Pruebas Bioquímicas.2

MC JEANETT CHÁVEZ ONTIVEROS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Enterobacterias Indol

LICENCIATURA EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Rojo de Metilo Vogues Proskauer Citrato como única fuente de carbono Fermentación de hidratos de carbono Descarboxilasa Fenil-Alanina desaminasa Citocromo-oxidasa Reducción de nitratos

MC JEANETT CHAVEZ ONTIVEROS Culiacán, Sinaloa.

Ortonitrofenil galactósido

Indol

Es uno de los productos de la degradación metabólica del triptófano, el cual surge por la hidrólisis del mismo con la ayuda de la enzima triptofanasa. Caldo de triptófano (1% Trp)

M di y R Medios Reactivos.ti Interpretación.-

Reactivo de Kovac (Soln. Acidificada de pdimetilaminobenzaldehido en alcohol isoamílico) Reactivo de Ehrlich

Positiva: Color fucsia brillante en la interfase del reactivo. Negativa: Un anillo amarillo

Control.Control positivo: E. coli Control negativo: Klebsiella pneumoniae

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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Prueba Positiva

Rojo de Metilo

Prueba Negativa

Principio.Prueba cuantitativa de la producción de ácidos que requiere que los m.o produzcan ácidos fuertes (láctico, acético y fórmico) a partir de glucosa, por la vía de fermentación de ácidos mixtos mixtos.

Medios y Reactivos.Caldo Rojo de Metilo-Voges-Proskauer (RM/VP) Indicador Rojo de Metilo

Interpretación.Positiva: Aparición de color rojo en la superficie del medio Negativa: Puede producir un color anaranjado

Controles.Control Positivo: E. coli Control Negativo: Enterobacter aerogenes

Voges- Proskauer

Citrato

Principio.El ácido pirúvico es un compuesto formado de la degradación de la glucosa

Medios y Reactivos.Medio Medio.Caldo RM/VP

Se degrada a acetoína (acetilmetilcarbinol)

• Uso de citrato como única fuente de C • Uso de compuestos amoniacales como fuente de N

Reactivos.-

vía butanodiólica

Alfa-naftol (5%) Acetoína + O2 + KOH (40%) Diacetilo alfa-naftol (rxna. Guanidina y/o arginina)

(5% EtOH)

Interpretación.-

• Prueba verifica:

Alcohol etílico absoluto Hidróxido de potasio (40%)

Rojo

Positiva: Aparición de un color rojo 15 minutos o más después del agregado de los reactivos Negativa: No aparece coloración roja, puede aparecer color cobre

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

• Se cultivan en agar citrato de Simmons (Citrato de sodio y (NH3)3PO4; azul de bromocresol) • Si es positiva habrá una alcalinización del medio.

2

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Fermentación de Carbohidratos (Caldo Rojo de Fenol) Glucosa Hidratos de Carbono

Sacarosa Lactosa Rojo de Fenol

IMViC

pH < 6.8

pH > 7.4

Amarillo

Roja-Rosado

Interpretación.POSITIVO

• (E.coli ++--) (Enterobacter --++) • (Salmonella -+-+ ) (Citrobacter -+-+)

Amarillo

Amarillo/ gas

NEGATIVO

No hay cambio en la coloración

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Rojo-rosado oscuro

3

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Glucosa

Fermentación de Azúcares

Organismo

Resultado del test

1)

Negativo

Control

2) S. aureus

Ácido

3) P. vulgaris

Ácido, gas

4)P. aeruginosa

Negativo

5) E. coli

Ácido, gas

Lactosa

Organismo

Resultado del test

1)

Negativo

Control

2) S. aureus

Ácido

3) P. vulgaris

Negativo

4)P. aeruginosa

Negativo

5) E. coli

Ácido, gas

Sacarosa

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Organismo

Resultado del test

1)

Negativo

Control

2) S. aureus

Ácido

3) P. vulgaris

Ácido, gas

4)P. aeruginosa

Negativo

5) E. coli

Negativo

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias,, en base enterobacterias a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

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Agar TSI (Triple Sugar Iron)

• Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. • Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas.

