Sumário: A. Introdução

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SUMÁRIO

A. INTRODUÇÃO B. O QUE É A CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA C. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS D. DETECTORES E. MÉTODOS QUANTITATIVOS F. BIBLIOGRAFIA

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A. INTRODUÇÃO A cromatografia faz parte de um importante grupo de métodos de separação, que nos permite separar, isolar, identificar e quantificar substâncias, mesmo em misturas muito complexas. Existem várias técnicas cromatográficas, que vão das mais simples, como a cromatografia sobre papel, até as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O ponto comum entre essas técnicas, e que caracteriza o método, é o fato dos componentes da mistura, ou amostra, serem distribuídos entre duas fases. Uma delas permanece fixa, e por isso é chamada de fase estacionária (F.E.), enquanto a outra percola1 através da F.E., sendo então chamada de fase móvel (F.M.). Esta situação dinâmica, resulta numa migração diferencial, ou seja, os componentes da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária. A tabela abaixo mostra algumas combinações de fases estacionárias e fases móveis: Fase Móvel

Fase Estacionária

Abreviatura

Mecanismo de Tipo de cromatografia separação CLS líquido sólido adsorção cromatografia líquida CGS gás sólido adsorção cromatografia gasosa CLL líquido líquido partição cromatografia líquida CGL gás líquido partição cromatografia gasosa Cada uma dessas combinações envolve diferentes mecanismos de separação. Por exemplo,

na CLS acontece, em geral: adsorção na superfície do sólido e interação resultante da troca iônica ou da formação de complexos. Na CGS também ocorre, de maneira geral, o fenômeno da adsorção. Na CLL ocorre a partição definida pela solubilidade relativa do soluto nos dois líquidos. Na CGL dá-se a partição do soluto definida pela pressão parcial de vapor do soluto na solução. A fase estacionária, de forma geral, é acondicionada nas chamadas colunas cromatográficas, que na sua maioria são tubos de vidro ou metal de dimensões diversas. Quando essa fase é um sólido, basta que a coluna seja preenchida com o mesmo, de acordo com técnicas especiais. Por outro lado, quando a fase estacionária é um líquido, esse pode tanto revestir as paredes da coluna, no caso de colunas capilares, quanto estar aderido a um suporte sólido com o qual se enche a coluna. A amostra é introduzida na coluna e a fase móvel carreia os diversos componentes dessa amostra através da coluna e, dependendo do tipo de cromatografia, pode participar ou não da separação. Assim, a separação dos diversos componentes será dada em função de uma maior ou

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Percolação é o nome dado ao movimento (infiltração) das águas pluviais no subsolo.

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menor afinidade de cada um deles, por cada uma das fases. Logo, o componente com maior afinidade pela fase estacionária fica mais tempo retido na coluna, enquanto aquele que tiver mais afinidade pela fase móvel percorrerá a coluna com mais rapidez (fig. 1). Outras características importantes na separação serão o tamanho da molécula, sua massa e, no caso da cromatografia em fase gasosa, sua pressão de vapor (ou ponto de ebulição).

Fig. 1 (a,b,c) - Ilustração esquemática de uma separação utilizando cromatografia líquida. (d) - Gráfico representativo de frações coletadas durante a eluição.

B. O QUE É A CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA A cromatografia gasosa veio possibilitar, de maneira rápida e eficiente, uma série de separações extremamente difíceis, ou mesmo impossíveis pelos métodos tradicionais, como por exemplo a separação da mistura benzeno-ciclohexano, impossível de ser feita por destilação fracionada, ou ainda, a análise de gases provenientes de automóveis, contendo mais de cem componentes, que podem ser separados por essa técnica. Os princípios do método cromatográfico são os mesmos para todas as formas de cromatografia, ou seja, é um processo no qual uma mistura de substâncias pode ser separada nos seus constituintes graças à passagem de uma fase móvel gasosa, que carreia a mistura, sobre uma fase estacionária. Como o nome denota, a cromatografia gasosa (CGS ou CGL) é aquela em que a fase móvel é um gás e a estacionária, um sólido ou um líquido. Na CGS a fase estacionária é um sólido com grande área superficial, enquanto que na CGL ocorre partição dos componentes de uma amostra entre uma fase móvel gasosa e uma camada delgada de um líquido não volátil que recobre um suporte sólido inerte. As principais características dessas técnicas (CGS ou CGL) são as seguintes: I. A fase móvel é um gás quimicamente inerte.

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II. Nas condições cromatográficas escolhidas para a análise só é possível analisar substâncias voláteis (ou derivados voláteis gerados a partir de reações químicas apropriadas). A função do gás usado como fase móvel é apenas a de carrear os componentes da amostra através da coluna, sem participar dos processos de interação. Por este motivo é chamado gás de arraste. Exemplos de gases mais utilizados em CG são o He, H2 e o N2 . Na figura abaixo observa-se os principais componentes de um Cromatógrafo a Gás.

Fig. 2 - Esquema de um cromatógrafo a gás.

O gás de arraste passa através de um regulador de pressão e penetra no injetor de amostra, arrastando a amostra para a coluna. Os componentes da amostra são separados durante a passagem pela coluna e, um após o outro, passam pelo detector que, por sua vez, envia um sinal ao registrador. Finalmente, o gás passa através de um medidor de vazão e é, então, liberado para a atmosfera. Quando qualquer substância diferente do gás de arraste passa pelo detector, este envia um sinal elétrico ao registrador, que passa para o papel os sinais recebidos, compondo o cromatograma. Para uma amostra de 3 componentes (A, B e C), por exemplo, o aspecto do cromatograma ideal seria o seguinte:

Fig. 3 - Cromatograma ideal para uma amostra contendo três substâncias.

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Como o detector não responde à passagem do gás de arraste, observa-se uma linha reta, constante, entre cada sinal, chamada Linha de Base. Quando a substância A alcança o detector, este é sensibilizado, envia um sinal ao registrador e o registro gráfico esperado é o observado na figura 3. Entretanto isso só seria possível se todas as moléculas da substância A alcançassem o detector simultaneamente. Na verdade acontece, entre outras coisas, o fenômeno da difusão longitudinal no interior da coluna, que faz com que as moléculas da mesma substância percorram a coluna com velocidades levemente diferentes. Isto faz com que o aspecto real de um cromatograma de uma amostra contendo três substâncias (A, B e C) seja como o que se vê na figura 4.

Fig. 4 - Cromatograma real de uma amostra contendo três substâncias.

A cromatografia gasosa permite a realização de análises qualitativas e quantitativas. A análise qualitativa é baseada na velocidade com que cada componente da mistura atravessa a coluna, utilizando-se o parâmetro Tempo de Retenção (Tr). O tempo de retenção de uma substância é o tempo gasto desde o momento em que a amostra é injetada, até o momento em que o maior número de moléculas da substância sai do sistema cromatográfico e é detectado. O Tr é calculado dividindo a distância (espaço entre o início do cromatograma e o ponto máximo do pico formado) pela velocidade do papel do registrador. O tempo de retenção é característico de uma dada substância, em condições determinadas de análise. Dessa forma, para uma dada coluna, um dado gás de arraste e condições de temperatura e pressão estabelecidas, cada substância tem um tempo de retenção próprio, que permite a sua identificação através da comparação com a análise de padrões, realizada sob as mesmas condições. A análise quantitativa está relacionada com a área formada sob os picos, pois a intensidade do sinal enviado pelo detector é proporcional à quantidade de substância presente na amostra. Para se realizar uma análise cromatográfica é necessário que o cromatograma obtido esteja bem "resolvido". Este termo, "resolvido", significa boa separação entre os picos, de tal forma que se possa determinar com precisão, tanto os Tr (s) como as áreas dos mesmos. Na prática, controlandose adequadamente os parâmetros cromatográficos, pode-se obter um registro cromatográfico com picos bem separados e simétricos, isto é, com boa resolução.

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EXERCÍCIOS 1) Na cromatografia gasosa, o tempo de retenção é determinado por alguns parâmetros. Para substâncias com peso molecular próximo, portanto, tem maior tempo de retenção aquela que: ( ) mais interage com a fase estacionária.

Justifique a sua resposta tanto para as

( ) tem menor pressão de vapor.

afirmativas corretas como para as

( ) menos interage com a fase móvel.

incorretas.

( ) for mais polar. 2) Por que o tempo de retenção de séries homólogas de substâncias é maior quanto mais pesada for a substância, na grande maioria das fases estacionárias usadas em CG, sendo essa ordem independente da polaridade da fase utilizada? 3) Dentre as alternativas abaixo, a única análise qualitativa que é impossível se fazer por cromatografia a gás é o teor de: A- ( ) metanol em bebidas alcoólicas. C- ( ) açucar no mel. E- (

B- ( ) n-octano em gasolina.

D- ( ) óxido nitroso em ar atmosférico poluído.

) metano em gases proveniente de biodegradação.

4) Para fazer uma análise cromatográfica, um analista injetou 1,0 mL de uma substância pura X (grau PA) e após um determinado tempo observou a formação do cromatograma 1 com dois picos. Surpreso com o resultado obtido, reinjetou novamente a referida substância pura nas mesmas condições cromatográficas, obtendo o cromatograma 2.

