Ensayos Preliminares: Usos De Papeles Sensibles Y Laminas Metalicas

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PRACTICA N° 1 ENSAYOS PRELIMINARES: USOS DE PAPELES SENSIBLES Y LAMINAS METALICAS I. OBJETIVOS: . Determinar la naturaleza de los tóxicos presentes en los alimentos mediante los Ensayos Preliminares . Investigar tóxicos volátiles y gaseosos mediante el uso de papeles sensibles . Investigar tóxicos metálicos y no metálicos ,mediante el uso de láminas metálicas. II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS . Los ensayos preliminares son un conjunto de operaciones destinados a orientarnos sobre la naturaleza del tóxico. Constan de dos partes: a) Examen Físico.- Estudio macro y microscópico, caracteres organolépticos, etc. b) Examen Químico: Reacción, papeles sensibles, láminas metálicas, diálisis, electrodiálisis, etc. . Los papeles sensibles son tiras de papel filtro impregnados con diversos reactivos, que sirven para demostrar la presencia de tóxicos volátiles y gaseosos, siendo las más importantes: - P.S. Alcalino - P.S. Iodoalmidonado - P.S. Picrosódico - P.S. Cloruro de paladio - P.S. Nitrato de plata - P:S. Nessler - P.S. Acetato de plomo * Si el papel sensible de Nitrato de plata se ennegrece indica presencia de fósforo e hidrógeno fosforado, arsina, formol y en general los cuerpos volátiles dotados de poder reductor. * Si el papel sensible de nitrato de plata y el acetato de plomo o mejor el de plumbito de sodio se torna negro, nos indica presencia de hidrógeno sulfurado, o de un sulfuro. * El P .S. de Cloruro de paladio se tornará gris más o menos intenso en presencia de CO , es muy sensible pero no específico, ya que el hidrógeno sulfurado, el NH3 y el etileno también lo ennegrecen * El P.S. Picrosódico en presencia de HCN se torna de color rojo sangre intenso, debido a la formación de isopurpurato, es muy sensible e inespecífico porque otras sustancias reductoras como: aldehído, cetonas, H2S, SO2, etc, dan el mismo color, pero debido a la formación del ácido picrámico. * El P.S. Nessler se torna de color amarillo rojizo por formación de oxiyoduro de mercurio en presencia de amoníaco, pero sólo debe usarse en ausencia de fósforo, del ácido sulfhídrico o del aldehído fórmico. . Los Ensayos Preliminares usando Láminas Metálicas se fundamentan en el intercambio de la carga iónica, conforme a la serie de tensiones: * Si la lámina de zinc ennegrece, es probable que la solución contenga un metal (plata, cobre, mercurio, antimonio, estaño, o bien otros metales menos electropositivos que el cinc).debe tenerse presente que la lámina de cinc también ennegrece en medio orgánico ácido, en ausencia de todo compuesto metálico,. * Si la lámina de hierro se cubre con una capa roja ,indica la presencia de cobre: Cu ++ + Fe0 Fe++ + Cu0 * Si en la lámina de cobre se deposita una capa gris blanquecina que lavada con agua destilada y frotada cuidadosamente con papel de filtro o un paño, adquiere el brillo metálico de un espejo, indica la presencia de mercurio o plata. Si la lámina de cobre presenta un depósito de color negro o púrpura oscuro, puede existir : Arsénico, antimonio o Bismuto.

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* Si en la lámina de Aluminio (exenta de cobre),puesto en contacto con la sustancia sospechosa y retirada luego, en seco aparecen eflorescencias blancas de hidróxido de aluminio (barbas de aluminio),que a, quitarlas de la superficie se reproducen, revela la presencia de mercurio. La reacción es debida a la oxidación rápida del aluminio en contacto con el aire, catalizada por el mercurio, con súbita formación de una amalgama de aluminio.  Si la lámina de Platino-cinc presenta una mancha negra sobre el platino, indicará antimonio; el plomo y el bismuto la volverán negras, el estaño ,gris oscuro; el cobre, pardo rojizo; el cinc, gris azulado. III. MATERIALES Y REACTIVOS . Morteros de porcelana con su pilón . Tubos de ensayo con tapa . Lunas de reloj . Cristalizadores . Frascos transparentes de boca ancha . Matraces con tapa . Probetas . Pipetas . Baguetas . Baño María

. Acido tartárico al 10% . Nitrato de plata al 5% . Acido pícrico al 1% . Carbonato de sodio al 10% . Reactivo de Nessler . HCl cc y al 10% . Sulfato ferroso al 2% . Láminas de cobre y de aluminio . Papel de filtro . Agua destilada

IV. PROCEDIMIENTO: Las muestras de pallares, yuca, carne o frutas, deben ser triturados o hecho papillas para poder realizar los análisis 4.1 Investigación de Tóxicos Volátiles y Gaseosos: 4.1.1. Investigación de Acido Cianhídrico.a) Preparación del P.S. Picrosódico: - Cortar tiras de papel filtro - Sumergir en una solución de ácido pícrico al 1% y escurrir el exceso. - Luego embeber en una solución de carbonato de sodio al 10% y escurrir el exceso. - Guardar en un aluna de reloj o tubo de ensayo b) Preparación del Papel Sensible Alcalino: - Cortar tiras de papel filtro - Embeber el papel de filtro con una solución de NaOH al 10% y escurrir el exceso. - Guardar el P.S. en una tubo o luna de reloj c) Preparación de la Muestra problema y Uso de los papeles Sensibles: - Colocar la muestra (yuca o pallares) en un matraz con tapa - Agregar agua destilada hasta cubrir la muestra (consistencia casi fluída) - Acidificar la muestra con ácido tartárico al 10% - Colocar o suspender los P.S. inmediatamente y tapar el matraz. - Llevar el matraz que contiene la muestra al baño maría por 30 minutos a 50-60°C. - Observar los cambios que ocurren especialmente en el papel picrosódico. - Después del tiempo establecido, retirar los papeles sensibles con mucho cuidado y colocarlo sobre una luna de reloj por separado. - Al P.S. Alcalino agregarle gotas de sulfato ferroso al 2% y gotas de HCL cc. Observar el color formado. 4.1.2 Investigación de Amoniaco: a) Preparación del P.S. Nessler: - Cortar tiras de papel filtro - Embeber el papel de filtro con el reactivo nessler y escurrir el exceso. - Guardar el P.S. en un tubo de ensayo b) Preparación de la Muestra Problema y uso del Papel Sensible: - Colocar la muestra de pescado (triturado) en un matraz con tapa. - Agregar agua destilada hasta cubrir la muestra

