These Doctorat Mauricio Schoebitz

UNIVERSITÉ DE NANTES UFR SCIENCES ET TECHNIQUES _____

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES POUR L’INGÉNIEUR GÉOSCIENCES ARCHITECTURE

N° attribué par la bibliothèque

Année 2010

Étude de l’encapsulation de rhizobactéries pour la biofertilisation du blé

THÈSE DE DOCTORAT Discipline : Sciences de l’Ingénieur Spécialité : Génie de Procédés

Présentée et soutenue publiquement par

Mauricio Ivan SCHOEBITZ CID Le 22 de septembre 2010, devant le jury ci-dessous

Président: Rapporteurs: Examinateurs:

Gérald Thouand, Professeur Université de Nantes, France. Yvan Moënne-Loccoz, Professeur Université Lyon 1, France. Stéphane Declerck, Professeur Université Catholique de Louvain, Belgique. Rémi Saurel, Professeur AgroSup Dijon, France. Hélène Simonin, Maître de Conference, ONIRIS, France Co-encadrant de thèse. Denis Poncelet, Professeur, ONIRIS, France Directeur de thèse.

ED : ……………………. (Uniquement pour STIM et MTGC)

Cette thèse a été réalisée dans le cadre d’un projet européen financé par RHIBAC «Food Quality & Safety» FP6-FOOD-CT-2006-036297 www.rhibac.org

REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé au laboratoire de Génie de Procédés Alimentaires de l'École Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l'Alimentation Nantes-Atlantique : ONIRIS. Je tiens à remercier à Monsieur Denis Poncelet, qui, en tant que Directeur de thèse, s'est toujours montré très disponible tout au long de la réalisation de ce travail, ainsi pour sa confiance et la liberté qu'il m'a accordé ainsi que nos nombreuses discussions m’ont permis de progresser. Mes remerciements s’adressent également à Mme. Hélène Simonin, maître de conférences à l’ONIRIS, pour leur encadrement, leur soutien, disponibilité et les remarques substantielles qu’elle a formulées pour la finalisation de ce travail. Sans elle, ce travail n’aurait pas sa forme actuelle. Mes remerciements les plus respectueux vont à M. Yvan Moënne-Loccoz, Professeur de l’Université Lyon 1 et M. Stéphane Declerck, Professeur de l’Université Catholique de Louvain qui m’ont fait l’honneur de prendre connaissance de ce travail et d’en être rapporteurs. Merci à M. Rémi Saurel, Professeur de l’AgroSup Dijon et M. Gérald Thouand, Professeur de l’Université de Nantes, d’avoir accepté de présider le jury de cette thèse. Mes remerciements s’adressent également à René Cardenas, pour sa générosité et pour ses précieux conseils qui m’ont guidé au cours de mes études. Je ne saurais oublier d’exprimer ma reconnaissance à Mme. Anne François Miegeville pour son aide fourni dans la préparation des échantillons pour la microscopie électronique à balayage. Je veux présenter, mes sincères gratitudes à tous les enseignants et l’équipe technique de l’ONIRIS qui ont contribué à la réalisation de ce travail. Également, j'exprime ma gratitude à toute l’équipe de Microencapsulation: Gisèle, Luca, Ming, Audrey, Guy, Lola, Sariah et Carole. À tous les moments passés ensemble au labo et en dehors. À l’accueil chaleureux que vous m’avez fait lors de mon arrivée et au soutien que vous m’avez apporté tout au long de ma thèse. Enfin, j'adresse mes plus sincères remerciements à ma famille, qui m'a toujours soutenu et encouragé au cours de la réalisation de ce travail de recherche.

Sommaire

Sommaire INTRODUCTION GÉNÉRALE .........................................13 ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...........................................17 1. Introduction ..............................................................................................17 2. La flore microbienne du sol .....................................................................18 2.1. La Rhizosphère......................................................................................................21 2.2. Les champignons: mycorhizes arbusculaires.......................................................22 2.3 Les rhizobactéries...................................................................................................24 2.3.1. Mécanisme de fixation de l’azote.......................................................................26 2.3.2 Production des phytohormones...........................................................................28 2.3.3. Solubilisation des phosphates dans le sol .........................................................29

3. Inoculation des rhizobactéries dans le sol ..............................................31 3.1 Inoculum liquide ....................................................................................................32 3.1.1 Imprégnation des semences ................................................................................32 3.1.2 Pulvérisation de l’inoculum................................................................................32 3.2. L'inoculum sous support.......................................................................................33 3.2.1 Formulations à base de talc ................................................................................34 3.2.2 Formulations à base des tourbes ........................................................................36 3.2.3 Formulations à base de vermiculite....................................................................36 3.2.4. Formulations à base d'argile .............................................................................37

4. L’encapsulation des rhizobactéries .........................................................39 4.1. Caractéristiques principales de l’encapsulation ..................................................40 4.1.1. Immobiliser et/ou isoler......................................................................................40 4.1.2. Protéger...............................................................................................................41 7

Sommaire

4.1.3. Libérer progressivement.....................................................................................42 4.1.4. Structurer et fonctionnaliser..............................................................................42 4.1.5 Pourquoi encapsuler des rhizobactéries?...........................................................43 4.2 Les techniques d’encapsulation.............................................................................43 4.2.1 Le « dripping » ....................................................................................................44 4.3 Les matériaux d’encapsulation .............................................................................46 4.3.1. Caractéristique de l’alginate de sodium ............................................................47 4.3.2 Survie des rhizobactéries encapsulée dans des matrices d’alginate..................49 4.3.3 L’adjonction de l’amidon à la matrice d’encapsulation ....................................50

Conclusion .....................................................................................................53

MATÉRIELS & MÉTHODES ............................................55 1. Micro-organismes et conditions de culture ............................................56 1.1 Souches de rhizobactéries ......................................................................................56 1.2. Milieux de culture .................................................................................................57 1.2.1 Composition milieu YEP .....................................................................................57 1.2.2 Milieu de culture de l’Institut Maurice R&D ....................................................58 1.2.3 Préparation du milieu Trypticase soy broth (TSB) ............................................59 1.3 Réhydratation et conservation des souches bactériennes.....................................60 1.3.1. Protocole de conservation ..................................................................................60 1.4 Cultures cellulaires.................................................................................................60 1.4.1 Cultures en Erlenmeyer ......................................................................................61 1.4.2 Cultures en fermenteur .......................................................................................61 1.5 Dénombrement des cellules....................................................................................63 1.6 Dénombrement des cellules contenues dans les capsules. ...................................64 1.7 Méthodes de caractérisation des bactéries ............................................................65 1.7.1 Microscopie optique et loupe binoculaire ..........................................................65 8

Sommaire

1.7.2 Morphologie et croissance des colonies .............................................................65

2. Procédé d’encapsulation ..........................................................................67 2.1 Préparation de rhizobactéries pour l’encapsulation.............................................67 2.2 Préparation de la matrice d’encapsulation ...........................................................69 2.2.1 Matériaux ............................................................................................................69 2.2.2 Choix de l’alginate ..............................................................................................69 2.2.3 Choix des agents de charge.................................................................................70 2.2.4 Fabrication de la matrice et des solutions de gélification .................................71 2.3 Le séchage des capsules .........................................................................................73 2.4 Stockage des capsules.............................................................................................73

3. Évaluation de l’adhésion des cellules sur les grains d’amidon .............76 3.1 Test de cosédimentation .........................................................................................76 3.2 Observation de l’adhésion des cellules sur les granules d’amidon au microscopique électronique à balayage.......................................................................78 3.2.1 Protocole de préparation des échantillons pour la microscopique électronique à balayage (MEB) ........................................................................................................79

4. Libération des rhizobactéries des capsules dans l’eau et dans le sol ...80 4.1 Libération des rhizobactéries dans l’eau...............................................................80 4.2 Libération des bactéries dans le sol .......................................................................81

5. Production des capsules à échelle pilote .................................................84 5.1 Production de la biomasse à l’ONIRIS .................................................................84 5.1.1 Préparation de la matrice....................................................................................85 5.1.2 Séchage des capsules...........................................................................................87 5.1.3 Séchage sur lit fluidisé ........................................................................................88 5.1.4 Séchage à l’étuve.................................................................................................89 5.2 Production des capsules à l’Université Austral du Chili (UACH) .......................91 5.2.1 Encapsulation des bactéries................................................................................93 9

Sommaire

6. Étude de l’efficacité des inoculums encapsulés en champs ..................95 6.1 Essais en champs au Chili .....................................................................................95 6.2 Essai en champs en Angleterre..............................................................................99

RÉSULTATS & DISCUSSION ..........................................103 1.Caractérisation de la survie des rhizobactéries au procédé d’encapsulation ...........................................................................................104 1.1 L’effet de la nature de la matrice d’encapsulation sur la viabilité cellulaire ....104 1.2 Évolution du nombre de cellules vivantes à différentes étapes du procédé d'encapsulation ..........................................................................................................111 1.3 Évolution du nombre de cellules vivantes dans des billes sèche durant le stockage à 4 °C ...........................................................................................................118 1.4 Influence de l’échelle de production ...................................................................121 1.4.1. Production des capsules pour l’UACH ...........................................................122 1.4.2. Production de capsules sèches d’alginate-amidon pour le partenaire industriel Masstock. ....................................................................................................................127

2. Optimisation de la survie des rhizobactéries au procédé d’encapsulation ...........................................................................................132 2.1 Optimisation par la modulation de l’état physiologique des bactéries...............132 2.1.1 L’influence de la phase de croissance sur la survie des cellules pendant l’opération de séchage à l’étuve. ...............................................................................132 2.1.2 Influence de l'adjonction d’osmo-protecteurs dans le milieu de culture........135 2.2 Optimisation par la modulation des paramètres du procédé d’encapsulation ..138 2.2.1 Influence de l'adjonction de glycérol dans la matrice d’encapsulation .........138 2.2.2 Modification du sel de calcium utilisé pour la gélification de l’alginate........139 2.2.3 Modulation du niveau de séchage et stockage des capsules............................142

3. Étude de l’adhésion des rhizobactéries sur l’amidon ..........................146 3.1. Influence de la souche de rhizobactéries sur l’adhésion à la surface des granules d’amidon .....................................................................................................147

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Sommaire

3.2. Influence de l’état physiologique d’Enterobacter ludwigii sur sa capacité d’adhésion aux granules d’amidon ...........................................................................148 3.3. Effet du type d’amidon sur l’adhésion cellulaire...............................................149 3.4. Pourcentage d’adhésion cellulaire en fonction de la concentration de l’amylose dans les granules d’amidon. ......................................................................................152 3.5. Observation au microscope électronique à balayage des bactéries adhérées sur la surface des granules de l’amidon. .........................................................................155

4. Libération progressive des rhizobactéries et efficacité en champs ....161 4.1 Libération des rhizobactéries dans l’eau et dans le sol ......................................161 4.1.1 Libération des B. pumilus et R. terrigena dans l’eau ......................................161 4.1.2 Libération dans le sol de B. pumilus encapsulée .............................................163 4.2 Étude de l’efficacité des inoculums encapsulés en champs................................166

CONCLUSION & PERSPECTIVES ................................175 BIBLIOGRAPHIE..............................................................179

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I. Introduction Générale

INTRODUCTION GÉNÉRALE Pendant la période qui comprend les années 1960-1990, le monde a vécu une immense transformation politique et économique, connue comme « la Révolution Verte». Cette révolution a permis une augmentation de la productivité agricole. Elle a été rendue possible par la mise au point de nouvelles variétés de céréales à haut rendement et par le développement de produits de la chimie de synthèse, comme les pesticides et les engrais. Grâce à la révolution verte, le rendement des cultures a augmenté, et cela a permis de nourrir la population mondiale tout en maintenant le prix des denrées alimentaires à des niveaux stables.

Depuis les années 90’, nous avons pris conscience d’avoir payé trop cher le gain de productivité du à la Révolution Verte. L’utilisation excessive des produits agrochimiques a conduit à une grave pollution de l’environnement et mis en péril la santé publique.

La recherche scientifique s’est intéressée à l'étude et à l'exploration du potentiel des microorganismes du sol, afin d’utiliser leurs propriétés phytosanitaires et phytostimulantes pour diminuer l’utilisation des produits agrochimiques. Les produits contenant des microorganismes, comme les bactéries ou les champignons, sont caractérisés de bioengrais. Ces micro-organismes peuvent être inoculés seuls ou en mélanges. Les rhizobactéries permettent de fixer l'azote atmosphérique ou de le solubiliser et de mobiliser les éléments nutritifs du sol. Ils peuvent également sécréter des substances stimulant la croissance des cultures.

Les résultats des recherches sur les propriétés des bioengrais ouvrent des nouvelles pistes offrant ainsi une alternative à l’utilisation des engrais chimiques. Cette alternative plus écologiquement durable permet d'accroître la fertilité des sols dans le cadre d'une production agricole durable et respectueuse des agro-écosystèmes.

Actuellement, l’inoculation du sol est réalisée par épandage de tourbe préalablement mélangée à une culture microbienne. Toutefois, l’encapsulation des cellules dans des hydrogels s'est avérée comme une technique prometteuse (Cassidy et al. 1996). En effet,

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I. Introduction Générale

l'encapsulation des cellules protège les micro-organismes des agressions de l'environnement et de la flore concurrente déjà présente dans le sol et permet une diffusion progressive des micro-organismes dans le sol (Fages 1992; Bashan 1998).

La diminution du taux de survie, durant l’encapsulation et tout particulièrement pendant l'étape de séchage, reste cependant une difficulté majeure. Selon plusieurs auteurs, le nombre de cellules viables diminue jusqu’à une valeur inférieure à 1% au cours du procédé d'encapsulation (Paul et al. 1993). La phase de séchage des capsules constitue donc l'étape la plus critique du procédé d’encapsulation . Elle demeure cependant indispensable, car elle permet de maintenir l'activité biologique des capsules malgré une période de stockage prolongée (Bashan et Gonzalez, 1999).

L’hydrogel le plus utilisé pour l’encapsulation des micro-organismes est l'alginate de sodium. Les billes d’alginate sont en fait, très fortement hydratées, 97% de leur masse étant de l’eau, et ne sont pas capables de protéger les micro-organismes pendant la durée du séchage. Après séchage, les capsules sont petites et contractées, et présentent un taux de mortalité des microorganismes élevé. Afin d'améliorer cet état, l'ajout d'adjuvants, tel que l’amidon, a permis d’augmenter la concentration initiale en matière sèche (Ivanova 2006). La formulation des capsules à base d’alginate et d’amidon permet une diminution de la consommation d’énergie par le procédé de séchage et un meilleur taux de survie des micro-organismes.

L’objectif principal de ce travail de recherche est l'augmentation de la survie des rhizobactéries encapsulées et la mise au point d’une méthode d’inoculation fiable pour permettre la protection des rhizobactéries au sein d’une matrice sèche d'alginate-amidon via l’immobilisation des bactéries au sein des capsules.

On s’attachera notamment à déterminer une formulation de matrice d’encapsulation d’alginate, alginate-argile et alginate-amidon, ainsi qu’identifier les conditions techniques optimales permettant de réaliser l’encapsulation. On évaluera également la survie des cellules durant le procédé d’immobilisation et durant leur stockage ainsi que leur libération dans l'eau et le sol.

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I. Introduction Générale

Ce travail se décline en quatre parties :

Le premier chapitre présente une revue bibliographique, portant sur la flore microbienne naturelle du sol, l’inoculation des rhizobactéries dans le sol et la production d’inoculant biologique par immobilisation des rhizobactéries.

Le second chapitre porte sur la description des équipements, des techniques expérimentales et des méthodes d’exploitation des données employées au cours de ce travail.

Le troisième chapitre décrit les résultats obtenus au cours de cette étude et leur interprétation, qui comprend: la caractérisation et l’optimisation de la survie cellulaire aux différentes étapes de l’encapsulation en fonction des espèces bactériennes, la compréhension des mécanismes de protection cellulaire par l’amidon et enfin les résultats d’application des capsules en champs.

Enfin, une conclusion approfondie permettra de discuter de nos résultats et d’analyser les perspectives qui en découlent. Notamment, les perspectives concernant l’utilisation future et de manière massive des capsules dans le domaine agricole seront discutées.

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II. Étude Bibliographique

ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE 1. Introduction Les rhizobactéries sont un groupe de bactéries qui vivent associées aux racines des végétaux qui jouent un rôle important pour la croissance des plantes. Elles colonisent les racines des cultures céréalières. Les mécanismes responsables de l'amélioration de la croissance incluent: la fixation d’azote atmosphérique, la production des hormones favorisant la croissance des cultures et la solubilisation/mobilisation des phosphates du sol.

L’utilisation des rhizobactéries dans l’agriculture permet de réduire l’emploi de produits chimiques de synthèse à effet néfaste pour l'environnement ou d’optimiser l’utilisation des engrais chimiques dans le cadre d’une agriculture raisonnée.

En conséquence, un nombre croissant de recherches et d'études portent sur la gestion du système sol-végétal et micro-organismes. Il s'agit de recherches encouragées et développées dans le cadre de nombreux projets internationaux. Elles ont permis notamment l’identification et la sélection de différents genres de rhizobactéries, telles que l’Azospirillum (Krieg et Döbereiner 1984), Raoultella (Van Elsas et al. 2007) et Bacillus (Siddiqui 2006).

Le but de ces recherches est de développer des bioengrais sous forme sèche et d'obtenir une concentration bactérienne nécessaire pour améliorer la croissance des plantes. Le travail de recherche porte sur l’encapsulation des rhizobactéries, qui est considérée actuellement comme l’une des techniques les plus prometteuses pour atteindre cet objectif.

L’étude bibliographique décrira en premier lieu les mécanismes d’action des rhizobactéries. Une deuxième partie sera consacrée aux différents modes d’inoculation possibles des dites bactéries dans le sol. Elle sera suivie d’une troisième partie concernant la production d’inoculants contenant des rhizobactéries immobilisées.

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II. Étude Bibliographique

2. La flore microbienne du sol Les micro-organismes vivants dans le sol sont des bactéries, des champignons, des algues, on retrouve aussi les parties souterraines des plantes ainsi que des animaux très variés allant des protozoaires aux mammifères. Tous participent d’une manière ou d’une autre à la formation de la rhizosphère. Le tableau II.1 présente les organismes vivants qui composent la rhizosphère.

Tableau II.1. Abondance des organismes vivants du sol (n.d. = non déterminé) (Gobat et al. 2003).

Organismes

Bactéries Champignons

Nombre par gramme de sol sec 106 - 109 n.d.

Algues

103

Protozoaires

104 – 106

Faune du sol

-

105

0,1 – 1 000

Biomasse moyenne m3

par

1011 - 1014

kg/ha prof. 20 cm 1 500

% (sans les racines) 25

n.d.

3 500

59

10 – 1 000

Traces

250

4

1 – 5 000

12

108

-

109

109 – 1011 10 –

5.106

Racines

n.d.

n.d.

6 000

-

Total

n.d.

n.d.

env. 12 000

100

Bactéries Au sens large, le terme de bactérie regroupe les organismes unicellulaires à organisation de type procaryote (Bactéries et Archaea), contrairement par exemple aux levures, qui sont des eucaryotes. Certaines bactéries du sol se déplacent à l’aide de flagelles qui fonctionnent comme des hélices de bateau entraînées par un moteur rotatif. D’autres, fréquentes dans les sols et litières, se meuvent en rampant à la surface de corps solides (Huang et al, 2002).

Le changement de composition du sol et du gaz dans un terrain est surtout lié aux fonctions bactériennes (Hurst et al, 2001). Par exemple, l’activité respiratoire aérobie, qui consomme l’oxygène, peut mener à l’anoxie : cela concerne les sols hydromorphes, où la diffusion de l’air est restreinte, mais aussi le centre de grandes particules dans des sols aérés. En présence d’un excès de substrat carboné, les bactéries accaparent l’azote disponible. En revanche,

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II. Étude Bibliographique

d’autres, dans des conditions de carence en azote, sont capables de fixer l’azote atmosphérique N2 et d’enrichir le sol en azote organique et minéral.

