  modifica  la  forma  de  las  curvas  de  glucosa e insulina.     El  objetivo  de  este  estudio  fue  evaluar  la  eficacia  de  una  administración  oral  única  de  extracto  Maqui  sobre  los  niveles  postprandiales  de  glucosa  e  insulina  en  individuos  con intolerancia a la glucosa.  Es  conocido  que  pacientes  con  intolerancia  a  la  glucosa  poseen doble riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2  y asociado a eventos cardiovasculares [30]. Por lo tanto, las  medidas  o  tratamientos  que  apunten  a  reducir  la  incidencia  de  la  diabetes  y  los  eventos  clínicos  en  estos  pacientes son de suma relevancia.     Los  resultados  obtenidos  muestran  que  la  administración  única  del  extracto  de  Maqui  conduce  a  alteraciones  en  la  forma  de  las  curvas  de  insulina  (Figura  3A)  y  de  glucosa  (Figura 3B). Sin embargo, la comparación estadística entre  el  área  bajo  la  curva  del  extracto  de  Maqui  y  placebo  no  mostró  diferencias  estadísticamente  significativas  en  las  determinaciones de insulina (ANOVA). A pesar de esto, los  pacientes  que  recibieron  200  mg  de  extracto  redujeron  significativamente  la  glucosa  postprandial  después  de  30  minutos  de  la  administración  de  una  comida,  en  comparación  con  aquellos  pacientes  que  solo  recibieron  placebo (Figura 3B). Fue posible también observar, que los  resultados  cinéticos  muestran  un  retardo  en  el  tiempo  en  el que se alcanza el máximo en la concentración de insulina  y glucosa en los pacientes tratados con extracto de Maqui    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 31 

 

 

 

    (Figura 3A), lo cual correlaciona con una disminución tardía  en los niveles de glucosa (Figura 3B).    Figura 3. Efecto del extracto de Maqui sobre las concentraciones de  insulina y glucosa postprandiales en pacientes con intolerancia a la  glucosa. Test de Tolerancia a la Glucosa.   

             

transportador  facilitativo  de  hexosas,  GLUT2  [31].  En  este  trabajo, se utilizaron las mediciones en Cámaras de Ussing  para  caracterizar  el  efecto  de  delfinidina  sobre  el  transporte  activo  de  glucosa  intestinal  (SGLT‐1).  Los  yeyunos de ratones fueron montados en las cámaras, hasta  que  éstos  alcanzaron  un  estado  estacionario.  A  continuación,  se  adicionó  glucosa  a  una  concentración  de  10  mM  en  el  lado  mucoso,  induciendo  un  aumento  en  la  Isc  (máximo  después  de  3  minutos),  representando  un  incremento  en  la  actividad  de  SGLT‐1.  Cuando  delfinidina  fue  agregada  al  baño  por  el  lado  mucoso,  se  produjo  una  marcada  inhibición  de  la  Isc  (Figura  4A),  inhibiendo  el  transporte  de  glucosa  en  aproximadamente  60%  (Figura  4B).     Figura 4. Delfinidina inhibe el transporte de D‐glucosa acoplado a sodio en  yeyuno de ratón. 

   

 

       

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

 

 

 

En cada tiempo, ambos grupos placebo y extracto, recibieron 30 minutos  antes una comida (definida y fijada en 75 g de arroz grado 1 cocinados). La  glucosa  plasmática  pre‐prandial  fue  medida  en  el  tiempo  base  (‐  10  minutos)  y  las  concentraciones  postprandiales  (al  final  de  180  minutos)  fueron  calculadas  usando  el  Test  de  Tolerancia  de  Glucosa  Estándar.  Las  muestras sanguíneas fueron obtenidas en cada sesión. Los resultados son  el promedio ± E.E., n = 8. * P< 0.05, con respecto al placebo. 

      A) Registro de voltaje transepitelial (Vte) de una pieza de yeyuno de ratón  montado  en  Cámara  de  Ussing.  En  1  se  indica  el  momento  en  que  la  concentración  de  D‐glucosa  en  el  lado  mucoso  es  aumentada  de  0  a  10  mM. La deflexión negativa de Vte refleja el transporte electrogénico de D‐ glucosa  acoplado  a  sodio,  donde  los  cationes  que  acompañan  al  monosacárido  alcanzan  el  lado  seroso  al  ser  transportados  activamente  por  la  Na+/K+  ATPasa.  En  2  se  indica  el  momento  en  que  se  adiciona  delfinina  50  μM  en  el  lado  mucoso.  B)  Resumen  de  las  corrientes  de  cortocircuito  (Isc)  para  los  experimentos  ejemplificados  en  A.  Delfinidina  produce  una  disminución  cercana  al  40%  (ii:  corriente  sensible  a  delfinidina) de la corriente de sodio inducida por D‐glucosa 10 mM (i). Los  valores  son  el  promedio  son  el  promedio  ±  E.E.,  n=4  de  diferentes  animales. 

  Delfinidina  inhibe  el  transporte  de  glucosa  dependiente  de sodio.     En  intestino,  la  entrada  de  glucosa  puede  involucrar  al  cotransportador  de  Na+/glucosa,  SGLT‐1,  o  al 

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    DISCUSIÓN   

DM  es  el  trastorno  endocrino  más  común,  siendo  un  problema  importante  de  salud  en  todo  el  mundo.  Este  grupo  de  enfermedades  metabólicas  se  caracterizan  por  hiperglicemia,  resultante  de  defectos  en  la  secreción  y/o  acción  de  insulina.  La  hiperglicemia  crónica  se  asocia  con  daño  a  largo  plazo,  disfunción  e  insuficiencia  de  varios  órganos, especialmente los ojos, riñones, nervios, corazón  y  vasos  sanguíneos.  Así,  el  estricto  control  del  nivel  de  glucosa  en  sangre  se  considera  esencial  para  retrasar  y/o  prevenir  el  desarrollo  de  complicaciones  de  la  diabetes  [32]. Basándose en los datos presentados en este estudio,  el  tratamiento  con  el  extracto  de  Maqui  rico  en  delfinidinas,  produjo  una  reducción  significativa  de  la  concentración  basal  de  glucosa  en  suero  en  ratas  diabéticas después de 4 meses de tratamiento (*P<0,001).  Igualmente,  los  resultados  del  Test  de  Tolerancia  a  la  Glucosa mostraron que este extracto es capaz de disminuir  los  niveles  de  glucosa  en  sangre  en  ratas  diabéticas.  Los  niveles  de  glucosa  sanguínea  normales  fueron  reestablecidos  a  los  240  minutos  después  de  la  administración de glucosa vía intraperitoneal.  La  diabetes  mellitus  tipo  2  y  la  obesidad  se  encuentran  fuertemente  asociadas  [33].  Recientemente,  se  ha  mostrado  que  las  antocianinas  podrían  afectar  el  desarrollo  de  la  obesidad,  al  menos  en  algunos  modelos  animales [34,35]. En este trabajo, nosotros no observamos  ningún  tipo  de  protección  contra  la  obesidad  en  ratas  diabéticas inducidas por inyección con STZ.  En  este  estudio,  hemos  demostrado  que  el  extracto  de  Maqui  rico  en  delfinidinas  redujo  significativamente  la  glucosa  en  sangre  en  pacientes  con  intolerancia  a  la  glucosa.  Los  resultados  muestran  una  diferencia  estadísticamente  significativa  en  los  niveles  de  glucosa  postprandrial  a  los  60  minutos  y  diferencia  en  la  distribución  de  las  curvas  promedios  e  individuales  de  insulina y glucosa, sugiriendo un efecto significativamente  potencial  del  tratamiento  con  extracto  de  Maqui.  Sin  embargo, esto solo puede ser corroborado con un número  mayor de pacientes con intolerancia a la glucosa, o bien en  un  estudio  que  involucre  a  pacientes  con  enfermedades  más  severas  relacionadas  al  metabolismo  de  los  carbohidratos,  como  diabetes  mellitus  o  síndrome  metabólico. Notablemente, ninguno de los voluntarios que  participaron  en  el  estudio  mostró  reacciones  adversas  al  tratamiento. Solo un paciente informó de reacciones leves,  tanto  para  el  extracto  de  Maqui  como  para  el  placebo,  sugiriendo que el extracto Maqui es seguro en la dosis a la  cual  fue  administrado.  Finalmente,  se  demostró  que  delfinidina  pura,  inhibió  el  transporte  de  glucosa  (SGLT‐1)  en  la  mucosa  de  yeyuno  de  ratón.  En  el  intestino,  los  enterocitos de la membrana de ribete en cepillo (BBM) son  el sitio primario de la absorción de los azúcares de la dieta.  El  cotransportador  de  Na+/glucosa  SGLT‐1,  transporta  glucosa  y  galactosa  desde  el  lumen  del  intestino  hacia  los 

  enterocitos  [36].  SGLT‐1  es  parte  funcional  del  sistema  periférico  que  censa  glucosa  exógena  para  mantener  la  homeostasis  energética  [37].  La  actividad  de  SGLT‐1  es  altamente regulada por algunos péptidos y hormonas en la  membrana de la mucosa o serosa [38,39, 40]. La regulación  de  SGLT‐1  involucra  un  mecanismo  postprandial,  seguido  por  un  rápido  ajuste  de  la  abundancia  de  la  proteína  en  BBM y reclutamiento del transportador de glucosa GLUT2,  lo cual depende de los niveles de azúcar luminales [37]. La  actividad  de  SGLT‐1  y  GLUT2  se  encuentra  incrementada  en diabetes tipo 2 [41,42], probablemente como resultado  de  su  desregulación.  Los  resultados  presentados  en  este  trabajo  muestran  que  el  extracto  de  Maqui  rico  en  delfinidinas  posee  un  efecto  potencial  en  el  mantenimiento  del  balance  de  glucosa  en  pacientes  prediabéticos.      AGRADECIMIENTOS    Agradecemos  a  Indena,  SpA,  Italia  por  el  extracto  estandarizado  de  Maqui,  y  a  Maqui  New  Life,  S.A.  por  los  fondos  para  investigación  entregados  a  la  Universidad  Austral de Chile.      BIBLIOGRAFÍA:    [1]   Zafra‐Stone S, Yasmin T, Bagchi M, Chatterjee A, Vinson JA, Bagchi D.  Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease  prevention. Mol Nutr Food Res. 2007; 51(6):675–83.    [2]    Seeram  NP.  Berry  fruits:  Compositional  elements,  biochemical  activities,  and  the  impact  of  their  intake  on  human  health,  performance, and disease. J Agric Food Chem. 2008; 56(3):627‐629.    [3]   Seeram  NP.  Bioactive  polyphenols  from  foods  and  dietary  supplements:  challenges  and  opportunities.  In  Herbs:  Challengesin  Chemistry  and  Biology;  ACS  Symposium  Series  925  (Herbs);  Ho,  C.  T.,  Wang,  M.,  Sang,  S.,  Eds.;  Oxford  University  Press:  New  York,  2006;  Chapter 3, pp 25–38.    [4]   Seeram  NP,  Zhang  Y,  Nair  MG.  Inhibition  of  proliferation  of  human  cancer  cell  lines  and  cyclooxygenase  enzymes  by  anthocyanidins  and  catechins. Nutr Cancer 2003; 46:101–106.    [5]   Seeram  NP,  Nair  MG.  Inhibition  of  lipid  peroxidation  and  structure‐ activity‐related  studies  of  thedietary  constituents,  anthocyanins,  anthocyanidins and catechins. J Agric Food Chem. 2002; 50:5308–5312.    [6]   Seeram  NP,  Momin  RA,  Bourquin  LD,  Nair  MG.  Cyclooxygenase  inhibitory  and  antioxidant  cyanidin  glycosides  from  cherries  and  berries. Phytomedicine. 2001; 8:362–369.    [7]   Ferreira  D,  Gross  GG,  Kolodziej  H,  Yoshida  T.  Tannins  and  related  polyphenols: fascinating natural products with diverse implications for  biological  systems  ecology,  industrial  applications  and  health  protection. Phytochemistry. 2005; 66:1969–1971.    [8]   Seeram  NP,  Heber  D.  Impact  of  berry  phytochemicals  on  human  health:  Effects  beyond  antioxidation.  In  Lipid  Oxidationand  Antioxidants:  Chemistry,  Methodologies  and  Health  Effects;  ACS  Symposium Series 956; Ho, C. T., Shahidi, F. S., Eds.; Oxford University  Press: New York, 2006; Chapter 21. 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 33   

 

    [9]   Seeram  NP.  Berries.  In  Nutritional  Oncology,  2nd  ed.;  Heber,  D.,  Blackburn, G., Go, V.L.W.,Milner, J., Eds.; Academic Press: London, U.K.,  2006; Chapter 37, pp 615‐625.  [10]  Keppler K, Humpf HU. Metabolism of anthocyanins and their phenolic  degradation  products  by  the  intestinal  microflora.  Bioorg  Med  Chem.  2005; 13: 5195‐5205.    [11]  Talavera  S,  Felgines  C,  Texier  O,  Besson  C,  Lamaison  JL,  Remesy  C.  Anthocyanins  are  efficiently  absorbed  from  the  stomach  in  anesthetized rats. J Nutr. 2003; 133: 4178‐4182.    [12]  Pandey  K.B.  and  Rizvi  S.I.  Plant  polyphenols  as  dietary  antioxidants  in  human health and disease. Oxid Med Cell Longev. 2009; 2(5):270‐278.    [13] Miranda‐Rottmann S, Aspillaga AA, Perez DD, Vasquez L, Martinez ALF,  Leighton  F.(2002).            Juice  and  phenolic  fractions  of  the  berry  Aristotelia  chilensis  inhibit  LDL  oxidation  in  vitro  and  protect  human  endothelial  cells  against  oxidative  stress.  J  Agric  Food  Chem.  Vol.,  50:7542–7547.    [14]  Bhakuni  DS,  Silva  M,  Matlin  SA,  Sammes  PG.  (1976).  Aristoteline  and  aristotelone,  unusual  indole  alkaloids  from  Aristotelia  chilensis.  Phytochemistry. Vol., 15:574–575.    [15]  Hoffmann  AE.  (1991).  Flora  Silvestre  de  Chile:  Zona  Araucana.  Fundación Claudio Gay, Santiago, p. 94.    [16]  Silva M, Bittner M, Cépedes CL, Jakupovic J(1997).The alkaloids of the  genus Aristotelia. Bol Soc Chil Quim. Vol., 42:39–40.    [17]  Escribano‐Bailon  MT,  Alcalde‐Eon  C,  Munoz  O,  Rivas‐Gonzalo  JC,  Santos‐Buelga  C.  2006.  Anthocyanins  in  berries  of  Maqui  (Aristotelia  chilensis (Mol.) Stuntz). Phytochem Anal. 17: 8 ‐ 14.    [18]  Céspedes  CL,  El‐Hafidi  M,  Pavon  N,  Alarcon,  J.  2008.  Antioxidant  and  cardioprotective  activities  of  phenolic  extracts  from  fruits  of  Chilean  blackberry  Aristotelia  chilensis  (Elaeocarpaceae),  Maqui.  Food  Chem  107: 820‐829.    [19]  Rojo L.E, Ribnicky D, Logendra S, Poulev A,  Rojas‐Silva P, Kuhn P, Dorn  R,    Grace  M.H,  Lila  M.A,  Raskin  I.  In  vitro  and  in  vivo  anti‐diabetic  effects  of  anthocyanins  from  Maqui  Berry  (Aristotelia  chilensis).  Food  Chem. 2012; 131(2):387‐396.      [20]  Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of  Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 1997; 20:1183–97.    [21]  Gabir  MM,  Hanson  RL,  Dabelea  D,  Imperatore  G,  Roumain  J,  Bennett  PH,  KnowlerWC    The  1997.  American  Diabetes  Association  and  1999  World  Health  Organization  criteria  for  hyperglycemia  in  the  diagnosis  and prediction of diabetes.Diabetes Care. 2000; 23: 1108–12.    [22]  López  Stewart  G.  Nueva  clasificación  y  criterios  diagnósticos  de  la  diabetes mellitus. Rev Méd Chile. 1998; 126(7):833–837.    [23]  World  health  organization.  Definition,  Diagnosis  and  Classification  of  Diabetes  Mellitus  and  its  Complications:  Report  of  a  WHO  Consultation. Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.  Geneva: World Health Org. 1999.    [24]  Von Eckardstein A, Schulte H, Assmann G. Risk for diabetes mellitus in  middle‐aged  Caucasian  male  participants  of  the  PROCAM  study:  implications  for  the  definition  of  impaired  fasting  glucose  by  the  American  Diabetes  Association.  Prospective  Cardiovascular  Munster.J  Clin Endocrinol Metab. 2000; 85: 3101–8.    [25]  World  Medical  Association  (WMA).  Declaration  of  Helsinki:  Ethical  principles  for  medical  research  involving human  subjects.  Adopted  by  the 18th WMA General Assembly, Helsinki, Finland, June; 1964.    [26]  European  Medicines  Agency:  ICH  harmonised  tripartite  guideline;  Guideline for good clinical practice E6(R1). 2002. 

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ARTÍCULO DE REVISIÓN   

 

   

  POLIFENOLES CON EFECTO ANTI‐HELICOBACTER PYLORI: FUENTES DE OBTENCIÓN Y SU  POTENCIAL UTILIZACIÓN EN FITOMEDICAMENTOS, NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS  FUNCIONALES.  (Polyphenols with anti‐Helicobacter pylori effect: Sources and its potential use in  phytomedicines, nutraceutics and functional foods)   

    Edgar R. Pastene N.1*,Ph.D., Sonja Hebel G.1,2, B.Q. y Apolinaria García C.2,Ph.D.     

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Laboratorio de Farmacognosia, Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.  2  Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción.   

 

  RESUMEN  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

Helicobacter pylori (H. pylori) infecta la mucosa gástrica de la mitad de la población mundial, siendo el único microorganismo  conocido por su capacidad de colonizar exitosamente el estómago humano.  Muchos estudios han permitido establecer que H.  pylori  es  uno  de  los  principales  agentes  etiológicos  de  la  gastritis  crónica,  úlcera  duodenal  y  del  linfoma  MALT.  En  1994,  la  Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC/OMS), definió a H. pylori como un agente carcinógeno tipo I, por su  directa asociación al cáncer gástrico de origen no genético. En Chile, la infección por H. pylori posee una alta prevalencia (~ 80%)  y  el  régimen  de  erradicación  habitualmente  considera  la  aplicación  de  una  terapia  múltiple,  la  cual  combina  dos  (o  tres)  antibióticos  y  un  inhibidor  de  la  bomba  de  protones  (PPI).  No  obstante,  se  espera  que  el  desarrollo  de  resistencia  a  los  antibióticos  por  parte  de  algunas  cepas  de  H.  pylori  vaya  en  aumento.  Lo  anterior  ha  incentivado  la  búsqueda  de  nuevas  substancias  con  propiedades  antibióticas,  así  como  otras  que  dificulten  el  asentamiento  exitoso  de  la  bacteria  en  la  mucosa  gástrica. En esta revisión se presenta brevemente algunos aspectos de la infección por H. pylori y sus mecanismos de daño a la  mucosa  gástrica,  con  énfasis  en  la  producción  de  especies  reactivas  del  oxígeno  y  el  nitrógeno  (ERON).  Con  la  descripción  de  dichos  mecanismos,  y  a  la  luz  de  recientes  hallazgos  en  el  campo  de  la  fitofarmacología,  se  persigue  dirigir  la  atención  hacia  nuevos blancos moleculares poco explorados. En particular, destaca un número importante de productos obtenidos del reino  vegetal,  pertenecientes  a  distintos  grupos  fitoquímicos  como  los  terpenos,  alcaloides  y  los  polifenoles,  para  los  cuales  se  ha  descrito efectos anti‐H. pylori a través de diferentes mecanismos. Por su presencia ubicua en muchas plantas que se emplean  con  fines  medicinales  y  su  consumo  a  través  de  ciertos  alimentos  ricos  en  ellos,  en  este  trabajo  se  discutirá  el  rol  de  los  polifenoles con efectos anti‐H. pylori. Estos, no sólo poseen actividad  antimicrobiana, antioxidante y gastroprotectora, sino que  también  juegan  un  papel  como  agentes  capaces  de  neutralizar  ciertos  factores  de  virulencia  de  H.  pylori.  Los  antecedentes  científicos y los resultados de nuestros estudios sugieren que estos compuestos tendrían una real utilidad al ser administrados  como agentes fitoterapéuticos, nutracéuticos o ingredientes funcionales.    

Palabras Claves: Helicobacter pylori, polifenoles, antioxidantes, ureasa, radicales libres.                      Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile                    ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

  1.  EPIDEMIOLOGÍA  Y  PRINCIPALES  MANIFESTACIONES  CLÍNICAS DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori.    Helicobacter  pylori  (Hp)  fue  identificado  por  primera  vez  por  Marshall  y  Warren  en  1982  como  una  bacteria  flagelada, microaerófila, Gram‐negativa de forma bacilar y  espiralada.    

   

    Hp destaca por su alta capacidad para colonizar el epitelio  gástrico  humano  e  in  vitro  necesita  condiciones  exigentes  de cultivo, multiplicándose de manera lenta (3‐5 días) con  una temperatura óptima de 35‐37 ºC, a pH neutro (Warren  1983; Marshall, 1984). 

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    En los países no desarrollados la infección es normalmente  adquirida en la niñez y en ausencia de tratamiento puede  persistir  toda  la  vida.  Hp  es  un  microorganismo  cosmopolita,  estimándose  que  más  de  la  mitad  de  la  población mundial está infectada (EUROGAST, 1993). Dicho  agente  puede  ser  aislado  en  personas  tanto  sintomáticas  como  asintomáticas.  En  individuos  infectados  en  forma  crónica,  Hp  constituiría  el  principal  agente  etiológico  de  enfermedades  como  la  gastritis  crónica,  la  úlcera  péptica,  el  adenocarcinoma  y  el  linfoma  asociado  a  la  mucosa  gástrica  (MALT)  (Blaser,  2004).  El  curso  de  la  infección  es  muy  variable  y  depende  tanto  de  factores  propios  de  la  bacteria como del huésped. La infección no sólo altera en  forma  directa  la  mucosa  gástrica,  sino  que,  además,  modifica  a  nivel  del  antro  gástrico  la  secreción  de  polipéptidos  gastrointestinales  con  acción  hormonal  (p.e.  gastrina),  generando  alteraciones  en  la  fisiopatología  gástrica relevantes a la posterior ulceración de la mucosa.  En base a los antecedentes epidemiológicos disponibles, la  Agencia  Internacional  para  la  Investigación  del  Cáncer  clasificó a Hp como un carcinógeno humano clase I (IARC.,  1994).  El  cáncer  gástrico  ocupa  el  segundo  lugar  entre  las  causas de muerte por neoplasias a nivel mundial, y en Chile  representa  la  primera  causa  de  muerte  por  tumores  malignos en varones, habiéndose estabilizado a partir de la  década de los 80´ la tasa de mortalidad cruda en alrededor  de 20 por cada 100.000 habitantes (Parkin, 2002; 2005).     1.1.  Estrategias  de  tratamiento  y  prevención  de  la  infección     1.1.1.  Tratamiento  farmacológico,  IV  Consenso  de  Maastricht.  La  evaluación  de  nueva  evidencia  experimental,  así  como  el  tratamiento  a  utilizar  en  la  erradicación  de  este  patógeno  se  evalúa  cada  cuatro  o  cinco  años  por  expertos  en  el  denominado  consenso  de  Maastricht.  La  triple  terapia  convencional  que  incluye  un  PPI  y  los  antibióticos  claritromicina  y  amoxicilina  o  metronidazol  recomendado  en  el  primer  consenso  ha  demostrado  una  pérdida  de  eficiencia  debido  a  la  alta  resistencia  bacteriana  a  claritromicina  y  con  frecuencia  sólo  permite  como  máximo  un  70%  de  cura  en  los  pacientes.  Esta  terapia  provoca  malestar  en  muchos  pacientes,  incluyendo  cefaleas,  náuseas,  vómitos  y  sensación de mareo, siendo responsable del abandono de  la misma y contribuyendo así a la resistencia bacteriana. La  terapia  actual  recomendada  se  basa  en  la  resistencia  a  claritromicina  presente  en  cada  zona  geográfica:  cuando  ésta  es  menor  a  un  15  o  20%  el  tratamiento  empírico  recomendado de primera línea es el ya mencionado, con la  adición de bismuto como alternativa, en cambio cuando la  resistencia  es  mayor,  este  último  componente  es  altamente  recomendable  y  debe  adicionarse  si  la  triple  terapia  convencional  falla,  junto  al  reemplazo  de  la  claritromicina  por  levofloxacino.  Es  favorable  además,  utilizar  altas  dosis  de  PPI,  dos  veces  al  día  y  aumentar  la 

  duración del tratamiento, de 10 a 14 días, en vez de los 7  recomendados anteriormente (Malfertheiner, 2012).   1.1.2.  Vacunas.  Los  estudios  de  vacunas  utilizando  diversos modelos animales han probado  que el desarrollo  de  una  estrategia  de  vacunación  es  viable  y  que  un  candidato  vacunal  contra  Hp  es  factible    (revisado  por  Harris  et  al.,  2006;  Kabir  et  al.,  2007;  Del  Giudice,  2009),  pero  aún  no  se  ha  tenido  éxito.  Se  han  realizado  numerosos  estudios  en  animales    para  determinar  el  devenir de la infección y para explorar la viabilidad de una  vacuna  para  la  prevención  o  erradicación  de  la  infección  por  este  microorganismo.  Sin  embargo,  los  modelos  animales,  con  la  posible  excepción  de  los  monos,  no  han  servido  lo  suficiente    para  aclarar  dudas  debido  a  los  contradictorios resultados (Kotiw et al., 2012).   Según  el  Departamento  de  Gestión  de  Información  del  Instituto  Finlay  (Cuba),  organización  científica  que  se  preocupa  de  la  investigación  y  producción  de  vacunas,  todos  los  candidatos  vacunales  dirigidos  contra  Hp  están  en  fase  experimental,  y  señalan  que  son  varios  los  problemas  a  resolver  antes  de  que  se  pueda  llegar  a  desarrollar  una  vacuna  contra  este  patógeno  (http://www.finlay.sld.cu/ domingo, 20 de agosto de 2006,  22:39:22).  Svennerholm  y  Lundgren  (2007)  en  su  minireview  sobre  el  progreso  del  desarrollo  de  vacunas  contra  Hp    concluyen  que  hay  una  gran  necesidad  de  clarificar  el  principal  mecanismo  inmune  protector  contra  Hp  al  igual  que  identificar  un  cóctel  de  antígenos  protectores  fuertes,  o  cepas  bacterianas  recombinantes   que  expresen  tales  antígenos,  los  cuales  podrían  ser  administrados    mediante  un  régimen    que  origine  una  respuesta inmune efectiva en humanos.   Actualmente se sabe que la colonización del estómago por  Hp  induce  una  respuesta  inmune  fuerte  pero  no  protectora,  efectuada  principalmente  por  las  células  Th1.  Estas células producen interferon gamma, interleuquina ‐2  y  factor  de  necrosis  tumoral‐beta,  el  cual  activa  a  los  macrófagos y es responsable de la inmunidad mediada por  células  y  de  la  respuesta  protectora  dependiente  de  fagocitos. Por el contrario, las células Th2 producen IL‐4, IL‐ 5,  IL‐10  e  IL‐13‐,  las  que  estimulan  las  síntesis  de  anticuerpos  y  la  activación  de  eosinófilos  e  inhiben  varias  funciones  de  los  macrófagos,  proporcionando  una  respuesta  protectora  independiente  de  los  fagocito.  Por  esto,  se  cree  que  la  eficiencia  de  una  potencial  vacuna  contra  Hp  dependerá  de  la  inducción  de  la  respuesta  inmune humoral (Malfertheiner, 2012).    2.  CARACTERÍSTICAS  ESPECÍFICAS  DE  LA  PATOLOGÍA  MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori.    2.1. Evasión de la respuesta inmune e inflamatoria    En la interacción huésped‐Hp, el movimiento del patógeno  hacia la mucosa gástrica se ve favorecido por la morfología  espiralada  y  los  flagelos.  Posteriormente,  Hp  se  une  a    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 36 

 

 

    ciertos  receptores  de  células  del  epitelio  gástrico  (Hessey,  1990;  Logan,  1996),  a  través  de  adhesinas  del  tipo  BabA,  SabA,  AlpA,  AlpB,  OipA  y  HopZ,  desencadenando  la  producción de interleuquinas, como IL‐8 (pro‐inflamatoria)  y  de  otras  quimioquinas,  como  la  ENA‐78  (péptido  activador de neutrófilos derivado de células epiteliales) y el  GRO‐α  (encogen‐α  regulado  por  crecimiento).  Un  factor  endógeno que, adicionalmente facilita la unión de Hp a las  células  epiteliales,  es  la  glicoproteína  denominada  DAF  (Decay‐accelerating  Factor,  70  kDa)  (Servin,  2005;  O´Brien  et  al.,  2006),  la  cual  en    presencia  de  Hp  puede  ser  up‐ regulada. Tras su adhesión a la mucosa, Hp secreta toxinas  de  naturaleza  peptídica,  como  VacA  y  CagA,  capaces  de  actuar localmente sobre el epitelio blanco. Si bien Hp logra  asociarse  al  epitelio  gástrico  con  bastante  éxito,  una  vez  ahí debe lidiar con la primera línea de defensa constituida  por  la  inmunidad  innata.  Este  sistema  consta  de  componentes  de  barrera  (epitelios,  defensinas  y  linfocitos  T  intraepiteliales),  células  efectoras  circulantes  (neutrófilos, macrófagos y células NK) y diversas proteínas  efectoras circulantes (complemento, colectina, factores de  coagulación, proteína C‐reactiva y citoquinas como TNF‐α,  IL‐1,  10,  12,  15).  Aunque  algunos  de  estos  componentes  poseen  receptores  capaces  de  reconocer  patrones  moleculares  asociados  a  patógenos  (PAMPs),  que  llevan  a  la  destrucción  del  agente  extraño,  Hp  es  capaz  de  vulnerarlos eficazmente. Por ejemplo, el TLR4 (un receptor  del  tipo  Toll),  que  normalmente  reconoce  a  los  LPS  bacterianos  para  activar  a  NF‐κB,  genera  frente  al  LPS  de  Hp  una  respuesta  que  si  bien  es  proinflamatoria,  es  notablemente más débil en comparación con la de los LPS  de  otras  bacterias  entéricas  (menor  reconocimiento).  Del  mismo  modo,  en  contraste  con  las  flagelinas  secretadas  por  otros  patógenos  Gram  negativos,  como  Salmonella  o  Escherichia    coli,  que  activan  consistentemente  la  respuesta  pro‐inflamatoria  mediada  por  los  receptores  TLR5,  la  flagelina  presente  en  Hp  no  es  secretada  y  por  ende se considera no inflamatoria (Gewirtz et al., 2004).  A  su  vez,  Hp  es  capaz  de  interferir  con  algunas  de  las  respuestas  inmunes  locales;  por  ejemplo,  inhibiendo  la  producción  de  óxido  nítrico  por  parte  de  macrófagos  y  down‐regulando  la  expresión  de  receptores  a  quimioquinas en neutrófilos infiltrantes.   En  forma  adicional  a  la  respuesta  inmune  innata,  la  infección  por  Hp  induce  una  respuesta  inmune  caracterizada  por  la  infiltración  de  la  mucosa  con  neutrófilos, linfocitos y otras células inflamatorias, y por la  producción  local  y  sistémica  de  anticuerpos  y  de  otros  mediadores  de  la  respuesta  celular.  Si  bien  las  respuestas  celulares  y  humorales  son  importantes  en  la  patogénesis  de  Hp,  éstas,  como  tal,  son  inefectivas  para  erradicar  la  infección.  Aún  más,  como  resultado  de  la  interacción  de  linfocitos,  neutrófilos,  macrófagos  y  mastocitos,  la  respuesta  inmuno‐celular  es  conducente  a  una  amplificación de la inflamación inicial en el sitio infectado.  Tras ser atraídas al sitio de la lesión, las células infiltrantes 

  liberan  mediadores  como  citoquinas,  eicosanoides,  y  activadores  de  la  cascada  del  complemento,  capaces  de  perpetuar  la  inflamación.  Junto  a  dichos  mediadores,  las  células  referidas  liberan  al  medio  una  diversidad  de  especies  reactivas  del  oxígeno  y  nitrógeno  (ERON),  generando una condición de estrés oxidativo crónico en el  epitelio  afectado.  Las  respuestas  del  huésped  permiten  la  activación y diferenciación de linfocitos Th0 (CD4+), los que  según  el  patrón  de  citoquinas  presentes  en el  medio  y  de  las condiciones inmunes del individuo, logran diferenciarse  en Th1, mediando una respuesta de tipo celular, o bien Th2  con  una  respuesta  de  tipo  humoral.  La  respuesta  de  tipo  celular  es  mediada  a  través  de  citoquinas  tipo  Th1  –tales  como  IFNγ,  IL‐2  y  TNF‐α,  mientras  que  las  citoquinas  tipo  Th2 –como la IL‐4 e IL‐5‐ promueven una respuesta de tipo  humoral.  Recientemente  se  ha  comenzado  a  comprender  cómo –a través de mecanismos que permiten a Hp evadir  la  respuesta  inmune‐  la  bacteria  logra  perpetuar  la  inflamación de la mucosa gástrica (Ganten, et al., 2007). Un  ejemplo  de  esto  último  lo  constituye  la  habilidad  que  tienen  ciertas  cepas  de  Hp  (60190;  CagA+;  VacA+)  para  inducir  la  apoptosis  de  linfocitos  T  a  través  de  la  vía  intrínseca  (mitocondrial)  y  no  la  extrínseca.  Lo  anteriormente expuesto se suma a reciente evidencia que  pone  en  el  centro  del  proceso  inflamatoria  a  la  citoquina  IL‐32 como un factor amplificador de la activación de NF‐kB  y producción de IL‐8. Así, considera que el control efectivo  del proceso inflamatorio promovido por Hp contribuiría en  forma  importante  en  la  prevención  de  muchas  complicaciones asociadas, incluyendo al cáncer (Sakitani et  al., 2012).    2.2. Helicobacter pylori y evasión del estrés oxidativo    Mención  aparte  merecen  las  enzimas  con  que  Hp  está  equipado para combatir las especies reactivas del oxígeno  y de nitrógeno liberadas por células del sistema inmune del  huésped  (revisado  por  Wang  et  al.,  2006).  Entre  ellas,  la  más abundante es la alquilhidroperoxido reductasa (AhpC),  una  enzima  que  dada  su  alta  expresión  en  Hp  evita  la  acumulación de lipoperóxidos al interior del patógeno.   Las  cepas  de  Hp  mutantes  para  AhpC  presentan  una  aumentada  sensibilidad  a  diversas  condiciones  de  estrés  oxidativo  (Olczak  et  al.,  2002),  sobre‐expresan  la  proteína  activadora de neutrófilos (Olczak et al., 2003), y presentan  una  menor  actividad  catalasa  (Wang  et  al.,  2004).  Junto  a  lo anterior, Hp dispone de actividad superóxido dismutasa  para  la  remoción  de  radicales  superóxido  generados  por  células  del  sistema  inmune  (Comtois  et  al.,  2003),  y  es  capaz  de  aumentar  la  expresión  de  enzimas  antioxidantes  como la metionina sulfo‐reductasa, necesaria para corregir  la  modificación  oxidativa  de  proteínas  en  sus  residuos  metionina (Alamuri et al., 2006).   Una de las características de la infección por H. pylori es su  alto  grado  de  infiltración  linfocítica  (Allen,  2001).  Los  neutrófilos  y  células  mononucleares  infiltran  la  mucosa    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 37 

 