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Agregar NaOH al 30% hasta reacción alcalina (exceso) Suspender el P.S. de Nessler sobre la muestra y tapar inmediatamente. Llevar a b.m. el matraz a 40- 60° C por 15 minutos y observar los cambios que puedan ocurrir. 4.1.3 Investigación de Hidrógeno Sulfurado: a) Preparación del P.S. de Nitrato Argéntico: - Cortar tiras de papel de filtro - Embeber el papel de filtro con una solución de Nitrato de Plata al 5% y escurrir el exceso. - Guardar el P.S. en un tubo de ensayo o luna de reloj b) Preparación de la Muestra Problema y Uso del P.S. Nitrato de plata: - Colocar la muestra (agua estancada, pescado ) en un matraz con tapa - Acidificar con ácido tartárico al 10% - Suspender inmediatamente el P.S. sobre el muestra y tapar rápidamente el matraz y llevar a baño maría por 15 a 30 minutos a 40 – 60°C. - Observar los cambios que puedan ocurrir. 4.2 Investigación de Tóxicos Metálicos y No metálicos: Procedimiento: - Colocar la muestra (agua, tierra agrícola, pescado, vegetal) en forma de papilla si fuera necesario, en un matraz de 250 ml - Agregar agua destilada hasta cubrir la muestra, luego acidificar con HCL al 10%. - Incorporar la lámina de cobre y/o aluminio en forma separada (la lámina debe ser previamente tratada) - Calentar suavemente a ebullición - A los 5 minutos de calentamiento observar si la lámina presenta alguna modificación, caso contrario seguir calentando hasta los 30 minutos, añadiendo de vez en cuando HCL al 10% para recuperar el Líquido evaporado. - Pasado el tiempo establecido, observar los cambios que puedan presentar las láminas. V. Resultados y Reacciones Químicas VI Interpretación y Discusiones de Resultados VII. Conclusiones VIII. Bibliografía Cuestionario 1. Qué métodos instrumentales que usan para realizar análisis toxicológicos. 2. Explique los fundamentos de los métodos cromatográficos y espectrofotométricos que existen. 3. Explique esquemáticamente la marcha analítica de reconocimiento de los cationes y aniones. -

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PRACTICA N° 2 INDICE DE LA ACTIVIDAD UREASICA I. Objetivo:  Determinar la actividad ureásica residual en productos de soya  Determinar la presencia de inhibidores de tripsina en soya ,mediante el método indirecto de la actividad ureásica.  Evaluar el nivel de procesamiento térmico a que han sido sometido los productos derivados de soya. II. Fundamentos Teóricos La soya cruda y harina de soya impropiamente procesada contienen factores antinutricionales o antinutrientes que pueden perjudicar la performance del ser humano. Entre estos factores antinutrientes principales tenemos: inhibidores de tripsina, hemoaglutininas y la enzima ureasa. La actividad ureásica se mide en base a cambios de pH dado por la cantidad de amoníaco formado de la reacción entre la ureasa presente en la soya sobre el sustrato urea contenido en los reactivos de la prueba. De tal manera que incrementos de pH mayores se observarán en aquellas harinas de soya que hayan sido subcalentadas, debido a que la enzima ureasa no ha sido deteriorada, por lo tanto los inhibidores de tripsina también estarán n presentes en mayor cantidad debido a que no han sido inactivados por el calor. Los incrementos de pH menores se observarán cuando la harina de soya ha sido sobrecalentada. La actividad de la ureasa es una indicación del nivel de cocinamiento o procesamiento de la harina de soya. Esto está basado en que la enzima ureasa es desnaturalizada aproximadamente a la misma tasa como aquella de los inhibidores de tripsina y toma ventaja del hecho que es más fácil examnina5r a la enzima ureasa que a los inhibidores de tripsina. El análisis de ureasa es aceptado por las industrias del alimentos de todos el mundo para usarse en la instrucción de la calidad de harina de soya. Se recomienda que la actividad de la ureasa en la harina de soya debe estar entre el rango de 0,05 – 0,2 de incrementos de pH, pero no más alto que 0,5.La Asociación Americana de la Soya ha recomendado estándares específicos para diferentes harina de soya, las cuales se dan a continuación: RANGO DE ACTIVIDAD UREASICA TORTA DE SOYA HARINA DE SOYA CON CASCARA HARINA D ESOYA SIN CÁSCARA

0,05 – 0,20 0,05 – 0,020 0,05 – 0,020

La actividad ureásica máxima de 0,2 a 0,3 de incremento de pH es indicativo de que la harina de soya ha sido tratada adecuadamente, valores mayores pueden indicar presencia de inhibidores de tripsina y valores menores revelan la baja calidad de la proteína debido al daño de excesivo calor. III. Materiales y Reactivos: . Placas petri . Tubos de ensayo . Baguetas . Pipetas de 5 y 10 ml . Vasos de precipitación . Probetas de 25 y 100 ml . Fiolas de 50 y 100 ml

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. Solución buffer fosfato de potasio pH =7 . Solución buffer úrea . Indicador rojo de fenol . Urea grado alimenticio. IV. Procedimiento: Método Control Soya: Fundamento: Es una prueba cualitativa, ya que se basa en la determinación de la intensidad de color (rojo) que presenta la soya al ponerse en contacto con una solución de buffer urea que contienen indicador rojo de genol el cual reemplaza al medir el incremento de pH. Así una coloración uniforme que abarque aproximadamente el total de la muestra (¡00%) será indicador de una soya subcalentada en virtud a mayor contenido de ureasa que reacciona con el reactivo. Coloraciones que abarquen entre el 25-50% de l a muestra es indicador de un óptimo tratamiento. Valore menores de 25% es índice de sobre calentamiento. Técnica: A) . En una placa petri agregar aproximadamente una cucharadita al ras de muestra y esparcir por toda la placa . Agregar con la ayuda de una pipeta sobre la muestra la solución buffer úrea rojo de fenol, de tal manera que moje toda la muestra . Luego realizar lecturas a los 5, 10 , 15 y a los 20 minutos . Dividir imaginariamente la muestra contenida en la placa en cuatro campos de tal manera que cada uno represente el 25% del total. B). Pesar aproximadamente 2 g de harina de soya en un tubo de prueba y añadir 10 ml de la solución bufferizada con rojo de fenol. . Añadir un poco de urea en el tubo, tapar y agitar vigorosamente 10 segundos. . preparar un blanco para cada determinación usando el mismo procedimiento pero omitiendo la úrea como en el paso anterior. . Dejar reposar la muestra por 30 minutos en ambiente cálido, y observar la aparición de color como se indica más adelante. Reportar el tiempo en minutos la aparición de un color rosa definido. Tiempo de aparición de color (minutos) 1 1–5 5 – 15 15 – 30 Sobre los 30