Les cyanobactéries sont photosynthétiques et leur activité est identique à celle des chloroplastes des algues et les végétaux. Nombre d’entre elles (ex. Nostoc, Anabaena) peuvent fixer l’azote. Certaines vivent en symbiose avec des plantes, comme Anabaena azolla dans les tissus des plantes fougères flottantes du genre Azolla. Elles constituent alors, à l’image des algues vertes, des symbioses semblables à des lichens (cyanolichens).

Par la synthèse de facteurs de croissance (vitamines) d’une part, et d’antibiotiques d’autre part, certaines bactéries exercent un contrôle positif ou négatif sur d’autres organismes.

Mais c’est avant tout par leurs fonctions biogéochimiques, telles que la minéralisation de la matière organique, l’oxydation des composés inorganiques réduits, la réduction anaérobique des composés inorganiques oxydés, la solubilisation ou la précipitation de minéraux, sans oublier la transformation de certains composants organiques en humine, que les bactéries jouent un rôle essentiel dans la formation et l’évolution du sol.

Le bon déroulement de toutes les étapes de croissance des plantes nécessite des sols bien vivants dont les habitants (faune, champignons, algues et bactéries) contribueront tous à rechercher et à mettre à la disposition de la plante tous les éléments nutritifs dont elle a besoin. Parmi tous ces éléments, l’azote est celui dont la disponibilité est souvent critique pour la production du blé.

Champignons Les champignons sont tous des eucaryotes hétérotrophes aérobies à digestion extracellulaire. Ils peuvent toutefois appartenir à des groupes taxonomiques très variables.

Les champignons transportent activement des quantités importantes d’eau et de substances d’un endroit à l’autre du sol. La translocation des éléments organiques sert à fertiliser le sol. L’extraction des sels minéraux prend toute sa signification chez les mycorhizes. C’est pourquoi les racines d’un végétal réalisent une forte association symbiotique avec les 19

II. Étude Bibliographique

champignons. Le champignon est ici un collecteur des sels minéraux, qu’il transfère à la plante ou garde en réserve pendant la saison morte.

Certains champignons sont spécialisés dans l’utilisation de polysaccharides végétaux et/ou lignine, et peuvent accumuler dans leur mycélium ou dans leurs spores des composés mélanisés précurseurs des matières humiques. D’autres sont habitués à vivre avec les plantes, en prélevant directement les aliments organiques dont ils ont besoin. Cette adaptation est souvent symbiotique, comme dans le cas des mycorhizes déjà évoquées, mais parfois parasitaires.

Algues Les algues microscopiques, unicellulaires ou en colonies filamenteuses, sont souvent abondantes dans les sols, mais restent surtout localisées à la surface ou dans de larges fissures.

Trois groupes taxonomiques eucaryotes sont représentés : les algues vertes (Chlorophycées : Chlamydomonas, Chlorellia, Pleurococcus), les algues jaune-vertes (Xantophycées : Heterococcus, Vaucheria) – ces deux groupes dominent dans les sol acides – et les diatomées (Bacillariophycées, Achnanthes, Navicula, Pinnularia), majoritaires dans les sols neutres ou alcalins. Quand aux « algues » bleues, les cyanophycées, elles sont en réalité des bactéries.

Selon les sols, la biomasse algale, cyanobactéries incluses, est comprise entre 10 et 1000 kg de matière sèche par hectare, avec un maximum de 24 kg pour les seules cyanobactéries des rizières. Il a été dénombré de 102 à 109 individus par gramme de terre dans les sols (Davet, 1996).

Grâce à leur activité photosynthétique, les algues colonisent rapidement les surfaces minérales brutes, dont elles accélèrent l’altération par les substances dissolvantes. Elles produisent aussi les polysaccharides extracellulaires qui agrègent les particules solides et en renforcent la cohésion. En milieu aquatique et dans les sols submergés, certaines forment de la craie en précipitant la calcite.

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II. Étude Bibliographique

2.1. La Rhizosphère La rhizosphère est le volume de sol qui adhère aux racines des plantes. C’est la zone d'absorption des nutriments et de l'eau et d’interaction entre les racines des plantes et les micro-organismes associés. Les interactions dans la rhizosphère sont très importantes et intensives entre la plante, le sol et les micro-organismes du sol. En fait, les interactions biochimiques et les échanges de molécules de signalisation entre les plantes et les microorganismes du sol peuvent influencer de manière significative la croissance des céréales (Pinton et al 2001; Werner 2004).

Figure II.1. Schéma de l’interactions entre les bactéries et les végétaux au niveau de la rhizosphère.(http://biosol.esitpa.org/).

Les plantes vivent au contact de nombreux micro-organismes. Ce contact est permanent et étroit puisque l'on peut détecter plus de 109 microorganismes par gramme de racine. La plupart de ces micro-organismes vivent probablement en saprophytes (leur action principale est le recyclage de la matière organique). Certains exercent un effet néfaste (organismes pathogènes par exemple) et d'autres peuvent, au contraire, protéger et favoriser le développement des végétaux.

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II. Étude Bibliographique

Dans la rhizosphère les organismes vivants qui favorisent la croissance des végétaux sont essentiellement, des bactéries et des champignons, grâce à leur capacité de fixation d'azote, production d’hormones et solubilisation des phosphates.

2.2. Les champignons: mycorhizes arbusculaires Les champignons constituent un règne à part, ils constituent dans notre cas ce qu'on pourrait appeler la « flore fongique ». Ils ne font partie ni du règne animal, ni du règne végétal. Cependant, leur comportement alimentaire les rend davantage semblables aux animaux qu’aux plantes. Tout comme les animaux, ils sont hétérotrophes vis-à-vis du carbone, c’est-àdire qu’ils ont besoin d’une source de carbone organique externe pour s’alimenter, contrairement aux plantes vertes qui produisent elles-mêmes ces éléments grâce à la photosynthèse.

La dénomination de mycorhizes a été utilisée la première fois en 1885 par A.B Frank pour décrire la modification des structures de certaines espèces forestières. Elle a été utilisée depuis pour designer les associations symbiotiques entre les champignons et les racines des plantes (Smith et Read 1997).

Le mot «arbuscules» désigne des structures intracellulaires très ramifiées, les arbuscules proprement dits sont censés être des sites de transfert des éléments nutritionnels entre le champignon et la plante. Ces arbuscules maximisent la surface de contact entre la plante hôte et les champignons pour permettre l'échange d'éléments nutritifs (Sylvia 2005).

Les mycorhizes arbusculaires sont constituées par l’association symbiotique d’un champignon et des racines d’une plante. En d’autres termes, il s'agit là d'une racine colonisée par un champignon mycorhizien qui en a modifié sa morphologie. Les mycorhizes arbusculaires déplacent activement des quantités importantes d’eau et des substances nutritionnelles d’un endroit à l’autre du sol. Le déplacement mécanique des éléments organiques permet de fertiliser le sol. C’est pourquoi les racines des végétaux effectuent une forte association symbiotique avec les champignons. Le champignon est un collecteur de sels minéraux, qui les

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II. Étude Bibliographique

transfère à la plante, les minéraux récoltés ce qui constitue une réserve pendant la saison morte.

Ces champignons appartiennent aussi bien aux Basidiomycètes qu’aux Ascomycètes et Gloméromycètes et ils forment des symbioses mycorhiziennes avec les racines de la majorité des plantes terrestres. Les différents types de mycorhizes qui existent se distinguent à la fois par les groupes taxonomiques des partenaires symbiotiques impliqués (plantes et champignons) et par les structures typiques formées dans la symbiose (Peduzzi et BoucherRodoni 2002).

Plus de 80 % des espèces végétales de la planète s'organisent sous la forme d’association symbiotique avec les mycorhizes (German et al. 2000; Siddiqui 2006). Suite à la colonisation par les mycorhizes, la fonction des racines se modifie sous l’effet du mycélium structuré sous la forme de mycorhizes arbusculaires. À ce jour, on dénombre environ 120 espèces de champignons capables de former ce type de mycorhizes; ils appartiennent tous aux Gloméromycètes et ne peuvent pas être cultivés seuls (en l’absence de la plante hôte). Leur cycle biologique dans le sol repose entièrement sur la présence de racines vivantes de la plante hôte .

En association avec le champignon, un nombre important de processus physiologiques des plantes sont améliorés: nutrition minérale, résistance aux stress biotiques (maladies) et abiotiques (pollution), enracinement et floraison. L’effet sur la croissance des plantes est très positif: accroissement parfois important en poids sec, en taille et modification de la teneur en éléments. La nutrition de la plante notamment en azote (minéral surtout) et en phosphore est améliorée par son transfert du champignon vers la plante (les capacités lytiques du champignon sont largement supérieures à celles de la plante, de même que la surface drainée). De même, le transfert de l’eau est favorisé; on a pu montrer que les mycorhizes accroissent sensiblement la résistance à la sécheresse, notamment en conditions extrêmes (zones arides). On observe également les effets non nutritionnels comme la protection de la plante contre les bactéries et champignons phytopathogènes et la tolérance des plantes aux métaux lourds, ainsi qu'éventuellement une tolérance au calcaire (plantes calcifuges). De son côté, le champignon reçoit des sucres, des vitamines et des molécules complexes (Weger et al. 1995). 23

II. Étude Bibliographique

La colonisation des plantes par les mycorhizes arbusculaires peut affecter de manière importante la population des bactéries bénéfiques associées à la rhizosphère. La synergie entre rhizobactéries et mycorhizes ont été décrites comme ayant un effet de promotion sur la croissance des plantes et des arbres (Glick et al. 1999). 2.3 Les rhizobactéries Les rhizobactéries sont des bactéries qui sont aptes à coloniser les racines de façon intense. Les bactéries non symbiotiques répondant à cette définition appartiennent à différents genres et espèces dont les plus étudiés sont: Azospirillum spp, Bacillus spp, Pseudomonas spp. (Kilian et al. 2000). Les effets bénéfiques des rhizobactéries sont liés à leur position stratégique à l’interface sol-racine. En effet, le rhizoplan et la rhizosphère sont le siège d’échanges intenses entre la plante et le milieu environnant (Brown 1974). Ces échanges sont réciproques. La plante libère des exsudats racinaires qui sont constitués de substances organiques carbonées et azotées : polysaccharides, acides organiques et protéines (Beckmann et al. 1994). De même, la densité des bactéries est plus élevée dans la rhizosphère que dans le sol distant des racines : il s’agit de «l’effet rhizosphère» (Fages 1992; Ravikumar et al. 2004). La quantité et la composition des exsudats racinaires conditionnent également la nature des activités bactériennes. Ces activités résultent de la synthèse de métabolites tels que les sidérophores, les substances de croissance et les lipopolysaccharides .

Si la plante libère des composés organiques, à l’inverse elle prélève de l’eau et des éléments minéraux indispensables à son métabolisme. Ce prélèvement est d’ailleurs associé à l’extrusion de protons qui contribue à abaisser la valeur du pH de la rhizosphère. Les racines sont également capables d’absorber certaines molécules organiques, produites par les microorganismes présents dans la rhizosphère. Les échanges entre la plante et le sol sont influencés par les rhizobactéries et ce d’autant plus que leur densité et leur activité sont élevées. Cette influence se manifeste par une modification de la croissance de la plante et de la fréquence des infections fongiques de la racine. Selon les rhizobactéries présentes, ces modifications peuvent être positives ou négatives pour la plante. Leur étude a donc suscité l’intérêt de nombreux chercheurs .

24

II. Étude Bibliographique

Les rhizobactéries sont les bactéries présentes dans la rhizosphère. Elles peuvent promouvoir la croissance des plantes grâce à plusieurs mécanismes : la fixation biologique de l’azote, la synthèse des phytohormones, l'augmentation de la disponibilité du phosphate, la diminution du stress environnemental et la synergie avec d’autres micro-organismes dans le sol (FuentesRamirez et Caballero-Mellado 2005).

Le nombre de bactéries identifiées en tant que rhizobactéries ou PGPR (en anglais « Plant Growth Promoting Rhizobacteria ») a connu une croissance notable ces dernières années, ceci est le résultat de plusieurs études et recherches incluant un grand éventail de plantes. Le tableau II.2 montre l’effet de l’utilisation des rhizobactéries sur l’augmentation de la croissance et de la protection aux maladies chez les plantes.

Tableau II.2. Les rhizobactéries: l’augmentation de la croissance des plantes et la protection aux maladies.

Rhizobactérie Pseudomonas fluorescens Bacillus pumilus

Culture Betterave

Effet Meilleure résistance aux maladies

Tomate

Meilleure résistance aux

Référence (Moenne-Loccoz et al. 1999) (Benhamou et al. 1998)

maladies Paenibacillus macerans et Bacillus subtilis Azospirillum brasilense

Riz

Promotion de la croissance (Vasudevan et al. 2002) des plantes

Blé

Promotion de la croissance (Kim et al. 2005) des plantes

Pseudomonas fluorescens

Blé

Promotion de la croissance (de Freitas et Germida des plantes 1992)

Pantoea agglomerans

Blé

Promotion de la croissance (Amellal et al. 1998) des plantes

Bacillus simplex et Bacillus firmus

Blé

Promotion de la croissance (Barneix et al. 2005) des plantes

Ces recherches ont contribué au progrès des connaissances des différents mécanismes d’action directe et/ou indirecte des rhizobactéries (Baker et Cook 1974). 25

II. Étude Bibliographique

Les mécanismes indirects se manifestent lorsque les rhizobactéries agissent en tant que contrôle biologique. Elles confèrent ainsi à la plante une résistance accrue aux maladies fongiques et bactériennes. Ce mécanisme indirect stimule également la croissance des autres bactéries symbiotiques qui protègent aussi les plantes des sols déjà contaminés par microorganismes pathogènes.

Les mécanismes directs incluent la production de phytohormones, l’amélioration du captage des éléments nutritifs chez les plantes (libération des phosphates) et la fixation de l’azote atmosphérique. Les différents mécanismes directs de promotion de la croissance sont ici détaillés.

2.3.1. Mécanisme de fixation de l’azote La découverte de la fixation de l’azote par les légumineuses remonte au 19ème siècle. Il a fallu près de cinquante ans pour établir que l’aptitude des légumineuses à utiliser l’azote de l’air était due à la présence de nodules sur les racines, induites par des «ferments» contenus dans le sol. Cette découverte fut rapidement suivie par l’isolement des Rhizobium, puis de plusieurs autres bactéries fixatrices d’azote dans la rhizosphère (Glick et al. 1999).

La canne à sucre a été considérée comme un modèle végétal, dans lequel a été étudiée la fixation d’azote (Smith 1995).

La réaction réalisée par le complexe nitrogénase exige :

-

8 électrons et 8 protons pour la réduction

-

16 ATP pour la fourniture de l’énergie d’activation

La réaction complète est donc :

N2 + 8e¯ + 8H+ 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

26

II. Étude Bibliographique

La formation d’ammoniaque s’accompagne toujours de celle d’hydrogène. Les électrons proviennent de deux sources selon les souches :

-

de NADH, H+ ou/et FADH2 fournis par les processus cataboliques (cycle de Krebs, β-oxydation des acides gras, etc.).

-

de la ferrédoxine ou/et de NADH, H+ formé au cours de la photophosphorylation acyclique.

Le complexe enzymatique de nitrogénase est constitué de 2 métalloprotéines qui comportent trois groupements prosthétiques différents. La première est une réductase (appelée nitrogénase 1) et renferme 2 sous-unités identiques. Elle contient du fer et se comporte comme une réductase. Pour chaque électron récupéré du donneur et cédé à la nitrogénase, il y a consommation de 2 liaisons phosphatiques riches en énergie (2 ATP). La seconde est la nitrogénase (nitrogénase 2), organisée en 2 sous-unités α identiques et en 2 sous-unités β identiques. Sous forme tétramérique α2β2, elle reçoit les électrons de la réductase pour réduire l’azote atmosphérique.

Figure II.3. Fixation biologique de l’azote par le complexe nitrogénase.

L'activité de la nitrogénase est contrôlée par la concentration du milieu en NH4+ et par la concentration en oxygène. La présence des ions ammonium inhibe l’activité enzymatique. La molécule d’oxygène peut endommager l'enzyme nitrogénase de manière irréversible, par

27

II. Étude Bibliographique

oxydation des protéines enzymatiques. Il existe aussi d’autres facteurs qui influencent cette activité, et par conséquent la fixation d’azote.

2.3.2 Production des phytohormones Une phytohormone est une molécule généralement produite par la plante. C'est une molécule qui régule la croissance végétale ou qui intervient dans la communication entre individus végétaux différents. Ces phytohormones peuvent avoir des effets bénéfiques sur la croissance végétale et le développement des plantes (Salysbury et Ross 1992).

Pour être une phytohormone, une substance doit normalement être: ·

endogène (non fournie par l'environnement),

·

oligodynamique (agir à faible dose, de l'ordre de la micromole) et

·

vectrice d'une information (apportée à une cellule cible sélectivement sensible à son action et dont elle influence le fonctionnement).

La plupart des rhizobactéries produisent des hormones auxquelles les végétaux sont sensibles. Ces hormones sécrétées par les bactéries s’ajoutent à l'éventail ou "Pool" des hormones végétales endogènes (Bashan 1998). Ainsi, les hormones bactériennes stimulent le développement du système racinaire ainsi que la croissance globale de la plante hôte. Dans le même temps, l'augmentation résultante de la production des métabolites végétaux est utilisée par les bactéries pour leur propre croissance, ce qui permet une relation réciproque bénéfique entre plantes et rhizobactéries (Patten et Glick 2002).

La promotion de la croissance des racines par les hormones est l'un des facteurs principaux qui ont été identifiés comme étant bénéfiques au rendement de production des plantes. La production bactérienne des hormones constituerait l'essentiel du mécanisme de stimulation de la croissance des plantes grâce à la grande sensibilité des racines aux hormones. Par exemple, les rhizobactéries sécrètent de faibles quantités d’hormones telles que les auxines qui stimulent l'élongation des racines. Par ce biais, elles sont capables de promouvoir la croissance des racines latérales ou le développement des poils absorbants (Brick 1996). 28

II. Étude Bibliographique

Figure II.4. Racines de plantes de tomate a et b racines de plantes contrôle sans rhizobactéries; c et d racines de plantes inoculées avec Enterobacter ludwigii.

La figure II.4 montre l’effet de l'augmentation des poils absorbants dans les plantes de tomate due à l’inoculation d’Enterobacter ludwigii isolée par Schoebitz et al. (2009). Sur les figures II.4 a et b les racines des plantes de tomate non inoculées, nous n’avons observé aucune promotion de croissance. En revanche, les figures c et d montrent un développement abondant des poils absorbants.

2.3.3. Solubilisation des phosphates dans le sol Les micro-organismes du sol peuvent également favoriser la croissance des plantes en améliorant les transformations de la matière organique des sols et en mobilisant des nutriments inorganiques.

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II. Étude Bibliographique

Les phosphates sont présents sous forme insoluble dans le sol et ne sont donc pas accessibles par les plantes. Certaines rhizobactéries peuvent libérer des acides organiques et des enzymes qui solubilisent les molécules phosphatées.

Par exemple, Pseudomonas spp. libère dans le sol l'enzyme phytase. Cette enzyme est responsable de la libération du phosphate, tel que l’inositol hexaphosphate. Dans des essais pratiqués au Québec (Canada) en champ ouvert, l’inoculation de Pseudomonas spp. a généré une augmentation du rendement du champ de maïs étudié. Dans un autre essai, ce même rhizobactérie a permit une augmentation du rendement des cultures de laitue de 18 % (Smith 1995).

Les scientifiques sont bien convaincus et d’accord aujourd’hui pour dire que l’un des moyens pour réaliser cet objectif est d’apporter ou de réintroduire dans les sols des rhizobactéries. Plusieurs types de bactéries peuvent remplir cette fonction de solubilisations des phosphates dans le sol, mais il est nécessaire de mettre au point une stratégie pour isoler les bactéries les plus performantes, optimiser leur intégration dans les sols et vérifier leur efficacité dans les champs.

Concernant leur intégration dans les sols, nous parlerons dans la partie suivante de l’incorporation de rhizobactéries par inoculation sous forme de cultures liquides et par l’intermédiaire de supports solides comme la tourbe, le talc, la vermiculite ou sous forme encapsulée.