Diferentes pruebas sobre agar TSI

•

•

Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de color rojo. rojo. Si la bacteria problema fermenta lactosa y/o sacarosa, acidificará f á el medio en su superficie f volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuará de color rojo.. rojo

Fermentación de azúcares (TSI)

1

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

2

3

4

Resultados (slant/butt)

Símbolo

Interpretación

1)No cambio/ no cambio

NC/NC

No Fermentación

2)Amarillo/amarillo con burbujas

A/A

Fermentación de glucosa y lactosa y/o sacarosa, con producción de gas

3)? Rojo/amarillo con precipitado negro

? NC/A

? Fermentadora de glucosa

4)Amarillo/amarillo con precipitado i it d negro

?

?

5)Rojo/Rojo

?

No fermentación, peptona catabolizada

5

5

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Ejemplo de la Fermentación de Carbohidratos en microorganismos

UREASA O 2HN

C

Urea

NH2

Principio O 2HN

C

NH2

CO2 + H2O + 2NH3

+ 2HOH Ureasa

(NH4)2CO3 ¿Qué azúcares fermentan Shigella s. y E. coli?

Fermentación de azúcares (Lactosa Agar Mac Conkey)

Materiales y Reactivos

Caldo Urea de Stuart

Extracto de levadura

0,1g

Fosfato monopotásico

Peptona

1g

Glucosa

1g

9,1g

Cloruro de sodio

5g

9,5g

Fosfato monopotásico

2g

Fosfato disódico

Urea

20g

Urea

20g

Rojo de fenol

0,012g

0,01g

Agar

15g

Rojo de Fenol

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Agar Urea de Christensen

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Procedimiento

Controles 1) Inoculación

Control Positivo

Proteus

Control Negativo

E. coli

35ºC / 18-24 hrs.

2) Incubación

3) Interpretación de resultados

Fenil- Alanina Desaminasa

Interpretación de Resultados Positivo

Coloración roja

Enterobacteriaceae

Caldo Stuart Negativo

No existe cambio en la coloración

Hidrolizado lento.Positivo

Color rojo solo en un principio solo en el pico de flauta, pero luego se torna en todo el tubo

Hidrolizado rápido.p Color rojo en el medio

Agar Christensen

Hidrolizado lento.Negativo

Proteus

Providencia

Morganella

Color amarillo original

Hidrolizado rápido.- Color amarillo original

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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Materiales y Reactivos

Agar Fenil - Alanina

Interpretación DL Fenilalanina

2g

Extracto de Levadura

3g

Cloruro de Sodio

5g

Fosfato de Sodio

1g

HCl concentrado

2,5 ml

Agar

12g

Cloruro Férrico

12g

Agua Destilada

100ml

Positiva Negativa

Coloración verde

No hayy cambio de coloración

Controles Control positivo.- Especies de Proteus Control negativo.- E. coli

Decarboxilasas

Procedimiento Inoculación del pico de flauta

35ºC/18-24 hrs

Incubación

Se agregan de 4 a 5 gotas de cloruro férrico

Se gira el tubo

Lisina

Cadaverina

Ornitina

Putrescina

Arginina

Citrulina

Medios y Reactivos

Peptona

5g

Extracto de carne

5g

Púrpura de bromocesol

0,01g

Rojo de cresol

0,005g

Glucosa

0,5g

Piridoxal

0,005g

Agua destilada

1l

Interpretación

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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Citocromo Oxidasa

Procedimiento 1)

Inoculación de 2 tubos

Figura 1. CADENA RESPIRATORIA (5 complejos). Medio Moeller (control)

Medio Moeller + Aminoácido CITOCROMO-OXIDASA

2)

Se cubren con aceite mineral estéril

3)

Incubación

1 cm por encima de la superficie

(35ºC/18-24hrs)

Interpretación Positiva.- Indica un vire de color azul-púrpura Negativa.g No existe cambio de coloración

Control Aminoácido

Control Positivo

Control Negativo

Lisina

Enterobacter aerogenes

Enterobacter cloacae

Ornitina

Enterobacter cloacae

Especies de Klebsiella

Arginina

Enterobacter cloacae

Enterobacter aerogenes

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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SE ENCUENTRA EN:

MEDIOS Y REACTIVOS • CLORHIDRATO DE TETRAMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE KOVAC)

o Microaerófilos

o Anaerobios Facultativos

La prueba de la oxidasa es importante para identificar microorganismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados.