Actividad Ureásica Muy Activa Activa Moderadamente Activa Ligeramente Activa Inactiva

V. Resultados y discusiones VI. Cuestionario: 6.1. Explique qué inhibidores enzimáticos se pueden encontrar en el grano de soya 6.2. Qué tratamientos tecnológicos se deben aplicar a la soya para mejorar su calidad. 6.3. Qué reportes científicos se han publicado sobre inhibidores enzimáticos y factores tóxicos en la soya. Anexe 02 folletos.

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PRACTICA N° 3

DETERMINACIÓN DE ACIDO FITICO EN COMPLEXOMETRIA INDIRECTA CON Fe (III)

CEREALES

Y

DERIVADOS

POR

1. Objetivo: . Determinar la concentración de ácido fítico en cereales y leguminosas por complexometría indirecta con Fe III. 2. Fundamento: El método está basado en la precipitación del ácido fítico con un notable exceso de disolución de Fe (III) en presencia de ácido sulfosalicílico, también en exceso, con el propósito de impedir la adsorción por el precipitado de parte del Fe (III) gracias a la formación de un complejo suficientemente estable. Por otro lado, el ácido sulfosalicílico sirve de indicador del punto final en la valoración complexométrica del exceso de Fe (III). 3. Materiales y Reactivos. a) Disolución de Fe (III) 2x10 M en HCl 0,16 M b) Disolución de AEDT 10 M c) Disolución de HCL 4x 10 con 5% de NaSO d) Disolución de Acido sulfosalicilico al 20% Matraces de 250 ml con tapa Matraces de 100 ml con tapa y de 500 ml Vasos de250 ml y 600 ml Tubos de reflujo Baño maría hirviente Agitador magnético y mecánico. 4. Procedimiento:  En un matraz de 100 ml con tapa agregar 5 a 15 g de harina desecada, añadir 40 ml de la solución (c ) , dejar por 90 minutos agitando frecuentemente y vigorosamente.  Después de sedimentar, colocar 20 ml del líquido sobrenadante (filtrado) en caso necesario) en un matraz de 350 ml, agregar 20 ml de la solución (c ) y 20 ml de la solución (a) .  Luego agregar al matraz 20 ml de ácido sulfosalicílico ( d) al 20% en agua y cerrar con un tubo reflujo de 30 cm de largo. calentar 15 minutos en baño maría hirviente, luego enfriar a chorro de agua y dejar en posición vertical.  Comprobar la existencia del precipitado de fitato férrico (precipitado blanco),y separar 20 ml del sobrenadante límpido en un vaso de 250 ml y completar hasta 200 ml con agua desionizada, ajustar el pH a 2,5 0,5 con glicocola o glicina (unos 0,75 g) y calentar a 70°C.  Titular en caliente y con agitador magnético el exceso de Fe (III) con AEDT 10 M hasta viraje del color rojo- marrón al amarillo claro. 5. Cálculos: % Acido Fítico = 0,66 ( 10 – v) P Donde: V = volumen AEDT en ml P= peso de la muestra en gramos 6. Cuestionario 1. Qué concentraciones de ácido fítico presentan los diversos granos de cereales y leguminosas. Indique la fuente bibliográfica 2. Porqué es importante determinar y evaluar la presencia de ácido fítico en cereales. Fundamente su respuesta.

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INVESTIGACION DE GLUCOSIDOS CIANOGENICOS EN ALIMENTOS

I. Objetivos: -Aislar el HCN liberado por los glucósidos cianogénicos. -Reconocer el HCN por: a) Rx. Cualitativa: Azul de Prusia (0,00002 g ) Modificación de Chelle (0,00001 g.) b) Rx. Microquímica. - Determinar la concentración de HCN liberado después de la hidrólisis de los glucósidos cianogénicos por el método Argentométrico II. Materiales y Reactivos - Sistema de destilación simple - Mechero o cocinilla eléctrica - Buretas - Fiola, matraces , vasos - Pipetas de 5 y 10 ml. - Matraz con tapa esmerilada -Tubos de ensayo -Cristalizadores -Microscopio - Probetas, - Vaguetas

- Acido tartárico al 10% - NaOH al 10 % y 0,1 N - Sulfato ferroso al 2 % - ClH., 10% y 20% - H2SO4 cc. - CO3 Na2 al 10% - Acido pícrico al 1% - Solución férrico - KOH alcohólico al 5% - Fenolftaleina - NO3Ag 0.005N ó 0,0005N - IK al 10% - NH3 Q.P.

III. Procedimiento 3.1 Aislamiento de HCN : Método de Destilación Simple - Instalar el sistema de destilación simple. - En el matraz colector, colocar 50 ml. de NaOH 0,1 N - Preparar una papilla de la muestra problema. - Pesar 20 g de la muestra y transferir rápidamente al balón del sistema. - Agregar 500 ml. de agua fría (de preferencia helada) - Luego adicionar ácido tartárico al 10% hasta acidez franca e inmediatamente adaptar el balón al resto del sistema de destilación, y ajustar bien los tapones para evitar fuga del HCN. - Calentar suavemente y elevar la temperatura hasta ebullición, con el fin de provocar una mayor cantidad de vapor de agua y facilitar el arrastre del tóxico por espacio de 10 minutos. - Interrumpir el sistema de destilación convenientemente. - Transferir el contenido del matraz colector a una fiola de 100 ml. Lavar bien el matraz con agua destilada y enrasar hasta volumen conocido. 3.2 Reconocimiento del HCN a) Reacciones cualitativas a.1 Reacción Azul de Prusia : Sensibilidad 2 x 10-5 g En un tubo de ensayo colocar 5 a 10 ml. de destilado obtenido, agregar 1ml. de Sulfato ferroso al 2% , llevar a calentamiento hasta indicios de ebullición , luego enfriar, después agregar gota a gota HCl cc. hasta la aparición del color azul de Prusia (ferrocianuro férrico. a.2 Reacción de Chelle: Sensibilidad 1 x 10 –5 g.