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II. Étude Bibliographique

3. Inoculation des rhizobactéries dans le sol L’étude des effets bénéfiques de l’inoculation des rhizobactéries n’est pas récente, car durant les années 1897, l'entreprise Bayer avait mis sur le marché allemand un produit fabriqué à base de bactéries stimulantes de la croissance des céréales. Les bioengrais ont été fabriqués à l'aide de la souche Bacillus subtilis (Marshall 1968). L’inoculation des rhizobactéries sur les champs a été réalisée à grande échelle par l’Union Soviétique en 1958 sur 10 millions d’hectares. Les bactéries utilisées appartenaient principalement aux espèces Azotobacter chroococcum et Bacillus megaterium (Cassidy et al. 1996). Cependant, Mishutin et Naumova (1962) ont estimé que ce traitement n’a engendré que des augmentations modestes de rendements et sur seulement 50 à 70 % des surfaces. Malgré ces résultats, l’inoculation des rhizobactéries a fait l’objet d’expérimentations précises réalisées à petite échelle dans divers pays (Bashan 1986; Hernandez et al. 2009). À partir des années 90, aux États-Unis, la rhizobactérie B. subtilis a commencé à être employée sur 2 millions d'hectares de cultures . Les données accumulées (1974-1994) de l'inoculation sur le terrain dans le monde suggèrent que les techniques d'inoculation ont connu une augmentation significative du rendement des cultures de l'ordre de 5-30% (Okon et Labandera-Gonzalez 1994).

La microflore rhizosphérique est constituée d’un ensemble de micro-organismes en équilibre, si la rhizobactérie introduite ne colonise pas la rhizosphère de façon agressive, son activité bénéfique ne peut pas s’exprimer, car l’équilibre microbien antérieur à l’inoculation se rétablit rapidement. Par contre, l’utilisation de certaines souches d’Azospirillum brasilense aptes à se maintenir et à se développer sur le système racinaire s’accompagne d’effets bénéfiques significatifs pour les plantes inoculées (Krieg et Döbereiner 1984; Fages 1990). À la suite de l’intérêt suscité par ces publications, une grande partie du travail de recherche réalisé sur les rhizobactéries est maintenant effectuée sur des bactéries appartenant au genre Azospirillum.

Pour améliorer la colonisation des rhizobactéries dans la rhizosphère, ces dernières doivent êtres implantées au plus près des graines sous la forme d’inoculum liquide, ou solide (talc, tourbe vermiculite et argile) ou d'inoculum encapsulé. Dans les parties suivant, nous montrerons les différents aspects de l’introduction de rhizobactéries dans le sol.

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II. Étude Bibliographique

3.1 Inoculum liquide Les inoculums sous forme liquide sont les plus simples à utiliser et les moins coûteux. La préparation de ce type d’inoculum s'effectue en mélangeant les bactéries soit avec un milieu de culture, soit avec une solution spécifique préalablement formulée.

Il existe principalement deux façons de traiter les semences pour l’application d’inoculum liquide bactérien. La première façon consiste à mélanger les graines dans l’inoculum liquide et la deuxième à pulvériser l’inoculum sur le sillon des semis.

3.1.1 Imprégnation des semences Les semences sont mélangées dans la suspension avant les semis. Cette méthode permet une mise en contact direct et immédiat entre les bactéries et les graines. La probabilité de présence des rhizobactéries sur les racines est par conséquent particulièrement élevée. Cette méthode d’application ne permet pas d’avoir sur toutes les semences le même nombre des bactéries, car on n'obtient pas un mélange homogène dans tout l'ensemble des semences. Par ailleurs, les bactéries ne sont pas suffisamment protégées contre les conditions de l'environnement et les contaminations durant le transport et l’application dans les champs (Bashan et al. 2002).

C’est pourquoi les semences imprégnées sont parfois séchées à l'air libre, pour être ultérieurement utilisées dans les deux prochains jours. Ce type d’inoculum est couramment utilisé aux États-Unis, au Canada, en Argentine et au Brésil, et principalement pour la culture du soja, du mais, des lentilles, des petits pois et des arachides (Bashan 1998).

3.1.2 Pulvérisation de l’inoculum La pulvérisation de l’inoculum liquide sur les graines ou l’épandage dans les champs de l’inoculum doivent être effectués quelques jours après ensemencement des graines. Pour ce type de pratique, l’agriculteur doit posséder quelques connaissances en microbiologie, car l’inoculum doit être généralement préparé juste avant son application (Morgan et al. 2006). L'agriculteur doit investir dans l'achat des réservoirs refroidis pour permettre la conservation de l’inoculum liquide dans de bonnes conditions. 32

II. Étude Bibliographique

L’inoculum liquide peut être pulvérisé directement dans le sillon des semis, ce qui offre une plus grande quantité de bactéries disponibles que celles qui sont inoculées directement sur les semences (Cassidy et al. 1996).

Pour certaines rhizobactéries, telles que Azospirillum spp., les formulations liquides s'avèrent largement défavorables, car elles ne fournissent pas un environnement protecteur pour lesdites rhizobactéries. Pour certaines espèces végétales, les inoculant liquides doivent être appliqués pendant plusieurs jours après les semis générant ainsi un travail supplémentaire et un coût additionnel non négligeable pour l’agriculteur.

L’emploi optimal d’engrais biologique dans le monde agricole actuel nécessiterait donc son stockage sans que celui-ci perde son efficacité et viabilité cellulaire. Afin de faciliter la manipulation, l’application et la conservation de l’inoculum liquide, il est donc, nécessaire de déshydrater les bactéries sous un support solide afin de protéger les rhizobactéries. 3.2. L'inoculum sous support Les microorganismes peuvent également êtres introduits dans le sol par l’intermédiaire d’un inoculant solide, dont le composant principal est appelé support. Un bon support doit avoir comme caractéristiques essentielles: la capacité de libérer un grand nombre de cellules viables dans de bonnes conditions physiologiques et ce au moment opportun.

Le plus souvent, les supports utilisés dans les formulations solides sont organiques et minéraux. Il s’agit de tourbe, de talc, d’argile et de vermiculite (figure II.5). Ils permettent d’améliorer le taux de survie des bactéries. Le tableau II.3 reporte la concentration de différents inoculums solides après des temps de stockage variables et pour diverses espèces de rhizobactéries. La diminution du temps de conservation des bactéries varie selon le type bactérien, le type d’inoculant utilisé et selon la granulométrie des particules.

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II. Étude Bibliographique

Tableau II.3. Durée de conservation des formulations en fonction des bactéries et des inoculant utilisés (Siddiqui 2006).

Support

Rhizobactéries

Stockage

Concentration finale CFU/g

Talc

P. fluorescens Pf1

8 mois

1,3x107

Talc

B. subtilis

45 jours

1,0x106

Talc

P. putida

45 jours

1,0x103

Talc

P. putida (souches 30,180)

6 mois

1,0x108

Tourbe

P. fluorescens Pf1

8 mois

7,0x106

Tourbe + chitine

B. subtilis

6 mois

1,0x109

Tourbe

P. chlororaphis (PA23) et B. subtilis (CBE4)

6 mois

1,0x108

Vermiculite

P. fluorescens Pf1

8 mois

1,0x106

Vermiculite

B. subtilis

45 jours

1,0x106

Vermiculite

P. putida

45 jours

1,0x103

Argile

P. fluorescens Pf1

4 mois

2,8x106

3.2.1 Formulations à base de talc

Le silicate de magnésium est un minéral naturel couramment connu sous le nom de talc, celuici est disponible à un faible coût sous forme de poudre. Le talc est très peu hygroscopique et inerte à température ambiante ce qui rend possible une longue période de stockage. Ce produit est souvent utilisé comme élément constituant de base dans de nombreuses formulations bactériennes pour l’agriculture.

34

II. Étude Bibliographique

Kloepper et Schroth (1981) ont démontré que le talc pouvait être un bon support pour la formulation de la rhizobactérie P. fluorescens. La méthode a consisté à mélanger de la gomme de xanthane et du talc. Ainsi, 5 ml de gomme de xanthane (20%) ont été mélangés avec 5 ml d'une suspension bactérienne de 1,0x109 UFC/ml. Après avoir laissé le mélange pendant 20 min, le talc (environ 5 fois le volume du mélange bactéries-gomme) a été ajouté et soigneusement mélangé. Le mélange résultant a été séché à 12°C pendant 3-4 jours. Les auteurs ont observé une viabilité initiale de 8,2x107 UFC/g de poudre et après deux mois de conservation ils n’ont pas constaté une diminution du nombre des rhizobactéries. Par contre, après de 10 mois de stockage le nombre des rhizobactéries a diminué jusqu’à 4,0x104 UFC/g (Kloepper et Schroth 1981a).

A

B

C

D

Figure II.5. Les principaux supports utilisés pour l’inoculation de Rhizobactéries dans le sol : la tourbe (a), le talc (b), l’argile (c), et la vermiculite (d).

35

II. Étude Bibliographique

3.2.2 Formulations à base des tourbes La tourbe est un matériau végétal organique qui se trouve couramment dans des régions marécageuses. Elle est issue majoritairement de la dégradation anaérobie de divers végétaux. La tourbe est couramment employée en tant que support de stabilisation des rhizobactéries. L’avantage de l’utilisation des formulations à base de tourbe est la conservation de l’activité physiologique des rhizobactéries. En effet, la multiplication bactérienne peut se poursuivre même pendant la période de stockage, à condition, évidemment, que les bactéries disposent de suffisamment de nutriments et qu’elles soient stockées à une humidité et une température adéquates.

La principale difficulté concernant l'utilisation de la tourbe comme support est liée à sa grande variabilité organique fortement en relation avec son origine géographique. La tourbe est en effet une matière organique complexe. La variabilité organique de la tourbe affecte grandement la qualité du produit final et sa stabilité au cours du stockage et a un effet important la densité de cellules vivantes dans le produit (Siddiqui 2006). Un autre inconvénient de l’utilisation de la tourbe et sa contamination microbiologique. En effet, les formulations des supports à base de tourbe sont sujettes aux contaminations par d’autres microorganismes, ce qui se traduit par une réduction de la durée de conservation de l'inoculum (Bashan 1998).

3.2.3 Formulations à base de vermiculite La vermiculite est un minerai naturel proche de la famille des micas qui a subi un traitement de chauffage à très haute température. Ce traitement ne fait pas fondre le matériau, mais permet sa dilatation. La principale propriété de la vermiculite est la rétention d’humidité, raison pour laquelle elle est utilisée comme support pour le développement des formulations des agents microbiens.

L'un des problèmes qui limitent l'utilisation de la vermiculite comme support aux rhizobactéries, est que ce matériau offre des avantages réduits en ce qui concerne la survie des micro-organismes pendant le stockage. Amer et Utkhede (2000) ont travaillé avec l’utilisation

36

II. Étude Bibliographique

de la vermiculite, en tant que support pour deux souches de rhizobactérie: la souche Bacillus subtilis cultivée dans un bouillon de dextrose de pomme de terre et la souche Pseudomonas putida cultivée sur milieu King's B durant 48 h à 150 revs/min à 22 °C. Puis, 50 ml de la suspension bactérienne ont été mélangés avec 50 g de vermiculite. La concentration finale a été d’environ 108 UFC/ml. Les matériaux ont été stockés dans un réfrigérateur (4°C) et à température ambiante (22 °C), pour déterminer la population bactérienne après 45 jours. En ce qui concerne le taux de survie de P. putida, sa viabilité a diminué jusqu’à 103 UFC/g à 0°C et de 102 UFC/g à 22°C. En revanche, la viabilité de la rhizobactérie B. subtilis a été de 106 UFC/g à 4°C et 22°C (Amer et Utkhede 2000).

3.2.4. Formulations à base d'argile L’argile est une roche sédimentaire composée majoritairement de silicates d’aluminium hydratés qui présentent une structure feuilletée. On distingue plusieurs types d’argile en fonction de l’épaisseur des feuillets, telles que la kaolinite et la montmorillonite.

L’addition d’argile dans la formulation bactérienne peut limiter la mortalité des cellules et leur confère une meilleure protection. Cependant, toutes les argiles n'apportent pas le même effet protecteur. Par exemple, l'utilisation de l'argile du type montmorillonite protège mieux les Rhizobium trifolii des températures élevées lorsque l'opération de séchage s'effectue aux environs de 70°C (Bashan 1998). En revanche, l'argile de type kaolinite n’offre pas cette protection. Marshall et al. (1974) a expliqué cet effet par la formation d’une enveloppe de protection autour des cellules permettant ainsi de modifier le flux de l’eau entrant et sortant dans les cellules pendant l'opération de séchage et la réhydratation.

De plus, Bushby et Marshall (1977) ont démontré que l’argile de montmorillonite protégeait les cellules des Rhizobium leguminosarum et Rhizobium trifolii mais qu’elle ne protégeait pas les autres types de bactéries telles que Rhizobium lupini et Rhizobium japonicum.

L'utilisation de l'argile dans la matrice présente cependant un problème non négligeable: ce matériau offre une surface chargée susceptible d'attirer des métaux lourds. En effet, Cassidy et

37

II. Étude Bibliographique

al. (1996) ont suggéré que les argiles peuvent attirer les ions de quelques métaux lourds et ainsi devenir toxiques.

L’argile reste cependant un matériau intéressant si elle est utilisée en complément dans une matrice d’encapsulation. Par exemple, la survie de Pseudomonas fluorescens inoculée à 108 UFC g-1 de sol est supérieure après 84 jours si les bactéries ont été encapsulées dans une matrice composée d’alginate et de 3% de bentonite (p/v) (107 UFC g-1 de sol) en comparaison aux bactéries libres (103 UFC g-1 de sol sec) ou aux cellules encapsulées avec de l'alginate seul (106 CFU g-1 de sol) (Cassidy et al. 1996).

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II. Étude Bibliographique

4. L’encapsulation des rhizobactéries Au cours des dernières décennies, l’encapsulation des rhizobactéries dans des hydrogels par la méthode de “dripping” a été évaluée. Le polymère qui a été le plus utilisé est l’alginate de sodium, car il forme des gels dans des conditions douces pour les micro-organismes. Ces polymères ont démontré largement leur potentiel en tant que supports bactériens (Bashan 1998). Ils offrent des avantages substantiels par rapport à la tourbe qui est reportée dans le tableau II.4.

Le principe de l'encapsulation des cellules est de protéger les micro-organismes vis-à-vis du milieu environnant pour mieux les libérer dans le sol et de façon progressive et prolongée (Paul et al. 1993). La vitesse de dégradation du polymère employé dépendra de l'activité biologique des micro-organismes du sol. En règle générale la dégradation du polymère doit se produire lors de la germination des semences.

Les capsules déshydratées sont stockées à température ambiante pendant une longue période. La capsule offre aux bactéries un milieu favorable en diminuant le risque de mortalité et permettant une longue conservation (Wang et al. 1999). Ces inoculants peuvent être améliorés avec l’apport de types de nutriments pour les bactéries afin d'améliorer la survie des microorganismes, ce qui est indispensable pour la réussite de l'inoculation de bactéries dans le sol.

Les préparations encapsulées ont résolu de nombreux problèmes liés aux inoculants traditionnels tel que la tourbe, qui est le support couramment utilisé pour les inoculants biologiques. À titre de comparaison, les caractéristiques des formulations à base d'alginate et des formulations à base de tourbe sont présentées dans le tableau II.4.

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II. Étude Bibliographique

Tableau II.4. Comparaison des inoculant à base d’alginate et de tourbe (MattilaSandholm et al. 2002).

Alginate

Tourbe

Technologie industrielle existante coûteuse

Divprocédéscédé industriels existent

Chimiquement et physiquement uniformes

Pas uniforme (matière organique complexe)

Biodégradable dans le sol

Biodégradable dans le sol

Libération des bactéries progressive et Libération des bactéries immédiate prolongée Contrôle de qualité techniquement Qualité de production non constante simple Longue durée de conservation à température ambiante

Durée de conservation limitée

Volume de stockage réduit

Besoin de grand volume

Forte résistance à la contamination

Faible résistance à la contamination.

Faible mortalité bactérienne dans le sol Faible mortalité bactérienne dans le sol Résistante aux fluctuations d’humidité

Forte sensibilité aux fluctuations d’humidité

Concentration maximale de l' inoculant La concentration de l’inoculant bactérien:1011 CFU/g bactérien peut atteindre 108 CFU/g

4.1. Caractéristiques principales de l’encapsulation Les principales fonctions de l’encapsulation sont ici décrites.

4.1.1. Immobiliser et/ou isoler L’immobilisation et/ou l’isolation de produits actifs permettent d’éviter le contact direct des produits avec l'environnement. L'encapsulation est une méthode qui permet par exemple à deux réactifs d'être séparés et de n'entrer en contact direct avec le milieu que lors de la rupture de la microcapsule. Le piégeage des arômes au sein de microcapsules permet soit un effet 40

II. Étude Bibliographique

aromatique prolongé, soit sa libération uniquement lors d'une opération spécifique comme une cuisson par exemple. Dans le cas de cellules vivantes ou d’enzymes, l'immobilisation dans des microcapsule favorise leur utilisation prolongée au sein des biréacteurs à fermentation continue. Dans ce cas les capsules sont perméables aux substrats et aux produits de la fermentation, mais permettent de consigner les bactéries dans un espace. La fermentation se produit à l'intérieur des capsules sphériques et non pas dans le milieu liquide de culture extérieure. Ceci permet d’augmenter la densité de bactéries et par voie de conséquence d’accroître les performances du fermenteur (Cassidy et al. 1996). L’encapsulation de cellules vivantes peut également avoir pour but de les libérer de manière contrôlée dans un endroit ciblé comme c’est le cas des bactéries probiotiques encapsulées par exemple.

4.1.2. Protéger De nombreux composés organiques sont fragiles et doivent par conséquent être protégés de leur milieu environnant. Par exemple, les vitamines ou les acides gras polyinsaturés sont facilement dénaturés par réaction d'oxydation.

De nombreux additifs industriels sont employés dans l'industrie agroalimentaire dont le fer; son incorporation favorise l'oxydation des acides gras ce qui n'est pas forcement souhaitable. Technologiquement il est plus avantageux d'incorporer cet élément dans le support de capsules chargées en Fe, dans ce cas, ce sera le support des capsules qui subira l'oxydation et non pas l'aliment. En somme, ce type de microencapsulation ferrique confère une plus grande efficacité technologique et est par voie de conséquence plus économique en ce qui concerne le coût lié aux pertes engendrées par un produit défectueux.

Les cellules vivantes sont également sensibles aux stress physiques et chimiques provoqués par des modifications de leur environnement. Les bactéries probiotiques, par exemple, peuvent ne pas survivre au pH très acide de l’estomac. La microencapsulation des probiotiques peut permettre ainsi de protéger les cellules du transit stomacal permettant d’atteindre leur cible intestinale (Ki-Yong et Tae-Ryeon 2000).

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II. Étude Bibliographique

4.1.3. Libérer progressivement Un composé actif confiné indéfiniment ne présente en soi qu'un intérêt très limité. L’encapsulation permet de libérer le principe actif ou le médicament à un moment précis et selon une cinétique bien définie.

Ce n'est toutefois pas toujours le composé encapsulé lui-même qui sera libéré, mais un sousproduit lié à la réaction avec une autre molécule venant de l'extérieur (l'eau par exemple). Le composé encapsulé sera l'un des produits de la réaction, ou le catalyseur (enzyme) de ladite réaction. Dans ce cas, il est plus juste de penser en termes de transfert du principe actif vers l'intérieur de la capsule ou vice versa, plutôt qu'en terme d'une libération simple de celui-ci.

En ce qui concerne la libération progressive des rhizobactéries. Bashan et al. (2002) ont évalué la libération progressive de la souche A. brasilense depuis des billes d’alginate en milieu liquide. Après 1 jour d’essai le nombre des bactéries libérées a été de 3,7x103 UFC/g de billes, après de 6 jours 2,3x105 UFC/g et depuis 10 jours la concentration de A. brasilense libérée a été de 6,3x105 UFC/g.

4.1.4. Structurer et fonctionnaliser L'encapsulation permet de créer de nouvelles fonctions et des structures innovantes. Par exemple, la perméabilité de la membrane de la capsule peut être fonction du pH du milieu, ainsi le principe encapsulé sera alors libéré en fonction de la perméabilité de la membrane.

L'aspect de la microcapsule peut même servir pour la différentier. Par exemple, sa forme peut servir d'indicateur pour renseigner le consommateur sur la nature du produit contenu dans la capsule. On trouve souvent sur le commerce des enrobages spécifiques possédant par exemple un "aspect métallisé" afin de différencier les aliments fonctionnels des poudres médicamenteuses et alimentaires.