• CLORHIDRATO DE DIMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE GORDON Y MCLEOD)

REACCIÓN

Cit crd Cit cox

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Incoloro Azul (azul de indofenol)

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PROCEDIMIENTO

REACTIVO DE KOVAC vs REACTIVO DE GORDON Y McLEOD

Directa

Indirecta

2 o 3 gotas de reactivo se agregan directamente en colonias bacterianas aisladas en un medio en placa.

Se agregan unas pocas gotas del reactivo a una tira de papel de filtro o se usan tiras o discos comerciales p g con reactivo impregnados desecado.

Ventajas del reactivo de Kovac INTERPRETACIÓN • Estabilidad durante el almacenamiento • Mas sensible para la detección de citocromo-oxidasa • Menos M tóxico ó i

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

10 s

Las colonias que tienen actividad de citocromooxidasa desarrollan un color azul oscuro en el sitio de inoculación en 10 s.

10 – 60 s

Debe evaluarse aún más porque probablemente no pertenezca a la familia Enterobacteriaceae.

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Reducción de Nitratos

Propósito

No deben usarse asas o alambres de inoculación de acero inoxidable o Nichrome para esta prueba.

Control Positivo

Este examen detecta la habilidad de un organismo para reducir nitratos (NO3) a nitritos (NO2) o algunos otros compuestos nitrogenados, tales como nitrógeno molecular (N2), usando la enzima nitrato reductasa.

CONTROLES Pseudomonas aeruginosa

Control Negativo

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Escherichia coli

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Reactivo A

Ácido Sulfanílico

8g

PROCEDIMIENTO Inoculación

Ácido acético (5N), 30%

1L

Incubación Reactivo B

α-naftalamina

8g

(a 35°C, 18 a 24 horas)

Ácido acético (5N), 30%

1L

Agregar 1mL de cada uno de los reactivos A y B

CALDO DE NITRATO O AGAR NITRATO (PICO DE FLAUTA) Extracto carne

3g

peptona

5g

Nitrato de potasio (KNO3)

1g

Agar (sin nitritos)

12g

Agua destilada

1L

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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El polvo de zinc se agrega a los tubos cuyo resultado parezca ser negativo (siga siendo claro).

Ortonitrofenil Galactósido

CONTROLES CONTROL POSITIVO

E. coli

CONTROL NEGATIVO

Acinetobacter calcoaceticus

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS (criterio ONPG TEST)

β-Galactosidasa

Bacterias no fermentadoras de lactosa

Son incapaces de producir ácidos a partir de lactosa.

Bacterias no fermentadoras de lactosa (carecen de permeasa, pero si poseen β-galactosidasa)

Dan una prueba positiva de ONPG.

Fermentadores tardíos de lactosa

Poseen una actividad permeasa lenta.

Fermentadores normales

Dan una prueba positiva de OMPG rápida.

Asa de crecimiento Bacteriano + 0.5 mL de solución fisiológica

PROCEDIMIENTO Se agrega una gota de tolueno

Mezclar durante unos s

A Agregar solución l ió ONPG amortiguadora

Lactosa permeasa

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Baño de agua a 37°C

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INTERPRETACIÓN

MEDIO RICO EN LACTOSA

Agar-hierro de Kligler (KIA)

Agar-hierro-triple-azúcar (TSI)

5-10 min

Algunos.

1 hora

La mayoría.

24 horas

Las reacciones no p deben interpretarse como negativas hasta después de 24 horas de incubación.

El color amarillo por lo común es evidente.

Fosfato de sodio buffer,1M, pH7 O-nitrofenil-β-galactósido (ONPG), 0.75 M REACTIVOS Solución Fisiológica Tolueno

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

CONTROLES CONTROL POSITIVO

E. coli

CONTROL NEGATIVO

Proteus

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http://www.uprm.edu/biology/cursos/micro/pruebas.htm • http://html.rincondelvago.com/pruebas-bioquimicas.html • http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.tro ybio.com/images/Product_Images_BBL/MCONKEYECOLI.gif&imgrefurl=http://www.troybio.com/images/Produ ct_Images_BBL/BBL.htm&h=1648&w=1629&sz=745&tbnid =fOb6kWI8BPcJ:&tbnh=150&tbnw=148&hl=es&start=14&p rev=/images%3Fq%3Dagar%2Bmacconkey%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

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