Explique o aparecimento do sinal com menor tempo de retenção no cromatograma 1.

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5) O esquema abaixo mostra um cromatógrafo improvisado. A detecção é feita pelo contraste da cor da chama das substâncias orgânicas (normalmente amarela e luminosa) contra a chama incolor do hidrogênio.

Como poderia ser feita neste cromatógrafo: A) A análise qualitativa de uma mistura de pentano e benzeno? B) A diferenciação de duas soluções de benzeno com concentrações distintas? C. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS C.1. ESCOLHA DA TEMPERATURA DO FORNO DAS COLUNAS Como a cromatografia gasosa utiliza um gás como fase móvel, é coerente pensar que as substâncias a serem analisadas devem estar no estado gasoso no momento em que penetram no interior da coluna. Quando as substâncias componentes de uma mistura entram em contato com a fase estacionária iniciam-se vários tipos de interações que irão influenciar na migração diferenciada de cada substância. Um fenômeno que em geral ocorre com todas as substâncias é o de ter, cada uma, o seu equilíbrio Líquido

Vapor deslocado para a fase vapor, quanto mais aquecido estiver o forno da

coluna. Quanto menos aquecido estiver o forno da coluna, esse equilíbrio também estará menos deslocado para a fase vapor. Dessa forma, conclui-se que uma substância eluirá mais rapidamente quanto mais aquecido estiver o forno da coluna e, por outro lado, a substância ficará mais tempo em contato com a fase estacionária, quanto menos aquecido estiver o forno. Consequentemente, os valores de Tr serão modificados à medida em que se altera a temperatura do forno das colunas. A ordem de saída das substâncias, entretanto, será regida por dois fatores simultâneos, que são: a afinidade de cada substância pela fase estacionária e a tendência de cada substância se manter

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na fase móvel. O primeiro fator depende da característica química (estrutural) da substância e o segundo fator é decorrente da pressão parcial de vapor da mesma. Deve-se ter em mente que a temperatura máxima com que se pode trabalhar com uma determinada fase estacionária depende de sua volatilidade. Acima desta temperatura pode ocorrer perda de fase estacionária (sangria), que provoca uma diminuição do tempo de vida da coluna. C.2. ESCOLHA DA VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A vazão de um fluido é o produto da velocidade de escoamento do referido fluido (v) pela área da seção reta (A) do tubo no qual está ocorrendo o escoamento, ou seja: Vazão = v ´ A

Desenvolvendo a equação anterior, tem-se:

V d ´ A = t t V = volume do tubo pelo qual ocorre o escoamento do fluido. d = distância percorrida pelo fluido dada em cm. t = tempo dado em min. v ´ A =

A alteração da velocidade de escoamento do gás, leva à mudança da vazão do mesmo. Essa última acarreta modificação na intensidade de interação de uma dada substância com a fase estacionária. Por que isto ocorre ? Suponha que, a uma dada vazão, as substâncias A e B , por exemplo, estão interagindo fortemente com a fase estacionária. Observa-se, neste caso, valores altos para TrA e TrB . Aumentando-se a vazão, as substâncias A e B têm as suas interações diminuídas e consequentemente os valores de TrA e TrB serão reduzidos. Analogamente ao aumento da temperatura do forno da coluna, também aqui, no aumento da vazão do gás de arraste, tem-se uma diminuição da capacidade de interação das substâncias com a fase estacionária e consequentemente uma diminuição nos valores de Tr. E em relação a diminuição da vazão do gás de arraste ? O que ocorre ? A vazão é alterada, aumentando ou diminuindo a pressão do gás no sistema, através do ajuste da válvula reguladora de fluxo. Media-se a vazão utilizando-se, por exemplo, um dispositivo bastante simples como o fluxômetro de bolha de sabão ou "bolhômetro". Trata-se de um cilindro com um volume pré estabelecido (marcado com dois traços), pelo qual faz-se passar uma película de sabão. Mede-se o tempo gasto para a movimentação da película entre as duas marcações. Aparelhos modernos contam com um medidor de fluxo próprio.

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C.3. ESCOLHA DA FASE ESTACIONÁRIA TIPO, % DA FASE ESTACIONÁRIA SOBRE O SUPORTE E GRANULOMETRIA

A característica química da fase estacionária (F.E.) influencia na qualidade de separação das substâncias que compõem uma dada amostra. Pode-se escolher uma fase baseando-se na polaridade da amostra que será evaporada. Os tipos de interações que ocorrem com mais freqüência entre a substância e a F.E. são: forças de Van der Walls , interações dipolo-dipolo, pontes de hidrogênio. Supondo uma F.E. líquida, onde ocorre partição, em geral as substâncias (solutos) polares são retidas em grande extensão conforme a polaridade aumenta. Por outro lado, solutos não-polares são retidos em maior extensão conforme a polaridade da fase diminui. Tratando-se de fase apolar, os solutos apolares irão interagir de forma semelhante, sem nenhuma seletividade especial, sendo então separados na ordem dos seus pontos de ebulição. Existe um grande número de líquidos que podem ser usados como fase estacionária, na cromatografia gás-líquido. Esses líquidos devem ter algumas especificações, a saber: ·

Serem térmicamente estáveis;

·

Não devem reagir com as substâncias presentes na amostra;

·

Devem ser seletivos para as substâncias que compõem a amostra. Se a fase estacionária é sólida, ela deve ser constituída por partículas de diâmetros regulares,

para maior eficiência de separação. No caso da cromatografia gás-sólido, onde ocorre adsorção, substâncias que são adsorvidas de forma semelhante podem ser separadas, se apresentarem volatilidades diferentes. Para gases fixos (O2, CO2, N2, etc.), utiliza-se separação por tamanho, em colunas de peneira molecular, aonde as moléculas que são capazes de entrar nos poros da fase estacionária sólida são mais retidas do que as moléculas maiores, que não conseguem penetrar na fase estacionária (passam "por fora"). Tratando-se da % de fase líquida que se deposita sobre o suporte, deve-se ter em mente que a camada de fase que envolve o grão do suporte deverá ter uma espessura que garanta a formação de um filme fino e homogêneo, favorecendo a interação soluto - solvente.

Fig. 5 - Corte transversal do grão envolvido pela fase estacionária líquida.

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O diâmetro do grão (suporte) é muito importante, pois deseja-se uma grande superfície de contato para que as interações ocorram. Quanto menor o tamanho do grão, para um mesmo volume de coluna, maior a superfície de contato da fase, retida sobre o grão, com a substância (soluto). Porém, nas baixas pressões de trabalho da cromatografia gasosa, não é indicada uma granulometria muito baixa, pois os grãos irão atuar como uma barreira à passagem do gás, dificultando o processo de separação. Normalmente utiliza-se uma granulometria da ordem de 80 a 100 mesh. No caso de coluna capilar, esse fenômeno de barreira não existe e a fase é depositada sobre a parede interna do "tubo capilar" por onde se fará passar a amostra. Para se aumentar a superfície de contato da fase estacionária com o soluto, trabalha-se com colunas longas. O diâmetro interno pode variar de 0,10 a 0.53 mm e a espessura do filme líquido depositado na superfície interna do tubo capilar é normalmente de 2,5 mm. Tabela 1 – Principais características das colunas empacotada e capilar

Características

Empacotada

Capilar

Comprimento (m) Diâmetro Interno (mm) Pratos por metros Pratos totais (aproximadamente) Resolução Fluxo (mL/min) Capacidade Espessura do filme líquido (µm)

1-5 2-4 1.000 5.000 Baixa 10 - 60 10 µg / pico 10

5 - 60 0.10 - 0.53 5.000 300.000 Alta 0.5 – 2.0 <100 ng / pico 0.1 – 5.0

C.4. ATENUAÇÃO

O atenuador é um dispositivo relacionado com a intensidade de corrente elétrica enviada ao registrador. O sinal elétrico é reduzido com a presença de resistências associadas ao circuito que liga o detector ao registrador. Assim, o sinal que chega ao registrador é reduzido. Isto não altera a resolução dos picos, mas modifica o tamanho dos mesmos.

Fig. 6 - Esquema simplificado do sistema de atenuação.

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C.5 ÁREA DO PICO

A quantidade de substância injetada vai gerar um sinal no detector. Quanto maior a quantidade, maior o sinal elétrico. De acordo com a difusão longitudinal, as moléculas não saem todas juntas, gerando um conjunto de sinais em forma de pico para cada substância que alcança o detector. A quantidade de substância então será proporcional à área do pico cromatográfico. Como esta área é obtida através da contagem de sinais elétricos, normalmente ela não tem unidade. EXERCÍCIOS

1) Assinale o parâmetro cromatográfico que quando é alterado não afeta o tempo de retenção de uma determinada substância. A- ( ) temperatura do forno das colunas.

D- ( ) polaridade da fase estacionária.

B- ( ) vazão do gás de arraste.

E- ( ) % de fase estacionária no suporte sólido.