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II. Étude Bibliographique

4.1.5 Pourquoi encapsuler des rhizobactéries? Selon Bashan et al. (1998; 2002), il existe de nombreux avantages liés à l’encapsulation de rhizobactéries, cela permet:

• De réduire la possibilité de contamination des inoculant pendant le stockage, le transport et l’application. • De produire l’inoculant en grande quantité et le stocker durant une longue période sous la forme de capsules sèches. • De produire des inoculants avec une forme adaptée aux équipements de semoir existant. • De libérer de manière contrôlée et progressive les cellules dans le sol. De plus, les capsules sont biodégradables et non toxiques.

Néanmoins, l’encapsulation des rhizobactéries peut présenter un certain nombre d’inconvénients :

• La diffusion des gaz et de l’eau sont réduites dans la capsule. • Le procédé d’encapsulation peut entraîner des modifications métaboliques des cellules, notamment dues au stress hydrique engendré par le séchage (Cassidy et al. 1996). Ainsi, il peut être nécessaire de répéter l’application des capsules dans le sol pour un effet optimal.

Les chercheurs ont actuellement à leur disposition un éventail de techniques et de matériaux pour immobiliser des cellules qui se sont largement développées durant ces trente dernières années. L’encapsulation constitue certainement à l’heure actuelle la voie la plus prometteuse pour permettre l'inoculation et une protection efficace des rhizobactéries dans les sols.

4.2 Les techniques d’encapsulation L’encapsulation est utilisée dans un grand nombre d’activités industrielles (Jackson et Lee 1991). Le nombre de travaux de recherche en encapsulation s’est densifié dans l’industrie agricole, en partie pour ce qui est de la réduction de l’emploi d'engrais chimique (Marshall

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II. Étude Bibliographique

1968; Cassidy et al. 1996). Différentes études ont porté sur l’encapsulation des rhizobactéries (Cassidy et al 1995; Mattila-Sandholm et al. 2002; Bashan et al. 2002), avec les objectifs suivants: l’obtention d’une concentration cellulaire finale supérieure ou égale à 106 bactéries viables/plante, maintien de la viabilité au cours du stockage pour au moins 6 mois dans des conditions ambiantes de température et d’humidité, libération progressive des cellules dans le sol. L'encapsulation est réalisée généralement en trois étapes :

- La première étape consiste en l'incorporation du principe actif dans la matrice ou le cœur de la capsule peut être liquide ou solide.

- La deuxième étape est une opération mécanique consistant soit à réaliser une dispersion liquide/air ou liquide/liquide (cas d'une matrice liquide), soit à pulvériser une solution sur les particules solides sous agitation mécanique (cas d'une matrice solide).

- La dernière étape consiste en une stabilisation par un procédé chimique de polymérisation, ou par un procédé physico-chimique (gélification, coacervation), ou physique (évaporation, solidification) réalisée sur les gouttelettes ou sur l’enrobage formé durant l’étape précédente.

Les applications potentielles offertes par l’encapsulation ont conduit à l’invention et au développement de nombreuses méthodes et techniques. Cette diversité de méthodes a fini par susciter des classifications complexes souvent incomplètes (Shahidi et Han 1993; Risch 1995; Thies 1996). Il est souvent très difficile de les différencier par catégories. Il existe ainsi une grande confusion dans les termes. Une même technologie porte des noms variables en fonction du domaine, un même terme pouvant parfois être utilisé pour des technologies différentes. Il y a souvent aussi confusion entre encapsulation et enrobage. 4.2.1 Le « dripping » Son principe dérive de la production simple de gouttelettes issues d'une aiguille ou d'un injecteur. L'intérêt principal de cette méthode est de former des gouttelettes dont la dispersion de taille est inférieure à 10% de la taille moyenne.

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II. Étude Bibliographique

Les appareils de dripping disponibles actuellement sont les suivants:

a) Générateur simple de gouttelettes consistant à faire passer le liquide à travers une buse ou une aiguille. b) Générateur de gouttelettes à haut débit par rupture de jet : le jet liquide refoulé à la sortie de la buse est tranché par des fils fixés sur un disque tournant à grande vitesse, ce tranchage est à l'origine de la formation des gouttelettes. c) Générateur de gouttelettes à disque tournant : un disque rotatif, sur lequel coule le liquide, entraîne la projection de gouttelettes à la périphérie du disque.

Scale-up

a) Générateur simple

b) Rupture de jet

c) Disque tournant

Figure II.6 Schéma des différentes « méthodes par dripping »

L’encapsulation par dripping s'effectue généralement par interaction ionique (entre alginate et calcium) ou action thermique (cires). Les deux principes peuvent également être combinés, comme dans le cas du Carraghénane/KCl.

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II. Étude Bibliographique

4.3 Les matériaux d’encapsulation Les matériaux d’encapsulation doivent être non toxiques, non polluants, et de qualité stable pendant une longue durée de conservation, c'est-à-dire présenter une activité et une densité suffisante de cellules afin de les libérer de manière progressive et prolongée dans le sol.

Les polymères naturels et synthétiques ont été utilisés pour l’encapsulation de bactéries. Les polysaccharides extraits des algues sont considérés comme naturels, comme l'alginate, le carraghénane, l'agar-agar, et l'agarose. Certains polymères synthétiques sont également utilisés pour l’encapsulation de cellules vivantes, ce sont les polyacrylamides, polystyrène et polyuréthane (Trevors et al. 1992). Ces polymères synthétiques offrent, en effet, une bonne résistance mécanique qui peut être intéressante pour une utilisation en fermenteur. Cependant, les gels sont formés par polymérisation ou par formation de ponts covalents interchaînes (réticulation), qui doivent êtres réalisés en présence des microorganismes et cela peut être relativement hostile pour les cellules et provoquer des pertes d’activité cellulaire importantes.

L'alginate est l'un des produits le plus couramment utilisés pour l'encapsulation de microorganismes. Les inoculums qui en résultent sont utilisés à des fins diverses: l'immobilisation des organelles des cellules et des enzymes pour la fermentation et l'application d'agents de lutte biologique (Bashan et Holguin 1994).

Plusieurs polymères sont utilisés en microbiologie industrielle et environnementale, le tableau II.5 montre le potentiel technologique important de ces différents supports bactériens (Marshall 1968; Cassidy et al. 1996). Ainsi que leurs caractéristiques fondamentales, leurs avantages et leurs limites sont présentés.

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II. Étude Bibliographique

Tableau II.5. Propriétés des différents polymères employés pour l'immobilisation des rhizobactéries.

Matériel

Avantages

Polyacrylamide

Facilement disponible

Agar et agarose

Facilement disponible

XanthaneFournis une Gomme caroube protection pour les bactéries Alginate Protection des rhizobactéries et libération dans le sol de manière progressive

Inconvénients coûteux, monomère très toxique, dégradation lente coûteux et dégradation lente Coûteux

Utilisation Inoculation de Rhizobium

Référence (Dommergues et al. 1979)

Encapsulation d'A. Bashan et al brasilense et de 1982 P. fluorescens (information non publie) Inoculation de (Jung et al. 1982) Rhizobium

Réduction de la Inoculation diffusion de d’A. brasilense l’oxygène

(Bashan et al. 2002)

4.3.1. Caractéristique de l’alginate de sodium L’alginate de sodium est produit par les algues brunes (Figure II. 6), comme Macrocystis pyrifera, Laminaria digitata, Laminaria hyperborea et Eklonia cava. La production d’alginate n'est pas une exclusivité des algues, en effet, chez les bactéries il existe aussi d'une production d’alginate extracellulaire. Un exemple est celui d'Azotobacter vinelandii et de plusieurs souches de Pseudomonas (Fett et al. 1986; Fett et Wijey 1995). Les principaux pays producteurs d'alginate au monde sont: la Norvège, la France, les États-Unis, le Pérou et le Chili.

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II. Étude Bibliographique

La figure II.7. Algues brunes, source principale d’alginate, attachées aux roches, images des côtes de l’Ile de Chiloé, Chili.

Les alginates sont des macromolécules linéaires constituées de deux monomères liés en alpha 1-4: l’acide β-D-mannuronique et l’acide α-L-guluronique dont la masse moléculaire est comprise entre 20.000 et 200.000 Da. L’alginate gélifie en présence de certains cations divalents et principalement le Ca2+ par simple formation de liaison ionique entre les polymères. Les propriétés de l’alginate sont variables selon l’origine des algues et le procédé de fabrication. Selon leur masse moléculaire, les alginates ont des propriétés de solubilité et de complexation avec le calcium.

Chaque molécule contient des régions mannuroniques et des régions guluroniques, et aussi des régions où les deux types de résidus s’alternent. Le polyuronide constitué par l’enchaînement des deux acides s’appelle l’acide alginique. Ces deux monomères ne sont pas répartis au hasard dans les macromolécules, mais répartis en segments d’une vingtaine d’unités. L’assemblage de ces segments en proportions variables dépend de l’espèce, de la partie de l’algue considérée, de l’âge de l’algue, du lieu de récolte. La répartition des monomères détermine les propriétés gélifiantes de l’alginate. Néanmoins par sélection de la matière première, il est possible de fabriquer une variété d'alginate aux caractéristiques constantes.

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II. Étude Bibliographique

La concentration d'alginate de sodium couramment employée pour l'encapsulation varie entre 1 et 3%. La solution d'alginate est mélangée à la culture cellulaire et est extrudée dans une solution de CaCl2 dont la concentration varie ente 0,05 et 0,1M.. Le temps de séjour des billes dans cette solution pour obtenir la gélification complète est de 30 minutes .

Plusieurs préparations à base d'alginates ont été utilisées pour l'encapsulation de mycorhizes arbusculaires, d’ectomycorhiziens et pour l'inoculation de bactéries du genre Frankia (Bashan et al. 2002). Cette technologie a également été utilisée pour encapsuler les rhizobactéries A. brasilense (Bashan 1986; Bashan et Holguin 1994; Bashan et Gonzalez 1999) et P. fluorescens (Paul et al. 1993).

4.3.2 Survie des rhizobactéries encapsulée dans des matrices d’alginate La matrice d'alginate protège les cellules du stress mécanique et limite leur mortalité pendant le temps de stockage prolongé (Morgan et al. 2006). Après un an de stockage à température ambiante, le taux de survie d’Azospirillum lipoferum encapsulée dans des billes d'alginate sèches est de 1010 CFU/g, la concentration dans ce cas est plus forte que dans les vecteurs classiques (Fages 1992).

Après 3 ans de stockage à 4°C, le taux de survie de Bacillus subtilis et de Pseudomonas corrugata immobilisés dans des billes d'alginate de sodium est de 108 UFC g-1. Après ces trois années de stockage, les bactéries n'ont pas perdu leur aptitude de stimulation la croissance des végétaux testés. Ainsi, pendant le stockage les micro-organismes ont conservé leurs propriétés physiologiques, celles-ci étaient comparables à celles du bouillon de culture de la formulation initiale (Trivedi et Pandey 2008). La survie de la souche A. brasilense Cd et P. fluorescens 313 encapsulées en billes d’alginate après 14 années de stockage a été de 105-106 UFC/g des billes. Après cette période longue de stockage, les rhizobactéries n'ont pas perdu leur aptitude de stimulation de croissance des plantes de blés. Cette étude a prouvé que les bactéries peuvent survivre dans l'inoculant d'alginate au-dessus de longues périodes (Bashan et Gonzalez 1999).

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II. Étude Bibliographique

Du point de vue agricole et industriel, il est très intéressant de pouvoir utiliser des formulations déshydratées. Cependant, la déshydratation des capsules engendre un stress hydrique important sur les cellules ce qui entraine la mortalité d’une grande proportion de la population bactérienne (Paul et al. 1993). Néanmoins lorsqu'elles sont correctement déshydratées le nombre de cellules survivantes peut être suffisant pour effectuer une inoculation correcte.

De plus, dans des conditions de stress quelques espèces bactériennes sont en mesure de produire et de stocker des substances osmoprotectrices. Par exemple, Azospirillum et Rhizobium produisent de la proline et du glutamate pour faire face à une déshydratation (Botsford et Thomas 1990; Bashan et al. 2004). La proline et le glutamate sont des molécules de grande importance pour la survie des cellules vis-à-vis du stress hydrique (Morgan et al. 2006).

Il est également possible d’augmenter la protection des bactéries vis-à-vis de la déshydratation par l’utilisation de matériaux supplémentaires dans la formulation.

4.3.3 L’adjonction de l’amidon à la matrice d’encapsulation Les amidons sont souvent employés par l’industrie agroalimentaire de façon variée, car ils fournissent une large gamme de fonctionnalité. La fonction recherchée par cette industrie est principalement la formation de gel et sa propriété collante. Dans les formulations pharmaceutiques, l’amidon est utilisé comme additif et adhésif.

L’amidon est un hydrate de carbone qui constitue le principal moyen de stockage d'énergie des végétaux. Ce glucide est stocké sous forme insoluble et morphologiquement granulaire avec une structure semi-cristalline. L’amidon possède deux polymères de glucose : l'amylose et l'amylopectine. Ces polymères constituent 98% de la masse totale sèche des granules natifs, le reste correspondant à la masse des lipides, des minéraux et des phosphates.

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II. Étude Bibliographique

Figure II.8. Les granules d’amidon de céréales et des tubercules (Boursier, 2005).

Les granules d’amidons possèdent une taille comprise entre 1 et 100 µm, ils sont de forme polygonale, sphérique ou lenticulaire et sont composés d’amylose, et d’amylopectine avec des degrés de cristallisation variant d’une espèce botanique à l’autre (Wang et al. 1999) (Figure II. 8). Certaines bactéries ont l’aptitude d'adhérer à la surface de granules d’amidon et il a été suggéré que l'adhésion des cellules sur les grains d’amidon était liée à son utilisation comme substrat (Jankowski et al. 1997).

Figure II. 9. Adhésion des bifidobactéries sur la surface des granules d’amidon (MattilaSandholm et al. 2002).

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II. Étude Bibliographique

Au cours des dix dernières années, un grand nombre de travaux de recherche ont visé à limiter la mortalité des cellules encapsulées. L’amidon a été utilisé dans ce but pour l’application de bactéries probiotiques dans les produits laitiers fermentés. L'adjonction de l’amidon diminue la mortalité prématurée des cellules. Le phénomène mécanique d'adhésion des bactéries sur les granules d'amidon a été mis en évidence pour le genre Bifidobacterium. On a également observé que ces cellules qui adhéraient aux granulés d'amidon étaient mieux protégées lors du stockage ainsi que pendant le transit intestinal (O'Riordan et al. 2001). La figure II.9 montre des bifidobactéries adhéré à la surface de grains d’amidon.

Figure II.10. Amidon partiellement hydrolysé (haut) et amidon de pomme de terre rempli avec des bactéries adhérées à l’intérieur (bas).

Il est également possible d’encapsuler des bactéries à l’intérieur de grains d’amidon préalablement partiellement hydrolysés. Ceci permet d’augmenter la protection des bactéries (figure II.10) (Benhamou et al. 1998).

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II. Étude Bibliographique

5. Conclusion La prévision de production de céréales pour répondre à l’augmentation de la population mondiale indique des besoins en engrais azotés très importants. Un des moyens pour pallier à cette demande est de fertiliser le sol avec des micro-organismes capables d’augmenter la croissance des plantes. Leur intégration dans le sol doit cependant encore être optimisée et vérifier leur efficacité dans les champs.

Le développement et l'industrialisation des produits biologiques basés sur les microorganismes bénéfiques pour l’agriculture ont fait croître la protection et le rendement agricoles. L’emploi des bioengrais est apparu comme une solution prometteuse pour améliorer les rendements des cultures, sans apport d'engrais chimique. Au cours de cette dernière décennie, beaucoup de travaux de recherche ont été consacrés à identifier les rhizobactéries les plus efficaces pour l'amélioration des cultures. D’une part, les données accumulées en ce qui concerne l'inoculation en grandeur nature et sur le terrain un peu partout dans le monde suggèrent que les techniques d'inoculation ont connu un succès entre 60 à 70%. D’autre part, un incrément significatif du rendement des cultures de l'ordre de 5-30% a été obtenu (Okon et Labandera-Gonzalez 1994).

De plus, l'emploi de cellules immobilisées a été identifié comme une technologie intéressante pour des applications dans le domaine de la protection de l'environnement. Certaines bactéries peuvent, en effet, être utilisées en tant que bio-pesticides et en tant qu'agent de biodégradation de produits toxiques résiduels susceptibles de polluer les nappes phréatiques (Barneix et al. 2005).

Dans la plupart des cas, les rhizobactéries sont inoculées directement dans le sol sous forme liquide ou en utilisant soit de la tourbe ou de l'argile (Bashan et al. 2002). De nombreux travaux de recherches ont montré que l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate pourrait apporter une meilleure protection des cellules contre les agressions du milieu environnant proche et pourrait conduire à un effet sur la croissance des plantes moins incertain (Dommergues et al. 1979).

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II. Étude Bibliographique

L’encapsulation a émergé comme étant l'une des meilleures options technologies d’introduction d’une flore bénéfique dans un sol, car les capsules confèrent aux bactéries une protection cruciale pendant les premières étapes d'adaptation des micro-organismes à l'environnement du sol (Amellal et al. 1998).

Dans ce travail, nous proposons d’immobiliser des rhizobactéries dans des capsules à partir d’une formulation possédant un taux de matière sèche initial élevé. Cette forte concentration de matière sèche de départ devrait permettre de limiter la durée et la consommation énergétique de l’étape de séchage ainsi que d’optimiser la viabilité des rhizobactéries au procédé d’encapsulation.

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MATÉRIELS & MÉTHODES Dans ce chapitre sont décrits les matériaux et les méthodes utilisés pour ce travail de recherche. Nous avons tout d’abord mis au point l’optimisation de procédé d’encapsulation, puis nous avons testé la capacité d’adhésion des rhizobactéries sur la surface des granules d’amidon et finalement nous avons produit des capsules à grande échelle pour étudier la libération des cellules dans le sol.

Nous avons choisi de présenter le chapitre « Matériels & Méthodes » en cinq sous-chapitres:

• Micro-organismes et conditions de culture.

• Procédé d’encapsulation.

• Évaluation de l’adhésion des cellules sur les grains d’amidon.

• Libération de rhizobactéries des capsules dans l’eau et dans le sol.

• Production des capsules à échelle pilote.

III. Matériels & Méthodes

1. Micro-organismes et conditions de culture Dans cette partie, nous allons décrire les souches de rhizobactéries utilisées pour cette recherche et leurs conditions de culture.

1.1 Souches de rhizobactéries Les rhizobactéries ont été utilisées dans cette étude, en tant que souches modèles, car ce sont des genres rhizobactériens bien étudiés et souvent pris comme référence par d’autres auteurs. Leurs effets sur la promotion de la croissance des végétaux sont largement décrits dans la littérature (Kloepper et Schroth 1981; Okon et Labandera-Gonzalez 1994; Zlotnikov et al. 2001; Schoebitz et al. 2009).

Le tableau III.1 récapitule l’ensemble des souches qui ont été utilisées pour ce travail.

Tableau III.1. Type des souches rhizobactérienne utilisé dans cette thèse.

Souches

Source

Caractéristiques

État de conservation

Azospirillum brasilense Sp245 et Sp7

Université Bacilles de 1-2 µm, Catholique de Gram négatif, mobile, Louvain, Belgique aérobie

Agar solidifiée

Bacillus pumilus C26*

Université Austral Bacilles sporulant, Gram Lyophilisé du Chili positif, mobile

Raoultella terrigena Austrian Research Bacilles à Gram négatif, Agar solidifiée TFI08* Centers GmbH immobiles, aéroanaérobies Enterobacter ludwigii Université Austral Gram négatif, aérobie Lyophilisé EMN037 (Schoebitz du Chili et al. 2009) Paenibacillus Université de Bacilles à Gram positif, Agar solidifiée polymyxa MXC5* mobile, formant une Hohenheim, spore, aéro-anaérobie Allemagne * Souches isolées dans le cadre du projet Rhibac; en cours de publication.