 

    estomacal infectada por H. pylori ocasionando inflamación  y  producción  de  especies  reactivas  del  oxígeno.  Se  ha  observado  que  ciertas  proteínas  acuosolubles  de  H.  pylori  son capaces de primar a los neutrófilos, incrementando su  capacidad  para  producir  ROS  y  quimioquinas  cuando  se  usan  agentes  inductores  como  el  PMA  y  el  fMLP   (Shimoyama  et  al.,  2003;  Nørgaard  et  al.,  1995).  Satin  y  colaboradores (2000), informaron que la proteína HP‐NAP  es  uno  de  los  factores  que  estimulan  a  la  NADPH  oxidasa  en neutrófilos, si bien, se observó un retardo en el patrón  de  respuesta  (medido  como  quimioluminiscencia  incrementada  para  luminol),  en  comparación  con  los  agentes  convencionales  que  inducen  el  estallido  respiratorio.  Específicamente,  los  autores  observaron  que  la  producción  de  ROS  alcanzó  un  máximo  entre  40‐60  minutos después de la incubación. Hp induce la migración  de los neutrófilos desde los capilares a la lámina propria y a  la  zona  glandular  de  la  mucosa,  especialmente  en  las  proximidades  de  los  cuellos  glandulares,  donde  se  encuentran las células germinales.     Los  neutrófilos  son  activados  por  factores  citotóxicos  del  propio Hp (como N‐formilmetionil‐leucil‐fenilalanina) y por  la  IL‐8  procedente  de  las  células  del  epitelio  tras  la  adhesión  bacteriana  (Mooney  et  al.,  1991).  Aun  más  relevante es que Hp posee la propiedad única de alterar la  distribución de NADPH oxidasa en los neutrofilos (Allen et  al.,  2005).  Lo  anterior  se  explica  por  un  ensamblaje  anómalo  del  complejo  funcional  NADPH  oxidasa  en  la  membrana  celular  y  no  en  el  fagosoma.  Específicamente,  mientras  el  flavocitocromo  b558  puede  ser  adquirido  por  los  fagosomas,  las  subunidades  p47phox  o  p67phox  no  pueden ser reclutadas eficientemente.   Los  factores  responsables  de  éste  tipo  de  evasión  aun  no  han  podido  ser  identificados.  La  evidencia  sugiere  que  se  trataría  de  moléculas  sensibles  al  calor,  resistentes  al  tratamiento con formalina y localizadas en la superficie de  H. pylori. Estos últimos factores no serían requeridos para  estimular  el  estallido  respiratorio  de  los  neutrófilos.  Por  otro  lado,  el  resultado  de  investigaciones  previas  indican  que  las  citotoxinas  CagA  y  VacA  son  innecesarias  para  la  activación de los neutrófilos (Danielsson et al., 2000). Otros  autores sugieren que la adhesina SabA de H. pylori podría  jugar  un  papel  preponderante  como  factor  activador  de  neutrófilos (Unemo, et al., 2005). De cualquier modo, este  mecanismo le permite a H. pylori desviar la producción de  anión  superóxido  hacia  el  exterior,  evitando  su  acumulación  en  el  fagosoma.  De  acuerdo  a  dicho  mecanismo,  Hp  actuaría  concertadamente  con  los  neutrófilos  para  producir  ulceración  gástrica  y  además  evadir  su destrucción  una  vez  fagocitado.  Consistente  con  lo anterior, se ha observado que la densidad de neutrófilos  infiltrantes  se  correlaciona  directamente  con  la  habilidad  de  Hp  para  causar  daño  a  la  mucosa  gástrica.  Por  otra  parte, el daño provocado por las ERON sobre las células del  epitelio  gástrico  permite  que  Hp  pueda  acceder  a  una 

  fuente  adicional  de  nutrientes.  Respecto  a  la  capacidad  que tienen los macrófagos activados en la mucosa gástrica  para  producir  óxido  nítrico,  especie  reactiva  que  en  conjunto  con  otras  persigue  la  eliminación  del  patógeno,  cabe destacar que Hp puede limitar los efectos bactericidas  del NO., tanto in vitro como in vivo, gracias a que expresa  (gen  rocF)  una  actividad  arginasa  capaz  de  “sifonar”  la  L‐ arginina  lejos  de  la  iNOS  del  huésped  (revisado  por  Peek,  2005).  Un  beneficio  adicional  asociado  a  la  alta  actividad  arginasa  de  Hp  es  la  generación  de  urea  (y  ornitina)  durante la hidrólisis de arginina. Si bien la arginasa puede  ser  inactivada  por  diversas  ERON  (McGee  et  al.,  2006),  y  desnaturalizada  por  altas  concentraciones  de  urea,  Hp  utiliza  una  tioredoxina  (Trx1)  como  chaperona  para  recuperar  la  actividad  catalítica  de  la  arginasa.  Por  tanto,  se  considera  que  el  sistema  arginasa/Trx1  actuaría  en  forma  concertada  como  sistema  de  adaptación  y  defensa  contra  el  estrés  oxidativo  resultante  de  la  respuesta   inmuno‐celular.       2.3.  Efectos  de  la  respuesta  inmuno‐celular  y  del  estrés  oxidativo sobre el huésped    Sumado  al  daño  directo  inducido  por  los  ERON  sobre  la  mucosa  gástrica,  los  eventos  que  conducen  al  proceso  inflamatorio anteriormente discutido, llevan a aumentar in  vivo  (en  mucosa  gástrica  y  a  nivel  sistémico)  diversos  parámetros  de  daño  oxidativo  a  lípidos  (reflejado  como  aumento en los niveles de MDA e isoprostanos) (Daví et al.,  2005;  Drake  IM  et  al.,  1998  )  y  al  DNA  (aumentada  excreción  de  8‐hidroxi‐guanidina)  (Smoot  et  al.  2000;  Ladeira  et  al.  2004;  Siomek  et  al.  2006).  La  respuesta  inmuno‐celular  produce,  además,  ciertos  eicosanoides  biológicamente  activos  a  través  de  un  mecanismo  de  peroxidación  del  ácido  araquidónico  catalizada  por  radicales del oxígeno (Davi et al., 2005).     Se  ha  planteado  que  el  daño  que  en  etapas  tempranas  (niñez  y  adolescencia)  genera  Hp  sobre  el  DNA  estaría  asociado  con  el  desarrollo  de  varios  tipos  de  cáncer  en  la  etapa  adulta  (Hatakeyama,  2004).  Sin  embargo,  tal  extrapolación  no  puede  ser  directa  debido  a  que  el  desarrollo  del  cáncer  en  respuesta  a  un  agente  carcinogénico  puede  tomar  entre  20  a  40  años.  No  obstante,  se  debe  recordar  que  las  ERON  son  una  de  las  explicaciones más socorridas  cuando se trata de buscar la  posible  asociación  entre  desarrollo  de  cáncer  y  Hp  (Kawanishi 2006; Schotterfeld, 2006). Por otra parte, se ha  demostrado  también  un  aumento  del  ácido  hipocloroso  (HClO) en mucosa gástrica de individuos infectados por Hp  (Matthews,  2005).  El  HClO  es  un  potente  pro‐oxidante  ‐ generado  a  partir  de  H2O2  (en  presencia  de  CI )  por  la  enzima mieloperoxidasa (MPO), liberada desde neutrófilos  activados. El HClO es capaz de reaccionar rápidamente con  el  NH3  generado  a  nivel  local  por  la  enzima  ureasa,  para    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 38 

 

 

    formar monocloroamina (NH2Cl). Este último compuesto es  altamente  lipofílico  y  por  tanto  capaz  de  atravesar  fácilmente  membranas  biológicas,  facilitando  la  oxidación  de macromoléculas al interior de las células epiteliales. Se  ha  observado,  además,  que  NH2Cl  es  capaz  de  inducir  la  infiltración  y  activación  de  neutrófilos  en  la  mucosa  gástrica  de  manera  similar  a  lo  observado  por  Hp  (Matthews, 2005). A su vez, se ha encontrado que ciertos  mecanismos  endógenos  de  defensa  antioxidante  como  el  glutatión  (GSH)  y  el  ácido  ascórbico  están  disminuidos  en  mucosas  infectadas  por  este  agente  (Arend,  2005;  Naito,  2002;  Ernst,  1999).  Más  aún,  en  la  mucosa  gástrica  de  pacientes infectados, relativo a pacientes Hp(‐), no solo los  niveles de GSH están disminuidos, sino que también los de  la  enzima  GSH‐transferasa  (Verhlust  et  al.,  2000;  Shirin  et  al., 2001; Jung et al., 2001).     Lo anterior conlleva una mayor producción local de ERON,  las  que  al  acumularse  pueden  ‐vía  regulación  de  ciertos  genes,  e  induciendo  daño  oxidativo  al  ADN‐  aumentar  el  riesgo de desarrollo de cáncer gástrico (Smoot et al., 2000;  Pignatelli  et  al.,  1998).  Cabe  mencionar  que  bajo  condiciones  desfavorables  (por  ejemplo,  de  estrés  oxidativo),  Hp  es  transformado  desde  la  forma  bacilar  original a la cocoide. Sólo esta última es capaz de generar  radicales hidroxilo, reconocidos como la especie de mayor  reactividad  hacia  sustratos  biológicos  (Nakamura  et  al.,  2000).  Se  ha  descrito  que  en  mucosa  gástrica  de  sujetos  asintomáticos,  la  erradicación  de  Hp  mediante  terapia  tradicional  conduce  a  una  normalización  de  los  niveles  de  actividad  de  ciertas  enzimas  antioxidantes  (como  iNOS  y  catalasa) (Felley et al., 2002).    3.  ASPECTOS  GENERALES  A  CONSIDERAR  EN  RELACIÓN  CON EL EFECTO DE LOS POLIFENOLES SOBRE Helicobacter  pylori.    Dado  que  el  estrés  oxidativo  asociado  a  la  respuesta  inmune  que  sucede  a  la  presencia  de  este  patógeno  representa  uno  de  los  principales  mecanismos  de  daño  al  epitelio  gástrico,  parece  muy  relevante  disponer  de  eficientes  sistemas  antioxidantes  (tanto  endógenos  como  dietarios)  en  la  zona  colonizada  por  Hp.  Sin  embargo,  las  estrategias  de  supervivencia  con  que  cuenta  Hp  contra  el  estrés  oxidativo,  hacen  surgir  la  interrogante  de  cuán  beneficiosa  puede  ser  la  administración  o  ingesta  de  antioxidantes.  Los  antecedentes  que  a  continuación  serán  revisados sugieren que estos compuestos podrían tener un  efecto protector no sólo para el huésped (citoprotegiendo  el  epitelio),  sino  también  sobre  Hp  (contribuyendo  a  sus  defensas antioxidantes).     Teóricamente, al aumentar la capacidad de Hp para “lidiar”  con  las  ERON  generadas  por  el  sistema  inmune  del  huésped,  se  aumentaría  también  la  posibilidad  de  que  la 

  colonización  del  epitelio  por  Hp  persista  en  el  tiempo.  No  obstante, estudios en los cuales se han evaluado extractos  de  plantas  ricos  en  compuestos  antioxidantes  dan  cuenta  de  efectos  anti‐Hp  tanto  in  vitro  como  in  vivo  (vide  infra;  Nostro  et  al.,  2005;  Mahady  et  al.,  2005;  Ustun  et  al.,  2006).  La  actividad  anti‐Hp  de  dichos  preparados  parece,  sin  embargo,  estar  asociada  a  determinadas  especies  vegetales  de  uso  médico  y/o  alimenticio,  y  por  consiguiente pudiera estar limitada a sólo algunas familias  fitoquímicas.  Ejemplos  de  esto  lo  constituyen  diferentes  bayas  (berries  ricos  en  polifenoles),  algunas  crucíferas  (brócoli  rico  en  glucosinolatos),  propóleos  y  especies  con  aceites  esenciales.  Sin  embargo,  dentro  de  los  grupos  de  fitoquímicos más estudiados destacan los polifenoles.   La  importancia  de  estos  compuestos  en  salud  humana  ha  sido  ampliamente  revisada  (Ross,  2002;  Hwa‐Young  Kim,  2003;  Kris‐Etherton  et  al.,  2004;  Raumussen  et  al.,  2005;  Ramassamy,  2006).  No  obstante,  lo  disperso  de  la  información  relativa  con  su  absorción,  metabolismo,  distribución  y  excreción  ha  llevado  a  muchos  investigadores  a  poner  en  duda  algunos  de  los  efectos  de  los  polifenoles  a  nivel  sistémico.  De  esta  forma,  se  ha  sugerido  que  el  primer  y  principal  sitio  donde  estos  compuestos podrían ejercer su acción antioxidante, sería el  tracto gastrointestinal (Revisado por Clifford, 2004).     De  acuerdo  a  antecedentes  de  la  literatura,  algunos  compuestos  polifenólicos  poseen  reconocida  actividad  bactericida,  dada  probablemente  por  mecanismos  inespecíficos que no necesariamente guardan relación con  su actividad antioxidante (citoprotectora) sobre las células  del  epitelio  gástrico  (Puupponen‐Pimia  et  al.,  2001).  Una  de  las  hipótesis  que  se  ha  aceptado  como  paradigma,  es  que  los  polifenoles  ejercen  parte  de  su  actividad  antimicrobiana  mediante  interacciones  inespecíficas  con  componentes  de  la  membrana  plasmática  (Mori  et  al.,  1987; Haraguchi et al., 1998; Funatogawa et. al., 2004). Al  respecto,  se  observó  un  efecto  dosis‐dependiente  al  evaluar  el  daño  provocado  por  algunos  polifenoles  en  los  modelos de integridad de liposomas y de alteraciones en la  morfología de Hp (Funatogawa et al., 2004). Sin embargo,  este  mecanismo  es  relevante  y  explica  la  actividad  de  taninos hidrolizables del tipo gálico  (telimagrandina I y II),  para  los  cuales  se  determinó  valores  de  MIC  hasta  7  ‐  8  veces  inferiores  a  los  obtenidos  con  los  taninos  condensados (procianidinas). Dado que sólo algunas de las  especies  vegetales  ricas  en  polifenoles  muestran  efectos  anti‐Hp,  resulta  evidente  que  los  vínculos  mecanísticos  entre las actividades antimicrobiana y antioxidante no son  obligados (Correia et al., 2004; Shin et al., 2005). Debido a  que,  entre  las  moléculas  fitoquímicas  bio‐activas,  los  polifenoles son los de mayor presencia en la dieta humana,  se  han  publicado  varios  estudios  que  relacionan  su  consumo con un efecto sobre Hp (Figura 1).       Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 39 

 

 

   

 

Figura 1.

  Estructura de diferentes polifenoles con efecto sobre Helicobacter pylori o sus factores de virulencia. 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 40   

 

    La  mayoría  de  dichos  estudios,  exceptuando  aquellos  realizados  con  té  verde  y  cranberry,  han  contemplado  la  evaluación  de  extractos  obtenidos  a  partir  especies  vegetales  de  uso  regional,  no  existentes  en  Chile.  Considerando  que  la  aplicación  de  las  terapias  triples  y  cuádruples  es  muy  costosa,  que  presenta  un  alto  nivel  de  reacciones  adversas,  y  que  junto  a  la  aparición  de  resistencia,  su  uso  masivo  sería  controversial  en  poblaciones  con  infección  endémica  por  Hp,  se  hace  crecientemente  necesario  investigar  el  potencial  que  pudieran  tener  extractos  vegetales  usados  como  ingredientes  de  productos  fitoterapéuticos,  nutracéuticos,  o  alimentos  funcionales.  Dichos  productos  ricos  en  antioxidantes  polifenólicos  podrían  usarse  en  individuos  colonizados  asintomáticos  contribuyendo  a  disminuir  la  evolución  de  otras  patologías  gástricas  y  extra‐gástricas.  Por  otro  lado,  se  ha  explorado  de  manera  creciente  las  potenciales relaciones sinérgicas entre productos naturales  y  los  antimicrobianos  usados  convencionalmente  para  la  erradicación  de  Hp.  Al  respecto,  en  cepas  de  Hp  con  diferente grado se susceptibilidad se ha descrito que el uso  combinado  de  extractos  de  jengibre  o  propóleos  con  claritromicina posee un efecto sinérgico o aditivo sobre la  inhibición  y  el  desarrollo  de  resistencia  hacia  éste  antibiótico, (Nostro et al., 2006).     Tal como se describe más adelante (sección 3.1), una serie  de estudios en los cuales se ha intentado aislar e identificar  los  polifenoles  presentes  en  plantas  y  alimentos,  sugieren  que  la  actividad  anti‐Hp  de  los  concentrados  polifenólicos  estaría  asociada,  mayormente,  a  los  antocianos,  flavonoides,  taninos  hidrolizables  (gallotaninos  y  ellagitaninos) y taninos condensados (procianidinas) como  los  sub‐grupos  más  activos  (Tómbola  et  al.,  2003).  Sin  embargo,  dentro  de  un  mismo  grupo  de  compuestos  fenólicos  existen  diferentes  grados  de  actividad  sobre  Hp,  lo  que  sugiere  que  los  mecanismos  de  acción  no  son  tan  inespecíficos  como  se  pensaba.  Por  ejemplo,  numerosos  estudios  realizados  con  flavonoides,  concluyen  que  la  mayor  solubilidad  en  lípidos  se  asocia  con  un  efecto  bactericida más potente (Hashimoto et al., 1998; Bae et al.,  1999,  2001;  Shin  et  al.,  2005;  Isobe  et  al.,  2006;  Ustün  et  al., 2006; Zhu et al., 2007).   Se  ha  propuesto  un  nuevo  mecanismo  mediante  el  cual  ciertos  flavonoides  de  baja  polaridad  pueden  ejercer  un  efecto  anti‐Hp.  Así,  la  actividad  bactericida  de  quercetina  [1], apigenina [2] y (S)‐sakuranetina [3], ha sido atribuida a  su  capacidad  de  inhibir    en  forma  competitiva  a  la  β‐ hydroxyacyl‐acyl  carrier  protein  dehydratase  (HpFabZ)  (Zhang  et  al.,  2008).  La  principal  función  de  HpFabZ  es  participar en la fase de elongación durante la biosíntesis de  ácidos  grasos  saturados  e  insaturados.  Dicha  proteína  también  es  blanco  de  otros  productos  naturales  como  la  juglona (hidroxi‐1,4‐naftoquinona, [4]), la cual es capaz de 

 

inhibirla  en  forma  competitiva  (Park  et  al.,  2006;  Kong  et  al., 2008).  3.1.  Antocianos, flavonoides, catequinas,  proantocianidinas y taninos hidrolizables.    Los  pigmentos  antociánicos  son  aquellos  polifenoles  que  confieren  el  color  a  las  frutas,  flores,  cereales  y  algunos  tubérculos.  Uno  de  los  productos  que  más  concentra  antocianos  es  el  jugo  de  cranberry  (Vaccinium  macrocarpon).  Este  último  ha  sido  estudiado,  particularmente,  por  sus  propiedades  antimicrobianas.  Estudios  clínicos  han  demostrado  que  el  consumo  sostenido de jugo de cranberry previene las (re)infecciones  del tracto urinario en mujeres (Avorn et al., 1995; Henil et  al.,  2000;  Kontiokari  et  al.,  2001;  Stothers,  2002;  Di  Martino et al., 2006). Se ha sugerido que los polifenoles de  cranberry  actuarían  evitando  la  adhesión  de  E.  coli  al  uroepitelio (Howell et al., 2002; 2005). Recientemente, las  propiedades  antimicrobianas  de  cranberry  han  sido  extendidas  a  Hp.  No  obstante,  aunque  los  antocianos  contribuyen  en  forma  importante  a  la  capacidad  antioxidante  del  cranberry,  se  ha  demostrado  que  la  inhibición  de  la  adhesión  de  Hp  a  la  mucosa  gástrica  humana, se debería más bien a sus constituyentes de alto  peso  molecular  (procianidinas  tipo  A,  [5])  (Burger  et  al.,  2000).  Basado  en  la  evidencia  arrojada  por  este  último  estudio,  Zhang  et  al.  (2005)  realizaron  un  ensayo  clínico  aleatorizado,  placebo‐controlado  y  doble  ciego,  en  una  población  adulta  de  Linqu  (China).  En  tal  estudio,  se  demostró  que  la  administración  de  250  ml  de  jugo  de  cranberry (2 veces al día por 90 días) ayudó a la supresión  de  Hp  en  un  14%  de  la  población  estudiada.  Estudios  in  vitro  han  demostrado  que  el  jugo  de  cranberry  asociado  con  otros  extractos  (Vitis  vinifera;  arándano  y  orégano)  inhibe  el  crecimiento  in  Vitro  de  Hp  en  forma  sinérgica,  correlacionándose  la  mayor  presencia  de  polifenoles  con  una mayor capacidad antioxidante de la “compleja” mezcla  ensayada  (Lin  et  al.,  2005;  Vattem  et  al.,  2005a).  Al  respecto,  se  debe  considerar  que  tal  complejidad  se  relaciona  con  la  presencia  de  otros  constituyentes  como  ácidos fenólicos.     Utilizando  bioprocesamiento  en  estado  sólido  (con  los  hongos  Rhizopus  oligosporus  y  Lentinus  edodes),  los  mismos investigadores lograron aumentar la extracción de  los  polifenoles  de  la  pomasa de cranberry,  obteniendo  un  producto con mayor efecto anti‐Hp (Vattem et al., 2005b).   En una aproximación similar, otros investigadores (Correia  et  al.,  2004)  encontraron  una  actividad  anti‐Hp  en  extractos  (ricos  en  quercetina  y  estructuras  tipo  bifenilos)  de desechos bioprocesados de la piña (Ananas cosmosus).  Sin  embargo,  en  este  último  estudio  no  se  logró  correlacionar  la  actividad  anti‐Hp  con  la  capacidad  antioxidante  de  los  extractos  empleados;  estos  últimos  concentraban  compuestos  con  una  mayor  presencia  de    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 41 

 

 

    grupos  fenólicos  (asociados  a  las  propiedades  antioxidantes  de  los  polifenoles)  (Correia  et  al.,  2004).  En  otro  estudio  donde  se  evaluó  la  actividad  antimicrobiana  de  12  tipos  de  berries  nórdicos  sobre  una  serie  de  patógenos humanos, se encontró que Hp y Bacillus cereus  fueron  las  bacterias  más  sensibles.  Interesantemente,  aunque  se  observó  que  los  niveles  totales  de  polifenoles  disminuyeron  durante  el  almacenamiento  en  frío,  la  actividad  antimicrobiana  no  fue  modificada  significativamente (Nohynek et al., 2006).    Por  otra  parte,  en  atención  a  su  alta  concentración  de  polifenoles,  se  ha  investigado  también  una  posible  acción  anti‐Hp  en  diferentes  tipos  de  té.  Estudios  in  vitro  realizados con infusiones al 5% de té verde (Lung Chen, cv)  demostraron  la  inhibición  de  la  multiplicación  de  Hp  (Yee  et al., 2000), proponiendo que dicha actividad residiría en  la  presencia  de  un  flavan‐3‐ol  conocido  como  galato  de  epigalocatequina  (EGCG,  [6]).  El  mismo  equipo  de  investigadores,  realizó  posteriormente  un  estudio  prospectivo entre dos grupos de individuos, infectados con  Hp (n = 42) y no infectados (n = 30), comparando el efecto  del  consumo  de  té  con  la  presencia  de  Hp  en  biopsias  gástricas.  Se  concluyó  que  habría  una  relación  inversa  y  significativa  entre  el  consumo  de  té  y  la  infección  por  Hp   (Yee et al., 2002).     A  la  luz  de  los  antecedentes  dados  por  la  etnomedicina,  ocasionalmente  avalados  por  estudios  experimentales  de  validación farmacológica, se han buscado diversos modelos  para  explicar  los  mecanismos  que  posiblemente  subyacerían a la acción anti‐Hp de los polifenoles presentes  en  los  recursos  etnomédicos  y  alimenticios  anteriormente  referidos.  Dentro  de  los  mecanismos  propuestos,  se  ha  explorado  la  relación  entre  el  tipo  de  estructura  de  los  polifenoles y su efecto como inhibidores de la actividad de  VacA  (medida  como  actividad  vacuolizante  y  el  flujo  de  urea  transmembrana  en  células  HeLa)  (Tombola  et  al.,  2003;  Ruggiero  et  al.,  2006).  Así,  el  resveratrol  [7],  la  morina [8], el ácido tánico [9] y el piceatanol [10] parecen  compartir  características  estructurales  que  sugieren  la  existencia  de  interacciones  específicas  molécula‐molécula  entre ciertos polifenoles y VacA. Otros polifenoles, con alta  actividad  antioxidante  (incluso  con  mayor  presencia  de  grupos  fenólicos),  como  el  ácido  ellágico  [11]  y  la  miricetina  [12],  se  mostraron  total  o  parcialmente  inactivos  hacia  VacA,  respectivamente.  Estos  últimos  compuestos  están  presentes  en  cantidades  variables  en  muchos  alimentos  de  origen  vegetal  y  se  les  puede  encontrar  en  altas  concentraciones  en  el  vino,  cerveza,  chocolate amargo y té verde.     Recientemente,  un  antecedente  adicional  respecto  a  la  existencia  o  bien  ausencia  de  relación  entre  actividad  antioxidante de los polifenoles y actividad anti‐Hp (medida  como  inhibición  de  vacuolación  y  del  crecimiento  de  Hp) 

  emergió  del  estudio  de  13  diferentes  tipos  de  estructuras  flavonoideas, todas con propiedades antioxidantes (Shin et  al.,  2005).  Dentro  de  los  compuestos  evaluados,  sólo  quercetina [1] y naringenina [13] (dos aglicones) inhibieron  la vacuolación inducida por Hp en células HeLa.     Como  evidencia  adicional  en  favor  de  la  asociación  no  obligada entre actividad antioxidante y efecto anti‐Hp, Shin  et  al  (2005)  demostraron  también  que  antioxidantes  de  estructuras  tan  disímiles  como  el  ácido  ascórbico,  el  glutatión,  la  epicatequina  [14]  y  el  trolox  (análogo  hidrosoluble  del  α‐tocoferol)  tienen  en  común  el  ser  inefectivos como inhibidores de VacA. Entre estos últimos  antioxidantes,  se  ha  evaluado  la  acción  inhibitoria  del  crecimiento  de  Hp  para  epicatequina  y  vitamina  C,  siendo  activa  sólo  esta  última  tanto  in  vivo  como  in  vitro  por  un  mecanismo aun no esclarecido pero que, en todo caso no  estaría asociado al efecto del pH (Zhang et al., 1997; Mabe  et  al.,  1999:  Wang  et  al.,  2000).  La  literatura  informa  que  otro hecho relevante es que algunos polifenoles inhiben la  activación de procaspasa‐3 a caspasa‐3 inducida por VacA,  sin  cambios  en  la  expresión  de  las  proteínas  Bax  y  Bcl‐2  (proteínas antiapoptóticas). Por lo tanto, quercetina puede  proteger  a  las  células  gástricas  de  la  apoptosis  inhibiendo  la acción vacuolante de la toxina VacA de Hp. Si bien estas  propiedades  antioxidantes  y  citoprotectoras  para  los  compuestos  señalados  son  reconocidas,  llama  la  atención  que en otros modelos se observe una capacidad de inducir  muerte  y/o  arresto  de  la  proliferación  en  líneas  celulares  inmortalizadas  derivadas  de  tumores  (Wang,  2000;  Lu  et  al.,  2002).  Esta  polifuncionalidad  por  parte  de  algunos  compuestos  fenólicos  (EGCG  por  ejemplo),  es  evidente  si  se considera que además, éstos podrían generar ambientes  oxidativos diferenciales que permitan proteger a las células  del  huésped  de  las  ERON  y  por  otro  lado  promover  la  apoptosis  de  las  células  tumorales  (Yamamoto,  et  al.,  2003).     Una hipótesis recientemente planteada para explicar el por  qué  solo  ciertos  antioxidantes  polifenólicos  se  muestran  activos  contra  Hp,  considera  el  potencial  efecto  prooxidante que muestran ciertos polifenoles. La forma en  que  los  polifenoles  podrían  actuar  como  generadores  de  especies  reactivas  del  oxígeno  fue  abordada  por  varios  investigadores (Aragawa et al., 2003; Arakawa et al. 2002,  2004;  Aoshima  et  al.  2005),  y  utilizando  como  modelo  de  polifenol,  catequinas  de  té  verde  (cuya  propiedad  bactericida es conocida), los autores demostraron que a pH  7‐8  (o  superiores),  tal  tipo  de  estructura  es  capaz  de  generar  cantidades  significativas  de  peróxido  de  hidrógeno.  De  acuerdo  a  los  autores,  la  generación  de  peróxido de hidrógeno podría explicar el efecto bactericida  de  los  flavan‐3‐oles.  La  habilidad  de  las  catequinas  para  generar  peróxido  de  hidrógeno  sería  favorecida  por  el  arreglo  de  grupos  hidroxilo  en  este  tipo  de  moléculas,  lo  + que  permitiría  la  disociación  del  H   en  solución  y  un    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 42 

 

 

    electrón en el fenol que reduce al oxígeno, generándose en  consecuencia  anión  superóxido.  El  anión  superóxido  posteriormente  sufre  reducción  por  la  catequina  (ej.  EGCG), lo que lleva a la formación de O2 2‐ ; adicionalmente,  el  protón  se  combina  con  el  superóxido  generando  H2O2.  Este  mecanismo  no  sólo  explicaría  la  generación  de  H2O2  producida por  catequinas puras sino también por parte de  infusiones  de  té  negro,  té  verde  y  té  Oolong  ‐4 ‐4  ‐4 correspondientes a 1.5 x 10 , 2.4 x 10 y 0.87 x 10  mol/l  respectivamente.  Estos  niveles  de  H2O2  serían  suficientes  para  ejercer  una  acción  bactericida  en  cepas  Gram  positivas  y  negativas  (Arakawa  et  al.,  2004).  Si  bien  es  improbable que la generación de H2O2  ocurra en el medio  gástrico,  podría  especularse  que  el  mayor  pH  del  periplasma de Hp, dado por la actividad ureasa, supondría  un  “ambiente”  favorable  a  la  formación  de  superóxido  en  presencia  de  ciertos  polifenoles.    Por  otra  parte,  cabe  mencionar que cepas de lactobacilos entéricos o gástricos,  capaces  de  producir  bacteriocinas,  ácido  láctico  y  acético,  son  también  capaces  de  generar  concentraciones  bactericidas de H2O2 (Fernández, 2003; García et al., 2009).  Interesantemente, los autores observaron que el co‐cultivo  de  Hp  con  lactobacilos  entéricos  o  gástricos  supone  la  inhibición del crecimiento de Hp.     4. LA ACTIVIDAD DE LOS POLIFENOLES COMO AGENTES  GASTROPROTECTORES EN LA INFECCIÓN POR  Helicobacter pylori.    Los  polifenoles  son  constituyentes  comunes  de  plantas  medicinales  y  de  uso  alimenticio  cuya  principal  ventaja  radica  en  la  baja  toxicidad  respecto  de  otras  substancias.  Tal  como  se  describió  anteriormente,  muchos  polifenoles  en  forma  aislada  han  mostrado  diferentes  grados  de  actividad anti‐Hp (sección 3). Cabe notar, sin embargo, que  la  evidencia  de  que  un  determinado  componente  de  un  extracto  es  activo  contra  Hp  no  necesariamente  debe  ser  interpretada como evidencia de que el extracto, como tal,  compartirá  también  la  actividad  observada  para  el  componente  aislado.  Si  bien  son  escasos  los  estudios  dirigidos  a  evaluar  la  actividad  anti‐Hp  de  los  compuestos  aislados, para algunos de los polifenoles se ha demostrado  una  actividad  anti‐ureasa  y/o  anti‐VacA.  Este  es  el  caso  para  los  flavonoides  (derivados  de  quercetina),  las  procianidinas  (tipo‐B,  [15]),  y  la  floridzina  [16].  En  el  caso  de  los  flavonoides  mencionados,  Shin  et  al.,  (2005)  ha  descrito  que  dichos  compuestos  inhiben  la  vacuolación  inducida  por  Hp  en  células  HeLa  y  que  adicionalmente  tendrían  una  moderada  actividad  inhibitoria  de  la  ureasa.  En el caso de las procianidinas, utilizando extractos de Vitis  vinifera ricos en procianidinas tipo B y C, Lee et al. (2006)  observó  que  dichos  compuestos  son  particularmente  activos inhibiendo la ureasa (ya a una concentración de 0.1  mg/mL).    

  En  el  caso  de  la  floridzina,  se  ha  encontrado  que  esta  chalcona  promueve  una  acción  anti‐Hp  inhibiendo  la  actividad  formadora  de  poros  de  la  toxina  VacA.  La  actividad  anti‐VacA  (IC50=  273  µM)  de  floridzina  es,  sin  embargo,  extremadamente  baja  respecto  a  la  del  ácido  tánico  (IC50=  2,7  µM),  observado  como  el  polifenol  más  activo  en  dicho  estudio.  Respecto  al  ácido  tánico,  se  ha  establecido que éste (en asociación con N‐propil‐galato) es  muy efectivo en inhibir la gastritis en un modelo de ratón  infectado  por  Hp  o  por  VacA  (Ruggiero  et  al.,  2006).  Adicionalmente, se ha comprobado que ciertos polifenoles  de alto peso molecular como las procianidinas oligoméricas  extraídas de lúpulo, son capaces de formar complejos con  VacA  in  vitro  (Yahiro  et  al.,  2005;  aspecto  revisado  por  Friedman,  2007).  Yahiro  observó  que  la  interacción  entre  las  proantocianidinas  oligoméricas  (con  un  grado  de  polimerización  promedio  equivalente  a  22  unidades  de  catequina)  y  la  toxina  VacA  constituye  un  potencial  mecanismo  de  neutralización  de  virulencia  de  la  bacteria.  Dichos  compuestos  fueron  efectivos  bloqueando  la  unión  de  VacA  a  sus  receptores  RPTPα  y  RPTPβ,  inhibiendo  la  unión  no  específica  de  VacA  a  la  membrana  celular,  disminuyendo  la  vacuolación  celular  in  vitro  y  atenuando  en forma significativa la gastritis inducida en ratones por la  administración de VacA.     De  la  misma  forma,  Ruggiero  et  al,  (2007)  demostraron  que la administración de extractos de vino tinto y/o de té  verde  a  ratones  a  los  cuales  se  les  indujo  gastritis  por  infección  con  Hp  o  por  administración  de  la  toxina  VacA,  tienen  un  claro  efecto  gastroprotector,  sugiriendo  que  la  toxina  sería  un  potencial  blanco  molecular  de  los  polifenoles  presentes  en  los  extractos  utilizados.  Interesantemente,  Hamauzu  et  al.,  2006,  observó  que  en  relación a los extractos de pulpa de manzana, extractos de  pulpa  de  membrillo  tienen  un  efecto  antiulcerogénico  claramente  mayor  sobre  la  injuria  gástrica  inducida  por  etanol  y  HCl.  Los  autores  sugieren  que  la  diferencia  en  la  efectividad  anti‐ulcerogénica  de  dichos  extractos  residiría  en la notablemente mayor concentración de procianidinas  con un alto grado de polimerización promedio en la pulpa  del  membrillo  (DP=29)  relativo  a  la  pulpa  de  manzana  (DP=3).    En  relación  a  esto  último,  Saito  et  al.,  (1998)  había  reportado  previamente  que  extractos  de  semilla  de  Vitis  vinifera, así como sus procianidinas (de alto PM), tienen un  efecto  antiulcerogénico;  los  autores  postularon  que  parte  de  dicho  efecto  se  debería  a  la  fuerte  unión  de  estos  compuestos  a  proteínas  presentes  en  la  mucosa  gástrica,  permitiendo  la  formación  de  una  barrera  protectora  con  potencial actividad antioxidante y antiinflamatoria local.     En  efecto,  recientemente  se  ha  establecido  que  extractos  de pulpa de manzana, ricos en polifenoles, promueven una  acción  antioxidante  y  citoprotectora  en  cultivos  primarios    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 43 

 

 

    de  células  de  mucosa  gástrica  (MKN‐28)  sometidas  a  un  sistema  xantina‐xantino  oxidasa,  como  generador  de  radicales  anión  superóxido  (Grazziani  et  al.,  2005).  El  efecto  protector  de  dichos  extractos  ha  sido  observado  también  en  un  modelo  in  vivo  de  injuria  a  la  mucosa  gástrica  inducida  por  la  administración  de  indometacina  Grazziani et al., 2005). Interesantemente, el daño oxidativo  y  las  lesiones  a  la  mucosa  gástrica  inducidas  por    indometacina  son  exacerbadas  por  la  infección  con  Hp  (Arend et al., 2005).      Figura 1. 