C- ( ) temperatura do forno do detector. 2) Após a injeção de 2,0 mL de uma certa solução amostra, em atenuação 100x, achou-se para uma certo componente, uma área de 12.000. Usando-se um volume injetado de 1,0 mL e atenuação 500x, considerando as demais condições iguais, a nova área do pico esse componente será: A- ( ) 1.200

B- ( ) 6.000

D- ( ) 24.000

E- ( ) 60.000

C- ( ) 12.000

3) Uma amostra contendo quatro componentes originou o cromatograma a seguir:

Ao diminuir-se a temperatura de análise, obteve-se o seguinte resultado:

Explique quais as possíveis causas que originaram a obtenção de cromatogramas diferentes e quais as formas de confirmar isso.

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4) Um cromatograma obtido num cromatógrafo a gás apresentou o seguinte aspecto: Um analista desejando otimizar as condições de análise, introduziu algumas alterações no cromatógrafo, uma por vez. Diga quais foram as alterações para cada um dos cromatogramas a seguir:

5) Um analista injetou 0,5 mL de água deionizada em cromatógrafo a gás com atenuação = x 10, coluna Porapak-Q com 3,0 metros de comprimento, vazão do gás de arraste de 40 mL/min, temperatura das colunas = 70ºC; temperatura do vaporizador = 120ºC; temperatura do detector = 200ºC; velocidade do papel = 2,0 cm/min, obtendo o cromatograma ao lado:

Considerando que o analista esperava obter um só pico, uma explicação plausível para o cromatograma obtido é: A-( )

a temperatura do forno da coluna estava abaixo do ponto de ebulição da água.

B-( )

a temperatura do forno do detector estava muito alta decompondo assim a amostra.

C-( )

a vazão do gás de arraste estava muito baixa, favorecendo a difusão dos gases.

D-( )

a amostra foi introduzida no vaporizador em tempos distintos havendo erro na injeção.

E-( )

a amostra estava contaminada com NaCl proveniente da resina trocadora de íons.

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6) Observe as estruturas das seguintes fases estacionárias: Poli (100% dimetilsiloxano) ou DB1

Fase ligada não polar Faixa operacional de temperatura -

Poli (5% fenil – 95% dimetilsiloxano) ou DB5

Fase ligada polaridade intermediária Faixa operacional de temperatura

Polietieleno glicol – PEG ou Carbowax 20M

Fase ligada polar Faixa operacional de temperatura +50ºC até +280ºC.

-60ºC - +320ºC

60ºC - +320ºC

Uma mistura de Tolueno (PE 111ºC), Naftaleno (PE 218ºC), Hexanol (PE 157ºC), Fenol (182ºC), Decano (174ºC) e Dodecano (216ºC) foi injetada em colunas contendo as fases indicadas, obtendo-se os cromatogramas abaixo.

Compare os cromatogramas e explique a ordem de saída dos componentes em cada fases, baseando-se na pressão de vapor dos componentes e na polaridades relativasdas substâncias e das fases. Substâncias Tolueno Hexanol Fenol Decano Naftaleno Dodecano

Polar Não Sim Sim Não Não Não

Aromático Sim Não Sim Não Sim Não

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Ponte H Não Sim Sim Não Não Não

Dipolo Induzido Sim Sim Não Induzido Não

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7) Um analista injetou num cromatógrafo a gás uma mistura contendo cinco substâncias, obtendo o seguinte cromatograma:

A) Como você avalia esta análise do ponto de vista econômico? Justifique. B) O que se poderia fazer para melhorar? Justifique.

8) O resíduo de evaporação de hexano comercial forneceu o seguinte cromatograma:

O que aconteceria se: A) Utilizassemos uma coluna com o dobro de comprimento da usada? B) Desejássemos saber se existe tolueno e benzeno no resíduo? C) Aumentássemos a vazão do gás de arraste?

D) Injetássemos o hexano e não o seu resíduo de evaporação ? E) Diminuíssemos a atenuação ? 9) Um analista quer identificar tolueno numa amostra com benzeno, tolueno, xilenos (orto, meta, para), p-etil-tolueno e p-propil-tolueno, utilizando uma coluna apolar. Injetou os padrões individualmente e uma mistura contendo todos os padrões, verificando que o tolueno tinha o mesmo tempo de retenção do o-xileno. Como ele deve proceder para saber se há realmente tolueno na amostra? Explique o procedimento a ser adotado, prevendo inclusive qual deverá ser a ordem de saída das substâncias. Leve também em conta que os pontos de ebulição dos xilenos estão na ordem: o-xileno< m-xileno< p-xileno.

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10) Um analista realizou uma análise de ésteres metílicos lineares com 10, 11 e 12 átomos de carbono a 120oC utilizando uma coluna de DEGS, obtendo o cromatograma abaixo:

Utilizando as mesmas condições de análise, o analista injetou alcanos lineares de 10, 11 e 12 átomos de carbono, obtendo o cromatograma abaixo:

A) A fase estacionária é polar ou apolar? B) Qual a provável ordem de saída dos compostos nos dois cromatogramas? C) O que deveria ser feito para melhorar a primeira análise, utilizando a mesma coluna? D) Como você faria uma análise qualitativa no 2O cromatograma? E) O que aconteceria se fosse alterada a velocidade do papel? F) Se fossem misturados esses alcanos e ésteres, como ficaria o cromatograma, nas mesmas condições cromatográficas? O que deveria ser feito para otimizar o cromatograma da mistura? 11) O que ocorrerá numa análise cromatográfica se: a) a temperatura do injetor é inferior ao ponto de ebulição de um componente da amostra? b) o volume injetado é muito grande? c) a temperatura da coluna é aumentada além da temperatura máxima recomendada? d) a temperatura do detetor for diminuida? e) injetar-se, distraidamente, uma solução de NaOH. f) a temperatura da coluna é inferior ao ponto de ebulição de um componente da amostra? g) o septo do injetor estiver muito furado? h) a temperatura do injetor for muito alta? 15

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12) Observe a tabela de tempos de retenção relativos2 para a H2O, n-propanol e heptano em várias colunas. Fase estacionária Temperatura da coluna água n-propanol heptano

Carbowax 20M 70oC 6 4,3 1

SE-30 70oC 1 1,5 7

Glicerol 50oC 90 2,3 1

DEGS 70oC 1 4 1,2

Esqualano 60oC 1 2,5 10

Em função da magnitude dos valores de retenção relativa encontrados e da polaridade das substâncias analisadas, colocar as fases em ordem crescente de polaridade. Justifique. 13) A reação do resorcinol ( I ) com o iodeto de metila (MeI) em condições estequimétricas (1:1 em mol) fornece uma mistura dos produtos ( II ) e ( III ), além de uma certa quantidade de ( I ) que não reagiu. A reação é: OH + MeI (I)

OMe

OMe +

OH

(II)

OH

(III)

OMe

O cromatograma A representa a injeção da mistura equimolar de ( I ) e MeI antes de reagir, enquanto que o cromatograma B corresponde à injeção de uma alíquota do meio reacional após meia hora de reação. A partir de então, a cada intervalo de meia hora, retirou-se alíquotas do meio reacional e o aspecto dos cromatogramas obtidos não foi diferente do cromatograma B, indicando que a reação havia chegado ao equilíbrio. Observe os cromatogramas abaixo e responda:

a) A provável ordem de saída, sabendo que a fase é polar. b) Por que o sinal 4 é mais largo que os demais? c) Se utilizasse uma quantidade bem maior, em moles, de MeI em relação a I, obter-se-ia após um determinado tempo, um cromatograma com somente dois picos. Explique e desenhe o referido cromatograma.

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Retenção relativa é a razão entre os tempos de retenção de duas substâncias, ou seja, Trx/Trref.

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14) A reação de desidratação do etanol (CH3CH2OH ® CH2CH2 + H2O) foi monitorada por cromatografia. Após 5 minutos de reação, obteve-se o cromatograma ao lado, onde L1 = 3,00 cm, L2 = 4,80 cm e L3 = 7,50 cm. Vel. do papel = 12 cm/min. Decorridos 15 minutos, nova injeção foi realizada nas mesmas condições anteriores, obtendo-se o seguinte cromatograma: Outros dados obtidos a partir do cromatograma foram reunidos na tabela abaixo: 1o cromatograma 2o cromatograma b (base) h (altura) b (base) h (altura) Pico 1 0,20 0,40 2,30 3,50 Pico 2 2,30 6,20 2,00 4,02 Pico 3 0,10 0,20 1,35 2,70 a) Qual a razão entre as massas de etanol no primeiro e segundo cromatograma? Dados

b) Qual a ordem de saída dos componentes na coluna, já que a fase estacionária é polar? Justifique. c) Qual o tempo de retenção de cada substância? d) Sabendo-se que o éter dietílico é um produto secundário da reação, onde ele poderia aparecer num outro cromatograma obtido após a injeção dos dois primeiros? e) Caso o pico do éter fosse obtido fundido ao seu vizinho no terceiro cromatograma, o que você faria para tentar separá-los? D. DETECTORES

Até esse momento, foram apresentados

todos os componentes de um sistema

cromatográfico à gás. Entretanto, faz-se necessária uma complementação sobre o princípio de funcionamento dos detectores, para que se possa compreender melhor como a presença de substâncias nos mesmos pode ser convertida em sinal elétrico. Atualmente existem vários tipos de detectores, com princípios de funcionamento completamente diferentes. Se verá neste capítulo os dois mais largamente utilizados, que são o detector de condutividade térmica (DCT) e o detector de ionização em chama (DIC). D.1. DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT)

Baseia-se na capacidade das substâncias de conduzirem calor. Essa característica depende da estrutura molecular de cada substância.