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III. Matériels & Méthodes

1.2. Milieux de culture Le milieu de culture est la matrice permettant la croissance bactérienne. Il s’agit d’une solution aqueuse où sont dissous tous les nutriments essentiels à la croissance des bactéries. La plupart des microorganismes cultivés ont besoin pour vivre d'éléments chimiques essentiels pouvant être incorporés dans le milieu soit par un substrat riche en protéines, sucres et vitamines soit par l’ajout des éléments essentiels en quantité précise sous forme de sels minéraux. Les milieux de culture utilisés pour produire la biomasse des rhizobactéries sont le milieu YEP (Ivanova, 2006), le milieu développé par l'Institut Maurice et le milieu TSB. La composition de ces milieux est présentée dans les tableaux III.2, III.3 et III.4.

1.2.1 Composition milieu YEP Le milieu de culture utilisé pour les souches de rhizobactéries figurant dans le tableau III.2, est couramment connu sous le nom de YEP (Yeast extract peptone).

Tableau III.2. Composition de milieu de culture YEP

Produit

Nom

Fournisseur

Concentration

Peptone

Biokar Diagnostic,

pancréatique de

5 g/l

France

commercial Peptone de viande

Viande Type 2 Extrait de levure

Extrait

Biokar Diagnostic,

autolytique de

France

5 g/l

levure Chlorure de

Chlorure de

Fisher Chemicals,

sodium

sodium

France

5 g/l

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III. Matériels & Méthodes

Préparation du YEP:

• Dans un Erlenmeyer de 1500 ml, introduire 500 ml d’eau distillée. • Introduire les différents produits du milieu de culture (tableau III.2). • Verser les produits dans l’Erlemeyer contenant les 500 ml d’eau distillée et agiter le mélange à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu'à obtenir une solution homogène. • Ajouter 500 ml d'eau distillée. • Stériliser ce milieu de culture liquide dans un autoclave à 121°C pendant 20 minutes.

1.2.2 Milieu de culture de l’Institut Maurice R&D Dans ce travail de thèse, nous avons également employé le milieu de culture qui est présenté dans le tableau III.3.

Tableau III.3. Composition du milieu de culture de l’Institut Maurice R&D (Brussels, Belgium).

Produit H 20

Quantité

Fournisseur

900 ml

Nutrient broth

16 g

Biokar, France

Yeast Extract

8g

Biokar, France

Tryptone

4g

Biokar, France

Peptone

3,2 g

Biokar, France

4g

Sigma

K2HPO4

0,16 g

Fisher

MgSO4*7H20

0,8 g

Merck, Allemagne

NaCl

Après, la stérilisation des produits à l’autoclave. Le glucose et le chlorure de calcium ont été stérilisés par filtration.

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III. Matériels & Méthodes

Tableau III.4. Additifs ajoutés après stérilisation du milieu de culture de l’Institut Maurice R&D.

Produit

Concentration

Fournisseur

Glucose

22 g/l

Merck, Allemagne

CaCl2

1,6 g/l

Biokar, France

Préparation de milieu de culture de l’Institut Maurice:

• Dans un Erlenmeyer de 1500 ml, introduire 500 ml d’eau distillée. • Introduire les différents ingrédients du milieu de culture (tableau III.3). • Agiter pendant 10 min le contenu de l'Erlenmeyer de 1500 ml sur un agitateur chauffant à une température de 80°C. • Retirer l'Erlenmeyer de l'agitateur et ajouter 465 ml d’eau distillée. • Introduire l'Erlenmeyer dans un autoclave à 121°C pendant 20 minutes. • Laissez refroidir le milieu de culture, puis on ajoute les additifs (tableau III.4) préalablement filtré à l’aide d’un filtre Millipore de 0,2 µm.

1.2.3 Préparation du milieu Trypticase soy broth (TSB) • Dans un Erlenmeyer de 1500 ml, introduire 500 ml d’eau distillée. • Peser 30 g/l de TSB déshydrate et prêt à l’emploi (Grosseron, France). Le bouillon contient ainsi: tryptone 17 g/l, peptone papaïnique de soja 3 g/l, glucose 2,5 g/l, phosphate dipotassique 2,5 g/l et chlorure de sodium 5 g/l. • Verser le contenu de la coupelle dans l’Erlemeyer contenant les 500 ml d’eau distillée et agiter le mélange à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu'à obtenir une solution homogène. • Ajouter 500 ml d'eau distillée. • Stériliser ce milieu de culture liquide, dans un autoclave à 121°C pendant 20 minutes.

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III. Matériels & Méthodes

1.3 Réhydratation et conservation des souches bactériennes La conservation des souches bactériennes doit permettre de pouvoir disposer d’un matériel bactérien stable aux propriétés physiologiques constantes pendant une longue période de stockage. La conservation des micro-organismes comprend trois étapes successives: la purification qui consiste à isoler un clone unique, la multiplication qui permet de disposer d'une quantité suffisante de cellules et enfin le stockage.

1.3.1. Protocole de conservation La multiplication et la purification d’une souche destinée à la conservation sont réalisées de la manière suivante :

• Prélever une fraction de l’échantillon bactérien (colonie provenant d'un milieu d’agarose). • Inoculer les bactéries dans un bouillon de culture YEP. • Incuber à 30°C pendant 12 h. • Prélever 0,1 ml du bouillon de culture incubé et l'étaler sur la boîte de Pétri. • Incuber la boîte de Pétri pendant 24 h. • Prélever de celle-ci un échantillon d'une colonie isolée. • L'échantillon ainsi prélevé est placé dans un tube d'Eppendorf qui contient 1,8 ml de YEP agar + 0,2 ml de glycérol (20%). • Stocker à une température de – 80°C.

1.4 Cultures cellulaires La préparation des rhizobactéries pour l’encapsulation se déroule en deux étapes; la première est la régénération de la souche, c’est-à-dire la préparation de la pré-culture, la seconde est la culture proprement dite. La biomasse de rhizobactéries à été produite en Erlenmeyer, pour les essais au laboratoire et en fermenteur pour la production à l’échelle pilote.

60

III. Matériels & Méthodes

1.4.1 Cultures en Erlenmeyer Afin d’amorcer la fermentation, il faut multiplier les bactéries dans une pré-culture. Cette étape consiste à faire croître les microorganismes, jusqu’à ce que la densité de population bactérienne soit suffisante pour coloniser efficacement le fermenteur de production.

Préparation de la pré-culture :

• Prendre un Erlenmeyer de 50 ml. • Introduire dans l'Erlenmeyer 9,8 ml de milieu de culture YEP. • Ajouter 0,2 ml d’amorce bactérienne. • Placer 24 h l'Erlenmeyer sous agitation (120 tours min-1) dans l’incubateur à une température de 30°C.

Après la fermentation de la pré-culture, un échantillon de ce dernier est transféré dans l’Erlenmeyer, pour démarrer la fermentation de la culture.

Préparation de la culture :

• Prendre un Erlenmeyer de 100 ml. • Verser 29,4 ml de milieu YEP dans l'Erlenmeyer. • Ajouter 0,6 ml de pré culture. • Placer dans l’incubateur à 30°C pendant 24 h sous agitation l'Erlenmeyer (120 tours min-1). • Après l’incubation, prélever 1 ml de la culture afin de pouvoir effectuer le dénombrement de la concentration initiale de cellules (voir chapitre III.1.5).

1.4.2 Cultures en fermenteur Afin d’identifier le milieu de culture qui permet la production d’une grande quantité de biomasse pour les bactéries, nous avons utilisé différents types de milieux de culture. Parmi les milieux de cultures, nous avons évalué le TSB (trypticase soy bean), le YEP et le milieu développé par l’institut Maurice R&D.

61

III. Matériels & Méthodes

La production de la biomasse a été réalisée dans un fermenteur (figure III.1) d'une capacité de 1500 ml, disposant seulement d'une régulation de température et d’un système d’agitation.

Tableau III.5. Paramètres utilisés pendant la fermentation.

Paramètre Température pH Agitation Temps Alimentation en oxygène

Valeur 30±2°C 7±0,3 350 tours min-1 24 h 0

Figure III.1. Fermenteur pour la production de biomasse d'une capacité de 2 l (Setric Génie Industriel, Toulouse, France).

62

III. Matériels & Méthodes

1.5 Dénombrement des cellules L’objectif de cette partie est de connaître le nombre de bactéries, présentes à la fois dans le milieu de culture cellulaire, et dans les capsules humides ou sèches. Lorsqu’il s’agit de dénombrer les cellules viables dans les capsules, une procédure de dissolution des capsules doit être préalablement suivie.

Mode opératoire:

• Prélever 1 ml du milieu culture choisi ou 1 ml de suspension cellulaire issue de la dissolution des capsules (voir chapitre III.1.6), le diluer dans 9 ml d'une solution physiologique stérile. • Répéter successivement la dilution encore 9 fois (figure III.2). • Prélever 0,1 ml de dilution de chaque tube à essai. • Étaler chacune des dilutions sur toute la surface de chacune des boîtes de Pétri contenant de milieu gélose YEP agar • Placer les boîtes de Pétri pendant 24 ou 48 h dans l'étuve à une température de 30°C. • Effectuer le comptage du nombre de colonies sur chaque boîte de Pétri et le calcul de la concentration bactérienne a été effectué de la façon suivante:

UFC/ml = nombre de colonies* 10n 0,1

n=nombre de la dilution

Remarque: Le seuil de validation se situe entre 30-300 colonies. Un comptage se situant en dehors du seuil cité n'a pas été considéré.

63

III. Matériels & Méthodes

Dans ce travail, nous avons exprimé les résultats de viabilité de différentes manières : - CFU/total : exprime le nombre de cellules vivantes pour un batch de production de capsules à différentes étapes de la production. - CFU/g de capsules. - CFU/capsule.

Figure III.2. Schéma de la technique d’étalement sur la surface d’une boîte de Pétri contenant de YEP Agar.

1.6 Dénombrement des cellules contenues dans les capsules. Le procédé de dissolution des capsules a été réalisé afin de dénombrer la concentration en rhizobactéries immobilisées au sein des capsules. La méthode inclut les procédures de réhydratation et de dissolution des capsules.

Procédure de réhydratation des capsules: • Prendre un tube à essai vide et stérile. • Introduire 10 capsules. • Ajouter 2 ml de NaCl 0,8%. • Réhydrater sous agitation pendant 30 min.

64

III. Matériels & Méthodes

Procédure de dissolution des capsules: • Introduire les 10 capsules réhydratées dans un autre tube à essai vide et stérile. • Ajouter 10 ml de tri-citrate de sodium (60 g/l). • Agiter pendant 30 min pour obtenir une suspension homogène. • Prélever 1 ml de la suspension pour dénombrer sa concentration bactérienne (voir chapitre III.1.5 ).

1.7 Méthodes de caractérisation des bactéries Afin de caractériser les bactéries nous avons utilisé le microscope optique et la loupe qui permet d’observer la morphologie et croissance des rhizobactéries. 1.7.1 Microscopie optique et loupe binoculaire Deux types de matériels ont été utilisés: un microscope optique (Leica, Leica Microsystem Wetzlar GmbH, Allemagne) et une loupe binoculaire (Leica Wild M3C, Leica Microsystem Wetzlar GmbH, Allemagne).

Pour l’observation des bactéries, on utilise un grossissement de x1000 grâce à un objectif x100 à immersion ce qui permet de visualiser les bactéries dont la taille est proche de 1 µm.

La préparation microscopique est réalisée en déposant un frottis fixé et coloré préalablement pour la coloration de Gram (protocole au-dessous) sur une lamelle de verre. La loupe binoculaire a été employée pour l’analyse préliminaire de la surface des différentes capsules. 1.7.2 Morphologie et croissance des colonies Le développement des colonies à la surface de la gélose aide à identifier la pureté des bactéries, après le procédé d’encapsulation. En effet, chaque espèce forme des colonies qui ont souvent une taille et une morphologie caractéristiques. La structure des colonies bactériennes a été examinée à l’œil nu et à l’aide d’une binoculaire.

65

III. Matériels & Méthodes

Cette identification se fait en plusieurs étapes :

• Inoculer 9,8 ml de bouillon nutritif (milieu YEP) avec 0,2 ml des bactéries à partir du stock conservé à (–80°C) à 28°C pendants une nuit. • Faire des dilutions progressives 102,103 etc... • Transférer 0,1 ml de chaque dilution au centre d’une boîte de gélose (milieu YEP Agar) et étaler en surface à l’aide d’un étaloir en plastique stérile. • Incuber les boîtes de Pétri pendant 72 h à 28°C. • Après l’incubation, prendre une boîte de gélose avec des colonies bactériennes à la surface. • Mettre sous la binoculaire. • Observer les colonies.

66

III. Matériels & Méthodes

2. Procédé d’encapsulation L’encapsulation est une technique qui permet d’incorporer une substance active dans une matrice. Cette technique est utilisée pour immobiliser les rhizobactéries dans des capsules. Elle consiste à mélanger les bactéries avec une matrice d’encapsulation, cette dernière étant à l'état liquide. Ensuite, ce mélange est extrudé à travers une buse en goutte-à-goutte. Les gouttelettes ainsi formées tombent dans une solution de chlorure de calcium. Elles se transforment instantanément en des microparticules de gel sphériques.

Les différentes étapes doivent être bien coordonnées et certaines peuvent être réalisées en parallèle pour optimiser le temps et l’efficacité de l’opération. Une procédure globale d’encapsulation (figure III.3) a été élaborée pour faciliter le suivi des opérations.

2.1 Préparation de rhizobactéries pour l’encapsulation L'ensemble du matériel utilisé a été préalablement stérilisé dans l’autoclave et l'opération d'encapsulation a été réalisée dans des conditions aseptiques, en utilisant une hotte à flux laminaire.

Protocole de concentration cellulaire:

• Centrifuger la culture à 8720 g à +4 °C pendant 10 min. • Ajouter au culot cellulaire 3 ml de solution physiologique (0,85 % de NaCl) puis le centrifuger pendant 10 minutes. • Extraire le surnageant à l'aide d'une micropipette. • Répéter encore ces trois dernières opérations. • Après la dernière centrifugation, mélanger le culot obtenu avec 3 ml de peptone (1 g l-1) afin d'obtenir une suspension homogène.

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III. Matériels & Méthodes

Figure III.3. Schéma du procédé d’encapsulation et libération de rhizobactéries.

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III. Matériels & Méthodes

2.2 Préparation de la matrice d’encapsulation Après la production de la biomasse, nous avons préparé la matrice d’encapsulation afin de créer un support pour les rhizobactéries. La composition de la matrice comprenait au moins l’alginate plus un matériau pour augmenter la teneur en matière sèche. Ces solutions ont été extrudées dans une solution de chlorure de calcium afin d’obtenir une gélification des billes d’alginate. Les matériaux utilisés sont décrits dans le tableau III.4.

2.2.1 Matériaux Les matériaux utilisés dans le procédé d’encapsulation sont décrits dans le tableau III.6.

Tableau III.6. Description des matériaux utilisés dans le procédé d’encapsulation.

Nom

Référence

Fournisseur

Alginate de sodium

Satialgine S60

Cargill, France

Amidon de maïs

Amidon standard de maïs Sigma-Aldrich, Allemagne

Amidon modifié

Cleargum CO 01

Roquette, France

Chlorure de calcium

Chlorure de calcium

Pancreac, Espagne

Gluconate de calcium

Calcium D-Gluconate

Sigma-Aldrich, Allemagne

2.2.2 Choix de l’alginate Nous avons testé trois types d’alginate en fonction de leur viscosité en solution et en fonction de la forme des capsules résultante. Le principe était d’atteindre une faible viscosité de la matrice d’encapsulation afin de permettre son extrusion ou dripping sous forme de gouttes permettant d'obtenir des capsules de forme sphérique. Dans le tableau III.7, les alginates testés sont répertoriés ainsi que leurs propriétés.

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III. Matériels & Méthodes

Tableau III.7. Comparaison de trois types d’alginate de sodium.

Alcogel 6021

Satialgine S550

Satialgine S60

3

3

3

0,15-0,3

0,2-0,4

0,03-0,06

Cargill, France

Cargill, France

Cargill, France

Concentration (%) Viscosité à 1% dans l’eau (Pa.s) Fournisseur

L’alginate est le polymère le plus répandu dans les applications d’immobilisation cellulaire, grâce à ses propriétés: forte résistance mécanique, chimiquement inerte, soluble (dans un milieu sans calcium); biodégradable, bonne protection des bactéries et pendant une longue période de stockage (Bashan 1998).

Il faut noter qu’au cours du développement de nouvelles capsules ou de nouveaux produits pour l’agriculture, il n’est pas évident de trouver un matériau qui permette à lui seul de satisfaire les différentes propriétés recherchées (Ivanova 2006). Par exemple, le faible pourcentage de matière sèche que possède l’alginate, il faudra ajouter des adjuvants à la matrice d’encapsulation, comme l’amidon de maïs ou l’argile.

2.2.3 Choix des agents de charge Dans le tableau III.8 sont détaillées les caractéristiques des capsules d’alginate, alginate-argile et alginate-amidon:

70

III. Matériels & Méthodes

Tableau III.8. Caractéristiques des capsules d’alginate, alginate-argile et alginateamidon.

Ingrédients

Matière sèche (g/100 ml) 3

Diamètre capsule sèche (mm) 1,0 ± 0,11

alginate-argile

9

1,3 ± 0,03

alginate-amidon

35

2,3 ± 0,16

alginate

2.2.4 Fabrication de la matrice et des solutions de gélification La matrice a été préparée par l'intermédiaire soit d'un mélange d'alginate seul, soit d'alginateargile, soit d'alginate-amidon, le tout dissout dans l'eau distillée et stérile selon la préparation suivante :

• Stériliser séparément sous forme de poudre 3 g d’alginate de sodium, 44,6 g d’amidon standard et 2,4 g d’amidon modifié pour la matrice alginate-amidon ou 7 g d’argile et 3 g d’alginate pour la matrice alginate-argile, dans un autoclave à 120°C, pendant 15 min. • Prendre un bécher stérile de 250 ml. • Introduire 100 ml d’eau distillée dans le bécher. • Placer le bécher sous agitation. • Ajouter la poudre d’alginate doucement, afin d’éviter la formation de grumeaux. • Agiter le tout durant 30 min pour obtenir une solution homogène. • Ajouter au mélange homogène les poudres stériles d’amidon standard et d'amidon modifié ou d’argile. • Agiter le tout pendant 15 minutes. Préparation de la solution de gélification :

• Prendre un bécher de 2000 ml. • Introduire 14,7 g de Ca2+ chloride ou de Ca2+ gluconate. • Ajouter 1000 ml d’eau distillée.

71

III. Matériels & Méthodes

• Mélanger avec un agitateur magnétique pendant 10 min. • Stériliser la solution dans l’autoclave à 120°C pendant 15 min.

2.3. Fabrication des capsules La fabrication des capsules a été réalisée avec l’appareil d’extrusion ou dripping (Figure III. 4). Le principe consiste à faire passer la matrice d’encapsulation contenant des rhizobactéries à travers une aiguille pour obtenir des gouttelettes. Les gouttelettes formées par extrusion sont réceptionnées dans une phase aqueuse gélifiante contenant du chlorure de calcium. Elles se transforment instantanément en des microparticules de gel sphériques.

Figure III.4. Procédé d’extrusion de billes d’alginate en «goutte à goutte»

La fabrication des capsules a été réalisée avec l’appareil d’extrusion selon la procédure suivante :

• Produire la biomasse (voir détails dans le chapitre III.1.4). • Centrifuger 30 ml du milieu de culture (8720 x g, 10 min à 4°C). • Incorporer le culot dans 3 ml de solution de peptone à 1%. • Mélanger la solution dans 30 ml de la matrice choisie. • Homogénéiser pendant 15 min. • Aspirer le mélange matrice-suspension cellulaire dans une seringue de 50 ml. 72

III. Matériels & Méthodes

• Placer la seringue contenant la matrice dans une pousse-seringue (Kd Scientific, ÉtatsUnis). • Extruder la matrice contenant les rhizobactéries à un débit de 120 ml/h. • Réceptionner les gouttelettes dans la solution de gélification préalablement placée sous agitation dans un bécher. Au contact de la solution, les gouttelettes formées se transforment instantanément en des particules de gel sphériques (hauteur de chute 15 cm). • Agiter les capsules dans la solution de Ca2+ pendant 30 min. • Rincer les capsules 2 fois avec une solution physiologique (0,8 % de NaCl). • Récupérer les capsules contenues dans le bécher à l’aide d’un tamis.