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En un tubo de ensayo colocar 5 a 10 ml. de destilado obtenido, agregar gotas de fenolftaleina hasta color grosella. Luego añadir H2SO4 cc con coloración transparente, volver al color grosella agregando CO3 Na2 aL 10% y más sulfato ferroso al 2% agitar manteniendo la alcalinidad del medio ( indicado por la coloración rosado) , añadir 4 a 5 gotas de HCl al 10 % . Da un color azul más intenso. a.3 Reacción de Guignard En un matraz de 100 ml. colocar 25 ml. del destilado obtenido agregar gotas de H2SO4 diluido adaptar la tira de papel reactivo de Guignard a la tapa esmerilada del matraz a fin de que quede dentro del matraz sin tocar el líquido , y luego llevar a una estufa a más de 40° C. La presencia de HCN es detectado por la coloración roja que adquiere el papel reactivo debido a la formación del isopurpurato de sodio. b) Reacción microquímica Para localizar glucósidos cianógenos en los tejidos vegetales, se investiga el HCN desprendiendo de la hidrólisis de éstos, de la siguiente manera: - Se sumerge un corte delgado de células intactas en solución de KOH alcohólico al 5% durante medio minuto , luego se lleva a una solución férrico ferrosa y se calienta a 60° C por unos 10 minutos y después de enfriarse se sumerge en una solución de HCl al 20% durante 10 minutos . - Se observa al microscopio y se verá la formación de azul de prusia en las células que contienen HCN. 3.3 Cuantificación de HCN - En un matraz de 100ml. colocar 10 a 25 ml. de destilado obtenido y agregar 2ml. de NH3 y 1ml. de IK al 10% . - Titular con una solución de NO3Ag 0,005 N ó 0,0005 N, hasta formación de precipitado amarillo lechoso y anotar el gasto realizado. IV. Resultados: - Indique las reacciones químicas que suceden al realizar la marcha del análisis toxicológico para el glucósido cianogénico presente en la muestra analizada. - Determinar las concentraciones de cianuro expresados como: mg% CN, mg% CNK, mg% CNNa , mg% HCN. V. Discusiones: Comparar los resultados obtenidos con los valores teóricos VI. Conclusiones. VII. Cuestionario: 1. Explique la biosíntesis de la glucósidos cianogénicos en vegetales. 2. Explique el fundamento del aislamiento y cuantificación del HCN 3. Qué recomendaciones y/o métodos se usa par eliminar o reducir las concentraciones de HCN presente en los alimentos que los contienen. 4. Investigue las concentraciones de HCN presente en los diversos alimentos, aparte de los estudiados en la teoría. VIII. Bibliografía

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DETERMINACION DE ACIDO CIANHIDRICO ( Método de la AOAC 2000) El método consiste en la titulación alcalina de CN-, obtenido en medio alcalino, de la fuente a evaluar, con arrastre de vapor. 1.Preparación d el Muestra.- La muestra debe de molerse antes de ser macerado y pasar por un tamiz N° 20. 2. Procedimiento.- Pesar 20 g de frijol molido y colocar en un matraz erlenmeyer de 2 litros. - Añadir 100 ml de agua destilada y se macera durante 2 horas, después de este tiempo añadir 400 ml más de agua y unas gotas de aceite mineral para evitar la formación de espuma. - Colocar el matraz (sobre una placa de calentamiento con agitación ) en un equipo de arrastre con vapor. - Introducir el extremo de salida del condensador en una solución que contienen 0,5 g de NaOH en 20 ml de agua, para neutralizar el ácido cianhídrico. Recolectar en un matraz,150 ml. aproximadamente del destilado y aforar a 250 ml con agua destilada. - Tomar 100 ml de esta solución con pipeta y verter en un vaso de precipitados, añadir 8 ml de NH4OH 6N y 2 ml de KI al 5%. - Valorar con NO3Ag 0,02 N usando microbureta. El punto final lo indica la aparición de una turbidez débil, pero permanente. 3. Cálculos: Considerar 1 ml de NO3Ag 0,02N.......... 1,08 mg HCN N ml de NO3Ag 0,02 N..... . X mg HCN

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DETERMINACION DE GOSIPOL LIBRE (Método Colorimétrico) Este método determina el gosipol libre y sustancias semejantes a él; aplicable a semillas de algodón o harina tratada, MATERIALES  Agitador mecánico  Fotocolorímetro con filtros de 440-465 mu o espectrofotómetro en banda de 440mu  Molino pulverizador  Frascos erlenmeyer 250,125 y 25 ml  Pipetas volumétricas de 1,5,10 y 50 ml  Papel filtro de retención mediana  Baño maría REACTIVOS:  Acetona en solución acuosa al 70%  Anilina pura recientemente destilada  Alcohol isopropílico en solución acuosa al 80% MUESTRAS:  Semillas de algodón  Torta o pasta de algodón  Harina de algodón Para semillas normales o productos que no contengan dianilina gosipol como resultado del tratamiento. La elección de la cantidad de muestra y de la alícuota que se deben tomar para el análisis dependen del contenido de gosipol libre que se supone contenga la semilla o harina de algodón, la siguiente tabla nos servirá de orientación: Tipo de muestra Harina sin tratar Harina Tratada Harina Tratada Harina Tratada Harina Tratada Harina Tratada Harina Tratada

Cantidad de Gosipol (%) 0,6 – 1,5 0,2 – 0,4 0,1 – 0,2 0,05 – 0,1 0, 02 – 0,05 < 0,02

Peso a tomar (g) 0,25 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0

Alícuota 2ml 2ml 2ml 5ml 10 ml 10ml

Pasta de algodón tratada: 1g Semilla sin tratar: 0,5 g Alícuota: color intenso: 1 – 2 ml Color claro: 5- 10 ml Procedimiento:  Pesar 1 g de muestra y colocarla en un erlenmeyer de 250 ml  Adicionar 50 ml de la solución de acetona al 70% exactamente pipeteados, tapar el frasco y agitarlo en un agitador mecánico por 30minutos  Filtrar en un erlenmeyer de 125 ml, descartando las primeras porciones del filtrado procurando hacerlo rápidamente para evitar evaporación del solvente  Pipetear alícuotas duplicadas del filtrado en las cantidades que indican las tablas y colocarlas en fiolas de 25 ml  Una de las alícuotas designadas como (A) se llevan a la marca con el alcohol al 80%  Otra alícuota designada como © se añade 1 ml de anilina pura y llevar a baño maría por 30 minutos a 95°C.

