Informe 6 Proteasas.pdf

ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL INFORME DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA PRÁCTICA NO. 6 PROTEASAS DE LA PIÑA Y DE LA PAPAYA

1. DATOS INFORMATIVOS NOMBRES: Adrian Changalombo Lisette Paredes Liliana Patarón Karen Silva

CÓDIGOS: 2710 2581

GRUPO No.: 2 FECHA DE REALIZACIÓN: 2018/01/10

FECHA DE ENTREGA: 2018/01/17

2. OBJETIVOS 2.1.

GENERAL  Analizar la acción de la bromelina presente en la piña y de la papaína presente en la papaya

2.2.

ESPECÍFICOS  Determinar la actividad enzimática de la papaína y bromelina.  Comprobar los resultados obtenidos durante la práctica.  Demostrar la sensibilidad de las proteasas a la temperatura

3. METODOLOGÍA 1. Marcar 5 tubos de ensayo con los números del 1 al 6. 2. Colocar en el tubo 1 un pequeño trozo de piña fresco, en el tubo 2 algunas gotas de jugo de piña, en el tubo 3 un trozo pequeño de manzana, en el tubo 4 un pedazo de papaya, en el tubo 5 unas gotas de jugo de papaya y dejar vacío el tubo 6.

3. Preparar en un recipiente gelatina siguiendo las instrucciones del envase. 4. Agregar a cada tubo aproximadamente 3 ml de la gelatina recién preparada todavía líquida, mezclar haciendo rotar los tubos, y colocar todos los tubos en un baño de hielo durante 5 a 10 minutos. 5. Cuando el tubo 6 contenga una gelatina firme, observar los restantes tubos y comparar los resultados. 6. Registrar los resultados observados en cada tubo en una tabla. Dado que las enzimas son sensibles a la temperatura, demostrar la sensibilidad de la proteasa de la piña a dichos factores. Para ello se repiten los experimentos pero calentando previamente el jugo de las frutas o los trozos de fruta, por ejemplo 3 minutos a 100 °C. 4. MATERIALES, SUSTANCIAS, REACTIVOS Y EQUIPO

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4.1. MATERIALES: 5 tubos de ensayo Trozos de piña Trozos de manzana Trozos de papaya Hielo Gelatina

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4.2. SUSTANCIAS: Agua Baño de Hielo Jugo de piña Jugo de papaya

5. MARCO TEÓRICO Y REFERENCIAL 5.1.

MARCO TEÓRICO

ENZIMAS Una enzima es una proteína que cataliza las reacciones bioquímicas del metabolismo. Las enzimas actúan sobre las moléculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares. Es importante destacar que las enzimas no modifican el balance energético ni el equilibrio de aquellas reacciones en las que intervienen: su función se limita a ayudar a acelerar el proceso. Esto quiere decir que la reacción bajo el control de una enzima alcanza su equilibrio de manera mucho más rápida que una reacción no catalizada. Los especialistas distinguen entre seis grandes tipos de enzimas de acuerdo a la reacción que se encargan de catalizar: las oxirreductasas, las transferasas, las hidrolasas, las isomerasas, las liasas y las ligasas. Las enzimas suelen ser utilizadas a nivel comercial e industrial para la producción de alimentos, el desarrollo de biocombustibles y la elaboración de productos de limpieza (como detergentes), por ejemplo. (Julián Pérez Porto y María Merino. Publicado: 2009. Actualizado: 2009.). PAPAÍNA