2.3 Le séchage des capsules Le séchage des capsules contenant des rhizobactéries est une opération critique pour la viabilité des cellules, c’est pourquoi deux systèmes de séchage ont été testés au cours de ce travail. Le séchage à l’étuve a été utilisé préférentiellement pour le séchage en laboratoire et l’étuve et lit fluidisé ont été utilisés pour le séchage à l'échelle pilote (voir chapitre 5.1.3).

2.3.1 Séchage à l’étuve Le séchage des capsules est une opération critique qui permet d’augmenter la durée de conservation des capsules. Pour la plupart des expériences décrites, dans ce travail de recherche, nous avons opté par le séchage dans l'étuve. Les capsules sont placées en mono couche dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre à l’étuve à une température de 35°C, pendant 24 h.

2.4 Stockage des capsules Pour la plupart des expériences présentées dans ce travail, les capsules sont stockées à 4°C dans des flacons en plastique fermés après leur séchage complet.

73

III. Matériels & Méthodes

Figure III.5. Capsules d’alginate-amidon stocké dans des flacons en plastique fermé.

Pour une partie des expériences, les capsules ont été stockées à différentes activités de l’eau après un séchage partiel sur lit fluidisé (tableau III.9). L’humidité relative a été fixée dans des bocaux grâce à la présence de solutions saturées en sel (figure III.6). Le bocal dessiccateur est équipé d'un support en verre sous laquelle on dispose une solution saturée en sels ayant une activité de l’eau bien déterminée (tableau III.10).

Tableau III.9. L’influence du temps de séchage au lit fluidisé des capsules sur la perte de l’activité de l’eau (Aw).

Temps de séchage (min)

Aw

80

0,84

85

0,75

90

0,55

105

0,31

110

0,11

74

III. Matériels & Méthodes

25 °C

Grille perforée Solution saturée en sel

Figure III.6. Schéma du bocal de stockage des échantillons des capsules de l’amidonalginate à 25°C et avec un Aw régulés.

Les capsules ont été stockées dans les bocaux pour une période de 16 semaines.

Tableau III.10. L’Aw en présence des solutions en sel saturées à 25°C.

Sel

Aw

LiCl

0,114

MgCl2

0,313

Mg(NO3)2

0,550

NaCl

0,750

KCl

0,845

75

III. Matériels & Méthodes

3. Évaluation de lʼadhésion des cellules sur les grains dʼamidon 3.1 Test de cosédimentation Dans notre travail de recherche concernant l'adhésion cellulaire sur les granules d'amidon, nous avons étudié différents types de rhizobactéries et d’amidon:

• A. brasilense Sp245, Sp7. • B. pumilus C26. • E. ludwigii BNM 0357. • P. polymyxa MXC5. • R. terrigena TFi08.

Les amidons suivants ont été testés :

• Maïs standard (native maize starch, Sigma, USA). • High maïs (1043, high-amylose, National starch, UK). • Waxy maïs (waxy corn starch; Sigma, St. Louis, USA). • Blé (unmodified starch, Sigma, St. Louis, USA). • Pomme de terre (Native starch, Sigma, Steinheim, Germany).

Le protocole de sédimentation a été adapté à partir de celui de Crittenden et al. (2001): • 10 ml de milieu de culture contenant des rhizobactéries sont rincés avec 10 ml d’une solution tampon phosphate à pH 7,0 (0,1 M). Ensuite le culot bactérien est mélangé avec 10 ml de solution tampon phosphate.

• Dans un tube à essai, on mélange 5 ml de la suspension de rhizobactéries et 5 ml de la suspension tampon qui contient 10 g/l d'amidon.

76

III. Matériels & Méthodes

• La suspension résultante est laissée au repos pendant 1 h à température ambiante (voir figure III.7).

• 2 ml du tube à essai de la même suspension à 0,5 cm au dessous de la surface du liquide ont été prélevés. Cet échantillon est analysé à l'aide du spectrophotomètre afin d’évaluer la densité cellulaire. Pour ce travail de recherche, une densité optique de DO540 est utilisée. Une solution de tampon phosphate est choisie comme solution étalon de référence laquelle a servi pour toutes les mesures de spectrophotométrie.

• La mesure du pourcentage de rhizobactéries adhérées aux granules d’amidon pendant les tests effectués sur les échantillons prélevés, sont comparés avec des échantillons de référence qui contenaient des rhizobactéries sans amidon et des échantillons d'amidon sans bactéries.

• Le pourcentage de rhizobactéries adhérées aux granules d’amidon s'expriment selon la l'expression suivante (Crittenden, et al. 2001) :

X= % des rhizobactéries adhéré aux granules d’amidon a= Do540 des échantillons d'un tube à essai avec de l'amidon + rhizobactéries b= Do540 des échantillons d'un tube à essai avec seulement de l’amidon c= Do540 des échantillons d'un tube à essai avec seulement des rhizobactéries

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III. Matériels & Méthodes

amidon

bactéries

Figure III.7. Schéma du test de cosédimentation des cellules libres et adhérées sur les granules de l’amidon.

3.2 Observation de l’adhésion des cellules sur les granules d’amidon au microscopique électronique à balayage La microscopique électronique à balayage (MEB) est une technique puissante d’observation de la morphologie des micro-organismes et de la structure des capsules. Elle est fondée principalement sur la détection d’électrons secondaires émergents de la surface sous l’impact d’un très fin faisceau d'électrons primaires qui balaye la surface observée et permet d’obtenir des images avec un pouvoir séparateur inférieur à 5 nm et une grande profondeur de champ.

Pour rendre la surface conductrice et permettre une observation fine à haute tension, on dépose par pulvérisation cathodique sur l'échantillon, un film métallique très fin (30-50 nm) de préférence en or ou platine.

Ces éléments lourds amplifient l’émission d’électrons secondaires et assurent une excellente résolution spatiale. De plus, comme ils sont inaltérables, ils permettent une longue conservation.

Mais il n’est pas toujours facile de réaliser une couche fine et uniforme, en particulier sur les échantillons poreux et les échantillons avec surfaces très accidentées ou les échantillons très hétérogènes.

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III. Matériels & Méthodes

3.2.1 Protocole de préparation des échantillons pour la microscopique électronique à balayage (MEB) • Les bactéries sont prélevées après 24 h de culture à 30°C, dans un milieu de culture YEP.

• Une gouttelette de culture est versée sur le filtre Whatman Anodisc 25 de 0,2 µm de seuil de coupure et de 2,5 cm de diamètre. Ensuite les filtres ont été placés dans une boîte de Pétri ouverte. Il sera déposé par la suite dans une étuve durant 30 min à 30°C.

• Le filtre avec les bactéries déshydratées est déposé dans un flacon qui contient une solution tampon phosphate à pH 7,0 pendant 10 min.

• La membrane où sont déposées les rhizobactéries est plongée dans une solution aqueuse de Glutaraldéhyde de concentration 0,25% et laissée pendant 2 h. Pour ce qui est des préparations des capsules, on emploi du Glutaraldéhyde à une concentration de 2%.

• La dernière étape est celle de la déshydratation à l'aide de différente concentration d’éthanol, à savoir: 30°, 50°, 70°, 80°, 90° et 99°.

Les filtres avec les bactéries fixées ou les capsules fixées dans le filtre ont été placés dans une boîte de Pétri contenant une concentration de 30°d’éthanol, pendant 10 minutes. En suite les filtres ont été placés, dans des concentrations d’éthanol supérieur, jusqu’à 99°C. Après de la déshydratation à l’éthanol, les cellules sont prêtes pour l’observation au microscope électronique à balayage.

79

III. Matériels & Méthodes

4. Libération des rhizobactéries des capsules dans lʼeau et dans le sol L'objectif de ces essais est d’analyser et de mesurer la libération des rhizobactéries des capsules vers le milieu extérieur, dans l’eau et dans le sol. Pour cela, nous avons mesuré le nombre des bactéries libérées réellement dans le sol et le nombre de bactéries qui restent dans les capsules. 4.1 Libération des rhizobactéries dans l’eau La libération des rhizobactéries par les capsules a été effectuée au laboratoire dans les fioles Erlenmeyer (figure III.8). Les étapes sont les suivantes :

• Prendre 0,5 g de capsules contenant des rhizobactéries. • Les verser dans la fiole Erlenmeyer. • Ajouter 10 ml de solution physiologique stérile (0,85 % w/v). • Mélanger pendant 24 h; 30°C à 120 tours min-1. • Prélever à l'aide d'une micropipette 1 ml de la solution contenue dans l’Erlenmeyer. • Dénombrer la concentration bactérienne dans la solution physiologique. • Vider la solution restante. • Répéter les cinq dernières opérations précédentes plusieurs fois.

Figure III.8. Étapes expérimentales pour tester la libération des rhizobactéries dans l’eau. 80

III. Matériels & Méthodes

4.2 Libération des bactéries dans le sol L’objectif de cette partie a été de mesurer la libération progressive des rhizobactéries depuis les capsules. Nous avons comptabilisé le nombre des B. pumilus libérés dans le sol stérilisé. Le dénombrement a été effectué durant une période de 3 semaines.

L'échantillon du sol type argileux (pH 5,2) a été prélevé à Nantes l’année 2009 et tamisé deux fois à l’aide d’un tamis en acier inoxydable de porosité 50 µm afin de le débarrasser des grosses particules et des petits cailloux et d’obtenir une texture fine. Par la suite, l'échantillon de sol a été stérilisé par autoclave en deux cycles de 15 minutes dans des flacons en verre et à une température de 120°C.

Protocole de libération des bactéries dans le sol (figure III.9):

• Prendre un flacon stérile de 7 cm de hauteur x 2,5 cm de diamètre. • Prendre 10 capsules d’alginate-amidon contenant des rhizobactéries. • Verser les capsules dans des flacons en plastique stérile • Ajouter 20 g de sol sec. • Mettre 3 ml de solution physiologique stérile (teneur en eau finale 10%). • Mélanger le sol et les capsules à l’aide d’une spatule stérile. • Fermer le bouchon du flacon. • Laisser les flacons à l’étuve pendant 4 semaines à une température de 25°C • Retirer les capsules chaque 4 jours, pendant une période de temps de 4 semaines. • Dénombrer la concentration bactérienne du sol.

81

III. Matériels & Méthodes

Figure III.9. Étapes expérimentales pour tester la libération dans le sol des rhizobactéries contenues dans les capsules. Nous avons évalué le taux de survie de B. pumilus dans le sol inoculé sous forme liquide et dans les capsules. 24 flacons stériles ont été remplis avec 20 g d'échantillon de sol stérile puis inoculé avec 3 ml de culture bactérienne (1x107 UFC/ml). 24 flacons supplémentaires ont été inoculés avec 10 capsules chacun. L’ensemble a été homogénéisé à l’aide d’une spatule stérile puis incubé à l’étuve pendant 4 semaines à une température de 30°C.

82

III. Matériels & Méthodes

Figure III.10. Mesure de la concentration bactérienne dans le sol.

Le prélèvement des sols a été fait chaque 4 jours, pendant 4 semaines. Le contenu de chaque flacon a été versé dans un sac stomacher, puis dilué au dixième dans une solution physiologique stérile. L’ensemble a été homogénéisé pendant 1 minute dans l'appareil de stomacher avant d’être dénombré par dilutions successives.

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III. Matériels & Méthodes

5. Production des capsules à échelle pilote Afin de tester l’efficacité des capsules en champs, nous avons réalisé des productions à plus grande échelle. Tout d’abord, nous nous sommes déplacés à Valdivia (Chili) pour produire environ 14 kg des capsules d’alginate pour une application immédiate sur le sillon de plantation des semences de blé (session de plantation septembre 2009).

Nous avons également fabriqué des capsules d’alginate-amidon contenant la souche B. pumilus C26 à échelle pilote au sein de notre laboratoire à l’ONIRIS et dans la halle de technologie du même établissement que nous avons envoyé à notre partenaire industriel du projet Rhibac en Angleterre. 5.1 Production de la biomasse à l’ONIRIS La souche B. pumilus C26, sélectionnée pour le projet Rhibac, pour ses capacités à augmenter la croissance des plantes en climat tempéré a été utilisée pour produire des capsules d’alginate-amidon. La production de la biomasse a été effectuée dans deux bonbonnes en plastique résistantes au passage dans l’autoclave, à l'intérieur d’une étuve à une température de 30°C. Les paramètres utilisés durant l’étape de fermentation sont décrits dans le tableau III.11.

Tableau III.11. Paramètres utilisés pour la production de la biomasse dans la bonbonne de fermentation.

Paramètres

Valeur

Milieu de culture YEP

10 L

Température

30 °C

pH

7.0

Temps

24 h

T°

30 °C

84

III. Matériels & Méthodes

Nous avons utilisé le milieu de culture YEP, pour la production de la biomasse de la souche B. pumilus. Le milieu de culture a été stérilisé deux fois (121°C ; 20 min), pour assurer une stérilisation complète du milieu de culture, en particulier au centre de la bonbonne. Le temps de fermentation a été de 24 h, avec une agitation réalisée à l’aide d’un barreau magnétique de 6 cm de longueur inséré à l'intérieur de la bonbonne (figure III.11).

Figure III.11. Production de la biomasse en deux bonbonnes de fermentation.

Contrairement à la production à l’échelle laboratoire (30 ml de milieu de culture), l’étape de centrifugation a été éliminée du fait d’un volume de culture obtenue trop importante (10 l) et les bactéries ont été encapsulées dans leur milieu de culture.

Les poudres d’alginate et amidon n’ont pas été stérilisées, car les contaminations microbiologiques étaient au-dessus d’une dilution de 102. Finalement, les 10 litres de milieu de culture ont été mélangés avec l’alginate et l’amidon à l’aide d’un mélangeur de matrice type cutter vertical (figure III.12).

5.1.1 Préparation de la matrice La préparation de la matrice d'encapsulation alginate-amidon a été faite selon la même proportion d’alginate et d’amidon que la procédure réalisée dans le laboratoire. Dans la production de la matrice à échelle pilote, nous avons utilisé également 45 % d’amidon 85

III. Matériels & Méthodes

standard de maïs, 2 % d’amidon modifié et 3 % d’alginate de sodium satialgine S60. Les quantités de chaque élément de la formulation sont présentées dans le tableau III.12.

Tableau III.12. Préparation d’un batch de matrice d’encapsulation d’alginate-amidon.

Matrice d’encapsulation

Poids (kg)

Solution microbienne

10,5

Masse de l'amidon de maïs

4,68

Masse de l'alginate

0,32

Masse de l’amidon modifié

0,25

Masse totale

15,75

La solution microbienne de B. pumilus et la matrice d’encapsulation ont été mélangées à l’aide d’un mélangeur vertical. Une matrice homogène a été obtenue après 30 à 300 tours par minute.

Figure III.12. Mélangeur de matrice type Cutter vertical 515.

86

III. Matériels & Méthodes

L’utilisation du mélangeur type cutter vertical a permis l’obtention d’un mélange homogène entre la matrice d’alginate-amidon et la biomasse bactérienne.

a

b

Figure III.13. Système de dripping muni de 8 buses d'extrusion (a), les gouttes formées sont gélifiées dans un bain de solution de CaCl2 sous agitation (b).

L’encapsulation a été réalisée par dripping munie de 8 buses d'extrusion, ayant chacune un diamètre interne de 1,5 mm. Ce système d'encapsulation est relié à une pompe péristaltique, qui extrude sur chacune des buses la matrice d'encapsulation d’alginate-amidon. Les gouttelettes formées par extrusion ont été réceptionnées dans 5 litres de CaCl2. Le débit généré par cet appareil se situe aux environs de 1,2 kg de capsules humides par heure.

5.1.2 Séchage des capsules Nous avons testé deux systèmes de séchage, le premier a été le lit fluidisé. Dans ce cas, le principe du lit fluidisé est de sécher les particules mises en suspension dans l’air. Ce dernier est fourni au lit par une plaque de distribution perforée spécialement conçue. La vitesse d’entrée de l’air est réglée pour être suffisante pour soutenir le poids des particules en suspension. L’avantage de cette technique est que le temps de séchage des capsules est

87

III. Matériels & Méthodes

d'environ 2 h. Le deuxième système de séchage testé a été l’étuve couplée à un ventilateur, avec un temps de séchage de 72 h.

5.1.3 Séchage sur lit fluidisé Nous avons utilisé le lit fluidisé pour le séchage des capsules, car ce système permet de sécher un grand volume de capsules en un temps assez réduit.

Les paramètres de température et vitesse de l’air pour le séchage de la souche B. pumilus C26 sont montrés dans le tableau III.14.

Tableau III.14. Caractéristiques du séchage en lit fluidisé

Valeur Temps séchage

75 min

t° moyen

25 °C

Vitesse de l’air

2,0 m/s

Poids total des capsules humides

2,0 kg

Poids total des capsules sèches

0,675 kg

Le séchage des capsules a été réalisé selon la procédure ci-dessous:

• Placer les capsules humides dans la cuve du lit fluidisé équipée d’une grille perforée pour permettre le passage de l’air. • Faire passer l’air à une température de 25°C et à une vitesse de 2,0 m/s. • Arrêter le séchage quand l'activité de l’eau (Aw) des capsules est inférieure ou égale à 0,25 et que la teneur en eau est comprise entre 12-15 %.

Le nombre total de bactéries a été déterminé avant et après le séchage. Nous avons suivi aussi la survie des rhizobactéries au cours du séchage en prélevant des échantillons des capsules. La figure III.19 présente le système de séchage sur lit fluidisé. 88

III. Matériels & Méthodes

Figure III.14. Système de séchage sur lit fluidisé (a) et la chambre de séchage des capsules (b).

Nous avons utilisé d’abord le lit fluidisé pour le séchage des capsules, car ce système permit le séchage d’un grand volume de capsules en un temps de séchage assez réduit. Les paramètres de température et de vitesse de l’air pour le séchage de la souche B. pumilus ont été montrés dans le tableau III.14.

On a constaté durant le début du procédé de séchage, une fluidisation limitée des capsules. La figure III.14 b ci-dessus montre le passage de l’air seulement pour certaines zones du lit. Après, que les capsules ont perdu une partie importante d'humidité.

5.1.4 Séchage à l’étuve Les 10 kg de capsules humides produits ont été placés et répartis sur 4 claies de séchage. Les capsules humides ont été mélangées périodiquement, pour assurer un séchage homogène de l'ensemble. Le tableau III.13 présente les conditions de séchage et les caractéristiques finales des capsules sèches.

89

III. Matériels & Méthodes

Tableau III.13. Caractéristiques du séchage à l’étuve.

Valeur Temps séchage

72 h

t° moyen

35 °C

Humidité de l’air

10 %

Poids total capsules humides

10 kg

Poids total capsules sèches

4 kg

Teneur en eau finale

7,0 %

Aw final

0,15

L’étuve est équipée de capteurs qui donnent la température et l’humidité de l’air. L’air de séchage a été préalablement séché grâce à un déshumidificateur. Au début, le séchage des capsules a été hétérogène, car seulement les capsules placées en surface ont été séchées. Raison pour laquelle le temps de séchage (72 h) a été prolongé pour sécher les 10 kg de capsules.

La figure III. 14 (gauche) montre l’étuve utilisée pendant le séchage et la figure IIl.14 (droite) présente les 4 claies contenant 2,5 kg de capsules humides.

90

III. Matériels & Méthodes

Figure III.14. Étuve de séchage modèle Vötsch VC 7018 munie d’un ventilateur à l'intérieur et de 4 étages pour placer les claies de séchage.

5.2 Production des capsules à l’Université Austral du Chili (UACH) La première étape de ce travail a été de s’assurer d’une quantité d’inoculum suffisant pour réaliser nos lots à l'échelle pilote. Trois souches ont été employées: R. terrigena TFI08, P. fluorescens C139, B. pumilus C26. Pour ce qui est de chacune des trois souches, une fermentation par souche a été nécessaire pour produire chaque type de biomasse. La fermentation a été effectuée à partir d’une pré-culture.