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Tem-se um filamento (resistência) onde se faz passar corrente elétrica. A resistência do circuito gera calor e faz o filamento se aquecer. ET = R ´ i2 , onde ET é a energia térmica gerada. Em maiores temperaturas, a resistividade dos materiais é maior, a resistência aumenta e a corrente cai se o potencial é constante (V = R ´ i), diminuindo a quantidade de calor gerado. A temperatura continua subindo e o calor gerado diminuirá até que o calor dissipado seja igual ao calor gerado e a temperatura se estabilize. Deixando um fluxo da gás em contato com esse filamento (fig. 9), mais calor poderá ser dissipado pelo fluxo gasoso e a temperatura e a resistividade do filamento diminuem. Com a resistência diminuída, a corrente que passa pelo filamento aumenta. A corrente que passa pelo filamento depende do potencial usado, do fluxo do gás de arraste e do tipo de gás que está sendo utilizado, já que há gases com maior condutividade térmica que outros, isto é, há gases com maior capacidade de dissipar calor do que outros. Quando passa um gás diferente do gás de arraste, há uma variação de corrente, causada pela diferença de condutividade térmica dos gases. Quando volta a passar gás de arraste, a corrente volta ao nível anterior. Isso será assinalado pelo registrador.

Fig. 9 - Corte esquemático de um DCT

Analisando um circuito mais sofisticado:

Fig. 10 - Detector de condutividade térmica com dois resistores.

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Conforme a figura 10, haverá resistências ou termistores em dois pontos do fluxo gasoso, um antes do ponto de introdução da amostra e outro na passagem do efluente da coluna. Como inicialmente, somente o gás de arraste passa pelos filamentos, estes, estando associados a uma ponte de Wheatstone, darão uma condição de equilíbrio, ou seja: R1 ´ R3 = R2 ´ R4 Quando a substância a ser analisada eluir da coluna, haverá uma condição de desequilíbrio (R1 x R3 ¹ R2 x R4), porque a condutividade térmica da substância juntamente com o gás de arraste será diferente da condutividade térmica do gás de arraste puro. Gera-se, portanto, um sinal que é amplificado e no registrador forma-se o pico correspondente à substância que foi detectada. Um outro sistema pode ser montado, trabalhando com duas colunas (referência e indicação) que são acopladas, cada uma, a dois termistores, em ramos opostos da ponte de Wheatstone. A figura 11 ilustra a montagem, que dá um sinal de maior intensidade. 1- Fonte 2- Ajuste de corrente 3- Miliamperímetro 4- Filamento de detecção 5- Filamento de referência 6- Ajuste do zero grosso 7- Ajuste do zero fino 8- Sistema de atenuação 9- Registrador FA - Fluxo de gás coluna de análise FR - fluxo de gás coluna de referência

Fig. 11 - Circuito elétrico simplificado de um DCT.

Observando-se os dados de condutividades térmicas da tabela 2, pode-se notar a acentuada diferença existente entre os valores referentes aos gases normalmente utilizados como fase móvel e os valores referentes à maioria das substâncias. A condutividade térmica do nitrogênio aproxima-se mais das condutividades dos compostos orgânicos, levando a uma menor sensibilidade de detecção, quando o mesmo é utilizado como gás de arraste. Tabela 2 - Valores de condutividade térmica de compostos. Substância Cond. Térmica Substância Cond. Térmica (cal.s-1.cm-1.F-1) (cal.s-1.cm-1.F-1) He 36,0 Cl2 2,11 H2 44,5 Br2 1,16 N2 6,24 C6H6 2,56 Ar 4,25 CH3OH 3,68 CH4 8,18 C2H5OH 3,47 CO2 3,96 H2O 4,25 19

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O DCT responde a todos os tipos de compostos orgânicos e inorgânicos que possam ser analisados por CG e não é destrutivo, tornando-se muito útil para trabalhos em escala preparativa. D.2. DETECTOR DE IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC)

Baseia-se na condutividade elétrica dos íons formados na chama do detector. A condutividade elétrica de um gás é proporcional à concentração das partículas com carga dentro do volume de gás. Nesse detector, tem-se inicialmente somente a passagem do gás de arraste e a quantidade de íons produzidos é bem pequena. Quando um composto orgânico passar pela chama, haverá uma produção maior de cargas devido à formação de íons e elétrons livres, dentre outros, gerando um aumento na corrente. Um esquema do DIC é mostrado a seguir:

Fig. 12 - Detector de ionização em chama.

Tem-se a chama formada por ar (O2) e hidrogênio e, lateralmente, dois eletrodos com potencial aplicado por uma fonte externa. A chama de hidrogênio produz poucos íons, em comparação com outras substâncias combustíveis. Quando um composto orgânico passa pela chama, formam-se mais íons, aumentando a corrente, que é amplificada, originando, posteriormente, o pico cromatográfico no registrador. O DIC só responde aos átomos de carbono oxidáveis. A intensidade de resposta decresce à medida em que aumenta a substituição por halogênios, grupos amina ou grupos hidroxila. Como se comportará o DIC quando passarem pela chama substâncias tais como H2O, CO2 ou CS2 ? E quanto aos compostos inorgânicos?

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Tabela 3 - Comparação entre os dois detectores Tipo de Detector D.C.T. D.I.C. Faixa de linearidade 105 107 Quantidade mínima detectável 10 ng 10 pg Sensibilidade do detector menor maior Universo de substâncias detectáveis universal seletivo Conservação das amostras não-destrutivo destrutivo Controle da temperatura rigoroso não rigoroso Existem outros tipos de detectores que são mais seletivos, como por exemplo: o detector de

captura de elétrons e o detector fotométrico. O primeiro é utilizado para análise de compostos halogenados, anidridos, peróxidos, nitrilas e organo-metálicos, dentre outros. O segundo é utilizado normalmente para análise de compostos sulfurados e fosforados. EXERCÍCIOS

1) Explique porque os cromatógrafos à gás com detectores de condutividade térmica, normalmente, operam com 2 colunas ao invés de uma só. 2) Os cromatogramas abaixo apresentam uma análise feita por cromatografia gasosa, onde fez-se a amostra passar simultaneamente por dois detectores (ionização em chama, DIC e condutividade térmica, DCT). Comente as diferenças presentes nos dois cromatogramas em termos de sensibilidade e seletividade e indique o procedimento mais indicado para quantificar as substâncias A e B presentes na amostra. Considere os sinais positivos para ambos os detectores.

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3) Um detector termossensível baseia-se no fato de que a resistividade de um filamento varia com a temperatura, emitindo então sinais que são registrados. Das duas montagens abaixo, qual seria a melhor e por que? Considere os circuitos elétricos utilizados e que a voltagem da fonte pode oscilar.

4) Uma análise realizada em cromatógrafo a gás com DCT forneceu o seguinte cromatograma:

Seria vantajoso fazer a análise em um cromatógrafo a gás com DIC ? Explique. 5) Correlacione as colunas: 1- Injetor

( ) Compõe a fase móvel na CG

2-Gás de arraste

( ) Promove a separação cromatográfica

3- Manômetro

( ) Vaporiza a amostra

4- Coluna

( ) Promove o aquecimento do detector

5- Forno

( ) Envia sinal elétrico para o amplificador

6- Detector

( ) Controla a pressão do gás

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6)Em um cromatógrafo operando com DCT injetou-se uma amostra e obteve-se um cromatograma com áreas iguais de H2O e EtOH. Considerando o gás de arraste Hélio e as condutividades térmicas dadas abaixo, complete as frases abaixo e justifique cada opção. Condutividade térmica a Oº C (valores fictícios) He

33,60

H2O

9,400

N2

8,332

EtOH

5,024

a) O teor de H2O nessa amostra é _______________ (maior, menor ou o mesmo) do que o de EtOH b) Numa mistura de concentrações iguais de H2O e EtOH, a área __________ (maior ou menor) seria a do EtOH. c) Numa mistura de concentrações iguais de H2O e EtOH, se o N2 fosse o gás de arraste, a área__________ (maior ou menor) seria a do EtOH. d) Se o detetor utilizado fosse o DIC ao invés do DCT, após injeção de mesmo volume da mesma amostra, usando o N2 como gás de arraste, o sinal relativo à ____________ (H2O ou EtOH) não apareceria no cromatograma. 7) Dentre as alternativas abaixo, a única determinação quantitativa que é impossível se fazer por cromatografia gasosa com DIC é o teor de: A-

( ) metanol em bebidas alcoólicas.

B-

( ) Octano em gasolina.

C-

( ) mentol (monoterpeno) em creme para a pele.

D-

( ) metano em gases provenientes de biodegradação.

E-

( ) vapor d’água no ar atmosférico.