 

  Principales blancos moleculares de los polifenoles sobre H. pylori.      En otro estudio, se ha establecido que extractos de cáscara  de  manzana  inhiben,  tanto  in  vitro  como  in  vivo,  la  activación de AP‐1 y la transformación neoplásica (Ding et  al.,  2004).  La  activación  del  complejo  AP‐1  es  uno  de  los  eventos claves en la promoción de tumores mediada por la  citotoxina CagA de Hp. Al respecto, se ha sugerido que los  polifenoles de manzana podrían inhibir la activación de AP‐ 1  interfiriendo  con  la  señalización  vía  MAP  kinasas,  ERK  y  JNK.  Mediante  experimentos  de  ESR,  Ding  et  al.  (2004)  confirmaron  el  efecto  estabilizador  de  los  extractos  de  manzana  sobre  los  radicales  OH.  y  O2.‐.    Esto  último  sería  particularmente relevante dado que, ERKs, JNKs y p38 son  moléculas  activadas  en  respuesta  a  estímulos  oxidantes.  Finalmente,  en  estudios  adicionales  conducidos  en  ratones, los mismos autores demostraron que los extractos  también  inhiben  la  inducción  de  tumores  por  TPA  (éster 

  12‐O‐tetradecanoil‐forbol‐13‐acetato).  El  efecto  de  los  polifenoles  sobre  el  estallido  respiratorio  inducido  por  PMA y fmlp en neutrófilos ha sido reportado por Limasset  y  colaboradores    (Limasset  et  al.,  1993).  Los  autores  evaluaron  el  efecto  de  34  polifenoles  sobre  la  producción  de  ROS  concluyendo  que  ésta  depende  del  estímulo,  llegando  en  algunos  casos  a  ser  opuesta.  Lo  anterior  sugiere  que  existen  diferentes  mecanismos  mediante  los  cuales  estos  compuestos  pueden  inhibir  la  producción  de  especies  reactivas  es  dicho  contexto  celular.  En  otro  trabajo,  Krol  y  colaboradores  (1992)  estudiaron  14  flavonoides, confirmando que un grupo hidroxilo en el C‐3,  dos  hidroxilos  en  el  anillo  B  y  la  presencia  de  un  doble  enlace  entre  C‐2  y  C‐3,  son  de  vital  importancia  para  la  inhibición  de  la  producción  de  ROS  en  neutrófilos.  Los  mismos  investigadores  además  sugieren  que  la  liposolubilidad  podría  ser  una  de  las  propiedades  preponderantes  para  que  la  actividad  de  los  flavonoides  sea  relevante  en  dicho  sistema  celular.  Posteriormente,  Limasset  et  al.,  (1999)  evaluaron  un  grupo  de  18  polifenoles  y  algunos  de  sus  metabolitos  putativos  como  algunos  ácidos  fenólicos.  Ellos  observaron  que  los  metabolitos  resultaron  ser  inhibidores  menos  potentes  y  específicos  que  los  compuestos  parentales.  Moreira  y  colaboradores  (2007)  estudiaron  el  efecto  de  cuatro  flavonoides (quercetina [1], miricetina [12], canferol [17] y  galangina [18]) sobre la producción de ROS en neutrófilos  de  conejo  estimulados  con  dos  receptores  del  complemento  (FcγR,  CR).  Interesantemente,  aunque  la  actividad  de  los  flavonoides  sobre  la  producción  de  ROS  pareció  ser  independiente  del  receptor  estimulado,  sí  mostró  estar  directamente  relacionada  con  la  liposolubilidad  del  compuesto  estudiado  e  inversamente  correlacionada con el número de hidroxilos presentes en el  anillo  B.    Como  se  indicó  previamente,  debido  a  la  alteración  en  el  ensamblaje  del  complejo  NADPH  oxidasa,  la  producción  de  ROS  inducida  por  Hp  podría  ser  responsable  de  la  exacerbación  del  daño  a  la  mucosa  gástrica por lo tanto, la presencia de antioxidantes eficaces  en  la  biofase  donde  ocurre  este  fenómeno  es  muy  importante.  En  estudios  realizados  por  nuestro  grupo,  los  flavonoides  presentes  en  un  extracto  de  manzana  (APPE)  fueron  capaces  de  neutralizar  la  producción  de  ROS  y  atenuar el daño a la mucosa de animales infectados con Hp  (Pastene  et  al.,  2009b).  El  APPE  posee  una  importante  concentración  de  glicósidos  de  quercetina  (58%  del  total  de  polifenoles),  siendo  la  rutina  [19],  hiperósido  [20],  isoquercitrina [21] y quercitrina  [22] los más importantes.  Estos  resultados  nos  permitieron  concluir  además,  que  mientras  algunos  compuestos  fenólicos  ayudan  por  sus  consabidas  propiedades  antioxidantes  y  antiinflamatorias,  otros  neutralizan  factores  de  virulencia  como  la  ureasa,  VacA  y  las  adhesinas  de  este  patógeno  (Pastene  et  al.,  2010).  En  efecto,  utilizando  el  mismo  APPE,  previamente  habíamos  descubierto  que  la  ureasa  de  Hp  podía  ser  inhibida  en  forma  muy  eficiente.  Sin  embargo,  tal  efecto    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 44 

 

 

    sólo  pudo  ser  asociado  al  otro  grupo  de  polifenoles  identificados  en  la  manzana,  las  proantocianidinas  (Pastene  et  al.,  2009a).  Las  proantocianidinas  se  conocen  también  como  taninos  condensados  y  son  abundantes  en  varias  plantas  medicinales  como  el  Espino  blanco,  Ginkgo  biloba  e  hipérico  pero,  además  son  constituyentes  normales  de  ciertos  alimentos  como  el  chocolate,  vino  tinto,  jugo  de  cranberry  y  manzana.  En  dichos  frutos,  normalmente  las  cáscaras  y/o  semillas  concentran  proantocianidinas  y  pueden  ser  utilizados  como  fuente  para  su  obtención  a  bajo  costo.  Así,  en  otra  iniciativa  ideada  por  nuestro  laboratorio  (PFT‐014,  Universidad  de  Concepción),  las  cáscaras  de  paltas  fueron  aprovechadas  para  la  obtención  de  un  polvo  enriquecido  en  proantocianidias  con  elevado  poder  anti‐ureásico  (Chávez  et al., 2011). Este proyecto dio origen a otro financiado por  Innova  Bio‐Bio  (2012)  que  tiene  por  objeto  realizar  los  estudios  de  diferentes  variedades,  optimización  del  rendimiento  y  desarrollo  de  operaciones  de  escalamiento  con  el  fin  de  calcular  la  rentabilidad  de  la  producción  del  extracto de cáscara de palta. Sin embargo, hasta ahora, los  estudios llevados a cabo con las procianidinas de manzana  y palta sólo nos habían permitido visualizar la importancia  del  grado  de  polimerización  sobre  la  actividad  inhibitoria  de  la  enzima.  Producto  de  estudios  realizados  en  proantocianidinas  obtenidas  de  otras  fuentes  vegetales,  quedó de manifiesto que la naturaleza de los monómeros  que  las  originan  y  probablemente  las  diferentes  conformaciones  espaciales  que  adoptan  en  solución,  son  factores  críticos  en  su  actividad  biológica.  Tal  situación  representa  un  grado  de  complejidad  adicional  y  que  motivó que recientemente nuestro grupo de investigación  se  adjudicara  el  proyecto  Fondecyt  titulado  “Structure‐ activity  relationship  of  natural  and  semi‐synthetic  proanthocyanidins  as  anti‐Helicobacter  pylori  molecules  through the inhibition of its urease activity and adherence  to  AGS  cells”  (N°11110442).  Esta  iniciativa  aborda  por  primera  vez  en  nuestro  país  la  investigación  de  interacciones  químico‐biológicas  entre  Hp  y  polifenoles,  centrándose en las proantocianidinas extraídas de diversas  materias primas como plantas medicinales, orujos de uva,  pomasa de cranberries y las cáscaras de manzana y paltas,  por nombrar algunas.      5. CONCLUSIONES    En  virtud  de  los  antecedentes  que  indican  que  algunos  polifenoles muestran una interesante actividad anti‐Hp (ya  sea promoviendo una acción antimicrobiana directa, o bien  indirectamente  afectando  la  virulencia  y/o  sobrevivencia  de  la  bacteria).  Tal  como  se  observa  en  la  Figura  2  los  potenciales blancos moleculares o sitios de acción que los  compuestos  polifenólicos  pudieran  tener  como  agentes  destinados  a  complementar  el  manejo  de  la  infección  por  Hp  y/o  de  sus  consecuencias.  Algunos  de  estos  blancos 

  moleculares  (Ureasa,  VacA,  flagelos,  adhesinas),  están  siendo  estudiados  en  profundidad  por  nuestro  grupo  de  investigación.  Sin  embargo,  la  inhibición  de  otros  factores  altamente relevantes y especializados como la toxina CagA,  permanecen aun difíciles de neutralizar.     Los  productos  fitoterapéuticos  y  alimentos  diferenciados  (funcionales),  debieran  estar  orientados  en  primera  instancia  a  la  prevención  y  en  segundo  lugar  a  complementar  las  estrategias  terapéuticas  existentes.  Si  bien  algunos  polifenoles  pueden  interaccionar  específicamente  con  varios  factores  de  virulencia  de  la  bacteria,  incluso  comprometiendo  su  viabilidad,  otros  lo  hacen en forma muy inespecífica. Claramente, se requiere  mucha  evidencia  preclínica  y  clínica  que  avale  la  real  contribución  de  muchos  productos  enriquecidos  en  polifenoles  en  el  manejo  eficaz  de  esta  infección  y  sus  alcances intra y extragástricos.      AGRADECIMIENTOS    Proyecto  Fondecyt  N°  11110442,  INNOVA  BIOBIO  12.57‐ EM.TES (12.171), CONICYT Programa Formación de Capital  Humano  Avanzado/  Beca  de  Magíster  en  Chile,  Año  Académico  2012  15550904,  Proyecto  Interno  Universidad  de Concepción Nº 212.085.033‐1.0      BIBLIOGRAFÍA:    Akhter Y., Ahmed I., Devi M., Ahmed N. The co‐evolved Helicobacter pylori  and gastric cancer: trinity of bacterial virulence, host suceptibility and  lifestyle. Infectious Agents and Cancer. 2007, 2: 2‐5.   Alamuri P., Maier R. Methionine sulfoxide reductase in Helicobacter pylori:  Interaction  with  methionine‐rich  proteins  and  stress‐induced  expression. J. Bacteriol. 2006, 188(16): 5839‐5850.  Alberto MR., Canavosio MAR., Manca de  Nadra MC. Antimicobial effect of  polyphenols from apple skins on human bacterial pathogens. Electron.  J. Biotechnol. 2006, 9(3): 205‐209.  Allen,  L.A.    The  role  of  neutrophil  and  phagocytosis  in  infection  caused  by  Helicobacter pylori. Curr. Opin. Infect. Dis.  2001, 14(3), 273‐277.   Allen  LA.,  Beecher  BR.  Lynch  JT.,  Rohner  OV.,  Wittine  LM.  Helicobacter  pylori disrupt NADPH oxidase targeting in Human neutrophils to induce  extracellular superoxide release. J. Immunol. 2005, 3658‐3667.   Amieva  MR.,  Vogelmann  R.,  Covacci  A.,  Tompkins  LS.,  Nelson  WJ.,  et  al.  Disruption  of  the  epithelial  apical‐junctional  complex  by  Helicobacter  pylori CagA. Science. 2003, 300:1430‐1434.   Aragawa M., Shigemitsu T., Suyama K. Production of hydrogen peroxide by  polyphenols  and  polyphenol‐rich  beverages  under  quasi‐physiological  conditions. Biosci Biochem Biotech. 2003, 67(12): 2632‐2640.  Arakawa H., Kanemitsu M., Tajima N., Maeda M. Chemiluminescence assay  for  catechin  based  on  generation  of  hydrogen  peroxide  in  basic  solution. Anal. Chim. Acta. 2002, 472: 75‐82. 

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ARTÍCULO DE REVISIÓN 

 

 

     

 

COMPUESTOS NEUROACTIVOS OBTENIDOS DESDE FUENTES NATURALES: CARACTERIZACIÓN  FARMACOLÓGICA DE NEUROMODULADORES DEL SNC.   (Neuroactive compounds obtained from natural sources: Pharmacological Characterization of CNS  neuromodulators)      Jorge Fuentealba Arcos1, Ph.D., Leonardo Guzmán2, Ph.D. y Luis G. Aguayo3, Ph.D    1

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Unidad  de Screening de Compuestos Neuroactivos,   Laboratorio de Neurobiología Molecular,  Laboratorio de Neurofisiología, Departamento  de Fisiología, Facultad de Cs. Biológicas, Universidad de Concepción, Chile. 

  RESUMEN  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

La  búsqueda  de  compuestos  bioactivos  presentes  en  la  biosfera,  es  un  esfuerzo  milenario  de  las  civilizaciones  que  se  ha  enfocado a obtener productos, moléculas y finalmente fármacos que ayuden a aliviar, tratar o recuperar al organismo de una  situación  patológica  o  anormal.  Desde  los  egipcios  (papiro  de  Ebers),  pasando  por  los  árabes  hasta  nuestros  días,  la  fuentes  naturales presentes en la biomasa nos han proporcionado invaluables recursos, con un alto potencial terapéutico para su uso en  medicina humana. Claros ejemplos de irremplazables herramientas farmacológicas, que ha impactado en el desarrollo del ser  humano,  son  las  penicilinas,  la  efedrina,  y  la  cocaína  por  ejemplo.  Moléculas  como  las  mencionadas,  han  demostrando  tener  perfiles farmacológicos diversos en efectos y potencias, permitiendo de alguna forma la caracterización de receptores y de otra,  el desarrollo de medicamentos de amplio uso (o abuso). Desde la alquimia a nuestros días, el deseo por buscar la fuente de la  vida eterna, se ha transferido a la ciencia moderna, como la responsabilidad de encontrar nuevas alternativas farmacológicas  capaces  de  resolver  los  problemas  asociados  al  envejecimiento,  en  especial  aquellas  relacionadas  al  deterioro  fisiológico  o  patológico  del  sistema  nervioso.  Preservar  en  el  tiempo  las  funciones  cognitivas  del  individuo,  o  retrasar  su  deterioro,  nos  desafían permanente y urgentemente a encontrar soluciones para patologías como el Alzheimer, ELA y Parkinson, que hasta el  momento, no tienen una cura definitiva. Este trabajo, revisa los principales hallazgos de nuestras investigaciones, relacionadas  con  la  caracterización  farmacológica  de  compuestos  neuroactivos  obtenidos  desde  la  naturaleza  nativa  del  país.  Cabe  mencionar,  que  de  los  compuestos  estudiados,  algunos  como  la  tutina,  una  sesquiterpenolactona  obtenida  de  Coriaria  ruscifolia: se proyecta como un potente agente neuroléptico; NE10, un neuroesteroide obtenido desde un residuo de celulosa  (tail oil): como un sedante no hipnótico que potencia los efectos de acepromazina; o un conjunto de polifenoles obtenidos de  maqui,  que  han  demostrado  una  potente  actividad  neuroprotectora  en  un  modelo  de  Alzheimer,  son  parte  de  los  resultados  más relevantes comentados en esta revisión.    Palabras claves: Neuroprotección, tutina, Alzheimer, Receptor de Glicina, Receptor de GABAA , epilepsia.    Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

  INTRODUCCIÓN    Desde  tiempos  milenarios,  el  ser  humano  ha  utilizado  sus  capacidades  cognitivas  y  racionales  para  observar  la  naturaleza  y  encontrar  en  ella  sustancias,  preparados  y  finalmente  fármacos  de  enorme  relevancia  para  su  salud,  su bienestar, su desarrollo y evolución. 

Así  ejemplo,  el  “papiro  de  Ebers”,  es  una  de  la  primeras  referencias de medicina, donde se recopilan antecedentes  de  más  de  700  sustancias  con  aplicación  terapéutica  (Hallmann‐Mikolajczak  2004;  York  et  al.  2010).  

  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐  Correspondencia  a:  Dr.  Jorge  Fuentealba  Arcos,  Departamento  de  Fisiología,  Facultad  de  Cs.  Biológicas,  Universidad  de  Concepción.  Barrio  Universitario  s/n  Concepción. POBOX 160‐C. Teléfono: 56‐041‐2661082. Correo Electrónico: [email protected]    

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    Pedacio  Dioscórides  y  Galeno  fueron  dignos  representantes  de  la  medicina  griega,  que  también  hicieron  significativos  aportes  al  estudio  y  aplicación  de  sustancias  naturales  en  el  tratamiento  de  enfermedades.  Este  proceso  de  conocimiento  y  desarrollo,  detenido  durante  la  inquisición,  reservó  el  estudio  de  las  propiedades  terapéuticas  de  plantas  y  otras  especies,  a  conventos  y  monasterios  durante  ese período  (ej.:  El  licor  monacal  y  el  Benedictino).  Los  alquimistas  (s  XVI),  fueron  los responsables de dar un nuevo impulso al estudio de las   

  sustancias  de  origen  natural,  en  especial  Paracelso,  un  alquimista  pionero  en  su  época.  De  ahí  en  adelante,  el  desarrollo  de  conocimiento  basado  en  el  estudio  de  los  compuestos  activos  presentes  en  plantas  y  diferentes  especies  de  la  biomasa  conocida,  sufre  un  crecimiento  vertiginoso  y  van  apareciendo  detallados  estudios  de  principios  activos  que  han  marcado  la  historia  de  la  farmacología, como por ejemplo el acido acetilsalicílico, las  penicilinas, la cocaína, y otras sustancias neuroactivas que  se describen en la tabla 1. 

  Tabla 1. 

 

  CNVD:  Canales  de  Sodio  Voltaje  Dependientes;  CCVD:  Canales  de  Calcio  Voltaje  Dependientes;  TRVP:  Receptores  Vanilloides;  RGly:  Receptores  de  Glicina;  RGABAA: Receptores de GABA tipo A; RN: Receptor Nicotínico; RM: Receptor Muscarínico; SK: Canales de Potasio activados por Calcio de Baja conductancia. 

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    El  estudio  y  caracterización  farmacológica  de  moléculas,  principios  activos  o  preparados    de  origen  natural,  con  actividad  en  el  sistema  nervioso,  han  contribuido  significativamente  al  entendimiento  de  los  mecanismos  celulares  y  moleculares  con  que  se  regulan  las  funciones  neuronales,  así  la  cocaína  se  transformo  en  1884  en  el  primer  anestésico  local  utilizado  en  oftalmología  (Aguayo  et al. 2006), por su acción bloqueadora de canales de Na+  voltaje  dependientes  (Strichartz  1988)  y  por  ende,  de  la  transmisión del impulso nervioso. Una aplicación similar se  dio al curare (S. toxifera), aplicado en anestesia general ya  en  la  década  de  los  40s  (Griffth  1942),  pero  esta  vez  con  una  acción  bloqueadora  sobre  el  receptor  nicotínico  muscular  (RNM),  lo  que  inhibe  la  comunicación  entre  la  moto  neurona  eferente  y  el  músculo  en  la  placa  neuromuscular,  y  así  la  contracción  muscular  (tono).  Por  otra  parte,  el  bloqueo  de  Canales  de  Ca2+  voltaje  dependientes  (CCVD),  por  medio  del  uso  de  toxinas  provenientes  de  diferentes  fuentes,  como  caracoles  marinos  y  arañas,  han  permitido  la  caracterización  farmacológica  y  el  entendimiento  del  rol  que  cumplen  los  diferentes  subtipos  de  canales  de  Ca2+  a  nivel  neuronal  (Olivera et al. 1984; Monje et al. 1993; Olivera et al. 1994);  especialmente  su  contribución  en  los  mecanismos  claves  de  la  señalización  celular,  como  por  ejemplo  la  exocitosis  (Berridge et al. 2003; Garcia et al. 2006). 

  testigos  las  reuniones  de  la  Sociedad  de  Farmacología  de  Chile.  TUTINA UNA POTENTE TOXINA CON POTENCIAL  APLICACIÓN COMO NEUROLÉPTICO/ANSIOLÍTICO.  La tutina, es una sesquiterpenolactona que fue obtenida y  purificada a partir del fruto maduro de Coriaria ruscifolia, y  que  presenta  como  farmacóforo  un  anillo  picrotoxoide  similar  a  la  clásica  picrotoxina  (figura  1A).  Nuestro  interés  en  estudiarla  nació  de  un  reporte  clínico  de  una  intoxicación  en  niños  que  consumieron  este  fruto  por  error,  y  que  tuvo  un  desenlace  fatal  en  uno  de  los  casos  (Hoffmann 1982).  Figura 1. 

El  incremento  progresivo  en  la  prevalencia  de  enfermedades  neurodegenerativas  producto  del  incremento  en  las  expectativas  de  vida  (Alzheimers‐ Association 2012), nos ha obligado nuevamente a mirar los  potenciales  que  tiene  la  naturaleza,  buscando  en  ella,  alternativas  terapéuticas  útiles  en  el  tratamiento  de  enfermedades que hoy en día no tienen una cura definitiva  o un tratamiento eficiente; Es el caso de la enfermedad de  Alzheimer  (EA)  o  la  enfermedad  de  Parkinson  (PK).  Considerando que muchos de los compuestos presentes en  la  naturaleza  son  altamente  selectivos  (ver  tabla  1)  y  de  altísima  potencia  (la  mayoría  actúa  en  el  rango  pM‐nM,  (Aguayo  et  al.  2006)),  es  que  resulta  atractivo  centrar  los  esfuerzos  en  obtener  nuevos  principios  activos  de  origen  natural,  que  nos  permitan  plantear  alternativas  en  el  desarrollo fármacos, o fitofármacos útiles en la modulación  del  SNC  y  en  el  tratamiento  de  las  enfermedades  que  lo  afectan.  El  objetivo  de  esta  revisión  es  repasar  los  principales  hallazgos  científicos  obtenidos  en  el  Laboratorio  de  Screening de Compuestos Neuroactivos del Departamento  de Fisiología de la Universidad de Concepción, en el cual se  han  caracterizado  farmacológicamente,  una  serie  de  compuestos  neuroactivos  con  una  potencial  proyección  hacia fitofármacos o formulaciones nutracéuticas útiles en  patologías  neurodegenerativas  con  AD  y  PK.  Una  Historia  de investigación de los últimos 7 años, de la que han sido 

    A. Estructura química de picrotoxina (izquierda) y tutina (derecha), nótese  las  similitudes  estructurales  y  las  diferencias  en  los  epóxidos  del  anillo  biciclo.  B  corrientes  sinápticas  espontáneas  de  neuronas  espinales  en  condiciones control (izquierda) y en presencia de tutina (200 µM) medidas  por  la  técnica  de  patch  clamp  (whole  cell,  voltage  clamp)(tomado  y  modificado de Fuentealba et al., 2007). 

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    Curiosamente,  el  fruto  de  esta  planta  (aparte  de  ser  venenoso), es dulce,  lo que puede atraer la curiosidad sin  la necesidad de advertir de su peligro. Esta planta ha sido  denominada  comúnmente  como  “maqui  del  diablo”  por  sus  efectos  tóxicos  en  seres  humanos,  como  mioclonias  y  cuadros  epileptogénicos  (Hoffmann  1982);  o  “matarratones”,  por  su  letalidad  para  roedores.  En  un  estudio  que  comenzamos  a  realizar  en  2005,  determinamos  que  tutina  (1‐1000  µM)  era  capaz  de  bloquear  las  corrientes  glicinérgicas  medidas  por  electrofisiología,  en  neuronas  espinales  de  ratón;  esto  provoca un incremento importante en la excitabilidad de la  red  neuronal  (figura  1B),    que  además  mostraba  ser  concentración  dependiente  (Fuentealba  et  al.  2007);  Adicionalmente,  ambos  hallazgos  se  correlacionaron  estrechamente  con  un  incremento  en  las  transitorios  de  2+ Ca   intracelular  (probablemente  por  un  predominio  del  tono  AMPAérgico);  y  con  un  incremento  de  los  niveles  citosólicos  de  CREB  fosforilado,  lo  que  en  su  conjunto  representaba un drástico incremento de la actividad de la   

red neuronal. Sin duda, que estos efectos daban sustento a  las  descripciones  de  los  cuadros  de  intoxicación  observados  (mioclonías,  convulsiones  y  ataques  epilépticos)  en  humanos  y  roedores  (Fuentealba  et  al.  2007).  Adicionalmente, en un estudio posterior de caracterización  de  los  efectos  de  tutina  en  diferentes  subtipos  de  los  receptores de glicina expresados en un modelo heterólogo  (células HEK), pudimos establecer la diferente sensibilidad,  de  los  distintos  subtipos  de  receptores  de  glicina  estudiados,  a  la  acción  bloqueante  de  tutina;  obteniendo  IC50s  de  35  µM  y  15  µM  para  α1  y  α2  respectivamente  (Figura  2A,  (Fuentealba  et  al.  2011)).  Este  antecedente  es  sumamente  importante,  ya  que  de  acuerdo  a  investigaciones  previas,  en  el  proceso  de  maduración  neuronal,  los  receptores  glicinérgicos  neuronales  (espinales)  inmaduros,  están  conformados  fundamentalmente por la subunidad α2 (van Zundert et al.  2004). 

Figura 2.   

  A. Curva Concentración‐respuesta de tutina en receptores homoméricos de glicina α1 y α2 expresados en células HEK (tomado y modificado de Fuentealba et al.,  2011). B. Efectos de potenciación de tutina en un mutante del receptor α1 de glicina resistente a etanol, nótese que en ausencia de potenciación del receptor por  etanol, tutina sigue potenciándolo (tomado y modificado de Fuentealba et al., 2011). 

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    Esto  quiere  decir  que  los  niños  (sistemas  neuronales  inmaduros)  son  más  sensibles  al  efecto  de  la  toxina  (tutina),  debido  a  la  presencia  principalmente  de  receptores  α2,  lo  que  al  cambiar  en  el  adulto,  donde  la  composición principal de estos receptores esta dado por la  subunidad α1, hace a un adulto más resistente o tolerante  al  efecto  de  tutina  y  a  los  niños  mucho  más  sensibles  (Fuentealba  et  al.  2011).  Valiéndonos  de  herramientas  de  biología  celular,  establecimos  también,  la  importancia  de  algunos  residuos  en  el  dominio  transmembrana  2  (TM2)  del receptor de glicina para la acción inhibitoria de tutina.  Al  igual  que  picrotoxina,  mutaciones  en  este  dominio  cambian  las  propiedades  de  conductancia  del  receptor  (Hawthorne et al. 2005), y la susceptibilidad a la inhibición  ejercida  por  tutina.  Sin  embargo,  lo  más  curioso  fue  observar  que  bajas  concentraciones  de  tutina,  ésta  era  capaces de inducir una potenciación de receptores homo y  heteroméricos,  no  observada  con  picrotoxina,  y  que  este  potenciación  ocurría  por  una  modulación  de  un  sitio  distinto  al  que  utiliza  etanol  (figura  2B)  para  potenciar  a  estos  receptores  (Castro  et  al.  2012);  esto  sugiere  la  presencia  en  el  receptor  de  un  sitio  específico  de  alta  afinidad  para  esta  acción,  y  otro  de  baja  afinidad  para  el  efecto  inhibitorio  (Fuentealba  et  al.  2011).  Esta  última  observación, proporciona un potencial importantísimo a la  tutina,  que  insisto  no  presenta  picrotoxina,  y  que  representa  la  base  para  el  desarrollo  de  una  familia  de  moléculas con actividad neuroléptica; donde por ejemplo,  por  medio  de  estudios  modelamiento  (Perez  et  al.  2011),  nos permita conocer en profundidad las estructuras claves  del farmacóforo y del receptor, que permitan el desarrollo  futuro de principios activos con la mencionada actividad  y  con la ventaja de ser altamente selectivos.    POLIFENOLES, NEUROPROTECCIÓN Y ALZHEIMER    La  enfermedad  de  Alzheimer  es  una  patología  neurodegenerativa  caracterizada  por  una  falla  cognitiva  compleja y progresiva, que hasta el día de hoy no tiene un  tratamiento  farmacológico  efectivo  (Arroyo  et  al.  2002;  Alzheimers‐Association  2012).  Los  actuales  tratamientos,  dependiendo de la etapa en que se apliquen, solo pueden  contribuir a una disminución en la velocidad de progresión  de la enfermedad (Corbett et al.). A pesar de que los voces  especializadas  apuntan  a  desarrollar  buenos  biomarcadores, que permitan “adelantar” el diagnostico de  la  enfermedad  (Hampel  et  al.  2010),  la  posibilidad  de  encontrar  en  la  naturaleza,  nuevos  compuestos  útiles  en  esta  patología,  como  lo  es  la  galantamina,  es  una  opción  que no podemos descartar. La galantamina, es un alcaloide  obtenido  desde  la  especie  Galantus  nivalis  (campanilla  de  nieve),  que  modula  alostéricamente  al  receptor  nicotínico  neuronal  (α7  y  α3β4)  (Arroyo  et  al.  2002)  y  ha  mostrado  una  eficacia    moderada  en  el  tratamiento  de  las  etapas  tempranas de la enfermedad (Corbett et al.). 

  En  función  de  ello,  nuestro  grupo  ha  centrado  sus  esfuerzos  en  el  estudio  de  la  fisiopatología  de  la  enfermedad  a  través  del  uso  de  modelos  neuronales  in  vitro,  y  en  ellos    hemos  caracterizado  ampliamente  el  efecto  del  péptido  βA  (Cuevas  et  al.;  Parodi  et  al.  2010;  Sepulveda  et  al.  2010).  Así,  focalizamos  nuestro  interés  inicial,  en  buscar  moléculas  que  puedan  modular  algunas  de  las  vías  alteradas  en  esta  patología,  y  la  generación  aumentada  de  radicales  libres  en  ellas  (Adam‐Vizi  et  al.  2006).   De acuerdo a estos antecedentes, moléculas con capacidad  antioxidantes  de  alta  potencia,  que  proporcionasen  a  la  mitocondria, un soporte frente a la generación de radicales  libres  descrita  en  la  enfermedad,  se  planteaba  como  un  buen  punto  de  partida.  Por  lo  tanto,  trabajamos  en  obtener  un  extracto  enriquecido  en  polifenoles  desde  un  fruto  que  tuviese  una  alta  cantidad  de  antioxidantes  (polifenoles)  descrita,  como  por  ejemplo,  el  arándano  (Vaccinium corymbosum). Así, utilizando como  modelo de  estudio  neuronas  hipocampales  de  rata,  tratadas  con  péptido  β‐amiloide  (βA,  oligomeros  solubles),  ensayamos  los efectos neuroprotectores de un extracto de arándanos  enriquecido  en  polifenoles,  lo  llamamos  BB‐4.   Incubaciones  crónicas  con  βA  (24  h)  mostraron  una  drástica  reducción  de  la  actividad  sináptica  espontánea  (medida  por  electrofisiología),  como  también  del  número  de  vesículas  de  neurotransmisores  contendidos  en  las  células  (inmunomarcaje  de  SV‐2,  SNAP‐25,  etc);  ambos  parámetros,  fueron  revertidos  parcialmente  por  la  co‐ incubación  del  péptido  con  BB‐4  (0.81  mg/mL),  mientras  que  la  actividad  de  transientes  espontáneas  de  Ca2+  citosólico, experimentaron una recuperación entre 25‐30%  (Fuentealba et al. 2011). Adicionalmente, observamos que  el péptido βA era capaz de inducir la fuga de ATP desde el  citosol al medio extracelular, lo que hasta el momento no  había sido descrito.     Esta  observación,  nos  instó  a  redirigir  nuestra  atención,  trabajos previos de nuestro grupo, han demostrado que el  péptido  βA  es  capaz  de  formar  un  poro  de  alta  conductancia  a  Ca2+,    silenciar  la  actividad  sináptica  y  depletar  los  terminales  sinápticos  de  vesículas  de  neurotransmisores  (Parodi  et  al.  2010;  Sepulveda  et  al.  2010);  pero  hasta  el  momento  no  se  había  descrito  la  posibilidad  de  que  moléculas  de  relevancia  fisiológica  “escaparan” del citosol a través de este poro; por lo tanto,  estudiamos  si  el  extracto  BB‐4  podría  tener  una  acción  sobre  los  niveles  intra‐  y  extracelulares  del  ATP,  de  esta  forma  intentar  asociar  de  alguna  forma  los  mecanismos  tóxicos del péptido con la disfunción mitocondrial. Así, en  el  efecto  neuroprotector  de  BB‐4  mostró  ocurrir  por  un  mecanismo diferente a la directa acción sobre el potencial  de  membrana  mitocondrial;  de  hecho,  BB‐4  prevenía  eficientemente  la  acción  tóxica  de  un  desacoplante  mitocondrial  clásico  (FCCP,  20  µM)  en  aproximadamente  un  80%,  pero  era  incapaz  de  revertir  el  cambio  en  el    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 55 

 

 

 

    potencial de membrana mitocondrial inducido por βA. Esto  sugería que el efecto de este extracto transcurría por una  acción  previa  al  desbalance  en  la  generación  de  radicales  libres  (e  interferencia  con  el  potencial  de  membrana  mitocondrial).  Finalmente  pudimos  constatar,  que  BB‐4  ejercía  una  acción  sobre  el  estado  de  agregación  de  las  especies oligoméricas del péptido βA, con lo cual alteraba  sus  propiedades  tóxicas  (perforantes)  y  disminuía  así,  la  sobrecarga de Ca2+ citosólico y mitocondrial, la pérdida del  potencial  de  membrana  mitocondrial  y  los  efectos  tóxicos  que  llevaban  a  la  muerte  a  las  neuronas  hipocamapales  (Fuentealba  et  al.  2011).  Sin  embargo,  esto  no  descarta  que  las  propiedades  antioxidantes  de  los  polifenoles  contenidos en el extracto, tengan un efecto antioxidante, y  seguramente  constituyen  un  mecanismo  adicional  de  protección en etapas crónicas de uso. Con estos hallazgos  pudimos  plantear  que  BB‐4  podría  ser  un  importante  complemento  nutricional  o  un  coadyuvante  en  la  prevención  de  la  aparición  de  este  tipo  de  patologías  en  individuos adultos mayores, los que nos hizo acreedores a  un importante premio a nivel nacional.    Siguiendo  con  el  razonamiento  anterior,  respecto  a  la  actividad de los polifenoles contenidos en especies y frutos  nativa de Chile, y con una visión de desarrollo que potencie  su riqueza, quisimos estudiar unos de los frutos nativos del  país  que  tiene  descrito,  un  alto  contenido  de  moléculas  polifenólicas y una potente capacidad antioxidante (Rubilar  et  al.  2011),  y  por  ello  nos  enfocamos  en  el  maqui   (Aristotelia  chilensis).  Preparamos  como  en  el  caso  anterior,  con  la  ayuda  del  laboratorio  de  Química  de  Productos  Naturales  de  la  Facultad  de  Cs.  Naturales  y  Oceanográficas  de  nuestra  Universidad,  un  extracto  a  partir  de  fruto  fresco  maduro  enriquecido  en  polifenoles  (MQ),  y  ensayamos  sus  capacidades  neuroprotectoras  en  nuestro  modelo  neuronal  de  neurodegeneración.  Observamos que MQ era capaz de proteger a las neuronas,  manteniendo  la  viabilidad  celular  (MTT)  en  un  95%  frente  al estimulo tóxico de βA (0.5 µM, 24 h), lo que se asoció a  un  mantenimiento  de  la  citoestructura  neuronal.  En  paralelo, parámetros de actividad de la red neuronal como  2+ son  la  frecuencia  de  oscilaciones  transitorias  de  Ca   citosólico  (Figura  3A)  y  la  actividad  electrofisiológica  espontánea  (Figura  3B),  también  presentaron  una  protección  frente  al  estimulo  tóxico  de  βA;  mientras  que  un  efecto  similar  se  observó  en  el  inmunomarcaje  de  proteínas claves de la exocitosis (SV‐2).     Finalmente,  estudios  cinéticos  y  de  fluorescencia,  demostraron  que  el  extracto  MQ  tiene  una  alta  potencia  en  cambiar  el  estado  y  la  velocidad  de  agregación  del  péptido βA, impidiendo la formación de especies tóxicas y  favoreciendo  la  sobrevida  neuronal  con  una  mayor  eficiencia de lo que habíamos observado previamente con  BB‐4.   

Figura 3.     

 

 

 

    A.  Registros  originales  de  las  oscilaciones  transitorias  de  Ca2+  citosólico  registradas  por  microfluorimetría  (Fluo4‐AM)  en  neuronas  hipocampales  de  rata,  en  presencia  de  βA  (0,5  µM)  y  MQ  (0,81  mg/mL,  B.  Corrientes  sinápticas  espontáneas  obtenidas  por  patch  clamp  en  similares  condiciones que en A. (tomado y modificado de Fuentealba et al, 2012). 

    Tomando  en  consideración  estos  hallazgos,  continuar  con  el desarrollo de productos naturales que permitan mejorar  la  calidad  de  vida  de  las  personas,  constituyen  un  hito  relevante,  más  aún  si  esto  se  alcanza  con  investigación  nacional,  con  fuentes  naturales  nativas  del  país,  y  con  recursos públicos de apoyo a la investigación.  