La papaína es una enzima que se extrae del fruto llamado papaya y que pertenece a una familia de proteínas relacionadas, que incluye endopeptidasas, aminopeptidasas, dipeptidil peptidasas y otras enzimas con actividades tanto exo-peptolíticas como endopeptolíticas..Las propiedades peptolíticas de la papaína provocan la ruptura de múltiples enlaces en las proteínas animales, lo que tiene por consecuencia que se pueda utilizar para ablandar la carne destinada al consumo humano. La papaína también hidroliza proteínas vegetales, y es útil para evitar la formación de los sedimentos proteicos que produce la proteína de la cebada en el proceso de fabricación de cerveza. También posee propiedades antiinflamatorias cuando es consumida directamente, por lo que los frutos que la contienen han sido usados como medicamento natural. Un entorno alcalino con pH mayor de 8, o una temperatura mayor de 37ºC desnaturaliza la papaína rápidamente. El crecimiento del negocio relacionado con su uso para ablandar carnes para consumo humano y para evitar la sedimentación durante la producción de cerveza ha causado que el consumo mundial de papaína haya aumentado hasta unos cien millones de dólares anuales. La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos de papaya inmaduros. Luego, en el laboratorio se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para su comercialización y uso, (Cáceres, 1996). BROMELINA Bromelina es una enzima con acción proteolítica para una mejor asimilación de los aminoácidos que las componen. La bromelina deshace las proteínas de igual manera que la pepsina, enzima que forma parte del jugo gástrico. Se encuentra en las piñas. Las bromelinas pertenecen al clan CA y a la familia C1 de las peptidasas. Los residuos catalíticos de la familia C1 han sido identificados como la cisteína y la histidina, formando una díada catalítica. Se han encontrado otros dos residuos en el sitio activo, un residuo de glicina precediendo al Cys catalítico y un residuo de asparagina siguiendo al His catalítico. Se cree que la Gln ayuda en la formación del agujero de oxoanión y la Asn a orientar el anillo imidazol de la His catalítica.y se encuentra en América. (Cáceres, 1996).

5.2. MARCO REFERENCIAL La presente práctica se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias, dicha facultad pertenece a la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, la misma que está localizada en la ciudad de Riobamba perteneciente a la Provincia de Chimborazo la misma que es una de las provincias de Ecuador situadas en la Región Sierra del mismo país. 6. PROCEDIMIENTO

6.1.

DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PRÁCTICA:

Colocar en el tubo 4 un pedazo de papaya

Agregar a cada tubo aprox. 3 ml de la gelatina recien preparada todavía líquida, mezclar haciendo rotar los tubos en un baño de hielo durante 5 a 10 min.

Colocar en el tubo 1 un pequeño trozo de piña fresco

Colocar en el tubo 5 colocar gotas de jugo de papaya

Cuando el tubo 6 contenga una gelatina firme, observar los tubos restantes y comparar los resultados.

Colocar en el tubo 2 algunas gotas de jugo de piña

Dejar vacío el tubo 6

Registrar los resultados observados en cada tubo en una tabla.

Colocar en el tubo 3 un trozo pequeño de manzana

Preparar en un recipiente gelatina siguiendo las instrucciones del empaque.

Repetir los experimentos pero calentando previamente el jugo de las frutas o los trozos de fruta, por ejemplo 3 minutos a 100 °C.

Marcar 5 tubos de ensayo con los números del 1 al 6.

7. RESULTADOS TUBO CONTENIDO 1 Trozos de papaya + 2 Trozos de piña + 3 Trozos de manzana + 4 Jugo de papaya + 5 Jugo de piña + 6 Gelatina 7 Trozos de papaya + 8 Trozos de piña + 9 Trozos de manzana + 10 Jugo de papaya + 11 Jugo de piña + 12 Gelatina

Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina

CONDICIÓN TIEMPO Frio 5 min Frio 5 min Frio 5 min Frio 5 min Frio 5 min Frio 5 min --------10 min --------10 min --------10 min Calor 10 min Calor 10 min --------10 min

RESULTADO Coagulación parcial Coagulación parcial Coagulación total Nula coagulación Nula coagulación Coagulación total Coagulación total Coagulación total Coagulación total Coagulación total Coagulación total Coagulación total

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS EN LA BIBLIOGRAFÍA El colágeno presente en la gelatina tiene la propiedad de retener líquido dentro de sus mallas para luego encapsularlo y formar redes de sólidos, pero la Bromelina inhibe la función del colágeno debido a que rompe todos los enlaces e impide que estas absorban el agua del producto, (Malajovich, 2010). Las enzimas son proteínas que al ser calentadas, experimentan un proceso de desnaturalización, con pérdida de su actividad, por lo tanto la velocidad de la reacción que catalizan, disminuye o cesa, (Fratti, 2013). En temperatura de la habitación, la enzima puede sobrevivir al menos una semana incluso bajo múltiples ciclos de congelación y descongelación, (Jaramillo, 2016).