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8) Para ligar um cromatógrafo à gás com DCT e gás de arraste He, um analista regulou a vazão do gás de arraste, as temperaturas dos fornos, a corrente de alimentação do DCT, um valor adequado de atenuação, zerou o aparelho (balanceou a ponte de Wheatstone) e finalmente ligou o motor do registrador com uma determinada velocidade e, sem efetuar nenhuma injeção, observou que a linha de base do cromatograma subia indefinidamente, conforme a figura abaixo. Assinale, dentre as alternativas abaixo, a única que se refere à hipótese improvável para

explicar

o

fenômeno

observado

(explique cada item):

A-

( )

B-

( )

CD-

( ) ( )

E-

( )

A coluna necessita de um recondicionamento, pois há substâncias dentro dela, proveniente de outras análises, que ainda não saíram totalmente. A temperatura do forno das colunas está regulada em um valor acima de ponto de ebulição da fase estacionária líquida, ocorrendo “sangramento da coluna”. A temperatura do forno do detetor ainda não está estabilizada. Os filamentos do detetor são sensíveis a uma determinada substância que impregna o ar do laboratório. Alguma região da linha do cromatógrafo (injetor, coluna, detetor ou tubos conectores) está suja.

9) Injetou-se uma amostra em um cromatógrafo à gás com DCT e gás de arraste He e observou-se no cromatograma obtido a formação de picos negativos, conforme ilustra a figura abaixo. Assinale, dentre as alternativas abaixo, a única hipótese provável para explicar o fenômeno observado.

A-

( ) A corrente de alimentação do DCT estava desligada.

B-

( ) Todas as substâncias analisadas na amostra têm condutividade térmica maior do que a do gás de arraste.

C-

( ) A polaridade da ponte de Wheatstone do DCT estava invertida.

D-

( ) A velocidade do papel do registrador foi regulada para um valor muito alto.

E-

( ) A atenuação usada estava muito pequena para a quantidade de amostra analisada.

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10) Observe os cromatogramas A e B obtidos a partir de uma mistura gasosa com concentrações molares iguais de metano, metanol e vapor d’água em uma coluna de característica polar, um detetor de condutividade térmica e um tipo de gás de arraste para cada cromatograma (considere as demais condições cromatográficas iguais).

Com base na intensidade dos sinais obtidos, na ordem de saída mais provável e nos valores de condutividade térmica dados (unidades relativas), os gases de arraste usados em cada cromatograma são, respectivamente: H2 = 44,5

He = 36,0

CH4 = 8,22

N2 = 6,24

H2O = 4,25

CH3OH = 1,00

( ) hélio e nitrogênio.

( ) nitrogênio e hélio.

( ) hélio e hidrogênio.

( ) nitrogênio e hidrogênio.

( ) hidrogênio e hélio.

E.MÉTODOS QUANTITATIVOS E.1. INTRODUÇÃO

A área sob um pico cromatográfico, originado a partir da passagem de uma determinada substância pelo detector, é proporcional à quantidade presente na amostra dessa mesma substância. Logo, a determinação dessa área servirá para quantificar o constituinte da amostra. O cálculo da área pode ser feito por algumas técnicas de integração. Mas, para que esse valor de área possa realmente expressar uma concentração, são necessárias algumas condições: 1. A existência de padrões com pureza confiável que possam ser utilizados nos cálculos. 2. Os compostos de interesse não podem sofrer decomposição térmica ou decomposição catalítica no sistema cromatográfico e nem ficarem retidos permanentemente. 3. O pico de interesse deve corresponder somente a uma substância, ou seja, não tenha ocorrido coeluição. 4. A quantidade de massa analisada esteja na faixa linear de resposta do detector, do amplificador e do sistema de integração.

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5. Dependendo do método de cálculo, o operador deve ter conhecimento da existência ou não de substâncias não detectáveis e/ou não eluídas. 6. Repetibilidade na operação do cromatógrafo, isto é, as temperaturas e vazões utilizadas, etc, para que se possa reproduzir corretamente os dados de retenção e resolução. 7. Amostragem correta do sistema a ser analisado. 8. Precisão e exatidão à altura das exigências do método analítico na determinação das áreas dos picos. 9. Análise das fontes de erro ao longo de todo processo para que o resultado final seja expressado com a precisão correta. E.2. DETERMINAÇÃO DAS ÁREAS DOS PICOS

A escolha do método a ser utilizado na determinação das áreas dependerá da precisão e exatidão desejadas, do tempo e recursos humanos, técnicos e financeiros disponíveis. Como exemplo, a tabela 4 mostra os resultados da determinação das áreas do cromatograma de uma mesma amostra feitos por diferentes técnicas de integração.

Tabela 4 - Comparação das técnicas de integração de áreas planímetro triangulação H´L (1/2 H)

cortar e pesar

disco de bola

digital

Propano

Área média 0,04

C.V. % 20

Área média 0,05

C.V. % 14

Área média 0,04

C.V %. 12

Área média 0,01

C.V. % 14

Área média 0,04

C.V. % 18

Área média 0,03

C.V. % 10

Isobutano

4,8

1,7

4,8

8,7

4,5

3,8

5,0

2,0

4,6

0,4

4,6

0,9

n-Butano

14,0

5,6

13.7

4,5

13,6

1,6

15,0

2,8

14,1

1,0

14,1

0,4

1-Buteno

18,5

3,3

18,5

4,8

18,6

3,1

18,4

1,2

18,7

2,5

18,7

0,3

trans-2-Buteno

20,2

6,5

20,3

3,3

20,1

2,0

20,1

1,4

20,2

1,1

20,2

0,2

cis-2-Buteno

16,1

3,7

15,8

1,6

16,4

3,7

15,9

1,5

16,1

0,7

16,0

0,4

Butadieno

18,2

2,0

18,3

1,8

18,2

1,7

17,6

1,2

18,3

0,7

18,3

0,5

Isobuteno

8,1

5,7

8,6

3,7

8,6

2,2

8,0

2,1

8,1

2,6

8,2

0,5

Tempo de cálculo (min) D.D.R.

45/60

45/60

50/60

100/120

15/30

5/10

4,1

4,1

2,6

1,7

1,3

0,4

C.V.= coeficiente de variação

D.D.R.= desvio relativo ao valor real

A escolha do método de análise quantitativa depende da precisão desejada, do tempo necessário, do custo e do equipamento disponível no laboratório para efetuar as medições e,

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também, do aspecto dos picos. A combinação de todos esses fatores é que vai definir o método a ser adotado. E.3. CÁLCULOS QUANTITATIVOS

Quatro métodos são geralmente utilizados na determinação quantitativa dos componentes da amostra3: normalização interna, normalização de áreas, padronização externa e padronização interna. E.3.1. NORMALIZAÇÃO INTERNA

A área de um sinal cromatográfico é dada pela equação a seguir e é proporcional à concentração da substância que passa pelo detector: S=

k x C x Vinj At

Onde S é a área do pico, determinada no cromatograma, k é a cte. de proporcionalidade que depende da interação da substância com o sistema de detecção, C é a concentração da substância eluída, Vinj é o volume injetado e At é a atenuação. Se o valor de k é o mesmo para todos os componentes da amostra e se também todos eles estiverem devidamente registrados no cromatograma, pode-se considerar que o percentual de área corresponde ao percentual de massa. Como exemplo, observe o cromatograma de uma amostra que contém somente as substâncias A, B e C (figura 13).

Fig. 13- Cromatograma das substâncias A, B e C.

A determinação quantitativa da substância "B" no cromatograma acima seria simplesmente a porcentagem de sua área em relação à área total, isto é:

% B =

SB ´ (1 0 0 ) S å i

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Limitações:

Vantagens:

· é simples e prática, sendo ideal para análises · essa técnica não serve para amostras mais

de rotina em que a exatidão não é um fator importante.

complexas. · exige o registro de todos os componentes da

· independe do volume injetado.

amostra.

· independe da estabilidade do aparelho.

· não é adequada para a análise de traços.

· não é necessária a utilização de padrões.

· normalmente a exatidão é baixa.

E.3.2. NORMALIZAÇÃO DE ÁREAS

Na normalização interna levou-se em consideração que a resposta do detector é sempre a mesma para qualquer substância, ou seja, k é o mesmo para todos os componentes da amostra. Se isso fosse verdade, a substância B teria a mesma área das substâncias A e C se essas três substâncias estivessem na mesma concentração. Isso representaria que o detector teria a mesma sensibilidade para todos os componentes dessa amostra. O que normalmente acontece é que o detector pode responder de maneira diferente para cada substância e, para uma mesma quantidade em massa de substâncias diferentes, fornecer, como resultado, áreas completamente díspares. Quando isso ocorre, o que é a maioria dos casos, a área obtida precisa ser corrigida. Essa correção é feita pela determinação do valor da constante de proporcionalidade k para cada um dos componentes da amostra, que é conhecida como fator de correção ou fator de resposta (f), a partir do cromatograma obtido de padrões das substâncias que compõem a amostra. O procedimento adotado para determinar os fatores de resposta é: ·

Preparar uma solução padrão contendo todos os componentes da amostra, de preferência, na mesma concentração.

·

Injetar essa solução e determinar as áreas dos picos.

·

Considerar uma das substâncias como referência no cromatograma.

·

Determinar os demais fatores a partir da relação entre as áreas da substância desejada e da substância escolhida como referência no cromatograma do padrão. Por exemplo, para calcular os fatores de resposta das substâncias A, B e C de uma amostra

contendo somente essas três substâncias pode-se, a partir das áreas dos picos no cromatograma da solução padrão, empregar as seguintes expressões:

3

A técnica de adição-padrão não será discutida neste texto.