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    Ello  proporciona  un  valor  agregado  al  conocimiento  científico generado, y así mismo,  a las potencialidades de  desarrollo  tecnológico  e  innovativo  del  país.  El  uso  de  extractos enriquecidos en polifenoles, pueden representar  una importante utilidad en la prevención de enfermedades  neurodegenerativas,  por  medio  de  un  consumo  permanente  de  frutos  o  preparados  nutracéuticos,  de  forma  de  mantener  una  alta  calidad  en  la  ingesta  de  alimentos, y a la vez nos permite desarrollar un paradigma  similar  al  propuesto  al  consumo  moderado  de  vino  tinto,  que  se  ha  establecido  como  un  reductor  de  riesgo  cardiovascular  en  su  consumo  crónico.  Siguiendo  este  razonamiento, estamos en condiciones de plantear que el  consumo  crónico  de  maqui  y  sus  polifenoles  ayudarían  a  reducir  el  riesgo  de  padecer  o  retrasar  la  aparición  de  enfermedades neurodegenerativas tipo Alzheimer.      SEDANTES, AGENTES DOPAMINÉRGICOS Y  MODULADORES NICOTÍNICOS    Sin  duda  que  el  espectro  de  usos  y  aplicaciones  farmacológicas  de  los  compuestos  presentes  en  la  naturaleza,  con  acción  en  el  sistema  nervioso  central  son  múltiples;  así,  hemos  desarrollado  estudios  con  un  derivado  esteroideo  de  progesterona  obtenido  desde  un  residuo  industrial  forestal,  que  es  capaz  de  potenciar  los  efectos sedantes de acepromazina y se proyecta como un  posible  co‐adyuvante  inductor  de  anestesia  en  medicina  veterinaria.  Adicionalmente,  un  compuesto  purificado  desde  la  hoja  de  un  árbol  nativo  chileno,  ha  demostrado  una  acción  dopaminérgica  muy  importante  y  selectiva,  lo  que  proyecta  su  uso  hacia  el  desarrollo  de  análogos  con  aplicación  en  la  enfermedad  de  Parkinson.  Y  por  último,  nuestras  recientes  investigaciones  nos  han  permitido  caracterizar los efectos de un alcaloide obtenido desde una  especie  considerada  maleza,  que  crece  en  nuestros  campos, y que tiene una potente acción neuromoduladora  y  protectora,  la  cual  cursa  sus  efectos  a  través  de  un  receptor  nicotínico  neuronal  y  que  se  encuentra  aún  en  fase de estudio.    Por  tanto,  podemos  concluir  que  utilizando  los  modelos  adecuados,  y  haciendo  las  “preguntas  correctas”  a  los  modelos de estudio, podemos alcanzar resultados con una  importante  proyección  para  el  desarrollo  de  nuevos  preparados  nutracéuticos  o  fitofármacos  de  aplicación  en  la prevención y cuidado de patologías que afectan al SNC.  Sin  duda  la  evidencia  obtenida  por  científicos  en  todo  el  mundo  y  los  aportes  que  hemos  hecho  en  nuestro  laboratorio,  apuntan  a  que  las  fuentes  naturales  nos  pueden proporcionar una gama de moléculas neuroactivas  altamente  potentes  y  selectivas  que  potencien  el  desarrollo de la farmacología desde las fuentes originales:  la naturaleza.   

  AGRADECIMIENTOS:    La asistencia editorial de Laurie Aguayo, ha sido clave en el  desarrollo  de  estos  trabajos.    La  asociación  con  el  Laboratorio  de  Productos  Naturales  de  la  Facultad  de  Ciencias  Naturales  y  Oceanográficas  de  la  Universidad  de  Concepción,  Dres.  Claudia  Pérez,  José  Becerra  y  Mario  Silva, ha sido clave en la obtención de los extractos, y por  ende,  en  la  consecución  de  estas  investigaciones.  Estas  investigaciones  han  contado  con  el  apoyo  financiero  de  Innova  Biobío  (05‐B1‐397L7),  Fondecyt  (11090091  JF)  y  la  Universidad de Concepción (DIUC 208.033.102.‐1.0)      BIBLIOGRAFÍA:  Adam‐Vizi, V. and C. Chinopoulos (2006). "Bioenergetics and the formation  of  mitochondrial  reactive  oxygen  species."  Trends  Pharmacol  Sci  27(12): 639‐45.  Aguayo, L. G., L. Guzman, et al. (2006). "Historical and current perspectives  of  neuroactive  compounds  derived  from  Latin  America."  Mini  Rev  Med Chem 6(9): 997‐1008.  Alzheimers‐Association (2012). "2012 Alzheimer's disease facts and figures."  Alzheimer's  and  Dementia:  The  Journal  of  the  Alzheimer's  Association: 8(March ).  Arroyo,  G.,  M.  Aldea,  et  al.  (2003).  "SNX482  selectively  blocks  P/Q  Ca2+  channels and delays the inactivation of Na+ channels of chromaffin  cells." Eur J Pharmacol 475(1‐3): 11‐8.  Arroyo,  G.,  M.  Aldea,  et  al.  (2002).  "[Nicotinic  Receptor,  galantamine  and  Alzheimer disease]." Rev Neurol 34(11): 1057‐65.  Baden,  D.  G.,  A.  J.  Bourdelais,  et  al.  (2005).  "Natural  and  derivative  brevetoxins: historical background, multiplicity, and effects." Environ  Health Perspect 113(5): 621‐5.  Berridge, M. J., M. D. Bootman, et al. (2003). "Calcium signalling: dynamics,  homeostasis and remodelling." Nat Rev Mol Cell Biol 4(7): 517‐29.  Bosmans,  F.,  C.  Maertens,  et  al.  (2004).  "The  poison  Dart  frog's  batrachotoxin modulates Nav1.8." FEBS Lett 577(1‐2): 245‐8.  Carroll,  F.  I.  (2004).  "Epibatidine  structure‐activity  relationships."  Bioorg  Med Chem Lett 14(8): 1889‐96.  Castro,  P.  A.,  M.  Figueroa,  et  al.  (2012).  "The  basic  property  of  Lys385  is  important for potentiation of the human alpha1 glycine receptor by  ethanol." J Pharmacol Exp Ther 340(2): 339‐49.  Corbett, A., J. Smith, et al. "New and emerging treatments for Alzheimer's  disease." Expert Rev Neurother 12(5): 535‐43.  Cuevas,  M.  E.,  H.  Haensgen,  et  al.  "Soluble  Abeta(1‐40)  peptide  increases  excitatory  neurotransmission  and  induces  epileptiform  activity  in  hippocampal neurons." J Alzheimers Dis 23(4): 673‐87.  Fuentealba,  J.,  A.  Dibarrart,  et  al.  (2012).  "Synaptic  Silencing  and  Plasma  Membrane  Dyshomeostasis  Induced  by  Amyloid‐beta  Peptide  are  Prevented  by  Aristotelia  Chilensis  Enriched  Extract."  J  Alzheimers  Dis. 

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ARTÍCULO DE REVISIÓN 

    AVANCES EN LAS INVESTIGACIONES FARMACOLÓGICAS Y TOXICOLÓGICAS CON EL EXTRACTO  ACUOSO DE LA CORTEZA DEL ÁRBOL DE MANGO (Mangifera indica L.).   (Advances in pharmacological and toxicological investigations with the stem bark aqueous extract of the  mango tree (Mangifera indica L.)      Gabino Garrido, Ph.D. y Marisela Valdés, M.Sc.    Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile.     

RESUMEN  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

El  extracto  de  Mangifera  indica  L  se  usa  en  la  práctica  etnomédica  para  la  mejoría  de  la  calidad  de  vida  de  pacientes  con  diferentes  patologías.  El  presente  estudio  pretendió  hacer  una  revisión  de  los  avances  que  han  tenido  las  investigaciones  farmacológicas  y  toxicológicas  llevadas  a  cabo  con  un  extracto  acuoso  estandarizado  de  la  corteza  del  árbol  de  mango.  Se  revisaron  las  publicaciones  de  la  composición  química  principal,  que  comprende  un  total  de  nueve  derivados  polifenólicos  y  diferentes microelementos como zinc, cobre y selenio. El extracto demostró, fundamentalmente, actividades antioxidante, anti‐ inflamatoria  e  inmunomoduladora,  analgésica  y  antialérgica,  con  un  mecanismo  de  acción  relacionado  con  la  capacidad  2+ secuestradora  de  especies  reactivas  de  oxígeno  y  de  interacción  con  Fe ,  la  inhibición  de  la  producción  de  citocinas  pro‐ inflamatorias,  IgE  y  eicosanoides,  de  la  actividad  de  fosfolipasa  A2  y  ciclooxigenasa  2  y  de  la  activación  del  NF‐κB.  Según  los  reportes  revisados,  el  extracto  es  seguro  para  su  administración  en  humanos  debido  a  su  bajo  potencial  de  toxicidad.  Se  realizaron varios estudios clínicos aleatorizados, estudios piloto, serie y reporte de casos con diferentes formas farmacéuticas  que corroboraron los hallazgos encontrados en la fase pre‐clínica o aportaron nuevos conocimientos que le atribuyen al extracto  un valor agregado importante.    Palabras claves: Mangifera indica, Mango, Vimang, Farmacología, Toxicología, Estrés oxidativo, Inflamación, Dolor    Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

INTRODUCCIÓN El mango (Mangifera indica Linneo, Anacardiaceae) es uno  de  los  frutos  más  importantes  desde  el  punto  de  vista  económico (FAO, 2012).     El  producto  principal  del  árbol  de  mango  es  el  fruto  maduro  entero,  que  puede  ser  consumido  crudo  o  procesado en una variedad de productos que garantizan un  suministro constante del fruto durante todo el año (Singh,  1990).    Industrialmente,  hay  tres  partes  de  interés  del  fruto  del  mango  a  saber:  la  pulpa,  la  cáscara  y  la  semilla. 

Tradicionalmente  la  pulpa  de  mango  es  el  principal  punto  focal  de  la  utilización  del  fruto  a  escala  industrial.  Esta  es  un  intermediario  importante  para  la  producción  de  bebidas,  como  un  ingrediente  saborizante  en  la  industria  láctea  y  en  formulaciones  de  alimentos  para  bebés  (Nanjundaswamy,  1998).  Su  composición  química  varía  dependiendo  de  muchos  factores  como  la  variedad,  la  localidad, el clima, y la etapa de madurez.    En el proceso industrial del fruto se obtienen subproductos  como  la  piel  y  la  semilla  (carozo  y  nuez  o  almendra),  que  representan  aproximadamente  el  35‐60%  del  fruto.

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Estos se descartan como desechos y se convierten en una  fuente  de  contaminación  debido  a  las  altas  concentraciones  de  compuestos  fenólicos  residuales  (y  el  alto  costo  que  representa  su  tratamiento),  que  pueden  tener  efectos  ambientales  perjudiciales,  principalmente  debido  a  que  estos  compuestos  podrían  inhibir  la  germinación de las semillas. Recientemente (Maisuthisakul  &  Gordon,  2009),  se  mostró  que  la  cáscara  constituye  aproximadamente  entre  el  15‐20%  de  la  fruta,  mientras  que  las  semillas  representan  del  20‐60%  del  peso  de  la  fruta  entera,  dependiendo  de  la  variedad  de  mango,  y  el  núcleo  interior  de  la  semilla  de  45‐75%  de  la  semilla  entera.  Estos  subproductos  del  mango  se  han  estudiado  como antioxidante (Abdalla et al., 2007; Dorta et al., 2012),  antibacteriano  (Vaghasiya  et  al.,  2011),  hipoglucemiante  (Rajesh  et  al.,  2008;  Gupta  &  Gupta,  2011),  anti‐ hipercolesterolémico  (Anila  &  Vijayalakshmi,  2002)  e  inductor  de  apoptosis  (Kim  et  al.,  2012),  entre  otros.  Por  ejemplo,  la  cáscara  de  mango  es  una  fuente  rica  de  compuestos bioactivos como los polifenoles, carotenoides,  vitaminas  C  y  E,  fibra  dietética  y  enzimas.  Además,  la  cáscara  de  mango  podría  ser  una  fuente  rica  de  compuestos  bioactivos,  y  enzimas  tales  como  proteasa,  peroxidasa  y  polifenol  oxidasa  (Mehrnoush  et  al.,  2012).  Esta  cáscara,  si  es  convenientemente  procesada,  podría  proporcionar  productos  útiles  con  los  que  se  pudieran  equilibrar los costes de tratamiento de residuos y también  disminuir  el  costo  del  producto  principal.  Por  lo  tanto,  existe un margen para el aislamiento de estos ingredientes  activos  y  también  el  uso  de  cáscara  de  mango  como  un  ingrediente en productos alimentarios procesados.    Asimismo, la almendra de la semilla contiene aminoácidos  esenciales, proteínas, grasas, carbohidratos, fibra, y es una  buena  fuente  de  polifenoles,  fitoesteroles  como  campesterol,  β‐sitosterol  y  tocoferoles  y  está  libre  de  materiales  tóxicos  como  el  ácido  cianhídrico  (Ajila  et  al.,  2007).  Debido  a  las  investigaciones  anteriores,  se  ha  sugerido  que  la  almendra  de  la  semilla  de  mango  podría  ser  utilizado  como  una  fuente  potencial  de  ingredientes  alimentarios funcionales (Khammuang & Sarnthima, 2011),  que  pudieran  ser  comercialmente  valiosos  en  la  industria  del aceite vegetal y en confitería, entre otros (Pereira et al.,  2011).    Las hojas y la corteza del árbol también han sido utilizadas  para diferentes fines, fundamentalmente medicinales y sus  aplicaciones cubren un amplio espectro de enfermedades,  pero  las  citadas  con  mayor  asiduidad  son  los  dolores  (menorrágicos,  dentales,  musculares  y  articulares),  las  infecciones cutáneas (escabiosis, epidermofitosis, micosis),  las  diarreas,  la  sífilis,  la  tuberculosis  y  algunas  enfermedades crónicas, tales como la diabetes y la anemia.  El  uso  de  la  corteza  del  árbol  de  mango  como  materia 

prima vegetal para la preparación de extractos acuosos por  diferentes  vías  (maceración,  percolación,  decocción  e  infusión), forma parte de la cultura popular en más de 30  países,  fundamentalmente  de  los  llamados  del  Tercer  Mundo, según reportes documentados desde hace más de  200 años (Napralert, 2007).     En  los  últimos  12  años  ha  habido  un  auge  en  las  publicaciones  relacionadas  con  las  actividades  farmacológicas  de  diferentes  extractos,  obtenidos  de  diversas  partes  del  árbol  de  mango,  pero  ha  sido  el  extracto  acuoso  de  la  corteza  del  árbol  el  que  más  ha  llamado  la  atención  de  un  grupo  de  científicos  que  ha  publicado  cerca  de  80  artículos  relacionados  con  la  tecnología química y farmacéutica, la composición química  y,  principalmente,  la  evaluación  farmacológica  pre‐clínica,  la toxicología y los estudios clínicos; así como el papel que  desempeña  en  la  actividad  farmacológica  del  extracto  la  xantona  glicosilada  mangiferina,  que  constituye  el  componente mayoritario dentro de éste.    En esta revisión se analizarán los avances realizados en las  investigaciones  farmacológicas  y  toxicológicas  llevadas  a  cabo  con  el  extracto  acuoso  de  la  corteza  del  árbol  de  la  especie  Mangifera  indica  (mango)  y  su  utilidad  potencial  en  diferentes  patologías.  Esta  hipótesis  es  soportada  por  evidencias pre‐clínicas y clínicas importantes, tanto para el  extracto como para la mangiferina presente en éste.      ESTUDIOS ETNOBOTÁNICOS Y ETNOMÉDICOS    El  árbol  del  mango  es  perenne  y  alcanza  de  15‐30  m  de  altura,  puede  vivir  por  más  de  100  años  y  desarrollar  un  tronco  con  más  de  4  m  de  diámetro.  El  origen  del  mango  ha  sido  establecido  en  Asia,  particularmente  en  la  región  Indo‐Burmese, en las laderas del Himalaya (Tjiptono et al.,  1984).  El  fruto  se  cultiva  desde  los  tiempos  prehistóricos,  hace más de 6 000 años, siendo considerado como el fruto  tropical  más  antiguamente  cultivado  por  el  hombre.  Aparecen  referencias  al  mango  en  las  Sagradas  Escrituras  en  Sánscrito,  las  leyendas  y  el  folklore  hindú  2  000  años  a.C. y se refieren a él como de origen antiguo. En la India,  el  árbol  de  mango  ha  sido  objeto  de  gran  veneración  (Sawangchote et al., 2009).     Las raíces del vocablo, por un lado se señala que la palabra  en sánscrito para el mango es amra, lo que significa "de la  gente" o "del pueblo", y se señala así porque fue registrado  en  ese  idioma  por  primera  vez  en  la  historia  de  la  humanidad hace más de 4 000 años.    Por  otra  parte,  se  dice  que  el  nombre  del  fruto,  así  como  del árbol, deriva del portugués "manga" que se refiere a un    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 60 

 

 

    término  malayo  que  se  pronuncia  "mangga"  o  "mangka",  asonancias  que  se  encuentran  sobre  los  pendientes  del  Himalaya  y  como  consecuencia,  la  transposición  en  las  diferentes lenguas modernas conserva la radical "mango".   Por  tanto,  las  diversidades  de  nombres  para  el  mango  en  todo el mundo reflejan las culturas y los idiomas hablados  por  las  personas  que  lo  cultivan  (Bally,  2006).  Muchos  de  los  nombres  tienen  derivaciones  comunes,  lo  que  refleja  los orígenes y la propagación del árbol de mango junto con  el crecimiento de las comunidades humanas. Por ejemplo,  en  las  islas  del  Pacífico  esta  especie  es  conocida  comúnmente como idele (Palau), kangit (Chuuk, Pohnpei),  mago  (Niue,  Samoa,  Tuvalu),  manako  (Hawaii),  manggo,  am  (Fiji),  mangko  (Kiribati),  mango  (Inglés),  mango  (Tonga), mangot, mangue, manguier (Francés), mangueira  (Yap)  y  en  otras  regiones  como  aam,  am,  amb  (Hindi),  ampleam  (Tamil),  bobbie  manja,  kanjanna  manja,  maggo,  manggaboom,  manja  (Holandés),  ma  muang  (Indochina),  mamung  (Tailandia),  manga,  mango  (Español),  manga,  (Portugués),  manga,  mempelam,  ampelam  (Malasia),  mangga  (Tagalog),  mangga,  mempelam  (Indonesia),  mango  (Ilokano),  mango  (Nueva  Guinea,  Pidgin),  Mangobaum  (Alemán),  mwàngx  (Laos),  paho  (Bisaya,  Filipinas),  svaay  (Cambodia),  tharyetthi  (Myanmar),  xoài  (Vietnam).    Entre  los  frutos  tropicales  comercializados  internacionalmente,  el  mango  ocupa  el  tercer  lugar  sólo  superado por el plátano y la piña, tanto en cantidad como  en valor (Yaacob & Subhadrabandhu, 1995) y el quinto de  la producción total de los cultivos frutales más importantes  del mundo (FAO, 2012). La producción mundial de mangos  se estima en más de 26 millones de toneladas por año. La  India ocupa el primer lugar entre los países productores del  fruto de mango en el mundo, que representan el 54,2% del  total  de  estos  frutos  producidos  en  todo  el  mundo  y  es  comercialmente el cultivo frutícola más importante de este  país,  con  más  de  mil  variedades  conocidas  hasta  la  fecha.  Durante el período 2008‐2009 este país produjo alrededor  de 13,6 millones de ton., el segundo lugar lo ocupó China  (~4  millones  ton.),  seguido  de  Tailandia  (2,5  millones  de  ton.),  Indonesia  (2,2  millones  ton.,  México  (~1,9  millones  ton.),  Pakistán  (~1,8  millones  ton.)  y  Brasil  (~1,2  millones  toneladas).  Otros  países  productores  importantes  de  mango  son:  en  Asia,  China  y  Filipinas;  en  África,  Nigeria,  Egipto,  Congo,  Costa  de  Marfil,  Sudáfrica  y  Ghana  y  en  América Latina, Haití, Cuba, Colombia, Venezuela, Ecuador  y Perú (FAO, 2012).    Las  diferentes  partes  del  árbol  de  mango  también  se  han  utilizado  por  sus  propiedades  medicinales.  Alrededor  del  80% de la población mundial, principalmente de los países  no  desarrollados,  tienen  en  los  extractos  de  productos  naturales  y  sus  derivados  su  primera  opción  para  el  tratamiento  terapéutico  en  la  Atención  Primaria  de  Salud  (Mahadi,  2001).  Las  hojas  de  mango  en  Tonga  se  usan 

  como  infusiones  y  se  utilizan  junto  con  la  naranja  y  otras  especies para hacer una poción para el tratamiento de las  recaídas durante alguna enfermedad (Thaman & Whistler,  1996). En Ghana se hierven las hojas con frutas cortadas de  Citrus  aurantifolia  contra  la  malaria  (Asase  et  al.,  2010).  También  en  Nigeria  se  utilizan  las  hojas  contra  esta  enfermedad  (Aiyeloja  &  Bello,  2006,  Ene  et  al.,  2010),  como  febrífugo  (Idu  &  Onyibe,  2007)  y  contra  la  diabetes  (Gbolade,  2009).  En  la  India,  la  diabetes  también  ha  sido  tratada con una bebida hecha a partir de la infusión de las  hojas  frescas  (Natarajan  et  al.,  2010).  Estas  hojas  frescas  también se utilizan para combatir los vómitos, la diarrea, el  dolor  estomacal,  el  agrietamiento  de  pies  (Rout  &  Panda,  2010) y el cólera (Kar & Borthakur, 2008). El jugo de éstas  se  aplica  localmente  en  los  ojos  para  la  conjuntivitis  (Upadhyay  et  al.,  2010),  problemas  gástricos,  úlceras  y  diarrea.  (Das  et  al.,  2008).  También  la  diarrea  y  la  disentería son tratadas con extracto de las hojas (Kalita  &  Bora, 2008; Biradar & Ghorband, 2010; De Wet et al., 2010;  Upadhyay  et  al.,  2010).  Además,  éstas  son  usadas  para  tratar  las  erupciones  de  la  lengua  (Jain  et  al.,  2010),  en  cataplasma  para  cicatrizar  heridas  recientes  o  crónicas  (Agyare et al., 2009) y en forma de polvo para aumentar la  fortaleza  de  los  dientes  (Natarajan  et  al.,  2010).  Hervidas  en  agua  se  usan  como  estimulante,  aplicadas  en  el  baño  después  del  parto  (Rajith  et  al.,  2010)  o  para  tratar  el  reumatismo  (Silja  et  al.,  2008)  y  mezcladas  con  hojas  de  Ficus  bengalensis  y  Ficus  religiosa  se  usan  contra  el  sangramiento  (Ponnusamy  et  al.,  2009).  En  Brasil  se  emplean contra infecciones vaginales, sífilis, gripe con tos y  congestión  (Coelho‐Ferreira,  2009).  En  Camerún  la  decocción  de  las  hojas  tiernas  se  aplica  contra  la  tos,  el  dolor  de  garganta  y  el  asma  (Focho  et  al.,  2009b;  Noumi,  2010).    En la India y Pakistán se utiliza la pulpa del fruto contra la  ictericia  y  el  hepatitis  (Khan‐Marwat  et  al.,  2012;  Pawar,  2012).  También  en  la  India,  la  pulpa  del  fruto  se  reporta  para  tratar  la  malnutrición  y  el  desbalance  en  la  dieta  (Singh  et  al.,  2007;  Pushpangadan  &  George,  2010),  el  estreñimiento (Satapathy, 2010), la tos (Gupta et al., 2010)  y  la  picadura  de  escorpión  y  como  remedio  para  el  agotamiento y el golpe de calor (Upadhyay et al., 2010). La  mitad  del  fruto  muy  maduro  se  come  con  sal  y  miel  y  se  utiliza para el tratamiento de trastornos gastrointestinales,  biliares, de la sangre y el escorbuto. Los mangos maduros  son una rica fuente de vitamina A y se utilizan para tratar la  deficiencia  de  esta  vitamina,  como  la  ceguera  nocturna  (Pushpangadan  &  George,  2010).  Muchos  de  los  usos  tradicionales  medicinales  del  mango  en  la  India  implican  comer el fruto verde. Debe tenerse en cuenta que el fruto  verde contiene una gran cantidad de la savia tóxica (Rozas‐ Muñoz  et  al.,  2012)  que  cuando  se  consume  en  exceso  puede causar dermatitis alérgica, irritación de la garganta,  indigestión, disentería y cólicos.     Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 61 

 

 

    La  resina  del  árbol  también  se  aplica  en  la  India  sobre  las  encías  y  los  dientes  dos  veces  al  día  contra  la  piorrea  (Shukla  et  al.,  2010),  el  agrietamiento  de  pies  y  piel,  vómitos, diarrea y dolor estomacal (Natarajan et al., 2010;  Rout  &  Panda,  2010),  extracción  de  diente  (Patil  &  Patil,  2010),  picadura  de  escorpión  (Kulkarni  &  Adwit,  2011)  y  desórdenes de la piel (Prashantkumar & Vidyasagar, 2008).    Desde  el  punto  de  vista  etnomédico,  en  la  India,  la  almendra  de  la  semilla  se  emplea  para  tratar  la  diarrea  crónica  (Tetali  et  al.,  2009),  el  asma,  para  expulsar  lombrices y otros gusanos en las úlceras (Rajendran et al.,  2008a)  y  para  problemas  urinarios  (Ballabh  et  al.,  2008).  Además,  se  ha  reportado  para  curar  los  vómitos  y  la  disentería  (Silja  et  al.,  2008).  Se  ha  observado  que  tradicionalmente  en  las  tribus  de  la  India  comen  la  almendra  de  la  semilla  del  mango  asada  durante  algún  período  de  inanición,  por  su  contenido  de  almidón.  El  polvo  de  la  almendra  también  es  usado  como  astringente  en  sangramientos.  Por  lo  tanto,  se  supone  que  es  adecuado para el consumo humano (Ramteke et al., 1999).   La  corteza  del  árbol  en  Samoa,  ha  sido  un  remedio  tradicional,  como  infusión,  para  las  infecciones  de  la  boca  en  los  niños  (Thaman  &  Whistler,  1996).  En  la  India,  los  extractos acuosos de la corteza se utilizan para la diarrea y  en  gargarismos  para  los  trastornos  de  garganta,  úlceras  bucales  y  olor  fétido  bucal  (Ganesan,  2008).  También  la  corteza  se  usa  como  anticonceptivo  (Henry  et  al.,  1996;  Bhogaonkar  &  Kadam,  2006),  astringente,  aperitivo,  antihelmíntico,  contra  la  gonorrea,  el  asma,  afrodisíaco,  para  prolongar  la  eyaculación  (Kadavul  &  Dixit,  2009;  Jain  et  al.,  2010)  y  mezclada  con  otras  plantas  contra  la  insolación  y  el  cólera  (Pooman  &  Singh,  2009).  La  decocción  de  la  corteza  fresca  (Upadhyay  et  al.,  2010)  o  seca  se  emplea  contra  la  diarrea  y  la  disentería  (Nath  &  Choudhury,  2010;  Purkayastha  et  al.,  2007)  y  la  difteria  (Pawar  &  Patil,  2007a).  El  jugo  de  la  corteza  se  utiliza  contra la ictericia (Sarkar & Das, 2010) y la corteza del tallo  como  cicatrizante  (Kuvar  &  Bapat,  2010).  En  Camerún,  la  corteza  del  tallo  se  usa  contra  el  asma  (Noumi,  2010),  el  reumatismo  (Jiofack  et  al.,  2008)  y  la  sífilis  (Focho  et  al.,  2009a),  en  Nepal  contra  los  dolores  abdominales,  disentería,  diarrea,  hepatitis,  enfermedades  de  la  piel,  como  antiparasitario  y  antiespasmódico  (Ghimire  &  Bastakoti,  2009),  en  Ghana  como  cataplasma  en  heridas  recientes  o  crónicas  (Agyare  et  al.,  2009),  en  Uganda  contra la tuberculosis y el VIH‐SIDA (Lamorde et al., 2010;  Tabuti et al., 2010), en Nigeria la decocción se usa contra la  malaria (Ene et al., 2010) y en Brasil la infusión se aplica en  quistes  de  ovario,  mioma  uterino  y  contra  la  tos  (Coelho‐ Ferreira, 2009).    USO ETNOMÉDICO EN CUBA    Como  se  ha  visto,  existe  un  conocimiento  etnomédico  documentado del uso de la corteza del árbol de mango en 

  varios países y, en particular, de la experiencia acumulada  durante más de 30 años en la población cubana (Guevara‐ García et al., 2004).   El uso específico del extracto acuoso de la corteza del árbol  de  mango  (ECAM)  en  Cuba  se  ha  realizado  de  manera  empírica  y  mediante  la  experiencia  acumulada  por  practicantes de la medicina natural y tradicional (Guevara‐ García  et  al.,  2004),  cuyo  trabajo  ha  sido  el  punto  de  partida para las investigaciones y el desarrollo de una línea  de  productos  naturales  denominada  Vimang®.  A  partir  de  dicho  extracto  y  en  dependencia  del  estado  del  paciente  que  se  somete  a  este  tratamiento  popular,  las  personas  han  empleado  formulaciones  artesanales  del  ECAM  como  la decocción con el 2% de sólidos totales, para su ingestión  por  vía  oral  en  dosis  de  30  mL,  3‐4  veces  al  día;  la  loción  tópica  hidro‐alcohólica  (alrededor  del  5%  de  etanol),  a  partir de la decocción, que se aplica sobre las lesiones de la  piel,  3‐4  veces  al  día,  con  un  tiempo  de  aplicación  alrededor  de  los  30  min;  la  solución  hidro‐alcohólica  (alrededor  del  2%  de  etanol),  a  partir  de  la  misma  decocción,  que  se  aplica  como  un  lavado  vaginal  o  un  enema  rectal  (entre  3  y  5  mL),  3‐4  veces  al  día;  y  el  ungüento  hidrófilo  que  contiene  alrededor  del  30%  de  la  decocción  y  que  se  aplica  de  forma  independiente  o  posterior a la loción tópica sobre las lesiones de la piel. El  tiempo  de  tratamiento  ha  sido  variable  y  depende  del  paciente,  con  un  promedio  entre  los  seis  meses  y  varios  años, según el tipo de enfermedad. Estudios etnomédicos,  publicados  de  forma  parcial  (Tamayo  et  al.,  2001;  Núñez‐ Sellés, 2005), han reportado que el extracto fue efectivo en  patologías  como  diabetes  mellitus  tipo  II,  hiperplasia  prostática  benigna,  dermatitis,  Lupus  eritematoso,  diferentes  tipos  de  neoplasias,  polineuropatías,  hemorroides,  cervicitis,  así  como  infertilidad  (fundamentalmente  femenina),  en  algunos  casos  con  remisión total de la enfermedad.    COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA  CORTEZA DEL ÁRBOL DE MANGO    El  extracto  es  preparado  por  decocción  por  una  hora  y  posteriormente  es  concentrado  por  evaporación  y  secado  por  spray  died  para  obtener  un  polvo  fino  de  color  café  (ECAM),  el  cual  funde  a  210‐215  °C  con  descomposición  (Acosta‐Esquijarosa et al., 2009). El ECAM es el ingrediente  farmacéutico  activo  estandarizado  que  se  utiliza  para  la  fabricación de las formulaciones Vimang® (Arús‐Pampin et  al.,  2003;  Lemus‐Rodríguez  et  al.,  2006).  La  composición  química  del  extracto  ha  sido  caracterizada  por  métodos  cromatográficos  (planar,  líquido  y  gas),  espectrometría  de  masa  y  espectrofotometría  UV‐Vis  (Núñez  et  al.,  2002;  2007a,b;  Núñez‐Sellés,  2005)  y  se  podría  resumir  de  la  manera siguiente:    • Polifenoles  (35‐45%):  mangiferina  (componente  mayoritario), ácido gálico, ácido 3,4‐ dihidroxibenzoico,    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 62 

 

 

 

   

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metil  éster  del  ácido  gálico,  propil  éster  del  ácido  gálico, (+)‐catequina, (‐)‐epicatequina, ácido benzoico y  propil éster del ácido benzoico.  Terpenoides  (25‐30%):  β‐elemeno,  β‐selineno,  α‐ guaieno,  aromandreno,  hinesol,  β‐edesmol,   cicloartranoles,  ledol,  taraxerol,  β‐chamigreno  y  bulnesol.  Esteroides (1‐3%): β‐Sitosterol y campestrol.  Azúcares  libres  (5‐8%):  galactosa,  glucosa,  arabinosa  y  fructosa.  Polialcoholes (3‐5%): sorbitol, mioinositol y xilitol.  Ácidos  grasos  (1‐3%):  mirístico,  palmítico,  linoleico,  oleico, esteárico, eicosatrienoico, succínico y malónico.  Elementos  (1%):  calcio,  magnesio,  potasio,  hierro,  selenio, cobre y zinc.   

publicaciones relacionadas con el ECAM, también se realizó  una  búsqueda  de  artículos  en  las  BD  PubMed,  Scielo  y  DOAJ.    

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE     Los  resultados  de  la  evaluación  de  las  propiedades  antioxidantes  del  ECAM  han  sido  publicados  ampliamente  (Martínez  Sánchez  et  al.,  2000a,b;  2001a,b;  2003;  Loy  et  al., 2002; Garrido et al., 2008).  Han  sido  reportadas  acciones  de  ECAM  como:  captura  de  ácido  hipocloroso,  captura  del  radical  superóxido,  captura  de radical hidroxilo, acción quelante de hierro, efecto anti‐ oxidante  sobre  ADN,  inhibición  de  la  peroxidación  lipídica  (IPL) espontánea, IPL catalizada por hierro, IPL microsomal  (IPLM), IPLM catalizada por hierro, protección a la pérdida  de  grupo  sulfhidrilo  (SH)  proteicos,  protección  a  la  aparición de grupo carbonilo (CO) proteicos e inhibición del  daño  por  isquemia/reperfusión  hepática  en  ratas  y  en  cerebro  de  Gerbil.  Todas  estas acciones  fueron  logradas  a  bajas concentraciones del extracto.  La comparación de la actividad antioxidante de ECAM con  relación  a  otros  compuestos  antioxidantes  reconocidos  tales como las vitaminas C y E, así como el beta‐caroteno,  demostró  que  el  extracto  es  similar  (inhibición  a  la  peroxidación  lipídica)  o  superior  (protección  al  daño  oxidativo)  a  dichos  compuestos  (Martinez‐Sanchez  et  al.,  2000b). La posible explicación  del mecanismo molecular a  través  del  cual  el  ECAM  ejerce  su  efecto  antioxidante  se  muestra en la Figura 1. 

  EVIDENCIAS  FARMACOLÓGICAS  PRE‐CLÍNICAS  REPORTADAS  PARA  EL  EXTRACTO  ACUOSO  DE  LA  CORTEZA DEL ÁRBOL DE Mangifera indica.    Del  total  de  las  publicaciones  relacionadas  en  el  área  de  Farmacología  y  Toxicología,  encontradas  en  la  BD  de  ISI  Web  of  Knowledge,  desde  1988  hasta  junio  de  2012,  alrededor  del  35%  corresponde  a  los  estudios  llevados  a  cabo  con  el  ECAM,  que  constituye  el  ingrediente  farmacéutico  activo  de  las  formulaciones  farmacéuticas  que  se  comercializan  en  Cuba  bajo  la  marca  Vimang®  y  registradas  como  nutracéutico  y  medicamento  de  origen  natural  para  su  uso  en  procesos  inflamatorios  y  de  dolor.  Para la obtención de una cobertura más amplia del total de    Figura 1. 

 

Efecto del extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM) sobre el balance redox. 