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  

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Preparar un blanco designado como (B) colocando en una fiola de 25 ml acetona al 70% en la misma cantidad de las alícuotas tomadas, añadirle 1 ml de anilina y llevarlo a baño maría junto con (C). Retirar los frascos B y C, enfriar y completar a la marca con alcohol de 80% (No el A) Leer en el fotocolorímetro las soluciones (A), (B) y (C) en filtros de 440mu y proceder a los cálculos. Lectura Real = C - (A+B)

El número obtenido de este cálculo se lleva al gráfico ( o una tabla) y se obtendrá la cantidad de gosipol en 25 ml, luego se refiere este dato a porcentaje: % Gosipol = mg gosipol en 25 ml x 50 x 100 ml alícuota x peso muestra (mg) Ejemplo: Peso de muestra = 1 g Alícuota: 2 ml A: 45 , 49 = X = 47 B =5 C = 260 Lectura Real = 260 - (47 + 5) = 208 Leer en la tabla adjunta, en este caso es: 0,200 Reemplazando en la fórmula: % Gosipol = 0,200 mg x 59 ml x 100 2 ml x 1000 mg % Gosipol = 0,5 Rango Normal: Harina Tratada: Harina sin tratar:

0,015 - 0,2 0,1 - 0,4 0,4 - 1,5%

Cuestionario: 1. Explique cómo se podría inactivar o eliminar el gosipol presente en la torta o harina de algodón 2. Qué concentraciones de gosipol tienen la planta de algodón y en los productos derivados de este. 3. Anexe 02 reportes de investigación científica sobre el gosipol.

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VALORES DE GOSIPOL SEGÚN ESCALA B - A ( mg gosipol en 25 ml ) L. R 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86

mg gosipol 0,021 0,022 0,023 0,024 0,025 0,026 0,027 0,028 0,029 0,030 0,031 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,039 0,040 0,041 0,043 0,044 0,046 0,048 0,050 0,052 0,054 0,056 0,058 0,060 0,061 0,063 0,065 0,067 0,069 0,071 0,073 0,075 0,077 0,079 0,080 0,082 0,084

L.R. 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106 108 110 112 115 116 118 120 122 124 126 128 130 132 134 136 138 140 142 144 146 148 150 152 154 156 158 160 162 164 166 168 170 172 174

mg gosipol 0,086 0,088 0,090 0,092 0,094 0,096 0,098 0,099 0,101 0,103 0,105 0,107 0,109 0,111 0,113 0,114 0,116 0,118 0,120 0,122 0,124 0,126 0,128 0,130 0,132 0,134 0,135 0,137 0,139 0,141 0,143 0,145 0,147 0,149 0,151 0,152 0,154 0,156 0,158 0,160 0,162 0,164 0,166 0,168

L. R. 176 178 180 182 184 186 188 190 192 194 196 198 200 202 204 206 208 210 212 214 216 218 220 222 224 226 228 230 232 234 236 238 240 242 244 246 248 250

mg gosipol 0,170 0,171 0,173 0,175 0,177 0,179 0,181 0,183 0,184 0,186 0,188 0,190 0,192 0,194 0,196 0,198 0,200 0,202 0,204 0,206 0,208 0,209 0,211 0,213 0,215 0,217 0,219 0,220 0,222 0,224 0,226 0,228 0,230 0,232 0,234 0,236 0,238 0,240

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Investigación de Saponinas en Quinua y Soya

1 Objetivo : * Aislar los saponinas de los vegetales por extracción acuosa y alcohólica. * Reconocer la presencia de saponinas en los extractos obtenidos por : . Reacción de coloración: -Reacción de Mitchell - Reacción de Rossell .Formación de espuma * Cuantificar el contenido de saponinas en nuestros alimentos mediante el método afrosimétrico.. 2. Materiales y Métodos . muestras alimenticias conteniendo saponinas. . cocinilla eléctrica . probetas de 100 yb 50 ml . matraces de 250 y 500 ml . pipetas de 10,5,1, y o,1 ml . tubos de reflujo . cristalizadores de 300 ml . tubos de ensayo de 16 mm de diámetro . embudos . Fiolas de 100 y 50 ml . Tubos de ensayo milimetrado. . baño maría . papel de filtro . Alcohol 95% . estándar de digitonina 3. Procedimiento. 3.1 Aislamiento de la saponina. a) Extracción Acuosa . Pesar 10 g de muestra de soya o quinua y colocarlo en un matraz de 250 ml, agregar 90 ml de agua destilada . Calentar a 70°C por 1 hora, agitando de vez en cuando. . Filtrar, y el líquido filtrado concentra en un cristalizador hasta consistencia siruposa (1/3 de su volumen) . b) Extracción alcohólica Pesar 10 g de muestra y colocarlo en el matraz y agregar 90 ml de alcohol 90%, y colocar un tubo de reflujo . Calentar a 70°C por 1 hora en baño maría, agitar de vez en cuando. . Filtrar y el filtrado colocar en un cristalizador y concentrar en baño maría hasta eliminar todo el alcohol. 3.2 Reconocimiento de la saponina a) Reacción de Rosoll . Al residuo del extracto acuoso y alcohólico (por separado) colocarlo en una cápsula de porcelana (cristalizador o luna de reloj) y agregar gotas de H2SO4 cc. . Observar las coloración que presenta, la reacción comienza con una coloración amarilla rojizo que pasa al rojo y finalmente violeta. b) Formación de espuma En un tubo de ensayo colocar 1ml del filtrado acuoso y agregar 9 ml de agua destilada . Agitar vigorosamente por 1 minuto y dejar en reposo. . Observar la formación de espuma persistente.