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SA = kA x CA x Vinj /At

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SB = kB x CB x Vinj /At

SC = kC x CC x Vinj /At

Onde segue-se a mesma notação do ítem anterior. Nesse caso, se a substância B for escolhida como referência o seu fator ( fB = KB/KB) será 1 já que:

S A k A C AVinj / At = SB k B C BVinj / At E tem-se, então:

S C k C CCVinj / At = S B k B C BVinj / At

S B k B C BVinj / At = S B k B C BVinj / At fA = SA / SB ;

fB = SB / SB = 1 ;

fC = SC / SB

admitindo que, no padrão, CA = CB = CC. Depois de determinar os fatores de resposta das substâncias a partir dos padrões, deve-se corrigir cada área no cromatograma da amostra, e o cálculo da concentração é similar ao cálculo percentual da normalização interna, só que neste caso utiliza-se as áreas corrigidas4. Assim, o cálculo percentual de uma amostra contendo as substâncias A, B e C fica: %A =

å( f

SA fA

SA A

+

SB fB

+

SC fC

)

´ 100

%B =

å( f

SB fB

SA A

+

SB fB

+

SC fC

)

´ 100

%C =

å( f

SA A

SC fC S + fB B

+

SC fC

)

´ 100

As vantagens e limitações da técnica de normalização de áreas são, praticamente,

as

mesmas da normalização interna exceto que o resultado obtido é mais exato devido à correção das áreas (dependendo fundamentalmente da pureza dos padrões). É uma técnica um pouco mais laboriosa e necessita da utilização de vários padrões, por isso, normalmente só é utilizada para amostras com poucos componentes. E.3.3. PADRONIZAÇÃO EXTERNA5

Como foi visto anteriormente, ambas as técnicas de normalização não servem para amostras mais complexas. Observe a figura 14: Cromatograma 1

(min)

Cromatograma 2

tR

tR (min)

Fig. 14 - Cromatograma 1 - injeção de amostra, Cromatograma 2 - injeção de padrão

4 5

Área corrigida = área calculada / fator de resposta relativo. Também conhecida como calibração absoluta.

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No cromatograma 1, relativo à uma amostra complexa, são registrados doze

sinais. O

cromatograma 2 corresponde a uma solução padrão da substância que gerou o pico no 11. Supondo que o problema em questão fosse quantificar nessa amostra, um determinado componente X que gerou o pico no 11, você seria capaz de listar os motivos pelos quais não é possível lançar mão da técnica de normalização nesse caso? Uma solução plausível para casos como esse é a técnica da padronização externa, onde é preparada uma solução padrão contendo somente a(s) substância(s) de interesse na amostra. A comparação com um padrão externo é possível, baseando-se no pressuposto de que uma substância X terá o mesmo fator de resposta quando presente na amostra ou em uma solução padrão. Pode-se considerar as relações matemáticas a seguir: Sx = fxCx

V in j

no cromatograma 1

S x' = f x C x'

V i n' j

no cromatograma 2

At At' Onde Sx e S’x são, respectivamente, as áreas que a substância X gerou nos cromatogramas

da amostra e do padrão; Cx e C’x se referem, respectivamente, às concentrações de X nas soluções amostra e padrão, f x é o fator de resposta da substância X frente ao detector utilizado, Vinj e V'inj os volumes injetados de amostra e de padrão e At e At’ são as atenuações de trabalho em cada cromatograma. fX e C'x são as incógnitas que podem ser determinadas pelas duas equações.

Para melhorar a precisão do método e também verificar a faixa de linearidade pode-se construir uma curva de calibração (área ´ concentração). Os volumes injetados e a atenuação a diferentes concentrações dos padrões da substância de interesse deverão ser os mesmos6. O procedimento adotado para fazer a curva de calibração é simples: a) Prepara-se padrões da substância a ser analisada. b) Injeta-se os padrões, um a um, e determina-se as áreas pertinentes à substância de interesse.

6

Obviamente, alguns outros parâmetros que podem alterar a área ou a sensibilidade analítica como a temperatura do forno do detector, corrente de alimentação para o DCT, vazão do gás de arraste, etc. deverão ser constantes. A atenuação de trabalho e o volume injetado fazem parte da constante no gráfico.

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Observando-se o exemplo da figura 15 e considerando C1< C2< C3< C4< Cn , tem-se que:

Curva de calibração - Padronização Externa

Área

Concentração

Fig. 15 - Curva de calibração na padronização externa.

Como outros métodos analíticos, a determinação da concentração desconhecida na solução injetada, a partir da curva de calibração, é feita por interpolação gráfica da área no cromatograma da amostra ou pela equação da reta determinada por regressão linear. Como sempre, há incerteza quanto ao volume injetado, principalmente, quando são utilizadas microsseringas7. Vantagens :

Limitações :

· basta determinar a(s) área(s) do(s) pico(s) · depende do volume injetado.

de interesse.

· depende da estabilidade do cromatógrafo e do

· independe da detecção de todos os picos.

detector.

serve para amostras mais complexas. · é possível usar essa técnica quantitativa na

análise de traços. · pode-se trabalhar com curva de calibração.

7

A utilização de válvulas de injeção com volumes fixos acarreta menor erro de injeção.

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E.3.4. PADRONIZAÇÃO INTERNA

Como visto anteriormente, na técnica de padronização externa corre-se o risco de não se analisar a amostra exatamente nas mesmas condições dos padrões. Isso pode acarretar erros nos cálculos das concentrações, principalmente com os erros do volume injetado. Por outro lado, isso não é problema na normalização, já que os cálculos (percentual em área e fator de resposta relativo) são feitos a partir da relação entre as áreas de dois picos num mesmo cromatograma.

Assim, alterações que ocorram na sensibilidade do detector e, principalmente, no volume injetado, afetarão os dois picos de modo igual, não interferindo dessa forma no cálculo quantitativo final. A padronização interna é uma técnica na qual um padrão é injetado concomitantemente à amostra desconhecida, isto é, ele é dissolvido na própria amostra e servirá de base para os cálculos quantitativos da substância a ser analisada a partir de uma relação de áreas. A técnica é similar à padronização externa, porém, como veremos adiante, o volume injetado agora é um parâmetro que pouco afeta a análise. O grande problema é escolher um padrão interno8 adequado para a amostra a ser analisada pois este deve atender aos seguintes requisitos: · Não pode estar presente na amostra. · Deve ter comportamento cromatográfico similar ao da substância a ser analisada. · Estar numa concentração conhecida. · Ser estável termicamente. · Não ficar adsorvido permanentemente na fase estacionária.

8 Essa técnica é restrita a soluções líquidas, dada a dificuldade em adicionar, com precisão, padrões internos gasosos em amostras gasosas.

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Observando-se o exemplo a seguir:

- Cromatograma 2 - Solução padrão do componente X. - Cromatograma 3 - Solução padrão de uma substância PI. - Cromatograma 4 - Amostra complexa + PI. - Cromatograma 5 - Solução padrão de X + PI.

Fig. 16 - Cromatograma 1 - Amostra complexa contendo o componente de interesse X, com concentração desconhecida.

É óbvio, observando os cromatogramas da figura 16, que a substância escolhida como padrão é um bom padrão interno (PI) para essa amostra, pois não está presente originalmente no cromatograma 1 (não há nenhum pico proveniente da amostra com o mesmo tempo de retenção do PI), além disso, o PI tem um comportamento cromatográfico similar ao do componente X. Fazendo

a relação da área do componente X (SX) com a área do padrão interno (SPI), pode-se calcular a concentração do componente X na amostra, utilizando a equação final do desenvolvimento a seguir: Sx K C x VinjAt = x SPI K PI C PI VinjAt

Como:

Kx = fX/PI K PI

A equação fica:

C x VinjAt Sx = fX/PI C PI VinjAt SPI

Como o volume injetado e a atenuação são iguais para o X e para o PI para um mesmo cromatograma, tem-se a equação simplificada, que é válida tanto para o cromatograma dos padrões de X mais PI quanto para o cromatograma da amostra mais o PI :

Sx Cx = fX/PI SPI C PI

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No cromatograma do padrão (cromatograma 5), pode-se determinar o fator de resposta relativo de X em função de PI ( fX/PI ) já que ambos têm concentrações e áreas conhecidas. Como o fator de resposta relativo ( fX/PI ) é o mesmo para os cromatogramas da amostra (+ PI) e dos padrões (X + PI), utiliza-se a mesma equação, relacionando as áreas da amostra mais PI (crom. 4) e, como se conhece a concentração do padrão, calcula-se a concentração de X na amostra. Assim como na padronização externa, essa análise pode ser realizada mediante a construção de uma curva de calibração. Essa curva de calibração é feita da seguinte forma: · Preparam-se vários padrões com várias concentrações conhecidas da substância a ser analisada. · Em cada um desses padrões é adicionada uma quantidade tal de padrão interno, de modo que a

área de X não fique muito maior do que a área do PI ou vice-versa9. · Cada um desses padrões é injetado em condições semelhantes e são medidas as áreas da

substância que se quer analisar e do padrão interno. · Constrói-se um gráfico em que a abcissa (x) é a razão da concentração (ou massa) da substância

em análise pela concentração (ou massa) do padrão interno e a ordenada (y) é a relação entre as áreas da substância X e do padrão interno. · Para a análise da amostra desconhecida introduz-se, de preferência, a mesma quantidade de

padrão interno utilizada no preparo dos padrões. · Injeta-se a mistura, calculam-se as áreas da substância X e do PI e as relações entre elas e

interpola-se no gráfico obtido anteriormente, de modo a se obter a relação de concentração. E, a partir do resultado obtido, calcula-se a concentração de X na amostra desconhecida. · Pode-se expressar o eixo X somente como Cx , se a concentração do PI for mantida constante

para todos os padrões e amostra.