 

  Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 63   

 

    Muchos polifenoles fundamentan su actividad antioxidante  no sólo en la capacidad de secuestrar radicales libres, sino  en  su  habilidad  de  acomplejar  el  hierro  (Perron  &  Brumaghim,  2009;  Chobot  &  Hadacek,  2010).  El  hierro  es  uno  de  los  microelementos  de  mayor  importancia  para  el  organismo  humano.  Su  capacidad  de  transitar  por  varios  estados de valencia lo convierte en elemento esencial para  la  actividad  biológica  de  un  número  relevante  de  moléculas, de forma particular, aquellas que participan en  reacciones  de  transferencia  de  electrones.  Al  mismo  tiempo,  esta  habilidad  lo  transforma  en  un  elemento  con  un  peligro  potencial,  al  catalizar  la  formación  de  ERO,  especialmente  el  radical  hidroxilo,  a  través  de  la  reacción  de  Fenton‐Haber‐Weiss.  El  organismo  ha  desarrollado  un  mecanismo  sensible  para  regular  las  concentraciones  de  hierro  y  evitar  su  participación  en  procesos  redox  no  deseados.  En  un  número  importante  de  patologías,  esta  delicada maquinaria regulatoria se ve afectada por factores  endógenos  y  exógenos  y  se  producen  acumulaciones  del  metal  en  tejidos  y  órganos,  con  el  consiguiente  daño  oxidativo y alteración de la función de la célula.    En  estudios  recientes  (Pardo‐Andreu  et  al.,  2005a),  se  demostró  que  el  ECAM  protegió  las  membranas  mitocondriales del daño oxidativo inducido por Fe2+. La CI50  del  extracto  frente  a  la  peroxidación  lipídica  inducida  por  2+ Fe  fue más de 10 veces inferior a la CI50 cuando en lugar  del  hierro  se  utilizó,  como  inductor,  el  peróxido  de  ter‐ butilo (TBOOH). De la misma manera, el ECAM estimuló la  autoxidación  del  Fe2+  a  Fe3+  e  impidió  la  reducción  de  la  forma  férrica  a  la  ferrosa  por  el  ácido  ascórbico.  La  interacción del ECAM con el hierro, incapacita al metal de  participar  en  la  generación  del  radical  libre  hidroxilo  a  través de la reacción de Fenton. Además, el ECAM mostró  una  potente  inhibición  de  la  degradación  de  la  2‐ 3+ deoxiribosa  mediada  por  Fe /EDTA‐ascorbato  ó  3+ Fe /EDTA‐hipoxantina/xantina  oxidasa.  El  incremento  en  la concentración de los ligandos utilizados (EDTA o citrato)  causó  una  disminución  significativa  en  el  efecto  protector  del  ECAM  (Pardo‐Andreu  et  al.,  2006a).  Cuando  el  ascorbato  se  reemplazó  por  el  radical  anión  superóxido  (formado  por  la  actividad  de  la  enzima  xantina  oxidasa/hipoxantina),  la  eficiencia  protectora  del  ECAM  estuvo  inversamente  relacionada  con  la  concentración  de  EDTA.  Estos  resultados  indicaron  que  el  ECAM  no  solo  bloqueó  la  degradación  de  la  2‐deoxiribosa  a  través  del  “secuestro” de radicales hidroxilos, sino que parece actuar  principalmente  a  través  del  acomplejamiento  de  iones  hierro,  lo  que  previene  su  participación  catalítica  en  la  reacción de Fenton‐Haber‐Weiss.    La mangiferina (MF), por su abundancia relativa dentro del  ECAM,  parece  ser  la  responsable  principal  de  este  comportamiento del extracto (Pardo‐Andreu et al., 2005b;  3+ 2006a). El complejo MF‐Fe  (2:1) incrementó la capacidad  secuestradora del radical superóxido y la citoprotección de 

  hepatocitos aislados expuestos a hipoxia‐reoxigenación en  comparación  con  la  MF  sola.  Además,  estudios  in  vivo  de  sobrecarga  de  hierro  (Pardo‐Andreu,  et  al.,  2008)  mostraron  que  el  ECAM  y  la  MF  mejoran  los  indicadores  séricos de capacidad antioxidante y daño oxidativo en ratas  sometidas a la administración i.p. de Fe‐dextrana; al mismo  tiempo que disminuyeron la acumulación hepática de este  3+ metal.  Tanto  el  ECAM  como  el  complejo  MF‐Fe   también  fueron  capaces  de  aumentar  la  viabilidad  celular  cuando  células  de  túbulo  proximal  HK‐2  fueron  expuestas  a  diferentes  concentraciones  de  As  (Garrido  et  al.,  2012).  Además,  se  sabe  que  parte  del  mecanismo  de  daño  que  provoca  el  As  es  a  través  de  un  componente  de  estrés  oxidativo importante (Flora, 2011).    En  otro  estudio  (Remírez  et  al,  2005),  se  demostró  que  el  ECAM  no  resultó  citotóxico  en  hepatocitos  aislados  de  ratas  en  el  rango  de  concentraciones  de  5‐1  000  μg/mL  después de 24 h de exposición de las células a éste. En ese  modelo  celular  sólo  se  observó  un  efecto  citotóxico  moderado  a  las  concentraciones  de  500  y  1  000  μg/mL  cuando  los  hepatocitos  fueron  expuestos  al  extracto  durante  72  h.  Posteriormente,  se  publicó  el  potencial  antioxidante  del  ECAM  sobre  los  hepatocitos  en  cultivo  lo  que  permitió  evidenciar  la  actividad  antioxidante  del  extracto  en  ese  modelo  experimental,  como  forma  de  evaluar su efecto sobre dicho órgano (Rodeiro et al., 2007).  El ECAM fue capaz de reducir la peroxidación lipídica en el  cultivo  y  revertió  significativamente  la  peroxidación  inducida  por  TBOOH,  lo  que  se  comprobó  por  la  disminución de la producción de MDA y un incremento de  las concentraciones de GSH a nivel celular.     Por otra parte, otros estudios (Pardo‐Andreu et al., 2005c)  han  mostrado  que  la  acumulación  de  productos  de  oxidación  de  la  MF  (productos  generados  a  partir  de  su  acción antioxidante) induce la transición de permeabilidad  mitocondrial  (TPM),  debido  a  la  capacidad  que  tienen  de  disminuir  el  contenido  de  grupos  tiólicos  de  la  membrana  mitocondrial,  así  como  del  glutatión.  Estos  productos,  de  posible naturaleza quinónica, son electrófilos débiles con la  capacidad  de  reaccionar  con  los  grupos  SH.  Resultados  similares  se  obtuvieron  también  para  el  ECAM  (Pardo‐ Andreu  et  al.,  2006c).  Este  comportamiento  debe  beneficiar  a  aquellas  células  expuestas  a  una  sobreproducción de ERO, como sucede en algunos tipos de  células  cancerígenas,  en  las  cuales  el  desencadenamiento  de  la  apoptosis  mediada  por  TPM  podría  representar  un  mecanismo  de  defensa  significativo  para  el  organismo  portador.    También  se  ha  reportado  que  la  MF  manifestó  un  efecto  hepatoprotector  contra  el  daño  hepático  inducido  por  tetracloruro  de  carbono.  En  este  mismo  estudio,  la  MF  presentó  una  fuerte  actividad  antioxidante  mediante  el  ensayo  del  1,1‐difenil‐2‐picrilhidracilo  (DPPH)  (Pauletti  et    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 64 

 

 

    al., 2003; Dar et al., 2005), lo que fundamentó los hallazgos  de  las  propiedades  secuestradoras  de  radicales  libres  in  vitro de este polifenol.     Por otra parte, MF ha demostrado efecto secuestrador del  radical superóxido producido por los sistemas hipoxantina‐ xantina oxidasa y metosulfato fenazina‐NADH; pero no fue  capaz  de  inhibir  la  actividad  de  la  xantina  oxidasa,  determinada  por  la  producción  de  ácido  úrico  como  sustrato,  ni  modificar  la  respuesta  contráctil  inducida  por  fenilefrina  o  ésteres  de  forbol  (como  PMA)  en  anillos  aórticos  de  rata  (Leiro  et  al.,  2003).  Sin  embargo,  su  aglicona  noratiriol  inhibió  la  generación  del  anión  superóxido  inducida  por  formilmetionil‐leucil‐fenilalanina  (fMLP)  y  el  consumo  de  O2  en  neutrófilos  de  rata  (Hsu  et  al.,  1997).  En  un  sistema  libre  de  células,  generador  de  radicales  de  oxígeno,  noratiriol  inhibió  la  generación  de  superóxido  durante  la  autoxidación  del  ácido  dihidroxifumárico  y  en  el  sistema  xantina‐xantina  oxidasa.  2+ Noratiriol inhibió el aumento de Ca  inducido por fMLP y  la formación de inositol trifosfato, así como las actividades  de  la  fosfolipasa  C  citosólica  de  neutrófilos  y  la  NADPH  oxidasa. Los autores afirmaron que el noratiriol contribuye  a la reducción de radicales superóxido atribuida al bloqueo  de la vía fosfolipasa C, la atenuación de la fosforilación de  la  proteína  de  tirosina  inducida  por  fMLP  y  a  la  supresión  de  la  NADPH  oxidasa  a  través  de  la  interrupción  del  transporte de electrones.     ACTIVIDAD ANTI‐INFLAMATORIA E  INMUNOMODULADORA    Existen  múltiples  evidencias  que  señalan  la  relación  existente entre el balance oxidativo a nivel celular y tisular,  la respuesta al dolor y el desarrollo de la inflamación, en la  que se muestra que las especies reactivas de oxígeno (ERO)  activan las proteína‐cinasas y fosfatasas, así como factores  de transcripción que promueven la biosíntesis de citocinas  pro‐inflamatorias (Kyriakis & Avruch, 1996; Cuzzocrea et al,  2001).  Las  citocinas,  a  su  vez,  promueven  la  aparición  de  nuevas ERO a partir de la activación de diversos factores de  regulación  transcripcional,  entre  los  que  se  encuentra  el  NF‐κB (Karin & Neriah, 2000; Li & Verma, 2002).    En  estudios  recientes  se  ha  comprobado  que  el  ECAM  redujo la inflamación inducida por carragenano, en ratas y  cobayos,  y  formalina,  en  ratones,  como  modelos  agudos  inflamatorios  (Garrido  et  al.,  2001).  En  un  modelo  de  inflamación  tópica  en  el  que  se  indujo  el  edema  por  agentes  irritantes  (como  el  ácido  araquidónico  o  el  PMA)  en la oreja del ratón, ECAM, administrado de forma tópica  (oreja),  inhibió  la  inflamación  con  una  reducción  de  la  actividad de la enzima mieloperoxidasa en el tejido de las  orejas tratadas con PMA + ECAM (Garrido et al., 2004a).   

  De  la  misma  manera,  en  un  modelo  de  enfermedad  peridontal  inducida  en  perros  (García‐Triana  et  al.,  2005),  el  ECAM  (1%,  disuelto  en  solución  salina  fisiológica),  aplicado dos veces al día durante tres semanas, redujo de  manera  significativa  el  índice  gingival,  la  profundidad  del  surco  gingival  y  la  pérdida  ósea,  por  lo  que  la  administración tópica del extracto atenuó el desarrollo de  la enfermedad peridontal.    Por otra parte, el ECAM inhibió la quimiotaxis de leucocitos  polimorfonucleares, lo que permite regular la migración de  células  inflamatorias  al  sitio  de  inflamación  e  inhibir  la  expresión  de  moléculas  de  adhesión,  relacionadas  con  los  procesos  de  activación  del  endotelio  vascular  y  los  procesos  de  trasmigración  de  leucocitos  y  otras  células  inflamatorias  al  tejido  inflamado.  Además,  se  pudo  comprobar  que  ECAM  inhibe  la  expresión  de  la  molécula  de  adhesión  ICAM‐1  cuando  las  células  endoteliales  son  estimuladas  con  IL‐1  (Delgado  et  al.,  2001;  Beltrán  et  al.,  2003).  La  capacidad  quimiotáctica  de  macrófagos  peritoneales  de  rata  también  fue  inhibida  por  ECAM  (García et al., 2002).    También,  el  ECAM  inhibió  la  producción  de  eicosanoides  tales como prostaglandina E2 (PGE2) y leucotrieno B4 (LTB4),  mediadores de procesos inflamatorios relacionados con la  activación  de  la  vía  metabólica  del  ácido  araquidónico,  en  macrófagos RAW264.7 y J774 (Garrido et al., 2004a; 2006).  Este  efecto  podría  deberse,  al  menos  en  parte  (PGE2),  a  que  ECAM  inhibe  la  expresión  de  la  enzima  inducible  encargada  de  la  síntesis  de  estos  mediadores,  la  ciclooxigenasa  2  (COX‐2),  mediante  la  inhibición  del  proceso  de  transcripción  de  los  genes  que  codifican  para  esta  enzima  en  macrófagos  peritoneales  murinos  estimulados  con  lipopolisacárido  bacteriano  (LPS)  e  interferón  gamma  (IFNγ)  (Leiro  et  al.,  2004b).  En  este  estudio,  ECAM  solo  redujo,  de  forma  significativa,  la  concentración de ARNm de la enzima COX‐1 con la mayor  concentración  evaluada  (400  μg/mL),  lo  que  pudiera  indicar  que  el  extracto  es  capaz  de  inhibir  selectivamente  la isoforma COX‐2 que se induce en el proceso inflamatorio  sin  alterar  la  función  biológica  de  la  enzima  COX‐1.  Adicionalmente,  el  ECAM  inhibió  la  actividad  de  la  fosfolipasa A2 (PLA2) de secreción sinovial humana (Garrido  et al., 2004a).    En  sistemas  experimentales,  en  los  que  se  emplearon  células  de  musculatura  lisa  vascular,  aisladas  de  arterias  mesentéricas  de  ratas  normotensas  y  espontáneamente  hipertensas, se lograron demostrar los efectos de ECAM y  la  MF  sobre  la  expresión  de  las  isoformas  inducibles  de  COX‐2 y de iNOS, ambos sistemas enzimáticos involucrados  en  la  hipertensión  arterial  como  enfermedad  inflamatoria  crónica,  en  la  que  desempeñan  un  papel  protagónico  los  diversos  procesos  e  intermediarios  asociados  a  las  funciones  básicas  del  endotelio  vascular  y  la  musculatura    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 65 

 

 

    lisa  vascular.  Se  comprobó  que  ECAM  inhibió  con  mayor  efectividad la expresión de iNOS inducida por IL‐1 en ratas  hipertensas  respecto  a  las  normotensas,  mientras  que  el  efecto  inhibidor  sobre  la  COX‐2  fue  más  acentuado  en  las  ratas normotensas (Beltrán et al., 2004).    El ECAM redujo la contracción inducida por noradrenalina y  otro  agente  vasoconstrictor  (U46619)  en  arteria  mesentérica de rata (Beltrán et al., 2004), efecto este que  no  se  justifica  a  partir  de  sus  propiedades  anti‐ inflamatorias.  Sin  embargo,  la  MF  no  mostró  actividad  vasodepresora,  lo  cual  sugiere  que  el  efecto  de  ECAM  sobre  la  vasoconstricción  mediada  por  la  expresión  de  COX‐2  e  iNOS,  está  relacionada  con  la  presencia  de  otros  componentes  del  ECAM,  cuyo  efecto  aún  está  por  demostrar.    En un modelo murino de choque endotóxico inducido por  lipopolisacárido  (LPS),  el  ECAM  inhibió  la  producción  de  TNFα  tanto  en  un  modelo  de  administración  aguda  como  cuando se administró durante una semana por vía oral. Se  pudo  comprobar  que  esta  inhibición  está  dada  por  la  acción  de  ECAM  sobre  el  trascripto  primario  de  esta  proteína (ARNm) tanto en hígado como en pulmones de los  animales  tratados  (Garrido  et  al.,  2004b).  En  los  modelos  de inducción de edemas auriculares por ácido araquidónico  y PMA, por administración aguda oral de ECAM, se obtuvo  una  inhibición  de  las  concentraciones  séricas  de  TNFα  (Garrido  et  al.,  2004a).  Además,  ECAM  y  MF  inhibieron  la  producción  de  esta  citocina  pro‐inflamatoria  en  macrófagos  RAW  264.7  y  N9  activados  con  LPS  e  IFNγ  (Garrido et al., 2004b). La acción de MF sobre macrófagos  residentes del SNC en microglia (como la línea celular N9)  pudiera explicar la actividad neuroprotectora detectada en  un modelo de neuroinflamación y daño oxidativo inducido  por estrés en el cerebro de ratas inmovilizadas (Máquez et  al., 2012). El tratamiento previo con esta xantona, por vía  oral durante siete días, previno todos los efectos inducidos  por  el  estrés  como  fueron:  el  incremento  en  las  concentraciones plasmáticas de glucocorticoides e IL‐1β; la  pérdida  del  balance  redox  y  la  reducción  de  las  concentraciones de catalasa cerebral; el incremento de los  mediadores  pro‐inflamatorios,  tales  como  TNFα  y  su  receptor  TNF‐R1,  el  NF‐κB  y  la  síntesis  de  enzimas,  como  iNOS y COX‐2; y el incremento de la peroxidación lipídica.  Estos  resultados  sugieren  que  la  administración  de  MF  (o  los  extractos  ricos  en  esta  xantona)  podría  constituir  una  nueva  estrategia  terapéutica  en  patologías  neurológicas‐ neuropsiquiátricas  en  las  cuales  exista  una  desregulación  del eje hipotalámico‐pituitario‐adrenal, neuroinflamación y  un daño oxidativo.    Por otra parte, se investigaron los efectos del ECAM en un  modelo de colitis ulcerativa inducida por sulfato sódico de  dextrano (DSS) en ratas (Márquez et al., 2010). Para ello, el  ECAM  se  administró  en  dos  protocolos  diferentes:  en  el 

  primero  se  administró  el  ECAM  por  vía  rectal,  durante  7  días en co‐tratamiento con DSS, y en el segundo ECAM se  administró una vez al día durante 14 días (por sonda oral, 7  días  antes  de  la  administración  de  DSS  y  rectal  por  7  días  durante  la  administración  de  DSS).  Los  resultados  demostraron  que  el  ECAM  tiene  propiedades  anti‐ inflamatorias que mejoran los signos clínicos, la reducción  de la ulceración y la reducción de la actividad MPO cuando  se administra antes de DSS. Además, la administración del  extracto  por  14  días  resultó  en  un  aumento  de  GSH  y  la  reducción  de  las  concentraciones  de  las  sustancias  reactivas  de  ácido  tiobarbitúrico  (TBARS)  y  de  iNOS  y  la  expresión de COX‐2, TNF‐α y TNF R‐2 en tejido colónico, y  una  disminución  de  las  concentraciones  séricas  de  IL‐6  y  TNFα.  Los  autores  declararon  que  la  administración  preventiva de ECAM, en un modelo de colitis inducida por  DSS, parece ser el protocolo más efectivo para disminuir el  estrés oxidativo y la inflamación en este modelo.    Existe  una  estrecha  relación  entre  la  inflamación,  el  desbalance oxidativo y la respuesta inmune. La producción  de  ERO  puede  modular  la  expresión  de  numerosas  moléculas (citocinas, anticuerpos, factores de transcripción  y  otras)  involucradas  en  la  respuesta  inmune,  lo  que  ha  permitido  relacionar  algunos  trastornos  en  la  inmunidad  con  el  estrés  oxidativo  y  los  mecanismos  de  defensa  antioxidante  con  las  propiedades  inmunomoduladoras  de  los fármacos (Matés et al., 2000). La respuesta inflamatoria  es  parte  y  consecuencia  de  algunos  tipos  de  respuesta  inmune  y  varias  de  las  citocinas  producidas  por  macrófagos,  células  T  y  mastocitos  conducen  al  reclutamiento  celular,  el  incremento  de  la  permeabilidad  vascular,  la  vasodilatación  y  otros  eventos  característicos  de  la  inflamación.  Otro  punto  en  común  entre  estos  fenómenos lo constituye la actividad del propio macrófago,  pues  es  una  de  las  principales  fuentes  de  producción  de  ERO, de mediadores pro‐inflamatorios y es uno de los ejes  centrales  en  la  activación  de  la  respuesta  inmune  adaptativa  que  inducen  la  coestimulación  para  la  activación de las células T.    En  macrófagos  murinos,  aislados  y  estimulados  con  LPS  e  IFNγ,  ECAM  redujo  las  concentraciones  de  ARNm  de  las  citocinas  TNFα,  IL‐1β  y  GM‐CSF,  sin  afectar  las  de  IL‐6,  e  incrementó  las  de  TGFβ.  Además,  redujo  la  concentración  de  TNFα  en  el  sobrenadante  de  cultivo  de  macrófagos  peritoneales, lo que permitió correlacionar la inhibición del  ARNm con la reducción de la proteína (García et al., 2002).  Por su parte, la MF inhibió el aumento de iNOS y TNFα en  macrófagos  de  rata  estimulados  in  vivo  con  tioglicolato  y  después in vitro con LPS e interferón gamma (Guha et al.,  1996).  A  concentración  de  100  mM  redujo  las  concentraciones  de  sus  ARNm.  Sin  embargo,  a  esta  concentración  aumentaron  los  valores  del  transcripto  primario  del  factor  de  crecimiento  tumoral‐beta  (TGF‐β)  (Leiro  et  al.,  2003).  El  hallazgo  de  que  MF  aumente  la    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 66 

 

 

    expresión  génica  de  TGF‐β  sugiere  que  este  polifenol,  o  extractos que lo contengan, podría tener algún valor en la  prevención  del  cáncer,  enfermedades  autoinmunes,  aterosclerosis y otras afecciones cardiovasculares.  Por  otra  parte,  el  ECAM  inhibió  la  producción  de  óxido  nítrico  (NO)  en  macrófagos  RAW264.7  (Garrido  et  al.,  2004b), así como en macrófagos peritoneales (García et al.,  2002)  estimulados  con  LPS  e  IFNγ.  Se  comprobó  que  esta  acción  de  ECAM  está  asociada  a  la  reducción  de  la  concentración  de  ARNm  que  codifica  para  la  iNOS,  lo  que  conduce  a  la  inhibición  de  la  expresión  de  esta  enzima,  encargada  de  la  producción  del  NO  a  partir  de  L‐arginina  (Leiro et al., 2004b).    El  ECAM  también  inhibió  la  activación  inducida  por  TNFα  del factor de transcripción nuclear NF‐κB en células Hela y  Jurkat,  con  lo  cual  se  impidió  la  degradación  del  inhibidor  citoplasmático  del  NF‐κB,  o  sea  IκB.  Por  tanto,  la  translocación del NF‐κB al núcleo de la célula y su posterior  unión  a  elementos  específicos  en  regiones  promotoras  de  genes  dianas  para  la  producción  de  proteínas  pro‐ inflamatorias, tales como citocinas, moléculas de adhesión  y enzimas, entre otros, también fue inhibida (Garrido et al.,  2005).  Por  otra  parte,  se  comprobó  que  ECAM  redujo  las  concentraciones  de  ARNm  del  NF‐κB  en  macrófagos  peritoneales  murinos  estimulados  con  LPS  e  IFN‐γ  sin  afectar la concentración de IκB, lo que explica que, además  de inhibir su activación, reduce la disponibilidad de NF‐κB  en  el  citoplasma  celular  y  garantiza  la  presencia  del  inhibidor IκB (Leiro et al., 2004a).    Se  piensa  que  uno  de  los  componentes  en  el  ECAM  responsable  de  los  efectos  anti‐inflamatorio  e  inmunomodulador  sea  la  MF,  por  lo  que  se  realizó  un  estudio  para  demostrar  los  mecanismos  de  acción  por  los  cuales  esta  xantona  ejerce  tales  efectos  (Leiro  et  al.,  2004a).  Todo  ello  se  realizó  a  través  de  la  medición  del  efecto  sobre  la  expresión  de  diversos  genes  relacionados  con  la  vía  de  señalización  del  NF‐κB,  por  lo  que  se  demostró que ésta inhibe la expresión de dos genes de la  familia  de  Rel/NF‐κB/IκB,  RelA  y  RelB,  lo  que  indica  un  efecto  inhibitorio  sobre  la  señal  de  transducción  mediada  por NF‐κB; del factor 6 asociado al receptor de TNF (Traf6),  lo que pudiera indicar un probable bloqueo de la activación  de  NF‐κB  vía  LPS,  TNFα  o  IL‐1;  de  otras  proteínas  involucradas  en  las  respuestas  a  TNF  y  a  la  vía  apoptótica  disparada  por  daño  al  ADN,  la  que  incluye  el  receptor  de  TNF (TNF‐R), el dominio de muerte asociado al receptor del  TNF  (TRADD)  y  la  proteína  que  interactúa  con  el  receptor  (RIP);  del  ligando  extracelular  de  IL‐1α,  lo  que  indica,  posiblemente, interferencia con la respuesta a IL‐1; de las  citocinas pro‐inflamatorias IL‐1, IL‐6, IL‐12, TNFα y RANTES  y  citocinas  producidas  por  monocitos  y  macrófagos  como  el factor estimulante de colonias de granulocitos (G‐CSF), el  factor estimulante de colonias de granulocitos‐macrófagos 

  (GM‐CSF)  y  el  factor  estimulante  de  colonias  de  macrófagos (M‐CSF); de otras proteínas de receptores toll‐ like  (además  de  Traf6)  tales  como  JNK1,  JNK2  y  Tab1;  de  Scya2 (Small Inducible Cytokine A2), una proteína similar a  la proteína quimioatrayente de monocitos‐1 (MCP‐1); y de  varias  moléculas  de  adhesión  intracelular  (ICAM)  y  la  molécula  de  adhesión  celular  vascular  VCAM‐1,  la  cual  se  encuentra aumentada en ateromas. La inhibición de JNK1,  unido  a  la  estimulación  de  c‐JUN  y  a  la  actividad  secuestradora  de  superóxido  anteriormente  mencionada,  sugiere  que  la  MF  podría  proteger  a  las  células  contra  el  daño oxidativo y la mutagénesis.    Además,  MF  bloqueó  la  activación  de  NF‐κB  inducido  por  TNF  y  los  genes  dependientes  de  NF‐κB  como  ICAM‐1  y  COX‐2 (Sarkar et al., 2004). El efecto estuvo mediado por la  inhibición de la activación de IKK y subsiguiente bloqueo de  la  fosforilación  y  degradación  de  IκBα.  De  igual  forma,  la  MF  inhibió  la  fosforilación  de  p65  inducida  por  TNF,  así  como  la  translocación  al  núcleo  y  la  activación  de  NF‐κB  inducida  por  otros  agentes  pro‐inflamatorios  como  PMA,  ceramide  y  LPS.  También,  inhibió  la  generación  de  ERO  inducida  por  TNF  e  incrementó  al  doble  las  concentraciones  de  GSH  (un  modulador  de  las  concentraciones  de  NF‐κB)  en  comparación  con  otros  antioxidantes.  Al  mismo  tiempo,  decrecieron  las  concentraciones  de  GSSG  e  incrementó  la  actividad  de  catalasa.  MF  y,  por  tanto,  el  ECAM,  podría  constituir  un  fuerte  candidato  para  la  terapia  antioxidante  y  anti‐ inflamatoria  debido  a  su  capacidad  para  inhibir  la  activación de NF‐κB y al incremento de las concentraciones  intracelulares de GSH.    Todas  estas  evidencias,  tanto  de  experimentos  a  nivel  molecular  como  en  modelos  animales,  demostraron  la  influencia  de  ECAM  sobre  especies  intermediarias  de  la  reacción  inflamatoria,  tales  como  moléculas  de  adhesión  (ICAM‐1),  citocinas  pro‐inflamatorias  (TNFα  y  sus  receptores  TNF  R‐1  y  R‐2,  IL‐1,  GM‐CSF  y  TGFβ),  enzimas  (COX‐2,  iNOS,  PLA2),  mediadores  de  la  cascada  del  ácido  araquidónico (PGE2 y LTB4) y factores de transcripción (NF‐ κB) que constituyen señales de activación intercelular muy  relevantes  de  la  respuesta  inflamatoria  y  del  sistema  inmune,  asociadas  a  los  procesos  de  daño  tisular  y  activación celular que producen la mayor parte de las ERO.    De otra parte, los estudios llevados a cabo con MF indican  que  ésta  es  un  inhibidor  de  la  expresión  de  genes  como  iNOS,  TNFα  y  NF‐κB,  lo  que  sugiere  que  esta  xantona  presenta  un  valor  potencial  en  el  tratamiento  de  desórdenes  inflamatorios  y(o)  neurodegenerativos.  Estos  resultados también indican que la MF modula la expresión  de un considerable número de genes que participan en la  replicación  viral,  la  regulación  de  la  apoptosis,  la  tumorogénesis,  la  inflamación  y  enfermedades  autoinmunes  por  lo  que  pudiera  ser,  en  parte,  la    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 67 

 

 

 

    responsable  de  las  actividades  anti‐inflamatoria  e  inmunomoduladora del ECAM. 

Un resumen de los efectos de ECAM sobre algunos de los  mediadores  pro‐inflamatorios  e  inmunológicos  se  puede  apreciar en la Figura 2.      Figura 2. 

 

TNFα

NF-κB

ECAM

ICAM-1

ADHESIÓN CELULAR Citoplasma

NF-κB

Núcleo Fosfolípidos Membrana

ADN

ECAM

GM-CSF

PLA 2

AA Mediadores Proinflamatorios ECAM

LOX

COX-2

ECAM LTB 4

PGE 2 iNOS

IL-1β TNFα

NO . O 2-

ECAM

ONOO -

INFLAMACIÓN

CHOQUE ENDOTÓXICO

 

    Mecanismo de acción anti‐inflamatoria del extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM). El proceso de inducción de señales, resultado de la activación del  factor de transcripción nuclear κB (NF‐κB) por el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) se inhibe por el ECAM. Bajo condiciones patológicas, la activación de NF‐ κB inducida por TNFα estimula la degradación del inhibidor citoplasmático (IκB) del NF‐κB. Después de ese evento, NF‐κB se trasloca al núcleo de la célula para  inducir la síntesis de ARNm de algunos mediadores pro‐inflamatorios tales como el TNFα, la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la ciclooxigenasa 2 (COX‐2), la  interleucina 1 (IL‐1) y el factor estimulante de colonias de granulocitos‐macrófagos (GM‐CSF); así como moléculas de adhesión que participan en el proceso de la  adhesión celular (como ICAM‐1). El ECAM también es capaz de inhibir otros mediadores importantes del proceso inflamatorio como la fosfolipasa A2 (PLA2), la  prostaglandina E2 (PGE2) y el leucotrieno B4 (LTB4). 

   

     

En otros modelos experimentales, se demostró que ECAM  moduló  la  respuesta  inmune  humoral  en  ratones,  mediante  la  inhibición  de  la  IgG2a  y  la  IgG2b,  inmunoglobulinas  características  de  la  respuesta  Th1  activadora  de  macrófagos,  pero  sin  afectar  la  producción  de  IgM  (García  et  al.,  2003a).  Este  resultado  se  corresponde  con  el  efecto  inhibitorio  de  la  actividad  de  macrófagos  (García  et  al.,  2002;  Leiro  et  al.,  2004b),  e  indica  que  ECAM  pudiera  utilizarse  en  enfermedades  caracterizadas  por  la  sobreproducción  de  inmunoglobulinas. 

La  activación  de  los  linfocitos  T  es  una  etapa  crucial  de  la  respuesta inmune que conduce a un incremento rápido en  la  expresión  de  genes  relacionados  con  la  proliferación  y  diferenciación  de  estas  células.  La  desregulación  de  estos  procesos  conduce  a  estados  inmunopatológicos  como  las  enfermedades  autoinmunes  y  la  inflamación.  Cuando  los  mecanismos de activación de células inmunocompetentes,  como  los  macrófagos  y  las  células  T,  persisten  por  permanencia  del  estímulo  antigénico  o  por  desregulación  de  los  mecanismos  inhibitorios,  se  produce  un  estado  de  sobreactivación  celular  que  conlleva  a  la  excesiva    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 68 

 

 

    producción de mediadores inflamatorios, lo que conduce a  un  proceso  inflamatorio  tal  que  puede  terminar  en  una  lesión tisular. Dichos procesos están altamente implicados  en la fisiopatología de enfermedades tales como la artritis  reumatoide,  las  enfermedades  inflamatorias  intestinales  y  el lupus eritematoso sistémico, entre otras (Issekutz et al.,  1988; Ali et al., 1997).    El  ECAM  también  inhibió  la  proliferación  de  células  T  humanas  estimuladas  por  un  superantígeno  de  enterotoxina  B  de  Staphylococcus  aureus  (Garrido  et  al.,  2005).  La  activación  de  los  linfocitos  T  ha  sido  estudiada,  tanto  en  la  inflamación  crónica  como  en  la  aguda,  ya  que  diferentes poblaciones de células T alteran el balance entre  el  aclaramiento  o  eliminación  del  patógeno  y  la  inducción  de  daño  tisular,  lo  que  depende  de  los  mediadores  citocínicos  que  ellos  secretan.  La  activación  por  citocinas  conduce a un incremento rápido en la expresión de genes  relacionados  con  el  crecimiento,  la  adhesión  y  diferenciación  de  estas  células.  El  tratamiento  con  ECAM  inhibió la proliferación celular mediada por el receptor de  células  T  e  inducida  por  SEB.  Además,  fue  estudiado  el  efecto  del  extracto  sobre  la  expresión  en  la  superficie  celular de los marcadores de activación CD25 en células T  primarias,  estimuladas  con  SEB.  El  extracto  inhibió  la  expresión de este marcador en  la superficie celular de los  linfocitos T. Como consecuencia de la activación celular, las  células T primarias progresan a las fases S y G2‐M del ciclo  celular,  y  en  este  estudio  se  evaluó  el  efecto  del  ECAM  sobre  la  progresión  del  ciclo  celular  en  estas  células  T  estimuladas.  El  tratamiento  con  el  extracto  previno  la  entrada de las células en la fase S del ciclo celular.    La muerte celular inducida por activación (AICD, Activation  Induced  Cell  Death)  es  esencial  para  la  homeostasis  del  sistema  inmune  (Krammer  et  al.,  1994)  y  su  desbalance  está relacionado con diversas enfermedades tales como las  inmunodeficiencias y las autoinmunes (Rieux‐Laucat et al.,  2003).  La  elevada  expresión  del  CD95L  asociada  al  incremento en la sensibilidad a la AICD que se observa en  los  individuos  infectados  con  el  virus  de  la  inmunodeficiencia  humana  evidencia  que  este  tipo  de  muerte  celular  contribuye,  en  parte,  a  la  pérdida  progresiva de linfocitos T CD4+ infectados y no infectados  que  conduce  a  la  desregulación  del  sistema  inmune  en  estos  pacientes  (Dockrell  et  al.,  1999;  Badley  et  al.,  2000;  Alimonti et al., 2003).    Los  resultados  experimentales  demostraron  que  ECAM  puede  regular  la  sobrevivencia  de  linfocitos  T  humanos  al  inhibir la AICD in vitro. Este efecto se ejerce al disminuir las  2+ concentraciones  intracelulares  de  ERO  y  Ca ,  señales  tempranas inducidas que estimulan al TCR (T cell receptor).     La capacidad de inhibir las ERO se demostró además, por la  reducción  en  la  expresión  de  la  enzima  manganeso‐

  superóxido  dismutasa  (Mn‐SOD),  involucrada  en  la  regulación  de  los  procesos  de  estrés  oxidativo  e  inducida  por  la  estimulación  del  TCR  (Hernández  et  al.,  2006a).  También,  el  ECAM  actuó  sobre  factores  transcripcionales  involucrados  en  la  AICD.  La  disminución  de  las  concentraciones  constitutivas  de  NF‐κB  en  presencia  del  extracto  determina  una  menor  disponibilidad  de  este  factor en la cascada de señales necesaria para la inducción  del  CD95L  (Hernández  et  al.,  2006b).  Por  otra  parte,  el  extracto  disminuyó  la  fosforilación  de  la  cinasa  de  c‐Jun  (JNK), lo que repercute en su activación y en consecuencia,  en  la  activación  del  factor  AP‐1  (Hernández  et  al.,  2006a).  El  conjunto  de  efectos  descritos  conduce  a  la  inhibición  observada  de  la  expresión  del  ARNm  del  CD95L  y  determina  que  ECAM  inhiba  la  AICD.  En  otro  estudio  (Hernández  et  al.,  2007)  se  demostró  que  los  principales  polifenoles que componen el ECAM, como MF, catequina y  epicatequina  son  responsables,  en  parte,  de  la  capacidad  del  extracto  de  regular  la  AICD  en  células  T.  Esto  pudiera  explicarse  a  través  de  un  mecanismo  que  involucra  la  disminución  de  las  concentraciones  de  ERO  y  Ca2+  inducidos  por  la  activación  del  TCR.  En  todos  los  casos  el  efecto fue inferior al mostrado por ECAM, lo que fortalece  la  hipótesis  del  efecto  sinérgico  que  pudiera  ejercer  la  mezcla de componentes que conforman el extracto.     En  la  Figura  3  se  muestra  un  esquema  de  los  blancos  potenciales  de  acción  del  ECAM  sobre  la  cascada  de  señalización  del  CD95L  estimulada  durante  la  AICD  en  linfocitos T humanos.     ACTIVIDAD ANALGÉSICA    Los  ensayos  desarrollados  con  la  finalidad  de  evaluar  la  acción anti‐inflamatoria del ECAM, en modelos in vitro e in  vivo, mostraron actividad anti‐inflamatoria y analgésica. De  forma  específica,  el  ECAM  redujo  el  dolor  inducido  por  formalina en la fase tardía de la reacción dolorosa (Garrido  et al., 2001, 2004a,b, 2005, 2006).     En la prueba de la formalina se acepta que la primera fase  resulta  de  la  activación  directa  de  las  fibras  aferentes  primarias nociceptivas y refleja un dolor de tipo fisiológico  o nociceptivo (Vyklicky, 1979; Ren & Dubner, 1999; Wilson  et  al.,  2006).  Sin  embargo,  existen  aún  dificultades  en  la  comprensión  de  los  mecanismos  de  la  segunda  fase.  Estudios  recientes  sugieren  que  dicha  fase  resulta  de  un  incremento de la excitabilidad de las neuronas del cuerno  dorsal  espinal  (CDE)  y  se  ha  demostrado  que  la  fase  I  es  necesaria  para  el  desarrollo  de  la  fase  II  (Ren  &  Dubner,  1999).  Este  ensayo  es  considerado  como  un  excelente  modelo de dolor persistente de moderada intensidad, que  se  asemeja  al  dolor  clínico  en  humanos  (Ortega  et  al.,  2002).  La  actividad  del  ECAM  quedó  demostrada  para  la  fase  II,  de  ahí  sus  potencialidades  para  el  tratamiento  del  dolor patológico y su acción antihiperalgésica.     Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 69 

 

 

 

    En  el  modelo  de  dolor  inducido  por  la  aplicación  i.p.  de  ácido  acético  se  obtuvo  un  resultado  similar  al  reducir  el  número  de  las  contorsiones  abdominales  (Garrido  et  al.,  2001).  Este  modelo  estudia  el  dolor  visceral  o  mixto  provocado  por  este  irritante  que  causa  inflamación  peritoneal e hiperalgesia (Reichert et al., 2001). También la  MF ha mostrado efecto analgésico en este modelo y en el 

del  plato  caliente  en  ratones,  sin  exhibir  la  actividad  anti‐ inflamatoria (Dar et al., 2005).    Ambos  estudios  (mediante  la  inducción  de  estímulos  nociceptivos  por  formalina  y  ácido  acético)  sugieren  la  potencialidad  del  ECAM  para  tratar  las  alteraciones  del  procesamiento nociceptivo en circunstancias patológicas.       Figura 3.   