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3.3 Cuantificación de saponinas Método afrosimétrico o medida de espuma . Fundamento.Este método mide la altura de espuma producida por la saponina cuando es sometida a condiciones estandarizadas de extracción y agitado y es comparado con la producción de espuma originada por la digitonina en concentraciones variables Procedimientos .A). Preparación de la muestra: . En un matraz de 100 ml colocar 1 g. de quinua o soya molida más 25 ml. de agua destilada . . Hervir por 30 minutos o agitar en un agitador mecánico . . Filtrar en caliente usando papel whatman N0 1. . Lavar el matraz y el filtro con 25 ml. de agua destilada caliente y filtrar . Enfriar hasta la temperatura ambiente en el caso que hierva . Tomar alícuotas de 2,5 ml. en tubos de prueba de 16 mm de diámetro o milimetrados y agregar 2,5 ml. de agua destilada . Agitar el tubo por 60 segundos junto con los estándares, dejar reposar el tubo por 30 minutos. . Hacer lecturas de espuma en milímetros Recomendaciones.Mantener en lo posible la ebullición a 90 0C y cuidar que no se produzca en forma violenta y en el caso que suceda retirar de la fuente calórica por un tiempo prudencial repitiéndose la operación hasta completar los 30 minutos . B) Preparación del estándar de digitonina.a) Pesar 5 mg. De digitonina y disolver en agua destilada ,llevar a volumen en una fiola de 50 ml. ( 0,1ml = 0,01mg.) . b) Luego tomar partes alícuotas de 0,0 ; 0,2 ; 0,1 ; 0,6 ; 0,8 ; 1,0 ; 1,2 ; 1,4 ; 1,8 y 2,0 ml. de esta solución y colocarlos en tubos de ensayo. Agregar agua 5 ; 4,8 ; 4,6 ; 4,4 ; 4,2 ; 4,0 ; 3,8 ; 3,6 ; 3,4 ; 3,2 ; 3,0 ml. c) Completar a 5ml. con agua destilada cada una de los tubos de ensayo, luego agitar por 60 segundos . d) Dejar reposar por 30 minutos e) Hacer lecturas de espuma en milímetros . Los cuales se deben comparar con las muestras de quinua y soya . Las determinaciones se hacen por duplicado . Preparación de los Stándares y lecturas realizadas. Tubo N0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Solución patrón (ml.) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 3,0 4,0 5,0

Concentración de saponina ( mg.) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,30 0,40 0,50

H2O (ml) 5 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,0 1,0 0,0

Altura de espuma (cm) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,7 1,3 1,5 2,5

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Cálculos: Muestra de quinua = 1 gr Altura de espuma = 1,3 cm Volumen de dilución 50 ml. Si en 50 ml.................1 g MP 2,5 ml ................ X X= 0,05 g En el cuadro de estándares 1,3 cm altura = 0,30 mg de saponina Si 0,30 mg de saponina ......0,05 g MP X .......................... 100 g MP X= 600 mg = 0,6% Cuestionario 1. Indique concentraciones de saponina en los diversos alimentos de origen vegetal, indicando las fuentes bibliográficas. 2. Anexe trabajos de investigación sobre saponinas ,en cuanto a sus efectos, usos y otros aspectos de interés toxicológico. 3. Qué otros métodos de investigación existen para poder aislar, reconocer y cuantificar saponinas. Describir y explicar dichos métodos.

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Investigación de Quinina en Bebidas

I. Principio: El contenido de quinina se determina por la medida de su absorbancia respecto a la luz ultravioleta a 347,7 nm de longitud de onda, en condiciones determinadas. II. Materiales y Equipos. Espectrofotómetro de luz UV Matraces aforados de 100 y 10 ml Pipetas aforadas de 50 y 10 ml III. Reactivos: a) Solución de HCL 1N b) Solución de Acido fosfórico al 25% c) Solución ácida: Mezclar volúmenes iguales de a y b IV. Procedimiento: 1) . Preparación del Patrón Quinina: - Disolver 50 mg de quinina básica pura en 20 ml de solución ácida y completar a 100 ml con agua destilada. - Agitar la solución y pasar con una pipeta de 10 ml de esta cantidad a un matraz de 100 ml. Añadir 18 ml de mezcla ácida y completar con agua destilada hasta el enrase. - Esta solución contiene 50mg/l de quinina. 2). Preparación de la Muestra: - Eliminar el CO2 de unos 60 ml de agua tónica (muestra problema) por calefacción a baño maría. - Enfriar a temperatura ambiente y se toman 50 ml del problema en un matraz aforado de 100 ml. Se añaden 20 ml de mezcla ácida y se completa y se completa con agua destilada hasta el enrase. - Se agita y mide la absorbancia a 347,5 nm frente a un reactivo en blanco 3). Gráfica de Calibración: - Con una pipeta introducir 0,1 , 2 , 4 ,6 , 8, 10 ml de solución patrón en matraces de 10 ml. - Completar hasta el enrase con la disolución ácida y agua (1+4) y mezclar suavemente. - Medir las absorbancias a 347,5 nm frente a un blanco. - Representar el gráfico. 4). Cálculo y expresión de los resultados: - Mediante la gráfica de calibración, calcular el contenido de quinina en la muestra mediante la absorbancia obtenida. - El resultado expresarlo en porcentaje Cuestionario: 1. Cuál es la fórmula de la quinina 2. Indique en qué productos y/o alimentos se usa la quinina y con qué fines. 3. Cuáles son las dosis admisible de ingesta y los valores aceptables en bebidas .

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INVESTIGACION DE TOXICOS METALICOS Y NO METALICOS MINERALIZACION DE LA MATERIA ORGANICA I.

Objetivos:   

II.

III.

IV.

Conocer los diferentes métodos de desintegración de materia orgánica para investigar tóxicos metálicos y no metálicos. Aplicar la desintegración de la materia orgánica por calcinación. Aplicar la desintegración de la materia orgánica por oxidación sulfonítrica.

