Seminarski Rad

SEMINARSKI RAD IZOLACIJA RNK





Izolacija RNK iz ćelijskih linija i tkiva, neophodan je korak u izučavanju ćelijski specifične genske ekspresije, mehanizama koji regulišu gensku ekspresiju, kao i u svim procedurama koje iziskuju pravljenje komplementarne DNK (cDNK).  ćelija sisara sadrži približno, a najveći dio ove RNK je lociran u citoplazmi

MOLEKULA RNK







više od 80% RNK je ribosomalna, 10% RNK predstavljaju male RNK kakva je transportna RNK (tRNK) i mala jedarna RNK . iRNK sačinjava samo 1-3% od totalne RNK. iRNK je u ćeliji prisutna u formi nukleotidnih nizova, čije su dužine i sekvence različite. Zavisno od vrste i uloge same ćelije različite iRNK mogu biti asocirane sa polisomima, neke od njih lokalizovane su u mikrosomima, ali većina iRNK prisutna je kao slobodna u citoplazmi











Za izolaciju i rad sa intaktnom RNK najvažnije je eliminisati svaku potencijalnu mogućnost za dejstvo endogenih ili egzogenih RNaza. Pridržavanje određenim pravilima može pomoći u eliminaciji prisustva i dejstva egzogenih RNaza. 1.) Koristiti sterilno plastično posuđe, koje ne posjeduje RNaze (sa oznakom “Rnase free”). 2.) Koristiti nastavke za pipete, koji ne posjeduju RNaze (sa oznakom “Rnase free”). 3.) Koristiti plastične rukavice, koje ne smiju biti pokidane, jer su ruke potencijalni izvor RNaza. 4.) Kada god je to moguće koristiti rastvore koji su autoklavirani i/ili pripremljeni sa autoklaviranom dejonizovanom vodom.





5.) Voda i rastvori koji ne sadrže primarnu amino grupu, kao i stakleno posuđe, mogu se tretirati sa 0.1% rastvorom dietilpirokarbonata (DEPC) preko noći. 6.) Uvijek koristiti vodu tretiranu sa DEPC (“DEPC-treated water”), koja se kao takva kupuje, a proces njenog fabričkog spravljanja podrazumjeva dodavanje 0.1% DEPC u vodu, lagano mućkanje, inkubaciju 6h na sobnoj temperaturi i autoklaviranje 20 minuta.

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA 

RNeasy Mini Kit namenjen je izolaciji totalne RNK iz male količine startnog materijala. Predstavlja brzu i jednostavnu metodu za izolaciju više od 100 µg totalne RNK iz animalnih ćelija i tkiva, bakterija i kvasaca (“RNeasy Mini Kits”), kao i iz biljnih ćelija i tkiva i filamentoznih gljiva (“Rneasy Plant Mini Kits”).

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA 

Ova metoda bazira se na selektivnom vezivanju za silica-gel membranu. Specijalizovani puferski sistem obezbjeđuje da se više od 100 µg RNK, duže od 200 baza veže za RNeasy silica-gel membranu. Pre vezivanja za silica-gel membranu biološki uzorci moraju se lizirati i homogenizovati u prisustvu pufera, koji sadrži visoko denaturišuću komponentu tzv. guanidin izocijanat (GITC), koji ima ulogu u inaktivaciji RNaza, kako bi se obezbijedila izolacija intaktne RNK.

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA 

Nakon liziranja uzorak se prenosi na QIAshredder homogenizer (specifičan ependorf), koji obezbjeđuje homogenizaciju uzorka, redukuje viskoznost lizata i eliminiše genomsku DNK. Zatim se na lizat dodaje etanol, koji treba da obezbjedi uslove za selektivno vezivanje RNK za RNeasy silica-gel membranu. Nakon tretmana sa etanolom lizat se prebacuje na RNeasy mini kolonu (specifičan ependorf, koji sadrži RNeasy silica-gel membranu).

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA 



Totalna RNK se vezuje (adsorbuje) za RNeasy silica-gel membranu, dok se kontaminanti spiraju sa membrane specifičnim puferima. Naposljetku se totalna RNK spira sa membrane pomoću 30-50 µl “RNase free” vode. Efikasno razaranje (liziranje) i homogenizacija startnog materijala dva su važna koraka u izolaciji totalne RNK. Kompletno razaranje plazma membrane same ćelije, kao i njenih organela neophodno je za oslobađanje kompletne RNK iz uzorka.

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA 

Različiti uzorci (biljni, životinjski i sl.) zahtijevaju različite metode za obezbeđivanje kompletnog razaranja. Nekompletno razaranje rezultira u značajnom smanjenju totalne RNK izolovane iz ćelija. Homogenizacija je neophodna za redukciju viskoznosti ćelijskih lizata, koja se povećava tokom procesa razaranja. Homogenizacijom se eliminiše genomska DNK visoke molekulske mase, kao i druge ćelijske komponente visoke molekulske mase, a sve u cilju dobijanja homogenog lizata.

IZOLACIJA RNK POMOĆU RNEASY MINI KITA 

. Nekompletna homogenizacija dovodi do smanjene efikasnosti RNK da se veže za RNeasy silica-gel membranu, što takođe, redukuje krajnju količinu izolovane totalne RNK

ČUVANJE I STABILIZACIJA STRANOG MATERIJALA ZA IZOLACIJU RNK 

RNK u tkivu nije zaštićena nakon izolacije tkiva ili ćelija, sve dok se uzorak ne tretira sa RNK stabilizujućim reagensom . Uzorci se čuvaju uranjanjem u odgovarajuću količinu RNK stabilizujućeg reagensa, ODMAH nakon izolacije startnog materijala. Ovaj postupak spriječava svaku nepoželjnu promenu u genskoj ekspresiji, RNK degradaciju, kao i indukciju novih gena, tokom perioda čuvanja RNK.

ČUVANJE I STABILIZACIJA STRANOG MATERIJALA ZA IZOLACIJU RNK 

RNAlater RNA stabilization reagent ulazi u ćelije difuzijom i “čuva” ćelijsku RNK. Neposredno nakon kontakta sa materijalom RNAlater difunduje u individualne ćelije. Kako bi se osigurala brza i pouzdana stabilizacija RNK uzorak mora biti izrezan na delove koji nisu veći od 0.5 cm. Ćelije sađene u petri ploči mogu se čuvati u RNAlater-u, tako što se u petri ploču na koju su ćelije zalepljene dodaje određena količina (3-5 ml RNAlater-a), petri ploča se zatvori i oblijepi parafilmom. Uzorci tretirani RNAlater-om stabilni su:

ČUVANJE I STABILIZACIJA STRANOG MATERIJALA ZA IZOLACIJU RNK      

Uzorci tretirani RNAlater-om stabilni su: • 1 dan na 37˚C • 7 dana na 18-25˚C • 4 nedjelje na 2-8˚C (u frižideru) • Neograničeno dugo na -20˚C ili -70˚C Uzorci ćelija, iz kojih će se izolovati RNK, takođe, se mogu čuvati bez dodatka RNA later-a na -70 u specijalnim zamrzivačima ili u tečnom azotu. To mogu biti ependorfi u kojima se nalaze ćelije, petri ploče sa zalepljenim ćelijama i sl.

LITERATURA  



http://www2.dbe.pmf.uns.ac.rs/PDF/fiziolog ija/Izolacija%20RNK.pdf Švob, T. i sradnici: Osnovi opće i humane genetike, Školska knjiga, Zagreb, 1990. Prentis S: Biotehnologija, Školska knjiga, Zagreb, 1991.