TCR

ZAP70

Lck

PLCγ2

RE R Rh ho o//RRaacc

Mn M nSSO ODD RR E OO S

3

ECAM

1

Æ Æ Æ

2

C a2 +

MMKKKK 44/ /7 7 4

EC AM

iM EM CA

lmoodduulin linaa CCaa lm

p

lcin ineeuurrin CCaalc in aa

JN K p

ECAM

κB NNFF-κ

NFAT

Ju n

EC AM 6

T r a n s c r ip c ió n

p ro m o to r C D 9 5 L

A p o p to s is

5

N ú c le o EC AM

 

Blancos potenciales de la acción del extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM) sobre la cascada de señalización del CD95L estimulada durante la muerte  celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T humanos. (1) Disminución de las concentraciones de ERO; (2) Disminución de las concentraciones de Ca2+;  (3) inhibición de la expresión de Mn‐SOD; (4) inhibición de la fosforilación de JNK; (5) inhibición de la expresión de ARNm del gen CD95L; (6) inhibición de la AICD.  RE: retículo endoplasmático. 

 

   

Como se ha mencionado, los resultados en otros modelos  in  vivo  de  inflamación  complementan  los  hallazgos  anteriormente expuestos ya que el ECAM inhibe el edema  de la oreja inducido por ácido araquidónico y los ésteres de  forbol  (Garrido  et  a.,  2004a),  que  exploran  con  cierta  selectividad  las  vías  de  la  lipooxigenasa  (LOX)  y  la  COX,  respectivamente.  Además,  estudios  bioquímicos  adicionales  en  estos  modelos  demostraron  una  reducción  sistémica del TNFα (Garrido et al., 2004b), el cual participa  primariamente en el establecimiento de la hiperalgesia.        

La  expresión  de  esta  citocina  pro‐inflamatoria  favorece  la  liberación  de  IL‐1,  IL‐6  e  IL‐8,  reduce  el  umbral  de  activación  de  fibras  C,  induce  la  liberación  de  neuropéptidos  como  la  sustancia  P  (SP)  y  el  péptido  relacionado al gen de la calcitonina (PRGC) y desencadena  las  vías  dependientes  de  la  COX,  para  la  formación  de  prostaglandinas  (García  et  al.,  2001;  Covey  et  al.,  2002;  Wood, 2005; Xu et al., 2006). Además, conjuntamente con  el  IFNγ,  el  TNFα  amplifica  la  producción  de  aniones  superóxido  por  los  neutrófilos  y  la  biosíntesis  de  NO,  por  aumento de la actividad de todas las isoformas de la NOS  (Eliav et al., 2001; Zelenka et al., 2005).  En los estudios in  vitro (Garrido et al., 2004b), diseñados para profundizar en    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 70 

 

 

 

    el  mecanismo  de  acción  de  los  efectos  descritos  anteriormente,  el  ECAM  inhibió  la  producción  de  TNFα  y  NO  en  líneas  celulares  de  macrófagos  RAW264.7  y  de  manera  interesante  el  mismo  resultado  fue  observado  en  macrófagos  residentes  del  SNC  en  microglia  (células  N9).  En macrófagos murinos después de la estimulación con LPS  e IFNγ redujo las concentraciones de iNOS y de su ARNm,  así como de COX‐2 y su ARNm (sin efectos marcados sobre  COX‐1),  TNFα;  así  como  PGE2,  que  posee  un  reconocido  papel como mediador de la hiperalgesia (Kress, 2005), e IL‐ 1β. La IL‐1β es considerada una molécula muy importante  en  el  desarrollo  de  la  hiperalgesia  inflamatoria,  por  sus  mecanismos  indirectos  sobre  la  liberación  de  PG,  la  inducción de receptores de bradicinina y el aumento en las  concentraciones locales del factor de crecimiento nervioso  (Eliav et al., 2001; Zelenka et al., 2005).    

Se  ha  documentado  que  el  NO  producido  por  la  óxido  nítrico  sintasa  neuronal  (nNOS)  y  la  iNOS,  difunde  fácilmente  a  través  de  las  membranas  celulares  y  viaja  a  neuronas  vecinas,  glias  y  a  la  terminal  nerviosa  presináptica,  donde  puede  activar  sistemas  de  segundos  mensajeros,  con  el  consiguiente  aumento  del  GMPc  que  activaría  a  las  proteínas  cinasas  dependientes  de  GMPc  y  estas favorecerían la liberación de glutamato (Vetter et al.,  2001).  Por  otra  parte,  la  PGE2  puede  activar  a  la  adenil  ciclasa,  vía  receptor  EP2,  y  aumentar  las  concentraciones  de  AMPc,  el  que  activaría  a  sus  proteínas  cinasas  dependientes,  como  la  proteína  cinasa  A,  la  cual  induce  mayor  liberación  de  glutamato  (Lui  &  Lee,  2004).  De  esta  forma,  los  procesos  presinápticos  y  postsinápticos  se  retroalimentan  y  exageran  la  señal  excitatoria  en  el  CDE.  Asimismo,  existe  una  elevación  de  las  concentraciones  de  PGD2,  PGE2,  PGF2α,  de  la  COX‐2  y  del  ácido  araquidónico  en  el  SNC.  También,  existen  evidencias  en  animales  y  humanos  que  confirman  los  efectos  antihiperalgésicos  centrales de los anti‐inflamatorios no esteroidales durante  la  inflamación  o  el  daño  nervioso  (Shi  et  al.,  2006).  Estos  antecedentes  sugieren  la  posibilidad  para  la  utilización    terapéutica del ECAM en estos estados.    La evidencia de que el ECAM previno la activación del NF‐ κB  inducida  por  TNFα  y  que  no  afecta  la  expresión  de  IκB  (Garrido  et  al.,  2005),  unificó  y  dio  soporte  a  todos  los  resultados  anteriores.  El  ECAM  pudiera  utilizarse  en  el  tratamiento  de  las  alteraciones  del  procesamiento  nociceptivo  con  las  consecuentes  implicaciones  beneficiosas sobre la inhibición de la cascada inflamatoria y  la hiperalgesia.    Estudios  recientes  in  vitro  (Lemus‐Molina  et  al.,  2009)  en  oligodendrocitos  y  en  neuronas  (muchas  de  ellas  son  interneuronas  inhibitorias)  apoyan  los  efectos  favorecedores  en  la  prevención  de  la  muerte  neuronal  excitotóxica  inducida  por  receptores  N‐metil‐D‐aspartato  (NMDA) (Baymgärtner et al., 2002). En estos experimentos 

se  observó  una  disminución  de  las  concentraciones  de  glutamato, en presencia del extracto y su xantona aislada,  que  lo  hacen  menos  biodisponible  para  la  interacción  con  sus receptores, en especial el NMDA. Múltiples evidencias  soportan  la  participación  de  la  vía  postsináptica  receptor  NMDA‐NO‐GMPc  en  el  proceso  de  hiperexcitabilidad  del  CDE  que  promueve  el  establecimiento  de  los  estados  dolorosos  crónicos  (Gao  et  al.,  2005,  Xu  et  al.,  2007).  Además,  se  ha  podido  demostrar  el  decrecimiento  de  la  muerte  celular  inducida  por  glutamato  en  cultivo  de  de  concentraciones  neuronas,  en  presencia  submicromolares  de  MF,  las  cuales  atenuaron  la  entrada  2+ de  Ca   mediada  por  receptores,  el  estrés  oxidativo  y  la  apoptosis  (Gottlieb  et  al.,  2006).  MF  disminuyó  la  generación  de  ERO  y  la  pérdida  neuronal  en  células  de  hipocampo CA1 de ratas que fueron sometidas a isquemia.  Las  ratas  con  isquemia  y  tratadas  con  MF  tuvieron  significativamente mejor comportamiento en tres pruebas  de conducta dependientes de hipocampo en comparación  con  las  ratas  isquémicas  no  tratadas.  En  estos  estudios  (Ibarretxe  et  al.,  2006),  se  utilizaron  concentraciones  nanomolares de MF, las que protegieron de forma parcial a  los oligodendrocitos; así como a las neuronas corticales de  un  daño  mediano,  pero  no  de  uno  intenso  mediado  por  receptores  AMPA  (alfa‐amino‐3‐hidroxi‐5‐metilisoxazol‐4‐ propionato). Además, MF atenuó la sobrecarga intracelular  2+ de  Ca   subsiguiente  a  la  activación  de  los  receptores  AMPA,  un  mecanismo  que  puede  contribuir  a  sus  propiedades neuroprotectoras.    La  Figura  4  resume  los  posibles  blancos  moleculares  de  acción del ECAM sobre el evento nociceptivo.    ACTIVIDAD ANTI‐ALÉRGICA   

En  un  modelo  preclínico  de  alergia  inducida  por  un  nemátodo (Trichinellas spiralis) en ratones se demostró el  efecto  antialérgico  y  antihelmíntico  del  ECAM  y  la  MF,  la  reducción en suero de los anticuerpos IgE específicos, y la  actividad inhibitoria sobre la desgranulación de las células  mastoides, evaluado mediante ensayos de anafilaxia pasiva  cutánea  (García  et  al  2003b).  Otros  estudios  permitieron  comprobar con mayor claridad el efecto del ECAM y la MF,  sobre diferentes parámetros de la respuesta alérgica, como  la producción de IgE, la respuesta anafiláctica, la respuesta  cutánea  al  incremento  de  la  permeabilidad  vascular  inducida  por  histamina  y  OVA,  la  liberación  de  histamina  de  células  mastocitarias,  mediante  un  modelo  de  inflamación  alérgica  inducido  por  ovoalbúmina  (OVA).  Ambos productos demostraron una reducción significativa  del  edema  plantar  en  un  modelo  in  vivo  de  inflamación  alérgica  mediada  por  mastocitos  y  la  proliferación  linfocitaria en respuesta a la OVA en ratones inmunizados.  Tanto ECAM como MF inhibieron la liberación de histamina  inducida por 48/80 en los mastocitos peritoneales de ratas  (García et al., 2006).     Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 71 

 

 

    Figura 4.      Estímulos nociceptivos periféricos

PKA GMPc

Terminación nociceptiva C

cinasa [Ca2+]

AMPc

GMPc AC GLUT GC EP2 ECAM

PLA2

NMDA

Neurona de proyección cuerno dorsal medular ECAM

ECAM

[Ca2+] AA iNOS

PGE2

nNOS COX-2 NO ECAM

    Posibles  blancos  moleculares  susceptibles  al  extracto  de  la  corteza  del  árbol  del  mango  (ECAM)  en  el  dolor  crónico.  ECAM  podría  disminuir  la  liberación  del  glutamato  (Glu)  por  la  terminal  nociceptiva  a  nivel  del  cuerno  dorsal  espinal  (CDE);  inhibir  la  activación  de  la  óxido  nítrico  neuronal  (nNOS)  promovida  por  el  aumento  de  las  concentraciones  del  Ca2+ citosólico generado por la apertura del canal del receptor NMDA que  aumenta  la  magnitud  de  la  despolarización  y  por  la  activación  de  los  receptores NK1 por la sustancia P (SP); activar la guanilato ciclasa, la cual  aumenta  las  concentraciones  de  GMPc,  cierra  canales  de  K+  y  activa  cinasas  dependientes  de  GMPc  que  promueven  la  liberación  de  Glu;  inhibir la activación de la fosfolipasa A2 (PLA2) y la síntesis de metabolitos  del ácido araquidónico (AA), en especial la PGE2 que en estas condiciones  interactúa con receptores EP2 presinápticos que aumentan la actividad de  adenilato  ciclasa  con  la  consiguiente  formación  de  AMPc  que  activa  la  PKA,  dependiente  de  AMPc,  la  cual  también  induce  liberación  de  Glu;  inhibir la síntesis o expresión de citocinas, la iNOS y la COX‐2 mediada por  el  NF‐κB;  e  inhibir  la  activación  de  NF‐κB.  De  esta  manera  ECAM  podría  inhibir  la  respuesta  neuroinmune  y  la  participación  glial  en  la  hiper‐ excitabilidad central. 

    Además, con el objetivo de estudiar los efectos del ECAM y  la  MF  sobre  la  respuesta  a  la  inflamación  pulmonar  y  la  producción  de  citocinas  Th2  se  desarrolló  un  modelo  de  asma  alérgica  inducida  por  OVA  en  ratones  (García‐Rivera  et  al.,  2011).  Tanto  ECAM  como  MF  produjeron  una  marcada  reducción  de  la  inflamación  de  las  vías  aéreas  alrededor  de  los  vasos  y  los  bronquios,  inhibieron  las  citocinas  IL‐4  e  IL‐5  en  el  fluido  broncoalveolar,  las  concentraciones de IgE y la proliferación de linfocitos.   Estos  resultados  experimentales  demostraron  las  propiedades  antialérgicas  del  ECAM  y  la  MF,  como 

  consecuencia  de  la  inhibición  de  mediadores  como  la  IgE,  la  histamina  y  de  la  capacidad  de  los  linfocitos  B  y  T  para  contribuir a la respuesta alérgica.     EFECTOS PROTECTORES SOBRE LA MOLÉCULA DE ADN  (ESTUDIOS DE ANTIMUTAGÉNESIS Y  ANTIGENOTOXICIDAD)    El potencial antimutagénico de ECAM fue realizado tanto in  vitro  como  ex  vivo  mediante  el  ensayo  de  Ames.  En  el  ensayo  in  vitro  se  evaluó  la  protección  del  ECAM  frente  a  diferentes  compuestos  con  reconocida  actividad  mutagénica.  Por  otro  lado,  en  el  estudio  ex  vivo  los  animales fueron tratados durante 30 días con dosis orales  del  ECAM  y,  a  partir  de  estos  animales,  se  obtuvo  la  fracción  microsomal  hepática  empleada  como  activador  metabólico  en  el  ensayo  de  Ames  (Morffi  et  al.,  2012).  Como  resultado  de  estos  estudios  se  demostró  que  el  ECAM  presentó  actividad  antimutagénica  frente  a  diferentes mutágenos a los cuales se expone comúnmente  el  hombre  (bleomicina,  ciclofosfamida,  mitomicina  C,  cisplatino,  dimetilnitrosamina,  benzo(a)pireno,  2‐ acetilaminofluoreno,  azida  sódica,  ácido  picrolínico  y  1‐ nitropireno).  Además,  el  ECAM  inhibió  la  actividad  microsomal  de  CYP1A1,  por  lo  que  los  autores  manifestaron  que,  además  de  la  potente  actividad  antioxidante que presenta el extracto, éste pudiera ejercer  su  efecto  quimiopreventivo  debido  a  su  capacidad  de  inhibir  la  actividad  de  algunas  isoformas  del  citocromo  P450. Además, en un estudio in vivo en el que se evaluaron  los efectos de ECAM sobre el daño al ADN inducido por la  bleomicina  (Ensayo  Cometa)  en  ratones  NMRI,  se  demostró  que  la  administración  del  ECAM  durante  siete  días  protegió  del  daño  primario  al  ADN  (Cancino  et  al.,  2001).    El  efecto  radioprotector  del  ECAM  frente  a  la  radiación  gamma  también  ha  sido  evaluado  (Rosario‐Fernández  et  al.,  2010).  En  esta  ocasión  se  utilizó  el  ensayo  bacteriano  SOS  Chromotest  (dosis  de  radiación  de  150  Gy),  así  como  se evaluó la peroxidación lipídica y la actividad enzimática  mitocondrial en eritrocitos (dosis de radiación 250 Gy), que  son  las  células  más  afectadas  durante  las  sesiones  de  radioterapia.  El  ensayo  SOS  Chromotest  indicó  que  el  extracto no fue genotóxico en presencia o no de activación  metabólica.  Además,  se  determinó  que  el  ECAM  presenta  actividad  radioprotectora  del  material  genético.  Los  autores afirmaron que estos resultados demuestran que el  extracto  es  capaz  de  proteger  la  estructura  celular  de  los  daños  inducidos  por  la  radiación  gamma  a  varios  niveles:  material  nuclear,  membranas  celulares  y  sistemas  enzimáticos  mitocondriales.  Posiblemente,  la  MF  sea  la  responsable  de  la  radioprotección  demostrada  por  el  extracto,  por  lo  que  se  diseñó  un  estudio  en  el  que  los  ratones  se  trataron  con  diferentes  dosis  de  MF,  una  hora  antes de la administración de 10 Gy de radiaciones gamma.    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 72 

 

 

    La  xantona  redujo  los  síntomas  de  la  enfermedad  por  irradiación  y  demoró  la  aparición  de  la  mortalidad  comparado con el grupo no tratado e irradiado (Jagetia &  Baliga,  2005).  La  acción  radioprotectora  de  la  MF  se  incrementó  de  manera  dependiente  de  la  dosis  hasta  2  mg/kg  y  declinó  posteriormente  hasta  100  mg/kg  (dosis  máxima  utilizada).  También  se  calculó  la  dosis  letal  50  (DL50) para este polifenol, la cual alcanzó los 400 mg/kg p.c.  De esta forma MF protegió a los ratones de la enfermedad  y  la  muerte  inducidas  por  irradiación  con  una  dosis  protectiva óptima de 2 mg/kg, la cual constituyó 1/200 de  la DL50. Asimismo, MF ha sido estudiada por su  capacidad  para  reducir  la  frecuencia  de  células  binucleadas‐ micronucleadas  inducidas  por  radiación  en  linfocitos  de  sangre  periférica  humana  (Jagetia  &  Venkatesha,  2005).  MF elevó, de forma significativa, el índice de proliferación  de  las  células  irradiadas  y  redujo  la  peroxidación  lipídica  inducida  por  H2O2  de  modo  dependiente  de  la  concentración. De la misma manera, en un sistema libre de  células,  MF  inhibió  la  inducción  de  los  radicales  hidroxilo,  superóxido, DPPH y ABTS. Por tanto, se demostró que MF  posee propiedades radioprotectoras al suprimir los efectos  de  los  radicales  libres  que  se  inducen  durante  las  radiaciones.    Por  otra  parte,  el  arsénico  (As)  altera  múltiples  vías  celulares  que  incluyen  la  expresión  de  factores  de  crecimiento, la supresión de proteínas checkpoint del ciclo  celular, promoción y resistencia a la apoptosis, la inhibición  de la reparación del ADN, las alteraciones en la metilación  del ADN, disminución de la inmunovigilancia, y el aumento  de  estrés  oxidativo,  por  la  alteración  del  equilibrio  prooxidante‐antioxidante (Flora, 2011).     Teniendo  en  cuenta  las  acciones  demostradas  tanto  para  ECAM  como  MF,  sobre  el  estrés  oxidativo  y  su  posible  protección  contra  el  daño  inducido  por  As,  se  diseñó  un  estudio  en  el  que  fueron  analizados  los  posibles  efectos  protectores  del  extracto  y  algunos  de  sus  derivados  fenólicos  (ácido  gálico,  catequina,  quercetina  y  MF)  sobre  la  citotoxicidad  inducida  por  arsénico  (As3+)  en  la  línea  celular de túbulo proximal renal HK‐2 (Garrido et al., 2012).  3+ En  células  cultivadas  durante  24  h  en  presencia  de  As ,  ocurrió  una  pérdida  de  la  viabilidad  celular,  dependiente  de la concentración, que fue significativamente recuperada  por  ECAM,  seguido  de  ácido  gálico,  catequina  y  MF.  El  3+ complejo  MF‐Fe   demostró  ser  más  eficaz  ante  dicha  problemática  que  MF  sola.  Tanto  ECAM  como  los  fenoles  aumentaron  significativamente  la  fracción  de  células  supervivientes.  En  las  células  pretratadas  con  ECAM  o  fenoles  durante  72  h,  la  protección  conferida  por  ECAM  resultó  disminuida  en  comparación  con  los  experimentos  más cortos (24 h). Las células pretratadas con una cantidad  sub‐citotóxica  de  As3+  o  cultivadas  en  presencia  continua  de  baja  concentración  de  MF  demostraron  ser  más  3+ resistentes  a  As   y  mostraron  un  incremento  tanto  en  la 

  cantidad de P‐gp como del ARNm de ABCB1, mientras que  las células cultivadas en presencia de albúmina resultaron  más  sensible.  Los  autores  manifiestan  que,  debido  a  que  todos los cambios anteriores comparten condiciones con la  expresión‐actividad  de  glicoproteína  P  (P‐gp),  un  transportador potencialmente implicado en la resistencia a  arsénico, la capacidad de ECAM y sus fenoles para modular  3+ la citotoxicidad inducida por As  sería, al menos en parte,  dependiente de sus interacciones con P‐gp.     ACTIVIDAD ANTICANCERÍGENA    Existen  reportes  en  la  literatura  relacionados  con  la  actividad  anticancerígena  de  extractos  de  mango  que  demuestran  especificidad  celular,  aunque  pocos  que  relacionen  al  ECAM  con  esta  actividad  a  pesar  que  el  extracto  se  utiliza  en  Cuba,  desde  el  punto  de  vista  etnomédico,  para  el  tratamiento  del  cáncer  (Guevara‐ García  et  al.,  2004).  Una  posible  validación  de  este  uso  la  ha  realizado  un  grupo  de  investigadores  (Delgado‐ Hernández et al., 2012) que evaluaron tanto al ECAM como  a  la  MF  en  modelos  de  angiogénesis,  teniendo  en  cuenta  que  los  procesos  angiogénicos  son  esenciales  para  el  crecimiento  y  la  proliferación  tumoral  (De  la  Vega  et  al.,  2012).  ECAM  y  MF  se  evaluaron  en  dos  ensayos  antiproliferativos de células endoteliales y tres modelos in  vitro  de  angiogénesis  humana  como  son  los  explantes  de  vasos  sanguíneos  de  placenta  humana,  el  gel  sobre  gel  (gel‐over‐gel, tipo sándwich) y ensayos en Matrigel. Tanto  el  extracto  como  la  xantona  inhibieron  la  formación  de  tubos capilares en los dos primeros ensayos, mientras que  MF  abolió  la  neovascularización  en  el  ensayo  tipo  sándwich.  Ambos  productos  redujeron  la  producción  de  TNFα  y  la  angiogénesis  inducida  en  células  B16F10  en  un  modelo de angiogénesis inducida en Matrigel en ratones.     Por  otra  parte,  otros  extractos  de  mango  han  mostrado  protección contra cáncer de próstata en modelos in vivo e  in vitro (Prasad et al, 2008) e inhibición del ciclo celular en  la  fase  G0/G1  de  células  HL‐60  (Percival  et  al.,  2006),  mientras  que  no  han  sido  efectivos  contra  células  de  cáncer  de  mama  MCF‐7  (García‐Solís  et  al.,  2009).  Posiblemente, la MF o el lupeol (triterpeno), presentes en  estos extractos, sean los responsables de esta actividad. La  MF  ha  mostrado  protección  contra  cáncer  de  pulmón  inducido  por  benzo(a)pireno  en  ratones  (Rajendran  et  al.,  2008b), lo que podría estar relacionado con la inducción de  la  permeabilidad  mitocondrial  (Pardo‐Andreu  et  al.,  2006c). Por otra parte, en un estudio a corto plazo, la MF  administrada  en  la  dieta  de  las  ratas  inhibió  el  desarrollo  de  lesiones  pre‐neoplásicas  inducidas  por  el  carcinógeno  azoximetano  (Yoshimi  et  al.,  2001).  En  un  estudio  a  largo  plazo  tuvo  baja  incidencia  sobre  la  multiplicidad  de  la  neoplasia  intestinal  inducida  por  dicho  carcinógeno.  Además, la proliferación celular en la mucosa del colon fue  reducida  en  las  ratas  tratadas  con  esta  xantona.  Estos    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 73 

 

 

    experimentos  sugieren  que  MF  constituye  un  potencial  agente quimiopreventivo.    En  otros  estudios,  MF  tuvo  una  actividad  inhibitoria  del  crecimiento  de  fibrosarcoma  ascítico  en  ratones  (Guha  et  al.,  1996).  Mediante  tratamientos  con  MF,  tanto  in  vivo  como  in  vitro,  aumentó  la  citotoxicidad  contra  células  esplénicas  y  macrófagos  de  ratones  normales  y  con  tumores implantados. El tratamiento in vitro con MF de las  células  esplénicas  de  ratones  a  los  que  se  les  implantó  el  tumor aumentó la citotoxicidad de estas células tumorales,  tanto  en  aquellas  sensibles  como  en  las  resistentes  a  células naturales asesinas (NK).     De  la  misma  manera,  la  administración  de  MF  protegió  a  células  N2A  (línea  celular  de  neuroblastoma  murino)  contra  la  citotoxicidad  inducida  por  MPP+  (el  metabolito  activo  de  1‐metil‐4‐fenil‐1,2,3,6‐tetrahidropiridina),  el  cual  induce  síndrome  parkinsoniano  en  animales  y  humanos  a  través de un mecanismo de neurotoxicidad comprometido  con el estrés oxidativo (Amazzal et al., 2007). MF restauró  el contenido de GSH y reguló la expresión del ARNm de la  superóxido dismutasa y la catalasa, por lo que los autores  plantearon  que  la  MF  podría  utilizarse  en  la  terapia  de  enfermedades  neurodegenerativas,  tales  como  el  Parkinson, en las cuales el estrés oxidativo desempeña un  papel crucial.     Por  otra  parte,  los  terpenoides,  como  el  lupeol  y  otros  relacionados también ejercen una variedad de actividades  citotóxicas contra varios tipos de células tumorales como el  melanoma  murino  B16  2F2,  leucemia  HL‐60,  U937,  K562,  melanoma  G36,  carcinoma  de  pulmón  humano  A‐549  y  adenocarcinoma  de  colon  humano  DLD‐1  (Chaturvedi  et  al.,  2008),  así  como  en  modelos  in  vivo  como  la  carcinogénesis  bucal  inducida  por  7,12‐ dimetilbenz(a)antraceno  en  el  cachete  del  hámster  (Palanimuthu  et  al.,  2012).  Probablemente,  el  potencial  quimiopreventivo  del  lupeol  radica  en  su  actividad  antioxidante  y  secuestradora  de  radicales  libres  y  moduladora  de  los  posibles  efectos  sobre  las  enzimas  metabolizadoras de xenobióticos de fases I y II a favor de la  excreción  de  metabolitos  carcinogénicos.  Además,  esta  molécula  es  capaz  de  actuar  sobre  otros  mediadores  moleculares  involucrados  en  esta  patología  como  son:  el  factor NF‐κB, las enzimas glutatión S‐transferasa, glutatión  reductasa, COX‐2, metaloproteinasa de matriz 2 y catalasa,  receptor  andrógeno,  proteína  cinasa  C  alfa,  forma  celular  de la proteína inhibitoria FLICE (cFLIP), receptor de muerte  3 (DR3), entre otros (Siddique & Saleem, 2011).     Por  otra  parte,  los  ácidos  fenólicos  como  el  ácido  gálico,  que  también  se han  reportado  en  los  extractos  de  mango  (Núñez‐Sellés  et  al.,  2002),  han  mostrado  inhibición  del  crecimiento  celular  en  líneas  celulares  humanas  de  esófago,  gástrica,  cérvix,  mama  (MCF‐7),  colon  (HT‐29, 

  Col201) y murinas como Colon 26 (Faried et al., 2007). De  la  misma  forma,  se  sabe  que  los  galotaninos  presentan  actividad contra el cáncer de colon (células T‐84 y HCT‐116)  (Gali‐Mahtasib et al., 2001; Oh et al., 2001; Chen & et al.,  2003;  Chen  &  Lin,  2004;  Al‐Ayyoubi  &  Gali‐Muhtasib,  2007),  células  de  cáncer  de  mama  (MCF‐7),  así  como  en  células T Jurkat (Chen & et al., 2003; Chen & Lin, 2004).    ACTIVIDAD  SOBRE  CITOCROMO  P450  Y  GLICOPROTEÍNA  P. POSIBILIDADES DE INTERACCIÓN CON FÁRMACOS    El metabolismo de los fármacos es el mayor determinante  del  aclaramiento  de  los  medicamentos,  las  diferencias  individuales  en  la  farmacocinética  e,  indirectamente,  la  eficacia  clínica  y  la  toxicidad  de  los  fármacos.  La  industria  farmacéutica  está  llamada  a  comercializar  los  fármacos  más  seguros  con  pocos  efectos  adversos,  propiedades  farmacocinéticas predecibles e interacciones cuantificables  fármaco‐fármaco,  fármaco‐producto  herbal  o  fármaco‐ alimento.  El  riesgo  potencial  de  las  interacciones  entre  derivados de plantas y fármacos es de particular interés en  la actualidad, justamente por el incremento del uso de los  primeros.     De esta forma, los hepatocitos representan el modelo más  apropiado  para  la  evaluación  del  metabolismo  integrado  de  fármacos,  productos  herbales  o  alimentos,  las  correlaciones  metabolismo‐toxicidad,  mecanismos  de  hepatotoxicidad y las interacciones (inhibición e inducción)  de  xenobióticos  y  enzimas  que  metabolizan  fármacos.  También son más rentables los estudios del perfil y la tasa  metabólica,  la  identificación  de  los  citocromos  P450  involucrados,  las  interacciones  potenciales  fármaco‐ fármaco  o  el  papel  de  las  enzimas  polimórficas  antes  del  inicio de los ensayos clínicos (Gómez‐Lechón et al., 2010).    Estudios  recientes  (Rodeiro  et  al.,  2008a,b)  demostraron  que  la  incubación  del  ECAM  con  las  células  hepáticas  no  modificó la actividad de diferentes citocromos del sistema  del  CYP‐450  (CYP3A,  2E,  2D6,  2B6,  2C9  y  2C19).  Sólo  se  observó  una  inhibición  significativa,  dependiente  de  la  concentración  del  CYP1A1/2,  lo  que  se  puede  considerar  como  un  resultado  que  puede  fundamentar  una  posible  actividad  quimiopreventiva  del  ECAM,  ya  que  este  citocromo ha sido asociado con la activación de diferentes  mutágenos  y  carcinógenos  en  el  organismo.  Además,  el  ECAM  provocó  una  inducción  dos  veces  mayor  de  la  actividad del CYP2B6 en este sistema celular. Mientras que  en  otro  estudio  (Rodeiro  et  al.,  2012)  se  examinaron  los  efectos  del  ECAM  y  la  MF  sobre  varias  enzimas  P450  y  UDP‐glucuronosiltransferasas  (UGTs)  en  hepatocitos  humanos cultivados en el que se observó una disminución,  dependiente  de  la  concentración  de  ambos  productos,  de  la  actividad  de  las  cinco  enzimas  P450  medidas  (CYP1A2,  2A6, 2C9, 2D6 y 3A4). Para todas las actividades se observó  una  reducción  de  al  menos  50%  a  la  concentración  más    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 74 

 

 

    alta  (250  mg/mL).  Además,  el  ECAM  redujo  considerablemente la actividad UGT1A9 (alrededor de 60%  a 250 mg/mL) y tuvo menos efectos sobre las otras UGTs.  En contraste, MF (250 mg/mL) tuvo efectos mayores sobre  UGT1A1 y 2B7 que sobre UGT1A9 (aproximadamente 55%  frente  a  35%  de  reducción,  respectivamente).  La  cuantificación  de  ARNm  específicos  reveló  una  reducción  en  el  contenido  de  ARNm  de  los  CYP3A4  y  3A5,  y  un  aumento  de  los  ARNms  de  CYP1A1,  CYP1A2,  UGT1A1  y  UGT1A9.  No  fueron  observados  efectos  notables  en  las  concentraciones  de  CYP2A6,  2B6,  2C9,  2C19,  2D6  y  2E1.  Los  autores  sugirieron  que  la  actividad  y(o)  expresión  de  las  principales  enzimas  P450  y  UGT  es  modulada  por  el  ECAM y que pudieran surgir interacciones potenciales con  fármacos  después  de  una  ingesta  combinada  de  este  extracto  con  los  fármacos  convencionales.  Por  lo  tanto,  si  bien es cierto que no siempre se manifiestan estas posibles  interacciones cuando se pasa de modelos in vitro a in vivo,  deben ser examinados los riesgos potenciales de seguridad  del ECAM cuando se co‐administre con otros fármacos.     Por  otra  parte,  muchos  compuestos  derivados  de  plantas,  incluyendo  los  polifenoles,  son  capaces  de  afectar  la  función  de  MDR‐1/glicoproteína  P  (P‐gp  ABCB1)  transportador  de  múltiples  fármacos,  lo  que  conduce  a  posibles  interacciones  hierba‐fármaco  (Chieli  &  Romiti,  2008).  Por  ello,  se  realizó  un  estudio  para  evaluar  los  efectos de ECAM y algunos fenoles presentes en él sobre la  actividad  de  P‐gp  en  una  línea  celular  de  túbulo  proximal  HK‐2, en una sub‐línea celular Caco‐2 (seleccionada por su  resistencia  a  vincristina,  Caco‐2/VCR)  y  la  sobreexpresión  de  P‐gp  (Chieli  et  al.,  2009).  Todos  los  compuestos  investigados,  a  excepción  de  catequina  y  ácido  gálico,  inhibieron la actividad de P‐gp en células HK‐2, en el orden  de  mangiferina  <noratiriol 
  el contenido de ARNm de ABCB1 y con la actividad de flujo  de  salida  del  transportador.  El  inhibidor  transcripcional  1‐ d‐ribofuranosilbenzimidazole  (DRB)  inhibió  el  aumento  de  la expresión de ABCB1 inducido por MF, lo que sugiere que  el  aumento  podría  ser  debido  a  la  regulación  transcripcional  del  ARNm  de  ABCB1.  Las  células  tratadas  con  MF,  que  sobreexpresaron  el  transportador,  estaban  protegidas  frente  a  la  citotoxicidad  de  ciclosporina  A,  un  sustrato  conocido  de  la  P‐gp.  El  efecto  protector  también  se  observó  en  las  células  pretratadas  con  ECAM.  Estos  resultados  demuestran  que  ECAM  y  los  polifenoles  presentes en él también pueden interactuar con ABCB1/P‐ gp a nivel de expresión. Estos resultados demostraron, por  primera  vez,  que  ECAM  y  los  polifenoles  presentes  en  el  extracto pueden afectar a la actividad del transportador de  múltiples  fármacos  P‐gp  ABCB1,  lo  que  sugiere  la  posibilidad de interacciones hierba‐fármaco que debían ser  estudiadas  en  profundidad,  fundamentalmente  en  modelos in vivo.    EVIDENCIAS TOXICOLÓGICAS   Estudios de Toxicidad  Estudios,  realizados  en  roedores  (ratas  y  ratones),  demostraron  que  el  ECAM  es  un  producto  que  clasifica  como  No  tóxico  cuando  se  administra  por  dosis  única  por  las vías oral (DL50 > 5000 mg/kg p.c.) y tópica (DL50 > 2000  mg/kg p.c) (Garrido et al., 2009). Mientras que la toxicidad  por dosis única, vía intraperitoneal (i.p.), en ratas permitió  clasificar  al  producto  como  Tóxico,  con  una  toxicidad  diferencial  entre  los  sexos,  de  modo  tal  que  mientras  la  DL50 en las hembras fue de 166,48 mg/kg p.c en los machos  fue  >  500  mg/kg  p.c.,  lo  que  indica  que  las  hembras  son  más  sensibles  al  producto  bajo  estas  condiciones  experimentales. El estudio en ratones demostró que la DL50  para las hembras fue de 273,14 mg/kg y en los machos de  219,67  mg/kg,  sin  mostrar,  en  este  caso,  diferencia  entre  los  sexos.  En  estos  ensayos  los  síntomas  clínicos  detectados  seguidos  a  la  administración  de  ECAM  fueron  consistentes con la clasificación del producto.     Estudios de Genotoxicidad    El  potencial  mutagénico  y  genotóxico  del  ECAM  se  realizó  mediante  una  batería  de  pruebas  que  incluyeron  los  estudios  propuestos  comúnmente  por  las  agencias  nacionales  e  internacionales  para  investigar  los  efectos  tóxicos del producto de ensayo sobre el material genético.  El ECAM fue evaluado en el ensayo de Ames con el empleo  de las cepas TA 1535, TA 1537, TA 1538, TA 98 y TA 100, en  presencia  y  ausencia  de  activación  metabólica,  pero  éste  no  indujo  efecto  mutagénico  hasta  concentraciones  de  5  000 μg/placa, límite máximo de evaluación propuesto para  este ensayo (Rodeiro et al., 2006).    El potencial genotóxico in vivo del ECAM fue determinado  por la administración por vía oral (20 ‐ 2 000 mg/kg p.c.) a    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 75 