Fundamento Teórico.La molécula proteica, por un mecanismo de neutralización de cargas eléctricas o por fenómenos de absorción o adsorción no bien establecidos forma con los compuestos metálicos y no metálicos, combinaciones de elevado peso molecular en las cuales desaparecen todas las características propias de los iones en solución. En esas condiciones resulta improbable reconocer un elemento metálico mediante sus reacciones comunes de identificación, ya que al formar parte integrante del complejo molecular proteico no puede ionizarse suficientemente como para producir una concentración adecuada de uniones. Existen diversos métodos de desintegración de la materia orgánica como:  Por calcinación  Por oxidación sulfonítrica: 1. Método sulfonítrico de A. Gautier modificado 2. Método de Déniges (Nitrosulfúrico-mangánico) 3. Método de Kaen (Nitrosulfúrico-perclórico)  Por oxidación con cloro naciente 1. Método de Fresenius –Babo 2. Método de Ogier o Brouardel- Ogier  Por oxidación con perhidrol: Método de Magnin Materiales y Reactivos: . Cápsula de porcelana . NaOH 10% Balón de Kjeldahl : HNO3 cc . rejilla de asbesto . MgO . Pipetas, probetas, bagueta .HCl cc .Matraces, embudos . NaOH 30% . Vasos .H2SO4 Q.P. .Cocinilla eléctrica . Perhidrol . Mufla . HCl 8% . Baño maría . ClO3K Procedimiento: 4.1 Desintegración de la Materia orgánica por Calcinación: . En una cápsula de porcelana, colocar entre 20-50 ml de MP (leche) . Agregar unas gotas de NaOH al 10% (fija el arsénico como arsenito). . Luego evaporar al baño maría hasta eliminar totalmente el agua. . Retirar hacia los bordes de la cápsula la película superficial que se forma durante la evaporación, usando una varilla de vidrio . Una vez eliminada el agua, añadir gota a gota c.s. de HNO3 puro hasta humectar totalmente el residuo (transforma el arsénico en ácido arsénico, que es más estable . Agregar unos ml de agua destilada y suspender bien con la varilla . Evaporar nuevamente a sequedad con ayuda del baño maría.

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V. VI. VII. VIII.

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. Agregar 2g de MgO y mezclar bien . Calentar en forma suave, hasta desecar completamente el residuo, luego calentar sobre llama directa hasta la obtención de cenizas blancas o grises. Por acción de la elevada temperatura la materia orgánica se destruye completamente y el arsénico queda fijado como piroarseniato de magnesio. . Dejar enfriar y luego agregar unos ml. De agua destilada e igual volumen de HCL cc. Las cenizas se disuelven en su casi totalidad, separándose por filtración todo residuo carbonoso e insoluble. . La solución acuoso-clorhídrico se destina para el reconocimiento de arsénico. 4.2 Desintegración de la Materia Orgánica por Oxidación Sulfonítrica. . En un matraz kjeldahl de 800 ml colocar 50 ml de vino y luego gota a gota c.s. de NaOH al 30% hasta reacción alcalina (el colorante natural del vino toma color verde). . Calentar suavemente hasta eliminar totalmente el alcohol. . Luego dejar enfriar y agregar 3-5 ml de sulfúrico Q.P. y 20 ml de HNO3 puro, calentando y prosiguiendo el ataque hasta concentrar la muestra problema eliminado gran parte del agua. . Al principio de la carbonización dejar de calentar y enfriar el recipiente a la temperatura ambiente. . Luego agregar otra porción de nítrico y calentar nuevamente, el agregado de este ácido se hará tantas veces como sea necesario hasta que el residuo ocupe un pequeño volumen y no acuse carbonización. . Continuar el calentamiento, en forma más intensa hasta la aparición de humos blancos, densos de trióxido de azufre. Luego dejar enfriar. El licor sulfúrico presenta color amarillo de intensidad variable (hierro-férrico) . Eliminar el resto de nítrico, agregando 1-2 ml de perhidrol y calentar (aclarándose en gran parte). . Una vez eliminado el resto de nítrico, dejar enfriar el balón y se diluye con c.s. de agua destilada. . Esta solución se emplea directamente para el reconocimiento de ciertos tóxicos, como por ejemplo el arsénico. Resultados y discusiones Conclusiones Bibliografía. Cuestionario. 1. Qué métodos instrumentales existen para evaluar tóxicos metálico y no metálicos. Explique el fundamento. 2. De ejemplos de alimentos que contienen contaminantes metálicos con la respectiva concentración. 3. Qué agentes oxidantes existen para lograr destruir la materia orgánica. Explique cada uno de ellos.

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Investigación de Arsénico en Leche y Vinos

I.

Objetivos:  Reconocer el ión arsénico en las muestras obtenida después de la destrucción de la materia orgánica.  Realizar reacciones cualitativas de reconocimiento para el ión arsénico

II.

Fundamentos Teóricos La investigación del arsénico puede hacerse en las sustancias sospechosas previa mine realización de la materia orgánica, la cual puede ser por calcinación o por destrucción sulfonítrica o por oxidación con cloro naciente. En caso de que la sustancia sospechosa es libre de materia orgánica se realizan ensayos de caracterización por vía seca los cuales sirven de orientación. La muestra oxidado por el método de cloro naciente resulta un líquido de color amarillo claro y contiene exceso de cloro. El arsénico se halla transformado por la corriente de cloro, que actúa como oxidante, en ácido arsénico, este exceso de cloro debe de ser eliminado calentando el líquido en baño de maría. Es necesario tener la precaución de no concentrar demasiado el líquido obtenido, porque se corre el riesgo de perder parte del arsénico y además que, por enfriamiento, pueda precipitar cloruro de potasio resultante de la reacción: cloro ------ clorato de potasio. Existen ensayos especializados para pequeñas cantidades de arsénico, que son aplicables a todos los compuestos de arsénico y juegan un papel muy importante en el análisis forénsico: a) Ensayo de Marsh: Se basa en la acción del hidrógeno naciente sobre los compuestos arsenicales, con los que produce hidrógeno arseniado, el que por el calor se descompone en hidrógeno y arsénico metaloideo. Se fundamenta en el hecho de que todos los compuestos solubles de arsénico son reducidos por el “hidrógeno naciente” en solución ácida a arsina ASH3,un gas incoloro, extremadamente venenoso con un olor a ajos característicos. Si el gas, mezclado con hidrógeno, se hace pasar a través de un tubo de vidrio calentado, se descompone en hidrógeno y arsénico metaloide, que se deposita como un “espejo” negro amarronado justo después de la parte calentada del tubo. b) Método de Gutzeit: Este es esencialmente una modificación del ensayo de Marsh, siendo la diferencia principal que se detectan la arsina por medio de nitrato de plata. c) Ensayo de Reinsch: El arsénico se deposita sobre el cobre (laminilla),en forma de una película gris de arseniuro de cobre (Cu5As2). d) Ensayo de Fleitmann: Se basa en el hecho de que el hidrógeno naciente generado en solución alcalina (Al o Zn y solución de NaOH),reduce a los compuestos de arsénico (III) a arsina, pero no afecta a los compuesto de Sb. Los arseniatos se deben reducir primero al estado trivalente antes de efectuar el ensayo. e) Ensayo por Vía Seca: Ensayo al soplete, los compuestos de Arsénico, cuando se calientan sobre carbón con CO3Na 2 dan una incrustación blanca de óxido de arsénico (III) y olor a ajos mientras están calientes y, cuando se les calienta con