L’amorce de l’inoculum de R. terrigena a été fournie par l’Austrian Research Center, Vienne, Autriche (ARC) et le B. pumilus et P. fluorescens ont été fournis par l’UACH sous la forme d’inoculum lyophilisé. Pour chaque type de rhizobactéries, une fermentation a été nécessaire pour produire la biomasse. La fermentation a été réalisée à l’UACH dans le fermenteur de type Biotron de 8 litres de capacité, avec un contrôle automatique du pH, la concentration de l'oxygène, la température et le tour d’agitation. Pour les fermentations, les paramètres suivants ont été utilisés:

91

III. Matériels & Méthodes

Tableau III.14. Paramètres utilisés pendant la production de la biomasse dans le fermenteur de type Biotron.

Paramètres

Valeur

Milieu de culture YEP

8l

Température

30 °C

pH

7,0

Temps

24 h 350 tours min-1

Agitation Alimentation en oxygène

1,0 vvm (volume d’oxygène par volume de liquide par minute)

La fermentation des rhizobactéries a été effectuée dans deux cuves de fermentation de 5 l et de 3 l de capacité. La régulation du pH a été effectuée avec une solution de 30 % d’acide H3PO4 et une solution de 10 M de la base NaOH.

Figure III.15. Production de biomasse dans un fermenteur Biotron de 8 litres de capacité.

92

III. Matériels & Méthodes

5.2.1 Encapsulation de bactéries Lorsque les cellules ont été bien dispersées, on a ajouté 3 % de l’alginate (Gely Gum 7208). Le mélange est homogénéisé à l'aide d'un robot de cuisine. Le mélange biomasse-alginate a été aspiré à l'aide d'une pompe péristaltique pour être ensuite refoulé sur un système d'écoulement multi buses en acier inoxydable (40 buses avec un diamètre interne de 1,5 mm). Ce dispositif expérimental a été mis au point par le professeur Luigi Ciampi de l'Université Austral du Chili. Cet appareil expérimental a permis un gain de temps et d'efficacité, car le mélange extrudé en goutte-à-goutte s'est réalisé via les 40 buses dans le bain de gélification de chlorure de calcium. Le débit d’extrusion de la solution atteint a été de 3 à 4 l/h. Le diamètre des billes produites était de 3 mm.

Figure III.16. Formation de la matrice d’encapsulation, homogénéisation de culture bactérienne et l’alginate de sodium.

93

III. Matériels & Méthodes

Figure III.17. Le système d’extrusion goutte à goutte « Multi buses » munies de 40 buses d'extrusion en acier inoxydable, chacune débite des gouttes d'environ 3 mm diamètre.

Le système d'encapsulation utilisé est connu comme un système d’extrusion goutte à goutte multi buses, a été fabriqué en acier inoxydable (figure III.17). Ce système d'encapsulation est relié à une pompe péristaltique, qui extrude sur chacune des buses la matrice gel-liquide d'encapsulation. Le débit généré par cet appareil se situe aux environs de 55000 billes/h, ce qui confère à ce dispositif expérimental de bonnes perspectives pour l'adapter à des opérations d'encapsulation à échelle de grands pilotes ou industrielle.

Il a été choisi de faire des billes humides, car l’utilisation de cet inoculant biologique de sol a été réalisé dans les jours suivants à notre étape d’encapsulation. La formulation des billes humides a comme inconvénient l’utilisation immédiate dans les essais sur les champs de culture et l'impossibilité de stocker les billes pour une période de temps prolongée. D’un autre côté, le séchage de billes diminue en 2 logs le taux de survie des rhizobactéries, donc l’utilisation de billes humides permet d’inoculer le sol avec une concentration élevée des rhizobactéries.

94

III. Matériels & Méthodes

6. Étude de l’efficacité des inoculums encapsulés en champs Afin de permettre des essais en champs par nos partenaires du projet Rhibac, Masstock (Angleterre) et l’Université Australe du Chili, nous avons réalisé une production à l’échelle pilote de rhizobactéries encapsulées. Au cours de la production, nous avons fabriqué 14 kg de capsules d’alginate humides pour l’essai au Chili et 2 kg de capsules d’alginate-amidon sèche pour les essais en l'Angleterre. Nous avons réalisé ces productions à l’UACH et à ONIRIS Nantes, France.

6.1 Essais en champs au Chili Pendant la période Juillet-Aout 2009, nous nous sommes déplacés à Valdivia, Chili, pour produire des rhizobactéries immobilisées dans des capsules d’alginate pour les essais en champs de notre partenaire du projet Rhibac. L'ensemencement des graines de blé de la variété Pandora et l’inoculation des rhizobactéries immobilisés ont été faits le 3 septembre 2009.

L'objectif de cet essai a été d’évaluer l’effet des 3 genres de rhizobactéries isolés par notre partenaire du projet sur leur capacité à solubiliser les phosphates du sol (concentration moyen de phosphate du sol: 11 ppm). Le but a été d’augmenter la disponibilité du phosphate afin d’augmenter la croissance des plantes de blé. C’est pourquoi l’UACH a évalué 5 traitements différents et dans tous les cas, avec la même fertilisation azotée. Le tableau III.15 récapitule les essais réalisés par notre partenaire.

95

III. Matériels & Méthodes

Tableau III.15. Fertilisation à base des phosphates (P2O5) et nitrates d'ammonium (NH4) NO3 dans les essais des champs au Chili.

Traitements

Fertilisation P2O5 (Kg/ha)

Fertilisation (NH4)NO3 (Kg/ha)

+ phosphates

150

300

- phosphates

0

300

Billes de R. terrigena

0

300

Billes de P. fluorescens

0

300

Billes de B. pumilus

0

300

La fertilisation à base de phosphate a été incorporée dans seulement un traitement au début de l’ensemencement. La fertilisation à base de nitrates a été de 300 kg/ha pour tout le traitement. Cette quantité d’azote a été divisée par trois et ajoutée au sol au début de l’essai, dans l’étape de tallage et finalement dans l’étape de formation de l’épi.

Nous avons adapté notre production de inoculants biologiques, par rapport aux demandes de notre partenaire, pour obtenir une concentration en rhizobactéries élevée pour chaque semence de blé. Le tableau ci-dessous montre les caractéristiques chimiques du sol et les caractéristiques de l’essai de terrain.

Tableau III.16. Caractéristiques chimiques du sol en Valdivia, Chili.

pH

Valeur 6,0

P (ppm)

11,9

Ca (ppm)

2652

Mg (ppm)

43,2

Na (ppm)

11,5

K (ppm)

136,5

Al (ppm)

8,1

N (ppm)

12,5

MO (%)

14

96

III. Matériels & Méthodes

Tableau III.17. Description de la caractéristique de l’essai d’inoculation des rhizobactéries encapsulées en champ.

Valeur Semences de blé

350 graines/m2

Taille de lot

7,5 m2

Traitement

5

N° répétition

3

Total surface

112 m2

Les capsules ont été incorporées en même temps que l'ensemencement des graines de blé. Les capsules et les graines de blé ont été semées à l’aide d’un semoir employé par notre partenaire. Elles ont été ajoutées à 1-2 cm des semences du blé. Une deuxième inoculation liquide de 20 ml par ligne (106 UFC/ml) a été faite au cours de l’étape de tallage des plantes pour tous les essais, afin de renforcer l’inoculation des rhizobactéries. L’inoculation liquide a été dispersée sur les fouilles de blé, à l’aide d’une pulvérisateur à dos de 50 l de capacité total.

Tableau III.18. Description de la concentration en rhizobactéries par billes et par semence.

Valeur Concentration billes

1,5x1012 UFC/g

Concentration billes

2,1x1010 UFC/billes

Poids bille

0,014 g

Billes par lot

0,3 kg

Graines par lot

0,16 kg

Billes par m2 Relation graines/billes

0,04 kg/m2 1:8

97

III. Matériels & Méthodes

Le rendement de la biomasse total de culture de blé a été mesuré à travers la matière sèche, en pesant la masse de feuilles, de tilles, d’épis et de graines. Le rendement de blé a été mesuré en pesant le poids des graines de blé.

Les figures III.18 et III.19 représentent respectivement un aperçu général des lots et d’un lot d’inoculation de rhizobactéries encapsulées.

Figure III.18. Aperçu général des lots réalisés pour notre partenaire UACH, Valdivia, Chili.

Figure III.19. Aperçu d’un lot (1,5x5 m) d’inoculation de rhizobactéries encapsulées dans la culture de blé. 98

III. Matériels & Méthodes

6.2 Essai en champs en Angleterre Nous avons produit au sein de notre laboratoire des capsules sèches d’alginate-amidon pour le partenaire industriel Masstock. L'ensemencement des graines de blé de la variété Paragon dans la zone de Cambridgeshire et l’inoculation des rhizobactéries immobilisées a été fait le 24 d’avril 2009. L'objectif était d’évaluer l’effet de nos capsules d’alginate-amidon sur le rendement de production du blé dans un autre pays avec des conditions climatiques et un sol différents de ceux du Chili. Les caractéristiques chimiques du sol sont décrites dans le tableau III.19 Les caractéristiques chimiques du sol et la description de l’essai sont données dans la partie matériel et méthodes et est résumée dans le tableau III.19 et III.20.

Tableau III. 19. Caractéristiques chimiques du sol en Cambridgeshire, UK. Valeur pH

6,5

P (ppm)

26

Ca (ppm)

1600

Mg (ppm)

50

Na (ppm)

90

K (ppm)

241

Tableau III.20. Description de l’essai d’inoculation des rhizobactéries encapsulées en plein champ. Valeur Semences de blé

400 graines/m2

Taille de lot

15 m2

Taux d’azote

3

N° répétition

4

Total surface

180 m2

99

III. Matériels & Méthodes

Les capsules ont été incorporées en même temps que l'ensemencement des graines de blé avec un rapport d’une semence pour trois capsules. La concentration finale en bactéries par semence était de 1x108 UFC.

Tableau III.20. Description de la concentration en rhizobactéries par bille et par semence. Valeur Bactéries dans la bille sèche

2,9x109 UFC/g

Bactéries dans la bille sèche

4,7x107 UFC/bille

Poids de bille

0,02 g

Billes par lot

0,3 kg/lot

Semences par lot

0,3 kg/lot

Billes par m2

0,02 kg/m2

Relation semence/bille

1:3

La figure III.20 présente les champs réalisés par notre partenaire Masstock, contenant des rhizobactéries encapsulées.

Figure III.20. Image des essais en champs réalisés par notre partenaire Masstock, l’Angleterre.

100

III. Matériels & Méthodes

La taille de lot utilisé en Angleterre a été de 15 m2. L’incorporation des semences et des capsules a été effectuée simultanément à l’aide d’un semoir. L’inoculation des rhizobactéries a été effectuée seulement une fois au début de l’ensemencement des graines de blé. Le méthode statistique utilisée a été les blocs aléatoires complets (4 répétitions)

101

IV. Résultats & Discussion

RÉSULTATS & DISCUSSION Ce chapitre est consacré à la discussion des résultats obtenus pendant ce travail de thèse. Ce travail de recherche vise à démontrer que l'emploi des bactéries encapsulées en tant qu'engrais biologique pour une agriculture respectueuse de l'environnement est à terme possible.

Les paramètres abiotiques et biotiques jouent un rôle très important pour déterminer le taux de survie des rhizobactéries dans le sol. L'humidité du sol, la température, le pH, la texture, la disponibilité de l’oxygène sont des facteurs qui déterminent la viabilité cellulaire. Parmi les facteurs biologiques, les plus importants sont la prédation par les protozoaires et la mortalité des bactéries lors de l’inoculation. L’encapsulation des rhizobactéries répond à une nécessité de disposer d'une technique pour prévenir ce type de contraintes lors de l'inoculation des bactéries dans le sol.

Notre travail a consisté essentiellement à évaluer le potentiel de développement de bioengrais, fondé sur les techniques d'encapsulation des rhizobactéries dans une matrice d’alginateamidon.

Ce chapitre est composé de quatre parties:

• Caractérisation de la survie des rhizobactéries au procédé d’encapsulation • Optimisation de la survie des rhizobactéries • Étude de l’adhésion des rhizobactéries sur l’amidon • Libération contrôlée des rhizobactéries et efficacité en champs

103

IV. Résultats & Discussion

1.Caractérisation de la survie des rhizobactéries au procédé d’encapsulation L’immobilisation des cellules est une technique qui permet d’incorporer des rhizobactéries dans une matrice de polymères. La méthode d’encapsulation que nous avons utilisée dans ce chapitre est le dripping. Les méthodes classiques d’immobilisation des rhizobactéries comprennent l’encapsulation des cellules dans une matrice principalement constituée d'alginate de sodium (Paul et al. 1993; Bashan et Gonzalez 1999). Les capsules d’alginate contiennent une teneur en matière sèche très faible. Le séchage de telles capsules suppose l’élimination d’une grande quantité d’eau. Nous avons donc décidé de rajouter de l’argile ou de l’amidon à la matrice d’encapsulation, ce qui a eu comme conséquence l'augmentation de la matière sèche permettant ainsi d'offrir une protection accrue aux rhizobactéries encapsulées.

Notre travail a comporté notamment la mise au point du procédé d’encapsulation d’Azospirillum brasilense Sp245 et Raoultella terrigena TFi08 on optimisant l’utilisation des substances osmo-protectrices. Le but était améliorer le taux de survie des rhizobactéries modèles choisies pour le projet Rhibac pour ses propriétés promotrice de la croissance des plantes.

1.1 L’effet de la nature de la matrice d’encapsulation sur la viabilité cellulaire La méthode la plus usuelle d'encapsulation des bactéries est leur inclusion dans des billes d'alginate de sodium (Cassidy et al. 1996). En soi la méthode est simple et permet le piégeage d'un nombre important de bactéries durant l'encapsulation (Bashan et al. 2002). Les billes ainsi formées contiennent plus de 95 % d'eau. Néanmoins, la viabilité des cellules décroit de plusieurs unités logarithmiques en quelques semaines après inoculation (Paul et al. 1993).

Le séchage des billes permet d'obtenir un produit plus stable, mais l'étape de séchage ellemême conduit à une forte mortalité (Paul et al. 1993). Nous avons voulu dans un premier temps vérifier ces observations.

104

IV. Résultats & Discussion

Nous avons donc réalisé une encapsulation d’A. brasilense Sp 245 par suspension des cellules dans de l'alginate de sodium, extrudée goutte à goutte dans une solution de gélification de CaCl2 suivi d'un séchage à l'étuve. Après encapsulation, les cellules ont été libérées par dissolution des billes et numération après dilution séquentielle. Le tableau IV.1 donne l'évolution du nombre total des bactéries aux diverses étapes de la production.

Tableau IV.1. Évolution du nombre total de cellules d’A. brasilense Sp245 vivantes à diverses étapes d’encapsulation.

Type de billes

Alginate

Cellules initiales UFC/ total

Billes humides UFC/total

Rendement d'encapsulation

Billes sèches UFC/total

Rendement du séchage

(5,65 ± 1,86)x1010

(1,64 ± 2,0)x 1010

29 %

(3,67 ± 5,14)x108

2,2 %

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type).

1 mm

1 mm

Figure IV.1. Billes d’alginate de sodium avant et après séchage à l’étuve. On a observé que l'encapsulation d’A. brasilense dans des billes d'alginate humides permet de maintenir un taux de survie de 30 %. Par contre, la viabilité chute à moins de 2,2 % après séchage, où on observe une forte diminution de la taille des billes (figure IV.1).

Nous avons observé que les billes d'alginate sèches ainsi obtenues ont une taille petite et de forme irrégulière. Le séchage des billes cause ainsi une forte réduction de leur taille entrainant 105

IV. Résultats & Discussion

une contraction de leur structure. Les billes présentent une structure craquelée et poreuse. Afin de réduire la porosité des billes, nous avons ajouté des matériaux de remplissage, tel que l’argile ou l’amidon.

Ainsi, cette opération permet réduire, la quantité d'eau à évaporer et permet d'offrir un support plus consistant pour les cellules. En effet, l’argile et l’amidon ont comme rôle principal d'ajouter de la matière sèche initiale sans augmenter trop fortement la viscosité de la suspension, requise pour une extrusion gouttes à gouttes. D'autre part dans notre sélection, nous désirions chercher des matériaux moins onéreux, biodégradables et compatibles avec des applications agricoles. Les essais préliminaires ont permis de sélectionner l'argile et l'amidon comme agents de remplissage. Afin de permettre une extrusion ou dripping correcte, nous avons pu établir les formulations suivantes :

Tableau IV.2. Comparaison des différents types de matrice d’encapsulation.

Dénomination

Concentration en Concentration en Matière sèche alginate dans la agent dans la initiale des matrice (p/p) matrice (p/p) capsules humides

Alginate

3%

0%

3%

Alginate- argile

2,7%

6,4%

9%

Alginate-amidon

2%

35%

37%

Nous avons choisi l’argile comme agent de remplissage avec une concentration maximale de 7% car pour des concentrations supérieures, la matrice d’encapsulation est trop visqueuse. Nous avons travaillé aussi avec l’amidon de maïs, avec une concentration maximale de 44,6 % d’amidon standard et 2,4 % d’amidon modifié. Ce dernier a été utilisé dans la formulation pour stabiliser le mélange des polymères de la matrice.

La figure IV.2 montre des capsules de forme sphérique et des capsules de forme irrégulière. Cette dernière dû à l’utilisation de l’alginate Alcogel 6021 de forte viscosité (entre 0,15-0,30 106

IV. Résultats & Discussion

Pa.s) que l’alginate Satialgine S60 (0,03-0,06 Pa.s). Cela montre qu’une viscosité élevée rend une extrusion goutte à goutte délicate et ne permet pas la formation de capsules de forme sphérique. 2 mm

2 mm

Figure IV.2. Capsules d’alginate-amidon formés à partir d’une matrice d’amidonalginate satialgine S60 (photo de gauche) et d’amidon-alginate alcogel 6021 (photo de droite). Par la suite, nous avons pu déterminer des concentrations optimales de chacun des constituants permettant d’obtenir des capsules d’alginate de formes régulières tout en contenant une concentration en matière sèche maximale.

La formulation d’alginate de faible viscosité et l’amidon de maïs ont été utilisés pour la suite de l’étude et figurent dans le tableau IV.3.

Tableau IV.3. Caractérisation des billes utilisées pour immobiliser des rhizobactéries.

Matière sèche initiale

Quantité d'eau à évaporer

Taille des billes sèches

alginate

3%

97 %

1,0 ± 0,11

alginate-argile

9%

91%

1,3 ± 0,03

alginate-amidon

37%

63%

2,3 ± 0,16

Type des billes

107

IV. Résultats & Discussion

D’après le tableau IV.3, la concentration en eau est supérieure dans les billes d’alginate et d’alginate-argile que dans les billes d’alginate-amidon. La matière sèche initiale dans la matrice d’alginate est 8 fois inférieure à celle présente dans la matrice d’alginate-amidon. a

b

c

1 mm

1 mm

1 mm

Figure IV.3. Illustration de la taille des capsules après séchage à l’étuve (a) capsules d’alginate (b) capsules d’alginate-argile et (c) capsules d’alginate-amidon.

Les photos de la figure IV.3 montrent que les capsules d’alginate se représentent sous la forme de billes dont le diamètre est de 1,0 mm et de forme irrégulière. Les capsules d’alginate-argile sont de forme sphérique, mais de petite taille: 1,3 mm. En revanche, les capsules d’alginateamidon présentent une taille plus grande: 2,3 mm et elles sont sphériques et de forme régulière après séchage. Nous avons par la suite, mesuré le taux de survie d’A. brasilense Sp245 dans les billes ayant différentes compositions et calculé le rendement d’encapsulation et de séchage.

Tableau IV.4. Test de viabilité de la souche A. brasilense Sp245 pour différents types des capsules. Type de capsules

Culture initiale CFU total

Billes humides Rendement CFU total d'encapsulation

Billes sèches CFU total

Rendement du séchage

Alginate

(5,6 ± 2,0)x1010

(1,6 ± 2,0)x1010

29 %

(3,7 ± 5,1)x108

2,2 %

Alginate-argile

(7,4 ± 0,7)x1010

(2,3 ± 0,2)x1010

31 %

(4,5 ± 0,5)x108

2,0 %

Alginate -amidon

(3,3 ± 1,4)x1010

(2,3 ± 0,2)x1010

90 %

(3,4 ± 2,3)x109

11,5 %

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type de ces répétitions).