 

 

    ratones  NMRI  de  ambos  sexos.  En  este  estudio  de  detección  de  daño  primario  al  ADN  no  existieron  evidencias de toxicidad en el hígado, principal órgano que  ha  sido  demostrado  metaboliza  la  mayoría  de  los  compuestos  presentes  en  el  extracto  como  son  los  polifenoles, los terpenos y los ácidos grasos (Walle, 2004).     A  diferencia  de  lo  observado  in  vitro,  el  ECAM  no  indujo  daño primario al ADN en leucocitos de sangre periférica, ni  en células hepáticas de los animales tratados, a pesar de la  dosis  máxima utilizada,  límite  máximo  aceptado  para  este  tipo  de  ensayos.  Tampoco  se  observaron  efectos  genotóxicos cuando el ECAM se administró por vía i.p. (50 ‐  200  mg/kg),  lo  que  demostró  que  tampoco  induce  daño  primario  al  ADN  en  leucocitos  de  sangre  periférica,  ni  en  células  hepáticas  de  ratones  NMRI  de  ambos  sexos  por  esta  vía  de  administración,  bajo  esas  condiciones  de  ensayo (González et al., 2007).     El  estudio  de  los  efectos  del  ECAM  sobre  la  inducción  de  micronúcleos  fue  realizado  en  linfocitos  humanos  de  sangre  periférica  en  el  que  se  demostró  que  el  extracto  presentó  un  efecto  citotóxico  a  la  concentración  máxima  ensayada (1 500 μg/mL), pero no indujo clastogenicidad en  el rango de concentraciones estudiado (150 ‐ 1 500 μg/mL)  después de 3 y 20 h de exposición, en presencia y ausencia  de activación metabólica, respectivamente (Rodeiro et al.,  2006).    En  los  estudios  realizados  in  vivo  se  corroboró  que  el  ECAM,  administrado  por  vía  oral  produjo  una  ligera  citotoxicidad  a  la  dosis  máxima  evaluada  (2  000  mg/kg  p.c.). Este evento no presentó repercusión clínica para los  animales  en  el  estudio  y  puede  interpretarse  como  un  indicador de evidencias de exposición del órgano diana. Al  analizar la frecuencia de MN no existió relación con la dosis  de ECAM administrada, por lo que es posible afirmar que,  de igual manera que en los ensayos in vitro, el extracto no  indujo clastogenicidad a nivel de la médula ósea de ratones  NMRI,  por  lo  que  el  nivel  de  dosis  al  que  no  se  observan  efectos  adversos  (NOAEL),  bajo  estas  condiciones  de  ensayo,  fue  2  000  mg/kg/día  (González  et  al.,  2007).  En  adición, la administración i.p. de ECAM (50 ‐ 200 mg/kg) a  ratones  NMRI  de  ambos  sexos  indujo  una  citotoxicidad  moderada  sobre  el  proceso  de  eritropoyesis  a  nivel  de  la  médula  ósea,  pero  no  sobre  los  leucocitos  de  sangre  periférica  de  los  animales  tratados  con  el  producto  y  tampoco  indujo  clastogenicidad  en  la médula  ósea,  por  lo  que el NOAEL en este ensayo fue de 200 mg/kg/día.    De  manera  general,  puede  apreciarse  que  no  existe  relación  entre  las  dosis  de  ECAM  administradas  en  los  estudios  realizados  y  la  frecuencia  de  micronúcleos  observada, ni tampoco en la respuesta de daño primario al  ADN  y  el  porcentaje  de  nucleoides  altamente  dañados  en  los  leucocitos  de  los  animales  tratados,  lo  que  soporta  la 

  hipótesis que la inducción de daño primario observada, in  vitro en el ensayo Cometa, pudiera estar relacionada con la  generación  de  H2O2  en  las  condiciones  de  incubación  empleadas.  La  ausencia  de genotoxicidad  in  vivo  coincide,  además,  con  lo  observado  para  otros  polifenoles  como  la  quercetina (Metodiewa et al., 1999) y la estrecha relación  entre el ambiente redox y la actividad genotóxica descrita  para  algunos  polifenoles  (Skibola  &  Smith,  2000;  Collins,  2005).    De  acuerdo  a  estos  resultados,  los  autores  sugirieron  que  el  ECAM  presenta  un  bajo  potencial  mutagénico  y  genotóxico in vitro y no es genotóxico in vivo.    Estudios de Teratogénesis    El  potencial  teratogénico  y(o)  embriotóxico  del  ECAM,  administrado  por  vía  oral,  fue  ensayado  durante  la  organogénesis de ratas Sprague‐Dawley, período de mayor  susceptibilidad para la producción de perturbaciones en la  morfogénesis normal de los órganos y tejidos del embrión.  El  ECAM  no  produjo  muertes  maternas  ni  signos  clínicos  relevantes  en  los  diferentes  grupos  de  tratamiento.  Los  análisis  estadísticos  del  consumo  de  alimentos  y  los  incrementos  de  peso  materno  durante  la  gestación  no  evidenciaron  diferencias  significativas  entre  los  animales  del  grupo  control  y  los  administrados  con  ECAM.  En  relación  con  los  efectos  del  extracto  sobre  el  desarrollo  embrionario,  no  se  obtuvo  un  incremento  de  las  muertes  en  útero,  retardo  en  el  crecimiento,  ni  teratogenicidad.  El  número de madres con fetos no viables y el tamaño de la  camada  no  mostraron  diferencias  estadísticamente  significativas  entre  las  madres  administradas  con  ECAM  y  las  controles.  Tampoco  las  pérdidas  post‐implantación  (reabsorciones  embrionarias  como  las  muertes  fetales)  ni  el  peso  de  los  fetos  difirieron  de  forma  significativa  entre  esos  grupos.  El  análisis  de  los  esqueletos  no  evidenció  malformaciones  en  el  grupo  de  control,  ni  en  los  grupos  tratados  (González  et  al.,  2007).  De  acuerdo  a  estos  resultados,  el  ECAM  no  es  un  agente  inductor  de  aberraciones  cromosómicas  que  no  provoca  alteraciones  en la división celular, ni  inducción de apoptosis a un nivel  tal  que  cause  embriotoxicidad  en  las  condiciones  experimentales  expuestas,  por  lo  que  su  NOAEL  fue  de  2  000 mg/kg/día.    En  estos  estudios  el  ECAM  presentó  un  bajo  potencial  teratogénico;  sin  embrago,  es  necesario  enfatizar  que  la  demostración  de  la  inocuidad  de  un  producto  sobre  el  proceso de la reproducción involucra no sólo la evaluación  de su potencial teratogénico, también involucra el estudio  de sus posibles efectos sobre otros indicadores como son:  el  ciclo  estral,  la  conducta  en  el  apareo,  la  fertilidad,  y  el  desarrollo  pre  y  postnatal  de  las  crías  (incluidos  los  estudios  sobre  la  descendencia)  y  una  evaluación  de  su  función  reproductora,  lo  que  permitiría,  unido  a  sus    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 76 

 

 

 

    propiedades  farmacológicas,  definir  su  posible  utilización  en mujeres gestantes y niños.    Otros estudios toxicológicos    Los  estudios  de  irritabilidad,  tanto  del  ECAM  como  de  las  formulaciones  Vimang®,  demostraron  que  se  está  en  presencia  de  un  producto  que  clasifica  como  No  Irritante  por vía oral, tópica, rectal, vaginal y ocular (Garrido et al.,  2009).  El  resumen  de  los  resultados  de  los  estudios  toxicológicos realizados al ECAM se muestra en la Figura 5.    EVIDENCIAS DE FARMACOLOGÍA CLÍNICA  

humanas asociadas al estrés oxidativo, inflamación y dolor,  sustentada  por  modelos  in  vitro  e  in  vivo,  así  como  del  conocimiento  el  perfil  toxicológico  del  extracto,  se  reportan también los estudios sobre la tecnología química  (Acosta‐Esquijarosa et al., 2009a,b, 2010; Nuevas‐Paz et al.,  2012)  y  farmacéutica  (Arús‐Pampin  et  al.,  2003;  Lemus‐ Rodríguez et al., 2006) que no sólo facilitaron la realización  de los ensayos anteriores, también permitieron obtener las  diferentes  formulaciones  que  se  usarían  en  la  realización  de los estudios clínicos (Núñez‐Selles et al., 2007c).  Ensayo  clínico  aleatorizado,  a  doble  ciego,  para  medir  el  efecto sobre los indicadores séricos de estrés oxidativo y  la  calidad  de  vida  en  el  adulto  mayor  en  la  Atención  Primaria de Salud.  

Teniendo en cuenta la efectividad demostrada por el ECAM  en  el  tratamiento  y(o)  prevención  de  enfermedades  El  objetivo  del  estudio  (Pardo‐Andreu  et  al.,  2006d)  fue  evaluar  la  mejoría  de  la  calidad  de  vida  mediante  la  ® suplementación  con  Vimang   en  el  Adulto  Mayor  en  la  Atención Primaria de Salud, de forma ambulatoria, para lo  cual  se  incluyeron  31  adultos  mayores  de  65  años,  aparentemente  sanos  (Grupo  1),  de  forma  aleatorizada,  a  ® los cuales se les suministró Vimang  (tableta, 300 mg, tres  veces  al  día)  y  se  controlaron  siete  parámetros  del  estrés  oxidativo: la capacidad total antioxidante sérica (CTA), GSH  (peroxidasa, reducido y total), sustancias reactivas al ácido  tiobarbitúrico  (TBARS),  superóxido  dismutasa  (SOD)  y  potencial  de  peroxidación  (PP).  Los  resultados  de  la 

evolución  del  estrés  oxidativo  en  este  grupo  se  compararon  con  los  de  un  grupo  de  30  adultos  no  ® suplementados  con  Vimang   (Grupo  2)  y  un  grupo  de  30  jóvenes sanos (Grupo 3), con edades entre 25 y 30 años a  quienes  se  le  realizaron  las  mismas  determinaciones.  Al  Grupo  1  se  le  aplicó  el  Cuestionario  de  Salud  SF‐36,  validado  internacionalmente  para  evaluar  la  calidad  de  vida,  que  contempla  nueve  funciones:  Función  física,  Rol  físico,  Rol  social,  Dolor  corporal,  Salud  general,  Vitalidad,  Rol  emocional  y  Salud  mental.  Las  determinaciones  se  realizaron  a  los  tiempos  cero  (inicio  del  ensayo),  15,  30  y  60 (final del ensayo) días.   Figura 5.   

9 N O T Ó X IC O (o r a l y tó p ic a ) 9 T Ó X IC O (i.p ) (ra ta s y ra to n e s )

9 N O T Ó X IC O (o r a l, 9 0 d ía s , r a ta s ) D o s is 2 0 0 0 m g /k g

9 N O T Ó X IC O (o r a l, 1 8 0 d ía s , r a ta s ) D o s is 2 0 0 0 m g /k g

S U B -C R Ó N IC O S

C R Ó N IC O S

AGUDOS

ECAM IR R IT A B IL ID A D

T E R A T O G É N E S IS G E N O T O X IC ID A D 9 N O T E R A T O G É N IC O (o r a l, r a ta s ) D o s is 2 0 0 0 m g /k g

9 N O G E N O T Ó X IC O in v iv o (o r a l, i.p ., r a to n e s ) D o s is 1 5 0 m g /k g (i.p .) 2 0 0 0 m g /k g (o r a l)

9

9 N O IR R IT A N T E (p ie l, r e c to y o jo s ) IR R IT A B IL ID A D M ÍN IM A (v a g in a ) C o n e jo s

  Resumen de los estudios toxicológicos realizados al extracto de la corteza del árbol del mango (ECAM). 

 

    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 77 

 

 

La suplementación con Vimang® modificó en el Grupo 1, de  forma  significativa,  cuatro  de  los  siete  marcadores  del  estrés oxidativo evaluados, al ser comparados con el grupo  control  (Grupo  2)  no  suplementado  con  Vimang®  a  los  60  días  de  tratamiento:  incrementó  la  actividad  de  la  SOD  extracelular  y  la  CTA;  al  mismo  tiempo  redujo  las  concentraciones  de  TBARS  y  de  glutatión  oxidado  (GSSG).  Fue  significativo  que  los  valores  de  esos  marcadores  del  estrés oxidativo en el grupo tratado alcanzaron los mismos  valores que el Grupo 3 (jóvenes entre 25 y 30 años).    Con  relación  a  la  evaluación  de  la  calidad  de  vida,  la  ® suplementación con Vimang  mejoró la autopercepción de  la  salud  en  los  adultos  tratados  en  ocho  de  los  nueve  parámetros  evaluados  del  Cuestionario  SF‐36.  Lo  más  significativo  de  esta  evaluación  fue  la  mejoría  en  el  parámetro  “Dolor  corporal”.  Dicho  parámetro  fue  el  primero  que  mostró  una  diferencia  significativa,  a  los  15  días de iniciado el tratamiento, y tuvo la mayor diferencia  al final del ensayo de todos los parámetros evaluados. Sólo  un parámetro del Cuestionario SF‐36 (“Rol emocional”) no  mostró  una  diferencia  significativa  al  término  del  estudio.  Los  autores  manifestaron  que  la  reducción  del  estrés  oxidativo en el adulto mayor, mediante la suplementación  con  Vimang®  implicó  una  mejoría  de  la  calidad  de  vida,  reflejado, sobre todo, en el alivio de los dolores corporales,  una mayor autopercepción de mejoría en el estado general  de salud y un desempeño superior de la actividad física.    Ensayo  clínico  aleatorizado,  a  doble  ciego  y  controlado,  para  determinar  el  efecto  sobre  marcadores  de  estrés  oxidativo y la progresión de la enfermedad VIH‐SIDA      El  objetivo  de  este  estudio  fue  evaluar  la  evolución  del  estrés  oxidativo  en  pacientes  seropositivos  VIH  en  condiciones de atención sanatorial y dieta controlada y su  efecto  en  la  progresión  de  los  marcadores  inmunológicos  de la enfermedad y la evolución clínica de los pacientes (Gil  del  Valle  et  al.,  2002;  Pérez  et  al.,  2003).  Para  ello,  se  diseñó  un  ensayo  clínico  aleatorizado,  a  doble  ciego  y  controlado,  en  el  que  se  evaluó  el  efecto  de  las  tabletas  Vimang®  (ocho  tabletas  de  300  mg,  diarias  durante  seis  meses) vs. placebo. Al finalizar el ensayo se pudo evaluar el  comportamiento  de  68  sujetos:  36  suplementados  con  tabletas Vimang® y 32 que recibieron placebo en los que se  evaluaron  variables  de  estrés  oxidativo,  hemoquímicas,  inmunológicas  y  nutricionales.  Estos  resultados  se  compararon  con  los  obtenidos  para  un  grupo  de  seronegativos (28 sujetos).    ® El  grupo  suplementado  con  las  tabletas  Vimang   tuvo  un  incremento  en  plasma  de  TAS  (Total  Antioxidant  Status),  GSH y GPx y una reducción en el potencial de peroxidación,  MDA,  hidroperóxidos  totales  en  plasma,  porcentaje  de  fragmentación  del  ADN  y  SOD.  Todas  estas  variables  tuvieron  una  diferencia  estadísticamente  significativa 

 

   

respecto  al  grupo  placebo.  La  mejoría  en  el  estado  redox  en el grupo suplementado con Vimang® fue del 56,3% con  relación  al  3,7%  del  grupo  placebo.  No  hubo  diferencias  significativas  en  las  variables  hemoquímicas  y  no  se  observaron  efectos  tóxicos  a  nivel  plasmático,  renal,  ni  hepático. De las siete variables estudiadas, tres mostraron  tendencia  a  la  disminución:  eritrosedimentación,  transaminasa  y  ácido  úrico.  Tampoco  se  detectaron  diferencias  significativas  entre  el  conteo  de  CD4  y  CD8/CD38  del  grupo  tratado  respecto  al  grupo  placebo  y  hubo  una  tendencia  hacia  la  reducción  en  el  receptor  de  CD95,  aunque  no  se  observó  diferencia  estadísticamente  significativa (p=0,08).    En este ensayo, la dieta fue controlada y monitoreada para  ambos grupos. El índice nutricional de la ingesta de macro  y micronutrientes durante el período de ensayo no mostró  diferencias  significativas  entre  los  grupos.  El  aporte  de  nutrientes  dentro  de  la  dieta  se  mantuvo  estable  durante  el  tiempo  del  estudio,  por  lo  que  los  autores  aseguraron  que  los  resultados  sólo  se  pueden  adscribir  al  efecto  del  tratamiento. Estos no detectaron reacciones adversas en el  grupo suplementado con las tabletas Vimang®.     Reporte de casos en asma bronquial   

Estudios recientes han mostrado evidencias de que las ERO  producidas  por  las  células  inflamatorias  de  las  vías  aéreas  desempeñan un papel esencial en la patogénesis del asma  bronquial (Nadeem et al., 2003) y que decrece la capacidad  endógena  antioxidante  en  pacientes  con  esta  patología  (Bowler  &  Crapo,  2002).  Por  lo  tanto,  se  administraron  cápsulas  Vimang®  (300  mg,  tres  veces  al  día  antes  de  las  comidas, durante 12 semanas) a dos pacientes con grados  de  asma  diferentes  (Álvarez‐León  et  al.,  2009).  El  diagnóstico se estableció mediante interrogatorio, examen  físico  y  confirmado  por  pruebas  de  ayuda  en  las  que  se  demostró  la  presencia  de  obstrucción  bronquial  por  espirometría  basada  en  el  cumplimiento  del  criterio  de  FEV1/FVC  <  80%.  El  paciente  I  (femenina,  39  años)  se  diagnosticó como asma moderada persistente y el paciente  II  (masculino,  43  años)  se  diagnosticó  como  asma  severa  persistente. A estos pacientes también se les determinaron  inmunoglobulina  E  (IgE)  total  en  suero,  proteína  catiónica  de eosinófilo (ECP) y la actividad de la metaloproteinasa‐9  (MMP‐9) a las 0, 6 y 12 semanas de tratamiento. Se pudo  observar  una  disminución  de  la  actividad  enzimática  de  MMP‐9 de forma proporcional al tiempo de tratamiento en  ambos  pacientes.  Un  comportamiento  similar  se  obtuvo  también  para  la  IgE  y  la  ECP.  Desde  el  punto  de  vista  funcional  se  logró  el  mismo  comportamiento  para  el  volumen  expiratorio  forzado  (FEV1).  Hubo  una  mejoría  clínica evidente, dada por el espaciamiento de los síntomas  diurnos (disnea, opresión torácica y sibilancia) y nocturnos  (tos  y  sibilancia)  a  partir  de  la  tercera  semana  de  tratamiento.  El  paciente  II  no  presentó  síntomas  agudos    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 78 

 

 

    durante el estudio y tuvo necesidad de usar el salbutamol  sólo  dos  veces  (una  vez  a  la  segunda  semana  y  otra  a  la  quinta  semana).  Resultó  significativo  que  ninguno  de  los  dos pacientes consumió esteroides durante las 12 semanas  de tratamiento.     Estudio  piloto  para  determinar  la  eficacia  en  el  tratamiento  de  afecciones  dermatológicas  de  alta  incidencia en la Atención Primaria de Salud    La piel, como órgano, no escapa a la acción deletérea que  pueden ejercer las ERO a nivel subcelular, celular y tisular,  cuando  por  la  presencia  de  patógenos  o  por  alteraciones  de su fisiología, se rompe el equilibrio redox, toda vez que  existe una íntima relación entre los procesos inflamatorios  crónicos o agudos, el envejecimiento, el estrés oxidativo y  la  protección  que  ejercen  los  polifenoles  (Afaq  &  Katiyar,  2011).    Teniendo  en  cuenta  estos  antecedentes,  se  estudió  la  evolución  clínica  de  345  pacientes  portadores  de  afecciones  dermatológicas,  atendidos  en  la  Atención  Primaria  (Guevara  et  al.,  2007)  los  que  usaron  la  crema  Vimang®  1,2%,  tres  veces  al  día,  en  las  zonas  lesionadas,  con el fin de conocer datos que permitieran un diseño más  adecuado  y  establecer  su  viabilidad  en  afecciones  dermatológicas de alta frecuencia.     En este estudio se siguió la evolución de 158 pacientes con  patologías  de  etiología  micótica.  De  ellos,  66  pacientes  presentaron  pitiriasis  versicolor,  34  otras  variedades  de  epidermofitosis,  fundamentalmente  en  los  pies;  34  presentaron intertrigo y 24 otras micosis que afectaban la  piel y las mucosas ótica, nasal, bucal, vaginal o rectal.     La evolución de las micosis, en general, tuvo una tendencia  significativa en el 39,2% de los pacientes hacia la Remisión  Completa (RC, desaparición de los síntomas y signos de la  enfermedad  en  el  curso  del  tratamiento,  remisión  completa de la crisis en el caso de afecciones crónicas) y en  el  52,2%  de  ellos  Remisión  Parcial  (RP,  alivio  significativo  de  los  síntomas  y  signos  de  la  enfermedad  con  reducción  en más de un 70% de la extensión de las lesiones o regreso  de los signos y síntomas a niveles inferiores a los del inicio  de la consulta, en el caso de las afecciones crónicas), frente  a un 9% de casos en que la afección tuvo una No Remisión  (NR,  mantenimiento  de  los  signos  y  síntomas  de  la  enfermedad iguales a los existentes al inicio de la consulta  o  reducción  de  la  extensión  de  las  lesiones  en  menos  del  70%).  Cada  patología  en  particular  evolucionó  con  la  misma  tendencia  hacia  la  RC  o  RP.  Este  resultado  podría  atribuirse al efecto anti‐inflamatorio de la crema Vimang®.  Las  atopias  y  el  eczema,  como  reacciones  de  hipersensibilidad, tuvieron una tendencia hacia la RC en no  más de tres meses y sólo pocos casos evolucionaron hacia  la  cronicidad.  En  este  estudio,  también  se  siguieron  35 

  pacientes con dermatitis atópica, de los cuales 22 tuvieron  ® RP,  10  RC  y  3  NR  con  el  empleo  de  la  crema  Vimang .  Además,  de  los  21  pacientes  con  psoriasis  15  evolucionaron hacia una RP y de 10 pacientes con eczema,  cinco evolucionaron hacia la RC. De modo general, el 59,1%  de los pacientes con patologías dermatológicas de etiología  inmunológica  evolucionó  hacia  la  RP,  el  30,3%  evolucionó  hacia  la  RC  y  el  10,5%  NR,  lo  cual  se  corresponde  con  las  tendencias  publicadas  acerca  de  la  evolución  de  estas  patologías  con  el  uso  de  esteroides.  Existe,  por  tanto,  la  posibilidad  de  reducir  o  evitar  el  empleo  de  corticoesteroides  en  estas  patologías,  con  un  efecto  económico  y  social  muy  beneficioso,  por  los  efectos  colaterales de este tipo de medicamentos.     Por  otra  parte,  en  27  pacientes  con  acné  juvenil,  17  presentaron RP y 7 RC, para un 100% de mejoría en plazos  de tratamiento que oscilaron entre los 25 y 60 días. De los  10 pacientes con piodermitis, cinco evolucionaron hacia RP  y  cuatro  hacia  RC,  para  un  90%  de  mejoría  en  esta  patología.  Todos  los  pacientes  con  Herpes  simplex  y  Herpes  zoster  remitieron  parcial  o  totalmente  la  enfermedad.  Esto  corrobora  resultados  anteriores  en  los  que se demostró in vitro (Carballo et al., 2002), la actividad  anti‐viral del ECAM frente al Herpes simplex tipo 1 (HSV‐1),  no  así  para  el  tipo  2  (HSV‐2),  así  como  la  evolución  satisfactoria  registrada  en  un  reporte  de  caso  de  una  paciente con Herpes zoster (Álvarez et al., 2002).     En  general,  de  49  pacientes  con  afecciones  de  origen  bacteriano o viral, el 63,3% evolucionó hacia RP y el 30,6%  hacia RC, lo cual resultó elevado de forma significativa.  En  los  trastornos  de  la  pigmentación,  las  arrugas  y  las  quemaduras  se  observó  una  evolución  favorable  hacia  la  RP  o  RC  de  las  lesiones  hipercrómicas  e  hipocrómicas  (incluyendo  el  cloasma),  en  las  que  el  origen  es  muy  diverso y no existe medicación específica. En el caso de las  arrugas, de 18 casos tratados, 15 tuvieron RP y 3 RC.     De  los  345  casos  comprendidos  en  este  estudio  el  52,5%  evolucionó hacia la RP, el 39,7% hacia la RC y el 7,8% NR.  Los  efectos  adversos  por  la  utilización  de  la  crema  fueron  escasos  y  fundamentalmente  se  manifestaron  en  piel  dañada.    Los  autores  consideraron  importante  señalar  que  la  terapéutica anti‐inflamatoria y antioxidante es inespecífica  de  estas  patologías  y  puede  accionar  de  modo  facilitador  sobre  su  evolución,  por  lo  que  los  resultados  expuestos  deben  ser  interpretados  en  el  sentido  de  confirmar  el  importante sustrato inflamatorio y de estrés oxidativo que  puede  existir  en  cualquier  afección  dermatológica  o  no,  con independencia de su etiología.   

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    Reporte y serie de casos en el tratamiento del dolor    Hay  algunas  evidencias  que  involucran  a  TNFα  en  la  sensibilización  central  (Garrido‐Suárez  et  al.,  2010).  Las  concentraciones  de  esta  citocina  pro‐inflamatoria  aumentan  exponencialmente  después  de  una  lesión  del  nervio  y  su  aplicación  intra‐ciática  en  ratas  produce  descargas ectópicas en fibras C y Aβ, además, anticuerpos  neutralizantes  anti‐TNFα  o  inhibidores  de  la  síntesis  de  TNFα  alivian  el  dolor  neuropático  en  la  lesión  de  constricción  crónica  y  modelos  de  ligadura  del  nervio  siático (Zelenka et al., 2005).  Por  otra  parte,  los  ensayos  clínicos  han  comenzado  a  demostrar que la inhibición de TNF alivia algunos tipos de  dolor neuropático (Rajkumar et al., 2003). TNFα promueve  la  síntesis  de  la  sustancia  P  (SP),  la  adenosina,  péptidos  relacionados  con  genes  de  la  calcitonina  y  el  factor  de  crecimiento  nervioso  (NGF),  así  como,  modula  genes  implicados en la expresión de otras citocinas (IL‐1, IL‐2, IL ‐ 6,  IL‐8  e  IFNγ)  e  induce  su  síntesis.  También,  IL‐1β  puede  contribuir  indirectamente  al  estado  excitotóxico,  a  través  de la liberación de NO, ERO, eicosanoides y glutamato. Del  mismo modo, se ha reconocido que las ERO, el TNFα y la IL‐ 1  pueden  inducir  daño  por  inhibir  la  capacidad  de  las  células  gliales  para  eliminar  el  glutamato  de  la  hendidura  sináptica (De Leo, et al., 2006). Por tanto, las acciones del  ECAM  y  la  MF  sobre  la  expresión  de  TNFα  e  IL‐1β,  previamente  demostradas  (Garrido  et  al.,  2004b;  Leiro  et  al.,  2004a,b),  podrían  explicar  el  efecto  antialodínico  y  la  disminución  de  la  frecuencia  de  dolor  paroxístico  en  estudios  experimentales  (Álvarez  et  al.,  2002;  Garrido‐ Suárez et al., 2009).    TNFα induce la potenciación a largo plazo de fibras C en el  cuerno  dorsal  espinal  en  ratas  con  daño  de  nervio  y  los  inhibidores  de  NF‐κB  bloquean  este  efecto  (Lin  et  al.,  2007).  NF‐κB  es  expresado  constitutivamente  en  el  cerebro; sin embargo, su expresión se incrementa después  de  una  lesión  de  la  médula  espinal  y  puede  activarse  por  diferentes estímulos como citocinas proinflamatorias, NGF,  PKC  y  glutamato.  También,  NF‐κB  regula  la  expresión  de  varias  proteínas  involucradas  en  la  nocicepción  y  la  plasticidad  neural  tales  como  citocinas  proinflamatorias,  quimiocinas,  iNOS,  COX‐2  y  pro‐dinorfina  (Romano  et  al.,  2006). La dinorfina podría modular la función immune de la  microglia  y  el  astrocito,  así  como  interactuar  con  el  receptos  de  NMDA  en  neuronas  y  producir  alodinia  (Laughlin  et  al.,  2000).  El  NF‐κB  es  también  un  elemento  clave  en  la  regulación  de  los  procesos  inflamatorios  de  células gliales reactivas, su inhibición transgénica atenúa el  dolor y la inflamación después del daño nervioso periferal  (Fu  et  al.,  2010).  Por  tanto,  los  efectos  inhibitorios  del  ECAM,  sobre  la  activación  del  NF‐κB  inducida  por  TNF  (Garrido  et  al.,  2005),  podría  sugerir  un  efecto  antialodínico del extracto. 