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un exceso de CNK y de CO3Na 2 anhidro en un tubo de vidrio seco se produce un espejo negro de arsénico, soluble en solución de hipoclorito de sodio en la parte más fría del tubo. III.

Parte Experimental: 3.1 Materiales y Reactivos . Sistema de Marsh . Sistema Gutzeit . Vasos de precipitación . Matraces . Probeta . Pipeta . Cocinilla eléctrica . Baño maría

. H2SO4 10% . Granallas de zinc . SO4Cu 1% . As2O3 . Acetato de Plomo . Cloruro de calcio o algodón hidrófilo . Hidróxido de sodio 30% . Nitrato de plata, sales

3.2 Procedimiento 1° Aislamiento del Tóxico Se usa las muestras preparadas en la práctica anterior, tanto el método de calcinación para la muestra de elche y el de oxidación sulfonítrica para la muestra de vino. 2° Reconocimiento del Arsénico a) Reacción de Bougault: El reactivo se prepara de la siguiente manera: Hipofosfito de sodio 10g Agua destilada 10 ml HCl puro c.s.p 100ml Dejar reposar y separar el ClNa por filtración a través de algodón  En tubo de ensayo colocar 5 ml del reactivo y calentar a ebullición durante medio minuto con ayuda de una pinza de madera. El reactivo debe conservarse límpido, tolerándose un color amarillo débil.  Se incorpora 0,5 a 1 ml de la solución acuoso-clorhídrica en examen y se calienta nuevamente a ebullición.  Para cantidades relativamente grandes aparece de inmediato un ppdo, oscuro, mientras que para pequeñas cantidades es necesario insistir en el calentamiento y dejar enfriar a la temperatura ambiente, pudiéndose refrigerar exteriormente. Antes de considerar negativo el ensayo, se aconseja observar nuevamente el tubo después de 24 horas. Es conveniente que la solución a investigar contenga exceso de de clorhídrico. b) Reacción de Betendorff: El reactivo se prepara de la siguiente manera: Cloruro estannoso 10 g HCl puro 100 ml Conviene preparar en el momento de su uso, la cantidad necesaria para realizar los ensayos cualitativos . En el tubo de ensayo se coloca unos mililitros del reactivo y luego unas gotas de la solución en ensayo y se calienta a ebullición utilizando una pinza de madera. En presencia de arsénico aparece color pardo o negro. c) Reacción de Gutzeit En el caso de efectuar el reconocimiento directo en el licor sulfúrico se procederá previa dilución conveniente.  Instalar el sistema de Gutzeit  Introducir unas granallas de zinc purísimo de uso forense en el frasco A (ver esquema), luego incorporar unos ml de solución de sulfato cúprico al 1%.

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

 IV.

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Luego agregar cantidad suficiente de H2SO4 al 10% (uso forense), y unos ml de solución acuosa sulfúrica en estudio y cerrar rápidamente el frasco como se indica, colocando en el frasco B, solución concentrada de NaOH, y sobre la abertura del embudo o tubito C, colocar pequeños trozos de papel de filtro que lleva cristales de NO3 Ag. A los pocos instantes se observa que el cristal adquiere color amarillo tenue, que se intensifica paulatinamente para vira al negro.

Resultados 4.1 Reacción de Bougault, se basa en la acción fuertemente reductora del ácido hipofosforoso en medio clorhídrico, que separa arsénico metaloideo de otros compuesto al máximo y al mínimo _ _ _ 5 PO2H2 + 4 AsO4H2 + 4 H +---------- 5 PO4H2 + 6 H2O + As4 ppdo. Sensibilidad: 0,1 mg de arsénico. Causa de error: Presencia de materia orgánica, selenitos, seleniatos. Se hace notar que las combinaciones de Arsénico al mínimo reducen más fácilmente que los compuestos al máximo razón por la cual existen discrepancia con respecto a la sensibilidad del reactivo. 4.2 Reacción de Betendorff, es semejante al anterior en cuanto a su mecanismo, utilizándose como reductor el cloruro estannoso en medio clorhídrico _ 10 Sn++ + 50 Cl - + 4 AsO5H2 + 24 H+ -------As4 ppdo. + 16 H2O + 10(Cl6 Sn) En este ensayo se pueden reconocer 0,013 mg de As como arsenito y 0,06 mg como arseniato. Interfiere el mercurio y la plata. Los compuestos de antimonio no dan esta reacción. 4.3 Reacción de Gutzeit: Es importante que el color amarillo sea nítidamente visible antes que aparezca el color negro. _ AsO4H2 + 9 H+ ---------------ASH3 + 4 H2O _ AsH3 + 6 NO3Ag -------------( AsAg3 .3 NO3Ag) + 3 NO3 + 3 H+ _ _ ( AsAg3 .3 NO3Ag) + 2 H2O ----------AsO2H + NO3 + 3 H+ + 6Ag 0

V. VI.

VII.

Conclusiones Cuestionario 1. Qué métodos o reacciones existen para reconocer arsénico en muestras . 2. Anexe reportes de investigaciones sobre arsénico en alimentos y bebidas. Asimismo los métodos de cuantificación que se aplican. Bibliografía

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