Sx/Spi

Curva de calibração Padronização Interna 40 30 20 10 0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

Vantagens : · São as mesmas da padronização externa, acrescentando-se o fato de que o volume injetado e a estabilidade do cromatógrafo deixam de ser um fator limitante. · Não são necessários vários padrões, como acontece na normalização de áreas. Limitações : · Dificuldade na escolha de um padrão interno que atenda a todos os requisitos necessários.

Cx/Cpi

9

Se possível, é interessante manter a concentração do padrão interno fixa enquanto a de X varia.

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EXERCÍCIOS

1)Uma amostra de três substâncias A, B e C foi analisada cromatograficamente e foram obtidos 3 picos distintos. O papel que registrou estes picos foi recortado no formato de cada um deles, de modo que cada pico foi pesado numa balança analítica e obteve-se 0,5710 g, 0,2230 g e 0,1240 g para A, B e C, respectivamente. Supondo que o papel tenha peso uniforme, calcule a % de B na amostra, levando em conta que o fator de resposta do detector é igual para as três substâncias. 2)Há possibilidade de se fazer uma análise por cromatografia gasosa se a constante k for diferente para cada componente da amostra? Justifique, descrevendo o procedimento a ser efetuado. 3)O cromatograma A corresponde a uma alíquota de 1,5 mL de uma amostra contendo somente as substâncias A, B, C, D e E, e o cromatograma B a uma alíquota de 1,0 mL de uma mistura padrão (em %p/p) de A (32%), B (38%) e C (30%). Considerando que B tem o mesmo fator de resposta que E e que C tem o mesmo que D, determine os valores de área por triangulação e o teor de A na amostra. ÁREAS

4) Uma amostra de 3 substâncias A, B e C foi analisada cromatograficamente, obtendo-se três picos 2

2

distintos. Estes picos apresentaram áreas iguais a 57,10 mm , 22,30 mm

2

e 12,40 mm

respectivamente. Calcule a porcentagem de B na amostra, levando em conta que A, B e C têm fatores de resposta iguais a 1,0; 1,5 e 2,0 respectivamente.

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5) 1,0 mL de uma mistura de 0,537 g de n-butanol e 0,497 g de dioxano foi injetada em uma coluna carbowax em um cromatógrafo à gás com atenuação na posição (´50), obtendo-se áreas de 104 mm2 para o n-butanol e 127 mm2 para o dioxano. 1,0 mL de uma mistura desconhecida das mesmas substâncias forneceu em atenuação (´10) as áreas de 400 mm2 e 228 mm2, respectivamente. Determine a concentração % v/v de cada solvente na mistura desconhecida. Dados de densidade (g/mL) : n-butanol= 0,810;

dioxano= 1,034.

6) Deseja-se quantificar, por CG, uma determinada amostra, para tanto pesou-se 4,28 g da amostra e diluiu-se com solvente adequado a 250,00 mL. Injetou-se 1,5 mL e obteve-se áreas de 23678 para A, 18245 para B e 3228 para C. Sabendo-se que os fatores de resposta, determinados a partir do cromatograma de uma solução com pesos conhecidos de A, B e C, são fA=1,60; fB=1,00 e fC=1,23, responda os ítens abaixo, considerando que a amostra contem somente A, B e C. a) O teor de A na amostra é ____________%. b) A massa de B presente na amostra é __________g. c) Em uma solução padrão com concentrações iguais de A, B e C, a área maior deverá ser a da substância _________. 7) Para analisar uma mistura de benzeno e acetona, misturaram-se massas iguais de cada substância e 1,50 mL desse padrão foram injetados num cromatógrafo a gás, obtendo-se dois picos distintos nas condições utilizadas. Em seguida foram injetados 3,00 mL da amostra a ser analisada. As áreas obtidas foram: amostra (cm2) benzeno 20,32 acetona 35,62 a) Qual é a concentração em % p/p de acetona na amostra?

padrão (cm2) 12,50 15,00

b) Refaça os cálculos usando a padronização externa, ou seja, considerando apenas os dados reverentes à acetona. c) Por que nesse caso, a técnica de normalização de áreas é melhor do que a padronização externa ?

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8) Um frasco de metanol foi contaminado com água. A fim de

Cromatograma A

utilizar esta mistura para fins analíticos, um químico decidiu analisar por cromatografia gasosa o teor de água no MeOH. Para tanto, realizou 2 injeções com o cromatógrafo nas mesmas condições. O cromatograma (A) foi a amostra e o cromatograma (B) foi uma

Cromatograma B

mistura padrão de 5,00 g de água destilada com 5,00 g de metanol PA, contendo 1,50% de água. Considerando a coluna polar, pede-se:

a) A identificação dos picos da amostra. Justifique. b) Qual é o teor de água no metanol ? 9) Numa análise cromatográfica, foram obtidos os seguintes resultados em percentual em área a partir do integrador eletrônico: % em área A B C Padrão 1:1:1 em massa 32 40 28 Amostra 36 40 24 Sabendo-se que o volume injetado em ambos os casos foi de 1,0 mL e a amostra é composta

somente por A, B e C, a concentração percentual corrigida de C na amostra é _______________%. Se o volume injetado fosse 2,0 mL para a amostra e 3,0 mL para o padrão, a concentração percentual de A seria __________________ %. 10) Deseja-se determinar o teor de cânfora e de carvona, monoterpenos encontrados em óleos essenciais. Para tal, 2,90 g do óleo contendo cânfora e carvona foram dissolvidos e diluídos em 100,00 mL de clorofórmio PA (sol. A). Uma alíquota de 5,00 mL da sol. A foi transferida para um balão volumétrico de 100,00 mL e diluída com clorofórmio PA até o traço de aferição (sol. B). 2,00 mL da sol. B foram injetados em um cromatógrafo com DIC e a área obtida no integrador pertinente à cânfora foi de 55420 e de 18020 relativa à carvona. Uma solução padrão de cânfora e de carvona contendo 3,58 g e 4,05 g de cada substância, foi preparada diluindo-as em b.v. de 100,00 mL em clorofórmio PA (sol. C). Em seguida, uma alíquota de 10,00 mL da sol. C foi transferida para um b.v. de 100,00 mL e avolumada em clorofórmio PA (sol. D). Depois misturou-se 20,00 mL da sol. D e 50,00 mL de clorofórmio PA (sol. E). Injetou-se 1,00 mL da solução E e as áreas de cânfora e de carvona foram 40877 e 43001. Determine o teor de cânfora e de carvona no óleo essencial.

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11) A fim de analisar o teor de acetaldeído em vinho, um analista fez 2 injeções em um cromatógrafo a gás operando com DCT. A primeira era constituída de uma mistura de 16,00 g de vinho com 0,0200 g de propanol (substância que o vinho não contém). A segunda injeção era constituída de uma solução aquosa de n-propanol a 0,058% e acetaldeído a 0,062%. As condições foram: Picos:

1- ar 2- água

Programa de temperatura :

3- acetaldeído Coluna :

porapak Q

4- etanol

Atenuação :

x 50

5- n-propanol

Volume de amostra :

1,0 mL

6- provavelmente, um álcool

Velocidade do papel :

0,25 pol./min

superior

Os cromatogramas obtidos foram:

Baseado nestes dados, calcule o teor de acetaldeído em vinho. Para melhorar esta análise poderia mudar-se o tipo de detector utilizado. Explique. 12)Determinou-se o teor de benzeno em tolueno comercial (toluol) por cromatografia gasosa a partir do seguinte procedimento: 1. Injetou-se uma alíquota de 2,00 mL da amostra em um cromatógrafo com DIC e atenuação (´ 30) e obteve-se o cromatograma abaixo, donde verificou-se que o sinal no 2 corresponde ao benzeno. 2. Preparou-se seis padrões em balões volumétricos de 25,00 mL, a partir de uma solução estoque de benzeno em tolueno a 0,100 g/L feita recentemente a partir dos solventes cromatograficamente puros, conforme a tabela abaixo.

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3. Injetou-se, com auxílio de uma válvula de injeção, 2,00 mL de cada padrão no mesmo cromatógrafo, com atenuação (´50). 4. Calculou-se a área correspondente ao benzeno em cada cromatograma por triangulação. Os volumes de alíquotas da solução estoque usada para preparar os padrões, medidos em bureta, e as áreas encontradas para o benzeno encontram-se na tabela abaixo: Área (cm2)

Volume de alíquota da solução estoque (mL) 15,00 12,00 10,00 6,00 4,00 1,50

0,51 0,41 0,32 0,21 0,13 0,055

Curva de calibração do benzeno

Área

Padronização externa 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Conc. (g/L)

y = 8,4x + 0,0

a) Faça uma tabela de valores para a curva de calibração e determine a área do benzeno na amostra por triangulação. b) Por interpolação gráfica, determine a concentração em ppm de benzeno no toluol. c) Por que, neste caso, a metodologia de normalização de áreas não é adequada para determinar a concentração de benzeno no toluol? Cite pelo menos três motivos e justifique.