EN LA PRACTICA Donde Fácilmente se evidencio la presencia de Papaína y Bromelina, fue en aquellos tubos donde se encontraban únicamente zumo de piña o papaya y así lo afirmaba la nula coagulación de la gelatina, cosa que no sucedió con los siguientes tubos que poseían el mismo contenido pero sometido a elevadas temperaturas, esto debido a la desnaturalización de dichas enzimas, cesando de a poco hasta llegar a reprimir por completo su acción hidrolítica. El mismo efecto de impedir la coagulación, ocurrió con los trozos de frutas de papaya y piña pero de manera parcial, generando un fluido muy denso y viscos, y esto se debe a que las enzimas no se encuentran tan disponibles en trozos de frutas como lo está en el zumo, por otro lado la manzana únicamente fue empleada como modelo de que diferentes frutos, poseen distintas enzimas y en la manzana es carente de proteasas, dejando que su medio se coagule normalmente.

9. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

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9.1. CONCLUSIONES Tras exponer jugos y trozos de fruta de papaya y piña a una solución de gelatina recién preparada según indicaciones del sobre se pudo verificar que al haber existido inhibición en la coagulación de la misma en ciertos tubos, la enzima que actuaba (componente de dichas frutas) es una proteasa dado que la gelatina en su mayor porcentaje es proteína y la coagulación es mediada por ella (colágeno). En los resultados obtenidos en cuanto a la bromelina y papaína con la solución de gelatina, se aprecia que las enzimas inhiben la función del colágeno debido a que rompen todos los enlaces e impide la gelatina cuaje. En el caso de las muestras de jugo y trozos de fruta de piña y papaya se pudo verificar la acción de las enzimas bromelina y papaína respectivamente debido a

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que estas no permiten que se cuaje la gelatina, en cambio en los trozos de manzana se da una coagulación de la gelatina porque esta fruta no posee este tipo de enzimas. Clasificar la enzima que actúa en el medio de gelatina a diferentes temperaturas A temperaturas altas se desnaturalizan las enzimas bromelina y papaína y por ende pierden su funcionalidad, lo que permite que la gelatina se coagule, en cambio a temperaturas bajas disminuyen su movilidad molecular y tenemos menor disponibilidad de estas. 9.2. RECOMENDACIONES Colocar las mismas cantidades de fruta como de jugo y gelatina en cada tubo de ensayo Someter a las muestras a una temperatura adecuada. Seguir las instrucciones del empaque para la preparación de la gelatina. Mantener condiciones asépticas durante el proceso.

10. BIBLIOGRAFÍA

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10.1. BIBLIOGRAFÍA Fratti, I. (2013). ACTIVIDAD ENZIMATICA –DESNATURALIZACIÓN DE ENZIMAS. UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA. Malajovich, M. A. (2010). LAS PROTEASAS EN LOS PRODUCTOS COMERCIALES. Guías de actividades. 10.2. WEBGRAFÍA Lezcano, A. Levaduras. Recuperado de: http://www.alimentosargentinos.gob.ar/contenido/revista/ediciones/53/prod uctos/r53_07_Levaduras.pdf Contreras, C. y Del Campo, M. (2014). PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA; UN BENEFICIO PARA LA SALUD. Recuperado de http://bibliotecadigital.usb.edu.co/bitstream/10819/2613/1/Fermentaci%C3% B3n%20alcoh%C3%B3lica%20un%20proceso_Carlos%20Contreras_USBCTG_20 15.pdf Vázquez, H. y Dacosta, O. (2007). Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de desechos agrícolas. Recuperado de http://www.ejournal.unam.mx/ict/vol0804/ICT000800404.pdf Carreto, F. (2006). Proceso de fabricación de bebidas alcohólicas. Recuperado de http://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099.1/4867/03_Memoria.pdf? sequence=4