  Además,  las  ERO  también  están  involucradas  en  la  sensibilización  central  y  se  ha  supuesto  que  las  concentraciones  elevadas  de  ellas  desempeñan  un  papel  importante  en  la  fosforilación  de  la  subunidad  1  del  receptor NMDA (pNR1), a través de la activación de PKC y  PKA  en  la  médula  espinal  (Kim  et  al.,  2006;  Gao  et  al.,  2007).     Todos  estos  antecedentes,  unidos  a  las  actividades  farmacológicas  demostradas  para  el  ECAM  y  MF  podrían  inferir  una  actividad  analgésica  importante  en  ensayos  clínicos (Garrido‐Suárez et a., 2010). Para ello, se estudió el  caso  de  una  paciente  con  diagnóstico  de  Síndrome  Doloroso  Regional  Complejo  (SDRC)  tipo  II,  secundario  a  una lesión del plexo braquial, con sección del nervio radial  a  nivel  humeral  que  fue provocada  por  el  desplazamiento  de la fractura del húmero izquierdo (Garrido‐Suárez et al.,  2007).  Al  acudir  a  la  consulta,  la  paciente  presentaba  cuatro meses de evolución, con síntomas sensoriales, dolor  persistente  quemante  y  paroxístico,  alodinia  mecánica,  edema, cambios vasomotores hacia la hiperhemia y mano  en  flexión  por  pérdida  de  la  función  motora  de  los  músculos extensores del antebrazo, con el compromiso de  la  articulación  del  carpo  y  hombro  de  limitación  severa  y  dolor  de  valor  5  en  una  escala  numérica  de  Likert.  El  estudio  de  conducción  nerviosa  mostró  alteraciones  mielínico‐axonales  discretas  del  nervio  mediano  y  mielínico‐axonales severas del nervio radial. Se instauró el  tratamiento con Vimang® (2 tabletas de 300 mg, cada 8 h y  aplicación local de crema 1,2%, 3 veces al día) por 4 meses,  asociado  a  los  bloqueos  simpáticos  y  somáticos  para  miembro superior y a la fisioterapia. La evolución clínica y  electrofisiológica  fue  muy  favorable.  Mediante  el  seguimiento  post‐tratamiento,  a  los  dos  meses  del  alta,  después  de  concluir  las  10  sesiones  de  bloqueos  y  el  tratamiento sistémico con Vimang, no se observó edema ni  cambios  de  coloración  en  la  zona  dañada,  mejoró  el  trofismo  de  la  piel,  se  conservó  la  flexo‐extensión  de  los  dedos  y  la  flexo‐extensión  del  carpo  fue  limitada  pero  posible.    Por  otra  parte,  se  determinó  la  actividad  analgésica  de  la  suplementación  con  formulaciones  Vimang®  en  15  pacientes  con  SDRC  y  la  posible  mejoría  de  la  capacidad  funcional  postratamiento  (Garrido‐Suárez  et  al.,  2009).  Para ello, los pacientes recibieron Vimang® tabletas (1 800  mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al día, antes de las  comidas),  crema  (1,2%  en  el  miembro  afectado  3  veces/día)  y  un  bloqueo  simpático  semanal  durante  4  meses.  Se  introdujo  la  fisioterapia  al  mes  de  tratamiento.  Las  variables  evaluadas  fueron  las  puntuaciones  diarias  medias de dolor (PDMD) mediante una escala de Likert, el  área  e  intensidad  de  la  alodinia  mecánica  dinámica,  la  alodinia al frío, somática profunda y la frecuencia del dolor  paroxístico. En los 15 pacientes las PDMD y el resto de las  alteraciones  sensoriales  se  redujeron  significativamente    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 80 

 

 

    desde  la  semana  2‐3  de  comenzado  el  tratamiento  con  respecto  a  los  valores  iniciales.  La  funcionalidad  del  miembro afectado, medida por  la escala de Ennenking et  al. modificada, aumentó desde 22,7 a 78,7%.   Por otra parte, se realizó un estudio de reporte de casos en  el  que  se  determinó  el  efecto  de  las  formulaciones  Vimang®  en  pacientes  con  Herpes  zoster  (Garrido‐Suárez,  et  al.,  2011a).  Los  pacientes  (n=12)  recibieron  tabletas  recubiertas (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces  al  día,  antes  de  las  comidas,  por  30  días)  asociadas  con  bajas  dosis  de  amitriptilina  (10‐25  mg/d)  y  fueron  controladas  las  dosis  de  rescate  del  analgésico  utilizado  (dipirona).  Además  de  las  tabletas,  ellos  utilizaron  compresas  que  contenían  una  dilución  al  2%  de  Vimang®  en  las  lesiones  de  la  piel.  Fueron  determinadas  las  PDMD  mediante  la  escala  de  Likert  y  también  fueron  determinadas  las  variaciones  en  las  dosis  diarias  de  los  fármacos usados concomitantemente. El efecto analgésico  fue observado desde la primera semana en relación con los  parámetros  iniciales  y  ninguno  mostró  neuralgia  post‐ herpética.  También  hubo  una  disminución  significativa  en  la  reducción  de  la  medicación  antidepresiva  y  la  dosis  de  rescate analgésica con respecto a las dosis diarias iniciales.  No fueron reportados eventos adversos.     En  otro  estudio  de  serie  de  casos  (Garrido‐Suárez  et  al.,  2011b)  fueron  analizados  los  efectos  de  tabletas  Vimang®  (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al día, antes  de  las  comidas,  por  120  días)  en  12  pacientes  con  dolor  asociado a zoster (seis con neuralgia herpética subaguda y  seis  con  neuralgia  post‐herpética).  La  terapia  complementaria  consistió  en  bajas  dosis  de  amitriptilina  (10‐25  mg/día)  y  crema  Vimang®  1,2%  aplicada  tópicamente.  En  este  estudio  se  registraron  las  PDMD  a  través  de  la  escala  de  Likert,  el  área  y  la  intensidad  de  la  alodinia, la intensidad de la alodinia térmica y la frecuencia  de  ardor  espontáneo.  Las  puntuaciones  de  dolor  y  alteraciones  sensoriales  disminuyeron  significativamente  desde la cuarta semana, con respecto a los datos iniciales.  Tampoco se reportaron eventos adversos.     Los  autores  manifestaron  que  los  resultados  obtenidos,  tanto en el reporte como en la serie de casos, sugieren que  la  suplementación  con  Vimang®  sería  beneficiosa  para  prevenir  y  tratar  el  dolor  neuropático,  aunque  resulta  necesaria  la  realización  de  un  ensayo  clínico  controlado  para aceptar esta hipótesis.    En otro reporte de casos se estudió la actividad analgésica  de  las  tabletas  y  crema  Vimang®  en  pacientes  portadores  de  osteoartritis  (OA)  de  rodilla  y  la  posible  mejoría  de  la  capacidad funcional postratamiento (Valverde et al., 2009).  Para  ello,  se  estudiaron  10  pacientes  con  diagnóstico  clínico  de  imagen  de  OA  de  rodilla.  La  semana  previa  al  inicio del tratamiento sus PDMD eran mayores de 4, según  una  escala  de  Likert  de  11  puntos.  Se  aplicó  el  índice  de 

  capacidad funcional de WOMAC (The Westerm Ontario and  Mc Master Universities Osteoarthritis Index) en la consulta  inicial  y  al  concluir  el  estudio.  Los  pacientes  fueron  asignados  aleatoriamente  a  tres  grupos  (grupo  Vimang®  tabletas 900 mg/día [n = 4], grupo Vimang® tabletas 1 800  mg/día  [n  =  3]  y  grupo  Vimang®  tabletas  900  mg/día  +  crema  Vimang  1,2%  [n  =  3]).  La  administración  de  las  tabletas  se  repartió  en  tres  tomas  cada  8  h  y  la  crema  se  aplicó tres veces al día con el mismo intervalo en la rodilla  afectada  durante  tres  meses.  Todos  los  pacientes  mostraron analgesia satisfactoria a partir de los 15‐21 días  hasta los tres meses. Este efecto se relacionó, al menos en  parte,  con  la  disminución  de  la  efusión  sinovial  que  se  observó en la mayoría de las articulaciones afectadas, pero  fue  independiente  de  la  disminución  del  grosor  de  la  sinovial  constatada  por  ultrasonografía.  Se  observaron  ambos  efectos,  promoción  e  inhibición  de  la  proliferación  sinovial, independientemente de la analgesia. La inhibición  de la proliferación de la membrana sinovial con respecto a  los  valores  iniciales  sólo  fue  significativa  en  el  grupo  Vimang 900. Los 10 pacientes mejoraron su calidad de vida  en  relación  con  el  alivio  del  dolor  y  el  aumento  de  la  capacidad funcional según el índice de WOMAC.    De  la  misma  manera  que  en  los  reportes  o  serie  de  casos  anteriores  resulta  necesaria  la  realización  de  ensayos  clínicos  controlados  para  confirmar  los  hallazgos  descritos  en esas publicaciones.    CONCLUSIONES    La  presencia  de  una  mezcla  determinada  de  polifenoles,  terpenoides,  ácidos  grasos  y  microelementos,  unido  a  un  proceso  de  estandarización  del  extracto  acuoso  de  la  corteza  del  árbol  de  mango  (ECAM)  le  otorgan  a  este  ingrediente  farmacéutico  activo  de  las  formulaciones  Vimang®  un  importante  perfil  antioxidante,  anti‐ inflamatorio,  inmunomodulador  y  analgésico  manifestado  en  una  inhibición  de  la  peroxidación  lipídica  y  una  protección  al  daño  oxidativo  de  la  cadena  de  ADN  mediante  el  mecanismo  de  secuestro  de  ERO,  probablemente a través de la acción de flavonoides y otros  polifenoles.  También  a  través  de  la  disminución  de  la  acumulación  de  Fe2+  mediante  la  reacción  de  acomplejamiento  con  la  mangiferina  (MF),  lo  que  puede  ejercer  un  mecanismo  preventivo  de  protección  a  diferentes  órganos.  El  ECAM  protege  a  la  mitocondria  celular  mediante  la  acción  sobre  diversos  sistemas  enzimáticos, en los que pueden estar involucrados diversos  componentes  químicos  del  ECAM  que  impiden  o  disminuyen la formación de ERO.     Desde  el  punto  de  vista  de  la  actividad  sobre  el  sistema  inmune,  el  ECAM  inhibe  la  producción  de  moléculas  pro‐ inflamatorias,  tales  como  NO,  PGE2  y  LTB4;  enzimas  involucradas en este proceso, tales como la PLA2, la iNOS y    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 81 

 

 

    la COX‐2 y la expresión de moléculas de adhesión como la  ICAM‐1  e  incrementa  TGFβ.  Todo  ello  vinculado  con  su  efecto  modulador  sobre  la  inhibición  de  importantes  funciones como la quimiotaxis; la expresión de las citocinas  TNFα  y  sus  receptores  TNF  R‐1  y  R‐2,  GM‐CSF  e  IL‐1β  mediante la inhibición de la transcripción de los genes que  las  codifican,  la  inhibición  de  la  producción  de  isotipos  específicos  de  inmunoglobulinas,  como  la  IgG2a  y  la  IgG2b  sin  afectar  la  producción  de  IgM;  la  inhibición  de  la  proliferación  celular  mediada  por  el  receptor  de  IL‐2  en  células  T,  a  través  de  la  inhibición  de  la  expresión  del  marcador  de  activación  CD25  en  la  superficie  de  células  T  primarias;  y  la  inhibición  de  las  vías  de  señalización  intracelular  mediadas  por  NF‐κB  en  linfocitos  T  y  en  macrófagos,  lo  que  conduce  a  la  inhibición  de  la  producción  de  mediadores  moleculares  que  participan  en  los procesos inmunológicos, nociceptivos e inflamatorios.   El  ECAM  inhibió  la  muerte  celular  inducida  por  activación  (AICD)  en  células  T  primarias  mediante  la  disminución  de  las  concentraciones  de  ERO  y  Ca2+  inducidas  por  la  activación  del  receptor  de  la  célula  T,  la  inhibición  de  la  fosforilación de la cinasa de c‐Jun (JNK) que participa en la  activación  del  factor  transcripcional  AP‐1,  la  disminución  de  la  expresión  del  factor  transcripcional  NF‐κB  y  la  disminución de la expresión del ligando de muerte CD95L.  Estos  resultados  demuestran  que  el  ECAM  puede  contribuir  a  prolongar  la  sobrevivencia  de  poblaciones  de  linfocitos  T,  lo  que  fundamenta  la  utilización  de  las  ® formulaciones Vimang  en el tratamiento de patologías en  las  que  el  fenómeno  de  la AICD  este  incrementado,  como  es el caso de la inmunodeficiencia asociada al VIH.    La actividad analgésica del ECAM quedó manifestada por la  inhibición de la fase II de la prueba de la formalina al 1%, lo  que  sugiere  que  el  ECAM  pudiera  actuar  sobre  el  proceso  de  sensibilización  periférica,  específicamente  sobre  el  componente  capsaicina‐sensitivo‐neurogénico;  la  disminución  de  la  concentración  de  glutamato  y  el  aumento del número de neuronas viables en un modelo de  muerte  neuronal  excitotóxica  inducida  por  NMDA,  lo  que  sugiere  que  el  ECAM  pudiera  inhibir  la  vía  postsináptica  glutamato‐receptor  NMDA‐NO‐GMPc  implicada  en  el  proceso  de  sensibilización  central  que  subyace  en  los  estados dolorosos crónicos.     El  efecto  antialérgico  del  ECAM  también  fue  evidenciado  mediante la reducción de la producción de IgE, la inhibición  de  la  desgranulación  de  las  células  mastocitarias,  la  reducción  de  la  permeabilidad  vascular  inducida  por  histamina,  así  como  la  liberación  de  histamina  de  células  mastocitarias,  la  reducción  de  la  respuesta  proliferativa  linfocitaria antígeno‐específica y la inhibición de IL‐4 e IL‐5  en un modelo de asma alérgica.    Las  evidencias  clínicas  con  el  uso  de  formulaciones  ® Vimang ,  en  ensayos  clínicos  a  doble  ciego,  en  estudios 

  pilotos  como  en  series  o  reportes  de  casos  han  demostrado  que  existe  una  correlación  significativa  entre  la disminución de los marcadores del estrés oxidativo y de  la  inflamación,  el  alivio  de  los  síntomas  clínicos,  la  recuperación de marcadores hemoquímicos y la mejoría de  la  calidad  de  vida  en  varias  enfermedades  crónicas,  así  como en la atención al Adulto Mayor.  Los resultados de los estudios toxicológicos pre‐clínicos y la  ausencia de eventos adversos significativos en los estudios  clínicos  han  demostrado  que se  trata  de  un  producto  que  no  presenta  efectos  tóxicos,  mutagénicos,  genotóxicos,  ni  teratogénicos  en  las  condiciones  experimentales  a  que  ha  sido sometido.    Resulta  necesaria  la  realización  de  ensayos  clínicos  controlados  en  patologías  que  transitan  por  un  componente de estrés oxidativo, inflamación o dolor para  asegurar  la  eficacia  de  las  formulaciones  que  contengan  como ingrediente farmacéutico activo al ECAM.    BIBLIOGRAFÍA:  Abdalla  A.E.M.,  Darwish  S.M.,  Ayad  E.H.E.,  El‐Hamahmy  R.M.  (2007)  Egyptian mango by‐product 2: Antioxidant and antimicrobial activities  of  extract  and  oil  from  mango  seed  kernel.  Food  Chem.  103,  1141– 1152.  Acosta‐Esquijarosa J., Jáuregui‐Haza U., Amaro‐González D., Sordo‐Martínez  L.  (2009b)  Spray  drying  of  aqueous  extract  of  Mangifera  indica  L  (Vimang): Scale up for the process. World Appl. Sci. J. 6(3), 408‐412.  Acosta‐Esquijarosa J., Nuevas‐Paz L., Amaro‐González D. & Álvarez‐De Leon  J.C. (2009a) Estudio del proceso de lixiviación de la corteza vegetal de  Mangifera indica L. Lat. Am. J. Pharm. 28(1), 27‐31.  Acosta‐Esquijaroza  J.,  Jáuregui‐Haza  U.  and  Carillo‐Le  Roux  G.  (2010)  Modelling  of  humidity  isotherms  of  Mangifera  indica  L  (Vimang®)  powder. World Appl. Sci. J. 11(12), 1504‐1509.  Afaq F., Katiyar S.K. (2011) Polyphenols: skin photoprotection and inhibition  of photocarcinogenesis. Mini Rev. Med. Chem. 11(14), 1200‐1215.  Agyare  C.,  Asase  A.,  Lechtenberg  M.,  Niehues  M.,  Deters  A.,  Hensel  A.  (2009)    An  ethnopharmacological  survey  and  in  vitro  confirmation  of  ethnopharmacological use of medicinal plants used for wound healing  in Bosomtwi‐Atwima‐Kwanwoma area, Ghana. J. Ethnopharmacol. 125,  393–403.  Aiyeloja  A.  and  Bello  O.A.(  2006)  Ethnobotanical  potentials  of  common  herbs in Nigeria: A case study of Enugu state. Educ. Res. Rev. 1(1), 16‐ 22.  Ajila  C.M.,  Bhat  S.G.,  Rao  U.J.S.P.  (2007)  Valuable  components  of  raw  and  ripe  peels  from  two  Indian  mango  varieties.  Food  Chem.  102,  1006‐ 1111.  Al‐Ayyoubi S., Gali‐Muhtasib H. (2007) Differential apoptosis by gallotannin  in  human  colon  cáncer  cells  with  distintic  p53  status.  Mol.  Carcinog.  46(3), 176‐186.  Ali  H.,  Haribabu  B.,  Richardson  R.M.,  Snyderman  R.  (1997)  Mechanisms  of  inflammation and leukocyte activation. Adv. Reumatol. 81, 1‐28.  

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ARTÍCULO DE REVISIÓN 

 

 

     

  MAQUI (Aristotelia chilensis): UN NUTRACÉUTICO CHILENO DE RELEVANCIA MEDICINAL   (Maqui (Aristotelia chilensis): a Chilean nutraceutical of medicinal relevance)      Jorge R. Alonso 1,2,3, M.D.      1

 Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires. Director de posgrado de los cursos de Fitofármacos y Nutracéuticos, Fitodermatología  2 y Alimentos Funcionales y Nutracéuticos.   Prof. Adjunto Cátedra de Farmacognosia y Fitofarmacia de la Univ. Maimónides (Argentina).  3    Presidente de la Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina.       

RESUMEN  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

Los nutracéuticos conforman un grupo heterogéno de alimentos, que más allá de cumplir con su rol meramente nutricional, se  proclaman como poseedores de un efecto beneficioso para la salud humana. Entre estos alimentos, destaca el maqui (Aristotelia  chilensis), cuyos frutos han demostrado poseer una importante variedad de efectos biológicos: analgésicos, antiinflamatorios y  antioxidantes  principalmente,  que  lo  posicionan  como  abordaje  complementario  de  procesos  crónicos.  Su  alto  contenido  en  antocianidinas y la presencia importante de derivados poliglicosados polares, hacen de los frutos de A. chilensis un interesante  recurso para la elaboración de extractos antioxidantes para ser empleados en alimentos y nutracéuticos. Al momento el mercado  norteamericano de suplementos dietarios y nutracéuticos cuenta con varios productos en base a extractos de maqui.    Palabras claves: nutracéuticos, maqui, Aristotelia chilensis, antioxidante, polifenoles.    Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile  ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 

INTRODUCCIÓN  Los  nutracéuticos  conforman  un  grupo  heterogéneo  de  alimentos,  que  más  allá  de  cumplir  con  funciones  nutricionales  y  energéticas,  poseen  cualidades  benéficas  para  la  prevención  de  muchas  dolencias  (especialmente  crónicas) así como para el abordaje complementario de las  mismas. Un nutracéutico  (término acuñado en 1989 por el  Dr.  Stephen  De  Felice,  Presidente  de  la  Fundación  para  la  Innovación en Medicina, de los EE.UU) se diferencia de un  alimento funcional, fundamentalmente en su presentación  y forma de suministro hacia el paciente. En ese sentido, el  nutracéutico  tiene  forma  de  presentación  farmacéutica  (cápsulas,  comprimidos,  etc),  en  tanto  el  alimento  funcional  conserva  su  forma  de  “alimento”,  y  puede  ser  adicionado  o  enriquecido  con  diferentes  sustancias  que  realzan  sus  propiedades  biológicas  (por  ej.  yogures  con  lactobacilos, pan con mayor tenor de fibras, etc).    Otros ejemplos los constituyen las uvas rojas (a través de la 

presencia  de  resveratrol,  un  gran  antioxidante),  la  cáscara  de  la  semilla  del  plantago  o  psyllum  (para  reducir  hipercolesterolemia  y  generar  menor  incidencia  de  cáncer  de  colon),  el  brócoli  (por  medio  del  indol‐3‐carbinol,  un  compuesto  con  propiedades  antitumorales),  la  soja  (a  través  de  sus  isoflavonas  en  el  abordaje  de  trastornos  climatéricos),  las  semillas  de  chía  y  lino  así  como  los  pescados de mar frío (por su riqueza en aceites Omega‐3),  el  tomate  (por  su  riqueza  en  licopeno,  otro  gran  1 antioxidante), etc  .      En  los  últimos  años  han  cobrado  mucha  vigencia  los  denominados  berries,  que  conforman  un  grupo  de  frutos  de  color  rojo,  violáceo,  morado,  con  alto  contenido  de  polifenoles  en  su  interior.  Entre  ellos  destacan  los  arándanos, el grosellero negro, las frambuesas, las uvas, la  murta  y  en  el  caso  que  nos  ocupa  en  este  artículo:  el  maqui. 

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    CONSIDERACIONES BOTÁNICAS Y TAXONÓMICAS    Reino: Plantae  Clasificación: Angiospermas  Orden: Oxalidales  Familia: Elaeocarpaceae.  Género: Aristotelia  Especie: chilensis  Nombre Científico: Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz.  Sinonimias: A. glandulosa Ruiz et Pavón, A. glabra Miers, A.  macqui L’Her.  Nombres populares: maqui, maquei, queldrón, queldón,  clon, coclón, koelon (Argentina, Chile), maki (Mapuche),  Chilean blackberry (inglés).      DESCRIPCIÓN BOTÁNICA    Se  trata  de  un  arbusto  dioico,  perennifolio  de  tronco  dividido, que alcanza hasta 4 a 5 metros de altura. Contiene  tallos rojizos, con ramas delgadas y flexibles. La corteza es  lisa, blanda, siendo fácilmente desprendible. Las hojas son  pecioladas, aovado‐lanceoladas, perennes, midiendo entre  4  a  9  cm,  con  bordes  dentados  y  dispuestas  en  cruz  con  respecto  al  resto  de  las  hojas  del  tallo.  Las  flores  son  pequeñas,  blanquecinas,  de  cinco  pétalos,  con  numerosos  estambres,  estériles  en  el  caso  de  pies  femeninos,  y  están  siempre  reunidas  en  inflorescencias  axilares.  Pueden  ser  hermafroditas  o  unisexuales  (uno  de  los  sexos  atrofiado).  Sus  frutos  son  bayas  pequeñas  de  5  mm,  de  color  negro  brillante  o  azuladas,  que  contienen  de  2  a  4  semillas.  2‐3 Florece de noviembre a diciembre y fructifica en verano  .     

 

  Fotografia del Maqui Chileno (Aristotelia chilensis).  http://en.wikipedia.org/wiki/File:Maqui_chileno.jpg  

    HÁBITAT – DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA    Las  Eleocarpáceas  conforman  una  familia  botánica 

  compuesta  de  10  géneros  y  alrededor  de  400  especies,  distribuidas  en  las  regiones  tropicales  y  templadas  del  mundo (salvo el continente africano).   El maqui es común hallarle en los parques nacionales Lanín,  Nahuel  Huapi  y  Los  Alerces  (Argentina)  así  como  en  los  bosques  andinos  chilenos  entre  los  paralelos  31°  y  42°:  entre  Illapel  y  Chiloé,  tanto  en  el  Valle  Central  como  en  4 ambas  cordilleras  e  Isla  Juan  Fernández  .  Crece  en  terrenos  alterados,  en  general  con  buena  exposición  a  la  luz,  siendo  una  especie  importante  en  el  control  de  la  erosión.  Se  desarrolla  como  especie  secundaria,  preferentemente en suelos húmedos, quebradas, faldas de  los  cerros  o  márgenes  de  bosques  3.  Suele  ser  de  las  primeras  especies  que  invaden  terrenos  quemados  o  abandonados.  Los  bosques  de  maqui  son  denominados  “macales”,  siendo  de  crecimiento  muy  rápido  en  4. condiciones de humedad apropiadas        HISTORIA    En época de la conquista, Alonso de Ovalle (1946) relataba  “sus  hojas  sirven  en  extremo  contra  quemaduras  y  otros  accidentes  que  nacen  del  calor”.  Murillo,  en  1889,  mencionaba el poder antiinflamatorio del jugo de las hojas  en  afecciones  de  garganta.  Vicuña  Mackenna  en  1887,  reseñaba: “del benéfico maqui se apovechan los aborígenes  para  las  diarreas  como  un  poderoso  astringente,  y  así  úsanla todavía las casas grandes de Santiago” 4. A pesar de  su fama, el maqui no formó parte de la famosa “Botica de  los  Jesuitas”.  El  maqui  es  considerado  uno  de  los  tres  árboles  sagrados  de  los  Mapuches.  Junto  al  canelo  y  la  laura  forman  el  Rehue,  es  decir,  el  “árbol  sagrado”  de  las  rogativas.  Es  también  un  símbolo  de  paz  o  intención  pacífica y benévola y es ampliamente usado en la medicina  natural  indígena.  La  denominación  “maki”  en  idioma  5 Mapuche significa fruto  .      AGROTECNOLOGÍA DE CULTIVO    No  hay  datos  de  cultivo.  Su  propagación  es  por  medio  de  semillas.  Fueron  llevados  a  cabo  estudios  de  propagación  generativa  para  A.  chilensis,  siendo  la  inmersión  de  la  semilla  en  agua  fría  durante  48‐72  hs  como  el  mejor  6 método de pretratamiento  .      PARTE UTILIZADA    Se emplean los frutos y su jugo, principalmente.      USOS ETNOMEDICINALES    En  uso  interno,  se  utilizan  los  frutos  como  tónico,    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 92 

 

 

 

    antidiarreico,  desinflamante,  cicatrizante,  diaforético,  digestivo,  expectorante,  diurético  y  purgante.  También  puede  usarse  la  infusión  (de  las  hojas  principalmente)  como  gárgaras  o  buches  en  inflamación  de  la  mucosa  orofaríngea.  La  etnia  Huilliche  de  Chile  ha  empleado  los  frutos  de  maqui  tradicionalmente  en  forma  de  compresas  externas  para  el  tratamiento  de  heridas  infectadas.  También  el  polvo  de  las  hojas  secas  quemadas,  como  cicatriante  de  heridas.  Los  frutos  e  incluso  las  partes  subterráneas,  son  ingeridos  como  alimento.  Sus  bayas  dulces y muy jugosas son ingeridas directamente, o usadas  para  preparar  una  especie  de  chicha  llamada  “tecu”.  En  Chiloé  emplean  el  fruto  mezclado  con  zarzamora,  para  combatir  el  dolor  de  garganta.  También  pueden  ser  empleadas  para  hacer  jugos  frescos  con  azúcar  y  agua,  o  usadas  secas  y  molidas.  Actualmente  la  comunidad  Mapuche    de  Neuquén    recolecta  sus  frutos  para  hacer  jaleas caseras. Con las semillas se prepara un tipo de harina  7‐8 artesanal         OTROS USOS    Se  emplea  su  madera  para  labores  artesanales,  la  cual  es  frágil  y  sonora,  sirviendo  por  ello  para  fabricar  instrumentos  musicales.  Su  jugo  puede  ser  utilizado  en  la  tinción  de  lanas  de  color  amarronado  para  tornarlas  rojo‐ violáceas,  dado  su  alta  concentración  de  taninos.  La  corteza,  fácilmente  desprendible  en  tiras,  se  usa  como  cordel  para  amarras.  Las  ramas  son  muy  utilizadas  para  prender  fuego.  Con  la  fermentación  de  los  frutos  suelen  4. elaborar vino        COMPOSICIÓN QUÍMICA    Alcaloides  indólicos:  aristona,  aristoletina,  aristotelinona,  aristotelona,  aristotelina,  aristotelinina,  protopina,  serratolina,  hobartinol,  8‐oxo‐9‐dehido‐hobartina,  makonina,  8‐oxo‐9‐dehidromakomakina,  9‐dehidro‐8‐oxo‐ makomakina  9‐10‐11   Flavonoides:  quercetina  5,3'‐dimetiléter,  friedelina,  malvidina,  petunidina  y  ácido  ursólico  (extracto  diclorometano).  Quercetina  3‐O‐β‐D‐glucósido  y  kempferol  fueron identificados en el extracto metanólico 3‐12‐13   Otros:  ácidos  cafeico  y  ferúlico  13,  3‐HO‐indol  (extracto  etanólico),  cumarinas  14‐15,  antocianidinas  (3‐glucósidos,  3,5‐diglucósidos,  3‐sambubiósidos  y  3‐sambubiósido‐5‐ glucósidos  de  delfinidina  y  cianidina).  El  componente  mayoritario entre las antocianidinas resultó ser delfinidin 3‐ sambubiósido‐5‐glucósido  con  un  34%  del  total  16‐17.  También  se  ha  reportado  la  presencia  de  los  ácidos  gentísico,  gálico,  sinápico,  p–cumárico,  hidroxibenzoico,  vaníllico,  maconina,  8‐oxo‐9‐dehidrohobartina  y  8‐oxo‐9‐ dehidromacomaquina.   

Figura 1.     

     

 

  COMPOSICIÓN NUTRICIONAL    Cada  100  g  de  frutos  contiene  150  calorías,  0,8  g  de  proteínas, 0,8 g de fibra cruda, 1,2 g de cenizas, 87 mg de  calcio,  44  mg  de  fósforo,  30,5  mg  de  hierro  y  296  mg  de  potasio.  Contiene  también  un    considerable  porcentaje  de  vitamina C y oligoelementos, destacando la presencia de Br,  18. Zn, Cl, Co, Cr , Vn, Tn, y Mo   Las hojas maduras del maqui  solo se diferencian de las jóvenes por su menor contenido  de  potasio  y  mayor  de  sodio.  Cabe  señalar  que  los  contenidos de magnesio, cloro, calcio, titanio y vanadio no  varían  entre  hojas  de  plantas  de  sitios  con  diferente  pluviosidad anual.      FARMACODINAMIA – ACTIVIDADES FARMACOLÓGICAS    Actividad  analgésica  y  antiinflamatoria:  Tanto  el  extracto  diclorometano  como  el  metanólico  de  los  frutos  de  A.  chilensis  han  demostrado  poseer  efectos  antiinflamatorios  muy importantes, evidenciados por vía tópica en el modelo  de  inflamación  en  roedores  por  inducción  con  TPA  (12‐ deoxiforbol‐13‐decanoato)  en  el  orden  del  63,9  y  66%  respectivamente. También a nivel tópico demostró efectos  muy  significativos    el  extracto  acuoso  de  los  frutos,  en  modelos de inflamación inducidos por ácido araquidónico,    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 93 

 

 

    del orden del 56,2%. Aún más potente resultó la actividad  antiinflamatoria de los extractos hexánico y diclorometano  (89,2%  para  ambos).  La  actividad  analgésica  a  nivel  tópico  fue  demostrada  por  los  extractos  acuoso,  diclorometano,  metanólico y por el extracto crudo purificado en alcaloides,  en  los    modelos  de  analgesia  por  formalina  y  tail‐flick  (producción  de  dolor  por  factor  térmico)  en  ratas  13‐19‐20.  Asimismo,  estos  extractos  lograron  reducir  la  producción  de  óxido  nítrico  (3,7  –  25,5%)  y  prostaglandina  E2  (9,1  –  89,1%) y la expresión de óxido‐nítrico‐sintasa inducible (9,8  –  61,8%)  y  ciclooxigenasa‐2  (16,6  –  62%)  en  macrófagos  21 RAW 264.7 estimulados por lipopolisacáridos  .  El  mecanismo  de  acción  propuesto  para  la  actividad  analgésica  de  los  extractos  hexánicos,  se    considera  que  estaría  modulado  por  receptores  serotonérgicos  (5‐HT3),  adrenérgicos (a‐1), colinérgico‐muscarínicos (ACh‐M) y por  la vía L‐arginina/NO (óxido nítrico). En cambio la actividad  antinociceptiva  del  extracto  diclorometano  estaría  modulada por las vías opioide, serotonérgica, adrenérgica y  nitridérgica. En el efecto analgésico del extracto metanólico  estarían  involucrados  los  sistemas  opioide,  adrenérgico,  colinérgico  muscarínico  y  L‐arginina/NO.  Los  alcaloides  (aristona,  aristotelona,  aristotelina  y  aristotelininia)  demostraron  relajar  la  musculatura  lisa  intestinal,  explicando  sus  acciones  antiinflamatorias  y  antiespasmódicas 22.     Actividad antioxidante: Los compuestos polifenólicos de los  frutos  de  maqui  han  demostrado  poseer  efectos  antioxidantes  in  vitro  23‐24.  El  jugo  demostró  sobre  células  endoteliales  humanas,  evitar  la  peroxidación  lipídica  inducida  por  cobre.  Dicha  actividad  protectora  endotelial  sería  atributo  principalmente  del  contenido  en  polifenoles  del  jugo  y  su  efecto  antioxidante    frente  a  situaciones  de  estrés  oxidativo  25.  De  igual  modo  la  combinación  de  jugo  de  limón  y  jugo  de  maqui  demostró  importantes  efectos  antioxidantes,  frente  a  los  radicales  DPPH,  anión  26 superóxido  y  oxhidrilo  .    Se  determinó  que  el  jugo  concentrado  de  maqui  presenta  mayores  contenidos  de  fenoles  (12,32  mm  Fe/100  g)  y  mayores  capacidades  antioxidantes  en  comparación  con  los  jugos  de  mora,  arándano, cranberry, frambuesa y frutilla (3,10 mm Fe/100  g).  Tanto el extracto acuoso como el metanólico de los frutos  de maqui demostraron in vitro efectos antioxidantes en los  modelos  de  inhibición  de  xantina‐oxidasa  y  DPPH,  en  el  13 orden  del  52.9  y  62.7%  respectivamente  .  Asimismo,  el  extracto  crudo  de  las  hojas  y  de  los  frutos  mostraron  actividad  antioxidante,  actuando  sus  polifenoles  en  la  inhibición  de  la  enzima  alfa‐glucosidasa,  lo  cual  es  importante  por  el  rol  que  cumple  esta  enzima  en  el  metabolismo  de  los  carbohidratos,  siendo  benéfico  este  27 efecto para los pacientes diabéticos  . El compuesto 3‐HO‐ indol también demostró importantes efectos antioxidantes  15.    

  Usos cosméticos: El extracto de maqui fue ensayado como  conservante  microbiano  y  antioxidante  cosmético.  En  tal  sentido,  se estudió  la  estabilidad  físicoquímica,  sensorial  y  microbiana  en  función  del  tiempo,  en  diferentes  condiciones  de  almacenamiento.  De  los  productos  elaborados, en ninguno se observó desarrollo bacteriano ni  fúngico, y se mantuvieron las características físicoquímicas  y  sensoriales.  Por  sus  propiedades  antioxidantes,  se  posiciona  el  maqui  como  un  muy  buen  producto  anti  age  28 .    Otras actividades de interés: Las hojas y tallos demostraron  experimentalmente  actividad  relajante  en  músculo  liso  y  actividad  antibacteriana  frente  Sarcinia  lutea  y  Staphylococcus  aureus.  Extractos  totales  de  maqui  evidenciaron in vitro actividad inhibitoria en células KB de  29‐30‐31 .  Sobre  estómago  de  rata,  carcinoma  nasofaríngeo  diferentes  fracciones  de  extractos  de  maqui  mostraron  efectos gastroprotectores 19.   En  un  estudio  reciente  se  evaluó  los  efectos  de  un  concentrado  de  A.  chilensis  sobre  la  expresión  de  ciclooxigenasa (COX)‐2, vías de señalización y viabilidad en  células de cáncer de colon. El tratamiento de células Caco‐ 2  con  A.  chilensis  por  24  horas  redujo  la  expresión  de  la  proteína  y  mRNA  de  COX‐2,  y  disminuyó  la  actividad  luciferasa  regulada  por  NF‐ĸB  o  NFAT.  El  tratamiento  de  células  Caco‐2  por  4  horas  con  A.  chilensis  redujo  transitoriamente  los  niveles  citoplasmáticos  de  IĸBα,  aumentó la fosforilación de ERK1/2 y Akt y la expresión de  c‐fos.  Asimismo  no  se  afectó  la  viabilidad  celular,  en  las  concentraciones  que  redujeron  la  expresión  de  COX‐2.  Estos  resultados  sugieren  un  potencial  efecto  anticancerígeno y antiinflamatorio de A. chilensis 32.  Los  taninos  del  fruto  le  confieren  al  maqui  propiedades  astringentes  y  antidiarreicas.  Por  su  parte,  los  polifenoles  27 de las hojas evidenciaron efectos antihemolíticos in vitro  .   La  combinación  de  jugo  de  limón  y  jugo  de  maqui  demostró  in  vitro  reducir  la  actividad  de  las  enzimas  acetilcolinesterasa  y  butilcolinesterasa,  siendo  el  jugo  de  26 limón  el  componente  más  activo  .    Un  trabajo  experimental  evaluó  el  potencial  neuroprotector  de  un  extracto elaborado a partir de polifenoles del maqui (MQ)  en  un  modelo  de  enfermedad  de  Alzheimer  inducido  por  oligómeros  solubles  de  ß‐amiloide  (Aβ).  A  tal  fin  se  utilizaron  cultivos  de  neuronas  de  hipocampo  de  ratas,  pudiéndose observar neuroprotección cuando las neuronas  eran  incubadas  con  ß‐amiloide  (0.5  μM)  más  extracto  de  maqui  por  24  hs.  En  el  mecanismo  de  acción  se  pudo  observar una recuperación en la frecuencia de oscilaciones  transitorias  de  los  canales  de  calcio,  comparado  al  grupo  control que recibió solo ß‐amiloide (Aβ = 72 ± 3%; Aβ + MQ  =  86  ±  2%;  n  =  5)  lo  cual  se  correlacionó  con    cambios  positivos observados en la actividad sináptica espontánea y  en la preservación de las ramificaciones dendríticas, siendo  la  actividad  antioxidante  del  maqui  el  principal  propulsor  33 de estos cambios  .    Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(2): 94 

 

 

 

    En cuanto al extracto metanólico de los frutos maduros, el  mismo  demostró  actividad  cardioprotectora  frente  a  modelos de isquemia aguda por reperfusión en un estudio  realizado  in  vivo  en  ratas34.  A  nivel  metabólico,  fue  evaluado  in  vitro  la  capacidad  de  algunos  extractos  de  maqui  para  reducir  la  adipogénesis  y  la  acumulación  de  lípidos  en  adipocitos.  Al  respecto,  los  extractos  fenólicos  demostraron inhibir la acumulación lipídica entre 4 y 10,8%  en  adipocitos  maduros  y  entre  5,9  y  37,9%  a  través  de  diferenciación.  De  ahí  se  desprende  su  utilización  en  productos reductores de peso 35.      EFECTOS ADVERSOS Y/O TOXICOLÓGICOS    Se  ha  reportado  que  los  flavonoides  presentes  en  el  extracto  acuoso  de  las  hojas,  en  contacto  con  sangre  humana,  generan  cambios  morfológicos,  alterando  la  forma discoidal del eritrocito hacia una forma equinocítica,  lo  cual  se  debería  a  su  interacción  con  fosfolípidos  de  la  14.  membrana      CONTRAINDICACIONES    No han sido reportadas.      STATUS LEGAL    La  planta  se  encuentra  dentro  del  listado  de  especies  reconocidas  de  uso  tradicional  medicinal  humano  por  el  36 Ministerio  de  Salud  de  Chile  .  En  Argentina  no  se  encuentra  en  el  listado  positivo  de  especies  de  trámite  simplificado para registro de medicamento fitoterápico.      FORMAS GALÉNICAS    Ante  la  falta  de  datos  de  formas  galénicas  oficinales,  se  comentarán a continuación algunas formas de preparación  de acuerdo con la medicina tradicional.    Infusiones:  Los  frutos  utilizados  contra  la  diarrea  y  disentería se preparan en base a 10 g de frutos frescos en 1  litro  de  agua  hervida.  Se  deja  reposar  (tapado)  durante  5  minutos  y  se  procede  a  beber  2  tazas  por  día  durante  3  días.  En  afecciones  de  encías,  aftas  e  inflamaciones  de  amígdalas,  anginas  y  catarros:  se  colocan  10  g  de  partes  frescas o 5 g de partes secas de la planta (preferentemente  flores) en un litro de agua a punto de hervor. Dejar enfriar,  filtrar y beber 3 tazas por día durante 1 semana.  Para úlceras internas del sistema digestivo, úlceras, gastritis  y enteritis se prepara una infusión con 15 g de hojas frescas  o  secas,  a  las  que  se  agrega  un  litro  de  agua  a  punto  de 

hervir. Dejar reposar 5 minutos y filtrar.    Uso  externo:  Se  trituran  20  g  de  hojas  secas  y  se  aplican  directamente sobre las heridas al menos 2 veces al día. La  pomada  se  elabora  en  base  a  30  g  de  frutos  frescos  triturados en mortero, a lo cual se agregan 100 g  de crema  base y 50 g de cera de abeja. Se procede a mezclar todo y  calentar a baño María durante 30 minutos a fuego mínimo.  Se utiliza en procesos infecciosos dérmicos y cutáneos.     

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