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13) Um analista deseja determinar a concentração de água residual em THF (tetraidrofurano) comercial por cromatografia gasosa. O cromatograma A é relativo à amostra de THF comercial, onde está assinalado o pico correspondente à água. A fim de escolher um padrão interno adequado, foram coinjetadas várias substâncias com a amostra e obtiveram-se os cromatogramas B (coinjeção de metanol), C (coinjeção de acetona), D (coinjeção de glicerol) e E (coinjeção de etanol). Após optar pelo EtOH como padrão interno, o analista preparou vários padrões contendo EtOH e H2O diluídos em THF anidro e obteve os cromatogramas F, G, H , I e J. a) A partir dos dados contidos na tabela abaixo e da curva de calibração, determine a concentração de água no THF comercial em ppm. b) Justifique a escolha do EtOH como padrão interno. solução analisada amostra

Área dos picos (mm2) EtOH H2O 22,9 23,2

C (ppm) EtOH 25

C (ppm) H2O ?

vol. inj. (mL)

cromatograma

1,0

E

padrão 1

23,0

3,0

25

5,0

1,0

F

padrão 2

23,0

8,2

25

10

1,0

G

padrão 3

22,5

20,3

25

25

1,0

H

padrão 4

22,7

28,7

25

35

1,0

I

padrão 5

23,4

41,5

25

50

1,0

J

Curva de calibração de água em THF Padronização interna

S água / S etanol

2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0

10

20

30

40

50

Conc. de água (ppm)

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14) Desejando determinar o teor de ácido láurico (C12H24O2) em óleo de milho, um analista optou pela técnica de cromatografia gasosa. Procedeu ao tratamento da amostra, pesando 1,250 g do óleo de milho e dissolvendo-o em CHCl3, completando o volume a 100,00 mL em balão volumétrico 9

(sol. A). Em seguida, uma alíquota de 2,00 mL foi tratada com excesso de diazometano , misturada com 2,00 mL de uma solução a 0,0500 g/L de amilato de metila (substância que o óleo de milho

não contém) e diluída em balão volumétrico até 100,00 mL com CHCl3 (sol. B). Injetou-se 1,5 mL da solução B no cromatógrafo, obtendo um cromatograma complexo, onde a área correspondente ao laurato de metila foi 15900 e ao amilato de metila foi 15850. Injetou-se, também, 1,0 mL de uma solução padrão contendo 2,30 ppm de laurato de metila e 1,00 ppm de amilato de metila, obtendo-se áreas de 10950 e 11720, respectivamente. Determine o teor de ácido láurico no óleo de milho. 15) Um alcoólatra teve morte súbita provocada após a injestão de whisky falsificado. O laudo médico deu como causa da morte intoxicação por metanol. O químico do laboratório tinha, portanto, que dosar o metanol na bebida para servir de prova no processo de falsificação. Fez-se uma solução contendo 50,0 mg/mL de MeOH em EtOH puro ( sol. A) e outra contendo 40,0 mg/mL de benzeno em EtOH puro (sol. B). A partir dessas soluções foram preparados padrões em balão volumétrico de 100,00 mL (ver os volumes de alíquota correspondentes na tabela abaixo). Pesou, então, 10,3520 g do whisky, adicionou 20,00 mL da solução B e avolumou a 100,00 mL com etanol puro (sol. H). Injetou-se 1,0 mL dos padrões C, D, E , F e G e da solução H, obtendo-se as seguintes áreas pelo integrador eletrônico: Solução C D E F G H

Solução A (mL) 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 -

Solução B (mL) 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00

Área de MeOH 4050 6120 8200 10010 12120 7200

Área de benzeno 8114 8120 8105 8100 8090 8050

a) Determine graficamente o teor de metanol no whisky. b) Por que as áreas correspondentes ao benzeno em todas as soluções analisadas não são exatamente as mesmas, apesar das concentrações serem iguais? Explique, também, porque isso não afeta o cálculo quantitativo.

9

Diazometano (CH2N2) é um reagente que transforma, quantitativamente, ácidos carboxílicos nos respectivos ésteres metílicos derivados. A reação é: R-COOH + CH2 N2 ® RCOOCH3 + N2

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G. BIBLIOGRAFIA 1-Carol, H. C., Braga, G. L.; Bonato, P. S.;

Introdução a Métodos Cromatográficos, Ed.

UNICAMP, Campinas, 4a Ed., 1990 2-Ciola, R.; Introdução à Cromatografia em Fase Gasosa, Ed. Edgard Blucher, São Paulo, 1973 3-Kennedy, J. H.; Analytical Chemistry - Principles, Harcourt Brace Jovanovich, Flórida, 1984 4-Willard,

H.;

Merritt,

Jr.

L.;

Dean,

J.;

Análise

Instrumental,

Fundação

Calouste

Gulbenkiam, Lisboa, 2a Edição, 1979 5-Ohlweiler, O. A.; Fundamentos da Análise Instrumental, L.T.C., Rio de Janeiro, 2a Edição, 1976 6-Ewing, G. W.; Métodos Instrumentais de Análise Química, Vol. I e II, Ed. Edgard Blucher, São

Paulo, 1972.

GABARITO Item B: 1 – O que mais interage com a fase estacionária e/ou tem menor pressão de vapor. 3–C 4 – sujeira na seringa ou impureza depositada na coluna. 5– A) injeção de padrões e comparação de Tr. B) Intensidade da luminosidade da chama. Item C: 1- C 2-A 4– Crom. A - maior atenuação Crom. B – maior velocidade do papel Crom. C – menor temperatura da coluna e/ou menor pressão de vapor. 5–D 7– A) os tempos de retenção aumentariam. B) Injetaríamos padrões de tolueno e benzeno nas mesmas condições e compararíamos os Trs. C) Os tempos de retenção diminuiriam. D) Provavelmente apareceria somente o sinal do hexano. E) Os sinais ficariam maiores e proporcionais ao fator de atenuação.

10 –

A – polar B – C10, C11 e C12 C – aumentar a temperatura e/ou a vazão do gás de arraste. D – Co-injecao de padrões.

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11 – A) As pressões de vapor ficariam baixas e alguns picos poderiam ficar assimétricos ou deformados ou até mesmo não apar4ecer no cromatograma. B) Os sinais ficariam muito intensos e provavelmente haveria perda de resolução devido a limitada capacidade da coluna. Poderia também ser observada assimetria nos picos. C) Haveria sangramento da fase e perda definitiva da eficiência da coluna. D) Certamente não haveria alteração nos Trs, mas dependendo do detetor poderia haver alteração na sua sensibilidade. Alem disso, algumas substâncias de menor pressão de vapor poderia condensar no detetor, podendo causar danos ao equipamento. E) Não seria muito sensato, até porque o NaOH não é volátil. O melhor seria tratar a amostra convenientemente para injetar somente a sua fração volátil ou semi-volátil. F) Não há problemas, desde que haja a separação cromatográfica desejada. G) Certamente haveria vazamento, que poderia prejudicar o funcionamento do equipamento ou perda de amostra. Lembre-se que o septo deve ser trocado periodicamente. H) Se o ponto de ebulição dos componentes da amostra for atingido, esta tudo bem. Entretanto, não seria conveniente exagerar na dose, pois há de convir que algumas substâncias são termo-labeis e poderiam se decompor no injetor. Alem disso, alguns tipos de septos não toleram temperaturas muito altas, o que poderia provocar muito ruído no e sujeira no sistema. 12 – Ordem de polaridade das fases: Esqualano: SE-30; DEGS; Carbowax; Glicerol. 13 – A) 1 – MeI; 2 → III; 3 → II; 4 → I. B) Permaneceu mais tempo no sistema cromatográfico, portanto sofreu difusão. C) Só sobrariam os picos do reagente (MeI) e dos produtos (II e III) ou então somente o reagente e o produto dimetilado (III). 14 – a) 1,7 b) etano, etanol e água. c) 1 → 15 s; 2 → 24 s; 3 → 37,5 s. d) emtre os picos 1 e 2. e) mudar a fase estacionaria ou diminuir a temperatura da coluna. Item D: 4– Sim, pois o pico da água que é o mais intenso iria praticamente desaparecer, alem do mais a detecção dos outros componentes seria melhor, pois o DIC é mais sensível para substancias orgânicas. 5 – 2; 4; 1; 5; 6; 3. 6 – a) maior; b) maior; c) maior; d) H2O. 7–E 8–D 9–C 10 – A

9 – a) 29%; b) 38%. 10 – Cânfora = 47,6%; Carvona = 16,6%. 11 – 0,11% 12 – 23 mg/mL 13 – 28 mg/mL 14- 0.92% 15 – 12,7%.

Item E 1 – 24,3% 2 – sim 3 – 9,3% 4 – 29% 5 – n-BuOH = 74,7% e dioxano = 25,3%. 6 – a) 41,5%; b) 2.19g; c) A 7 – 59,4% 8 – b) 9,24%

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