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Uribe, L. (2007). Caracterización fisiológica de levaduras aisladas de la filósfera de mora. Recuperado de http://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis276.pdf Anónimo. (2013). Condiciones para el desarrollo de las levaduras. Recuperado de http://www.conocimientosweb.net/dcmt/ficha19506.html Anónimo. Experimento sobre la fermentación de levaduras. Recuperado de: https://www.experimentosfaciles.com/experimento-sobre-fermentacion-enlevaduras/ Anónimo. (2007). Cuaderno No. 13. Recuperado de: http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo= 3¬e=13 Bautista, Y. (2014). Actividad de las levaduras. Recuperado de https://es.vbook.pub.com/document/228230220/Actividad-de-Las-Levaduras Jaramillo, R. (15 de Abril de 2016). Copro. Obtenido de http://copro.com.ar/Bromelina.html Anónimo (2015). Inflar un globo con levadura y azúcar. Disponible en: http://fqexperimentos.blogspot.com/2012/05/218-inflar-un-globo-con-levadura-y.html Gonzáles, M. (2014). Caracterización bioquímica y biotecnológica de la levadura “Saccharomyces cerevisiae” GL15. Disponible en: https://biblioteca.unirioja.es/tfe_e/TFE000802.pdf Anónimo. Metabolismo del piruvato. Disponible en: http://www3.uah.es/bioquimica/Tejedor/BBM-II_farmacia/T4-piruvatopagina.pdf Mercedes, M. (2016). ESTUDIO DEL PROCESO BIOTECNOLOGICO PARA LA ELABORACION DE UNA BEBIDA ALCOHOLICA A PARTIR DE JUGO DE NARANJAS. Disponible en: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/1933/tesisUPV2468.pdf

11. CUESTIONARIO a. ¿Por qué se preparó un tubo que sólo contenía gelatina? Se puso un tubo con gelatina sin agregado enzimático como tubo de control, mismo que ayuda a interpretar las características que tiene la gelatina al no ser expuesta a actividad enzimática. Además, era un referente a la hora de la coagulación de las demás muestras dado que, si ese ya coagulaba, el resto de muestras ya lo habría hecho, esto hablando del caso en el que se expuso los tubos a una elevada temperatura para inducir una desnaturalización de las enzimas y permitir dicha coagulación. Para las muestras que no fueron expuestas a elevadas temperaturas simplemente fue un tubo de control como se mencionó antes (Anónimo). b. ¿Por qué se preparó un tubo con un trozo de manzana?

Para comparar la actividad enzimática que tiene la manzana respecto a las presentes en la piña y papaya. Dado que la manzana no tiene proteasas se llevó a cabo con normalidad la coagulación de la gelatina en el tubo que contenía trozos de manzana. c. ¿Qué pueden decir acerca de los resultados obtenidos, teniendo en cuenta que la gelatina está constituida por proteínas? Para los tubos que no fueron expuestos a elevada temperatura y contenían pedazos de frutas se observó una coagulación parcial, dado que la densidad del agregado enzimático con gelatina adquirió una densidad mayor a la que había inicialmente, una vez llevada al agua con hielo. En las mismas condiciones, para los tubos con zumo de dichas frutas se obtuvo una solución muy fluida, lo cual explica que la actividad enzimática de las proteasas presentes en cada fruta es mayor en su zumo que encapsuladas en la fruta como tal. Ahora bien, cabe recordar en la composición de la gelatina predomina proteínas como el colágeno y que si la misma no coagula en la experimentación es un indicador de actividad enzimática de proteasas. En los tubos que fueron expuestos a 100°C se pudo apreciar que en su totalidad coagularon, lo cual es lógico ya que a esa temperatura las enzimas presentes en las furas y zumo se desnaturalizan, esto último no es más que la pérdida de funcionalidad de las enzimas dado que de una estructura cuaternaria de las proteínas se retorna a una primaria. Al suceder esto se inhibe toda acción enzimática y se da la coagulación completa de la gelatina.