108

IV. Résultats & Discussion

Les capsules d’alginate contiennent environ 97 % d’eau. En utilisant ce type de matrice, la protection des cellules au cours du séchage est assez faible. En effet, nous avons observé dans ce cas pour A. brasilense Sp245 une diminution du nombre de cellules vivantes de 2 unités logarithmiques.

Nous avons ajouté à la matrice d’encapsulation 7% d’argile, malgré l’augmentation de la concentration en matière sèche, nous avons observé que l'ajout d’argile ne permettait pas d'augmenter le rendement de la viabilité d’A. brasilense Sp245 durant le séchage. Finalement, on a travaillé avec un mélange de 3% d’alginate et 30% d’amidon de maïs. Cette matrice a été formulée par Ivanova (2006) dans son travail de thèse fait au sein de notre laboratoire.

D’autre part, il apparaît que la viabilité apparente des cellules diminue durant la fabrication des billes d'alginate-amidon à pH 4,9 mais cet effet n'apparaît pas si le pH est ajusté à 7,2. La perte apparente de viabilité à bas pH pour la souche A. brasilense Sp245 pourrait être due à un phénomène d'adhésion des cellules aux granules d’amidon comme il le sera démontré plus tard (Chapitre 3 de Résultats & Discussion).

La figure IV.4 présent de façon schématique, l’effet de l’adjonction d’amidon dans la matrice d’encapsulation.

Figure IV.4. L’augmentation de la concentration de la matière sèche par incorporation de l’amidon, dans la matrice d’encapsulation (Ivanova 2006).

109

IV. Résultats & Discussion

Les billes d’alginate ont été utilisées en agriculture pour encapsuler différents types de microorganismes, tels que Rhizobium japonicum (Jung et al. 1982) Azospirillum brasilense (Bashan et al 2002) et Bacillus subtilis (Young et al. 2006). L’alginate est le polymère le plus utilisé pour l’encapsulation des micro-organismes (Cassidy et al. 1996). Néanmoins, l’encapsulation d’A. brasilense dans une matrice d’alginate seule ne permet pas la protection des rhizobactéries vis-à-vis du procédé d’immobilisation, notamment dans la phase de séchage des capsules.

Les billes d'alginate ne constituent pas un engrais biologique satisfaisant, car leur taille est trop petite et de forme irrégulière. Il est donc primordial d'ajouter un adjuvant dans la matrice d’encapsulation. Dans la littérature, nous avons trouvé plusieurs types d'adjuvants, comme l’argile, composant naturel du sol (Vasudevan et al. 2002) et l’amidon de maïs (Ivanova 2006). Le principe a été d'incorporer un agent de remplissage, pour augmenter la matière sèche, améliorer la stabilité de l'inoculant bactérien et surtout réduire le coût et la durée du séchage.

Les capsules d'alginate-argile ne représentent pas une bonne solution pour une utilisation dans le domaine de l'agriculture en tant que bio-engrais. Cela est principalement dû au fait que l’argile ne fournit pas une protection efficace des cellules (seulement 2% de survie pour A. brasilense après séchage). L’utilisation d’une concentration supérieure à 7% d’argile pourrait donner de meilleurs résultats de viabilité, mais une augmentation de la viscosité de la matrice, ne permet pas la formation des billes d’alginate-argile de tailles homogènes et sphériques.

Nous avons également fabriqué des capsules d’alginate-amidon avec une forte teneur en matière sèche. L'amidon est un matériau de remplissage bien adapté, accessible et de surcroît peu onéreux pour la fabrication des capsules. En effet, l'amidon est l'un des biopolymères les plus employés dans l'industrie agroalimentaire (Hickman 1999).

Ainsi, une nouvelle matrice d’encapsulation contenant 33 % de matière sèche a été mise au point. L’utilisation de cette matrice destinée à la production d’un inoculum encapsulé dans des billes de taille importante (2,3 mm) permet d’obtenir un nombre significatif d’A. 110

IV. Résultats & Discussion

brasilense Sp245 (d’environ 2,7x106 UFC/capsule) ayant une durée de vie prolongée comme nous le verrons dans le chapitre suivant. La diminution du taux de mortalité cellulaire lors de l'encapsulation n'est pas un sujet scientifique simple. La survie des cellules dépend en effet de plusieurs facteurs : la composition des milieux de culture, l’espèce et la souche bactérienne et l'état physiologique des cellules (Paul et al. 1993). Chaque facteur doit être étudié afin d'assurer la meilleure activité de l'inoculant après séchage et pendant le stockage de celui-ci. En combinant ces facteurs, nous avons pu obtenir un inoculant déshydraté, avec une forte densité de bactéries immobilisées vivantes. L’adjonction d’amidon à la matrice d’encapsulation peut être utilisée aussi, comme une source de carbone par les rhizobactéries, ce qui favorise éventuellement leur développement dans le sol. Ce type de capsules pourrait permettre une libération progressive de ces dernières et une colonisation efficace de la rhizosphère du blé.

Le pH initial de la matrice d’encapsulation alginate-amidon a une valeur de 4,9. Nous avons choisi d'ajuster le pH final à 7,2, car nous avons observé une diminution du nombre des bactéries libres (bactéries non adhérées sur l’amidon), par effet d’un phénomène d’adhésion des rhizobactéries sur l’amidon à pH 4,9. Cet aspect sera traité en profondeur dans le chapitre 2 des résultats & discussion.

À partir de ce choix de matrice, nous avons cherché à étudier la survie de plusieurs espèces de rhizobactéries aux différentes étapes du procédé d’encapsulation. Cela nous permettra par la suite identifier les étapes critiques du procédé d’encapsulation et d’envisager des voies d’optimisation spécifiques à chaque espèce bactérienne.

1.2 Évolution du nombre de cellules vivantes à différentes étapes du procédé d'encapsulation L’encapsulation des rhizobactéries dans des billes d’alginate est la méthode la plus connue d’immobilisation cellulaire (Park et Chang 2000). Néanmoins, nous avons démontré dans le point précédent, que les billes ainsi formées contiennent un bas pourcentage de matière sèche initiale (5%) et que le taux de survie de la souche A. brasilense Sp245 a été seulement de 2,2% après séchage.

111

IV. Résultats & Discussion

Nous avons voulu vérifier le rendement du procédé d’encapsulation sur d’autres types de rhizobactéries et les comparer avec la souche A. brasilense. Les rhizobactéries utilisées ont été les suivants: Enterobacter ludwigii BNM 0357, Raoultella terrigena TFi08 et Bacillus pumilus C26. Elles ont donc été immobilisées dans les capsules et ont été séchées à l’étuve. Le tableau IV.5 montre l’évolution du nombre total des rhizobactéries à diverses étapes d’immobilisation.

Tableau IV.5. Taux de survie de différentes souches de rhizobactéries immobilisées dans des capsules d’alginate-amidon.

Souche

Culture initiale UFC total

Capsules sèches UFC total

Survie %

E. ludwigii

(2,78 ± 1,0)x1010

(1,24 ± 3,5)x107

0,04

R. terrigena

(2,50 ± 0,34)x1011

(1,10± 0,4)x1010

4,40

B. pumilus

(1,03± 0,30)x1011

(1,0± 0,5)x1010

10,0

(3,3 ± 1,4)x1010

(3,41 ± 2,3)*109

10,0

A. brasilense

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type de ces répétitions).

On observe que l’encapsulation d’E. ludwigii dans des capsules d’alginate-amidon ne permet pas de maintenir une forte viabilité durant tout le procédé d’encapsulation. Par contre, le taux de mortalité de R. terrigena, B. pumilus et A. brasilense varient entre 4 à 10 % de rendement selon les rhizobactéries. Les résultats montrent que les espèces B. pumilus et A. brasilense sont celles qui présentent la meilleure survie.

Le taux de survie de R. terrigena, B. pumilus et A. brasilense a été supérieur aux taux de survie des rhizobactéries immobilisées dans des capsules d’alginate trouvées dans la littérature. Ces travaux concernent les bactéries encapsulées A. brasilense Cd séchées à l’étuve (38°C) (Bashan et al. 2002). A. lipoferum séchées par flux d’air (Paul et al. 1993), et Pseudomonas aeruginosa (Cassidy et al. 1995). Dans tous ces travaux scientifiques, le taux de survie après séchage présentait une valeur inférieure à 1%.

112

IV. Résultats & Discussion

Cette différence de viabilité pourrait être liée à la concentration élevée en matière sèche dans la matrice, par rapport à la composition classique de la matrice d’encapsulation à base seulement d’alginate. Une autre explication à cette meilleure survie pourrait être due à la présence d’une source de carbone dans la matrice d’encapsulation.

Afin de mieux comprendre les phénomènes qui influencent le taux de survie final, nous avons mesuré la survie d’E. ludwigii, de B. pumilus, d’A. brasilense et de R. terrigena après les différentes étapes du procédé d’encapsulation, c'est-à-dire respectivement dans la culture initiale, dans la matrice d’encapsulation, dans les capsules humides et dans les capsules sèches. Les résultats présentés (figure IV.5) sont la moyenne et l’écart-type de la répétition de trois essais.

Figure IV.5. Évolution de la survie d’E.ludwigii au cours du procédé d’encapsulation.

On observe que l’encapsulation d’E. ludwigii dans des capsules d’alginate-amidon permet de maintenir une forte viabilité jusqu’à l’étape où les capsules sont humides. En revanche, le nombre de bactéries diminue notablement au cours de l’étape de séchage où l’on observe une chute de trois unités logarithmiques du taux de survie.

113

IV. Résultats & Discussion

Nous observons également que le nombre de cellules vivantes de R. terrigena est stable pendant l’étape d’encapsulation, mais diminue significativement durant l’étape de séchage avec une décroissance de plus d’une unité logarithmique du nombre de cellules vivantes comme le montre la figure IV.6.

Figure IV.6. Évolution de la survie de R. terrigena au cours du procédé d’encapsulation.

D’après la figure IV.7, on observe dans le cas de B. pumilus une faible diminution du nombre de cellules vivantes dans la phase d’encapsulation, principalement lors du passage en capsules humide. Le séchage entraîne également une diminution de viabilité de moins une unité logarithmique (10% de rendement final).

114

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.7. Évolution de la survie de B. pumilus au cours du procédé d’encapsulation.

Figure IV.8. Survie de l’A. brasilense dans les procédés d’encapsulation.

On observe que l’encapsulation d’A. brasilense dans des capsules d’alginate-amidon permet de maintenir une forte viabilité jusqu’à l’étape de séchage des capsules humides. En revanche, le nombre des bactéries diminue au cours de l’étape de séchage puisque d’après la figure IV.8, la survie chute d’environ une unité logarithmique.

115

IV. Résultats & Discussion

Plusieurs types de rhizobactéries ont été sélectionnés pour leurs aptitudes de stimulation de la croissance chez les végétaux. A. brasilense est le rhizobactérie modèle dans cette étude, car ses qualités de promotion de la croissance ont déjà été largement étudiées et démontrées (Fages 1994; Okon et Labandera-Gonzalez 1994; Fallik et Okon 1996; German et al. 2000; Kim et al. 2005). E. ludwigii est une nouvelle rhizobactéries récemment isolée du sol des climats tempérés pour ses effets d’augmentation de la croissance de Lolium perenne (ryegras) (Schoebitz et al. 2009). R. terrigena est une souche sélectionnée par notre partenaire autrichien (ARC) pour sa fixation biologique d’azote. B. pumilus a été isolée par notre partenaire chilien, pour sa production d’hormones et son aptitude à former des spores de résistance.

Si la sélection de ces rhizobactéries a été faite pour leurs capacités physiologiques à stimuler la croissance des plantes (intérêt agricole), nos résultats montrent que toutes les souches subissent une perte importante en cellules viables lors du séchage. Il a été montré par Paul et al. (1993) que la déshydratation d’A. lipoferum immobilisée en billes d’alginate pourrait avoir des effets préjudiciables sur l’état des cellules et inhiberait une partie de leurs processus physiologiques (fonctionnement des protéines et l’activité enzymatique) entraînant une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, lors du séchage les rhizobactéries sont soumises à un stress mécanique important. En effet, l'augmentation de la pression osmotique dans le milieu extracellulaire entraîne une sortie d’eau de la cellule due à l’osmose et provoque la plasmolyse. Cette dernière se matérialise par la rupture de la membrane plasmique (Mille et al. 2002).

Néanmoins, toutes les souches n’ont pas la même résistance aux stress subits pendant le procédé d’encapsulation et en particulier vis-à-vis du séchage. La survie de la souche E. ludwigii décroît de trois unités logarithmiques pendant la phase de séchage. Il semble donc que la bactérie E. ludwigii soit très sensible au stress hydrique, conséquence du séchage. Malgré son intérêt d’un point de vue physiologique, cette souche n’est pas adaptée au procédé de séchage, donc son potentiel d’utilisation pour la production de bioengrais est limité. Cette souche demanderait donc des recherches plus approfondies afin d’obtenir une production de capsules avec une forte densité en cellules vivantes qui seraient physiologiquement actives. 116

IV. Résultats & Discussion

Les bactéries A. brasilense et B. pumilus sont celles qui ont présenté la meilleure résistance au procédé de séchage. A. brasilense est capable de former des kystes et de produire une substance résistante: le PHB (poly-β-hydroxybutyrate) dans certaines conditions de stress hydrique et nutritionnel (Sadasivan et Neyra 1987; Neyra et al. 1999). Dans le sol où la disponibilité en carbone ou en azote est faible, l’accumulation de PHB est favorisée, augmentant ainsi la survie et la compétitivité d’A. brasilense (Kadouri et al. 2003). La production de kystes rend le genre Azospirillum plus résistant à la déshydratation, ce qui a été mis en évidence par le travail de Hubert (1991). La production des kystes pourrait donc être la cause de la meilleure résistance vis-à-vis du stress hydrique d’A. brasilense. Cette espèce bactérienne est donc plus adaptée au procédé de bioencapsulation et plus précisément au séchage.

Comme pour A. brasilense, nous avons obtenu un pourcentage final de viabilité de 10 % pour B. pumilus. La formation des spores chez le genre Bacillus, lui confère une forte résistance dans les conditions de stress, comme le séchage (Ivanova 2006). Ainsi, la formation de spores (observé après de 24 h de fermentation) pourrait expliquer la grande résistance aux diverses étapes du procédé observée avec cette bactérie.

Les résultats de survie varient fortement en fonction de la rhizobactérie utilisée. Tout particulièrement, une souche sporulante ou formatrice de kystes pourrait permettre d’obtenir un taux de survie plus élevé. Le fait que le taux de mortalité de cellules vivantes au cours d’un séchage dépend à la fois de l’espèce et la souche bactérienne ainsi que des conditions de séchage est largement reporté dans la littérature (Morgan et al. 2006). Il faut donc prendre en considération le type de rhizobactéries encapsulées et optimiser spécifiquement l’encapsulation de chaque souche bactérienne.

Ivanova (2006) a montré que la survie d’A. brasilense Sp245 à l’encapsulation est liée à la taille des capsules. Elle a montré que dans des capsules d’alginate-amidon de grande taille (3,5 mm), le taux de survie était de 36 % après séchage. Par contre, pour des capsules d’une taille de 2 mm, elle n’obtenait que 15 % de viabilité après séchage. Dans notre cas, nous avons observé 10 % de survie pour A. brasilense Sp245, après séchage dans des capsules d’alginate-amidon (2,3 mm). Nos résultats confirment donc ceux d’Ivanova (2006). La taille 117

IV. Résultats & Discussion

des capsules influence la vitesse de séchage et cela peut être la cause d’une meilleure survie pour de grandes capsules qui sèchent plus lentement. La vitesse de séchage des cellules vivantes a, en effet, un impact important sur leur survie (Paul et al. 1993). Le taux de survie dans les capsules pourrait donc également être optimisé en faisant varier les procédés et les paramètres de séchage (température, humidité relative). Une solution pour maintenir une forte densité de cellules vivantes serait de s’affranchir du séchage. C’est ce que nous avons fait dans le cadre de notre essai de production à l’échelle pilote (voir 1.4 des Résultats et Discussions). Dans ce cas, les capsules humides ont été incorporées dans le sol immédiatement après leur production. Cependant, les capsules humides présentent l’inconvénient majeur de ne pas pouvoir être stockées pendant de longues périodes sans perdre une grande partie de l’activité physiologique des rhizobactéries. Le niveau de séchage optimal sera étudié dans la partie IV.2.2.3. La partie 1.3 présente l’étape de stockage qui suit le procédé de séchage.

1.3 Évolution du nombre de cellules vivantes dans des billes sèche durant le stockage à 4 °C On a réalisé l’encapsulation d’A. brasilense Sp245 et de la R. terrigena TFi08 par suspension des cellules dans l'alginate-amidon de maïs. Après encapsulation, environ 10 g des capsules sèches ont été déposés dans des flacons en plastiques. Les flacons ont été installés à l'intérieur du réfrigérateur à une température moyenne de 4 °C.

L’évolution du nombre de cellules vivantes (par gramme de capsules) pour A. brasilense et R. terrigena au cours d’un stockage de 400 jours est présentée sur la figure IV.9.

118

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.9. Évolution de la concentration en cellules vivantes dans des capsules d’alginate-amidon pour A. brasilense (courbe bleue) et R. terrigena (courbe rouge) au cours d’un stockage à 4 °C.

Le nombre de cellules d’A. brasilense vivantes dans les billes d'alginate-amidon est demeuré constant à environ 109 UFC/g au cours de 400 jours de stockage à 4°C. Les capsules d'alginate et d'amidon permettent donc de protéger les cellules pendant le stockage et de maintenir un taux élevé et constant de survie d’A. brasilense durant plus d'un an de stockage.

Le nombre initial des cellules viables de R. terrigena présentes dans les capsules sèches était de 109 CFU/g, cette valeur a diminué d’une unité logarithmique après 100 jours de stockage. La valeur du taux de survie est restée constante, pour finalement diminuer de façon notoire et atteindre 106 CFU/g, après un an de stockage.

Le deux rhizobactéries testées ont montré un comportement complètement diffèrent vis-à-vis de la survie dans l’étape de stockage. La différence de survie entre les deux rhizobactéries après 400 jours de stockage a été de trois logs. La stabilité de la survie d’A. brasilense durant le stockage, pourrait être liée à la capacité de cette dernière à former des cellules enkystées, lors de l’apparition d’une période de stress hydrique.

119

IV. Résultats & Discussion

Nos résultats montrent que R. terrigena ne possède pas une bonne résistance aux conditions de stockage, en effet nous avons montré une diminution du nombre de cellules vivantes de trois unités logarithmiques après un an de stockage. Néanmoins, selon l’entreprise Nitragin, un des principaux producteurs d’inoculants biologiques dans le monde, l’efficacité d’un inoculum liquide d’A. brasilense est assurée jusqu’à une concentration de 1x108 UFC/ml (Nitragin 2010). Nous observons que nous assurons bien une concentration minimale de 1x108 UFC/g pour R. terrigena encapsulée dans des billes d’alginate-amidon pendant les 6 premiers mois de stockage à 4°C.

Par ailleurs, la FAO, l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture, a publié une norme pour la production de bioengrais à partir du genre Azospirillum (IS: 14806:2000) selon laquelle l’inoculum peut être stabilisé pendant une période maximale de 6 mois à une température entre 20 - 25 °C à condition que sa concentration en cellules vivantes soit de 1x107 UFC/g de support et qu’aucune contamination par d’autres micro-organismes soit détectable à une dilution de 105 (Tandon et Roy 2004).

Nos résultats montrent que le taux de survie de R. terrigena encapsulée, après 6 mois de stockage, est similaire au taux de viabilité recommandé par la société Nitragin pour assurer une bonne efficacité de l’inoculum et est supérieur aux exigences de la FAO. Néanmoins, ces recommandations concernent un autre genre bactérien et l’efficacité en champs doit être démontrée pour le rhizobactérie R. terrigena.

Dans notre étude, nous avons utilisé une température de stockage différente du protocole de la FAO puisque le stockage a été réalisé à 4°C. Bashan et al. (2002) ont étudié la survie d’A. brasilense durant le stockage. Ils ont mesuré la viabilité des bactéries dans des billes d’alginate sèches après 10 jours de stockage à 4 °C; la diminution de la viabilité a été de l’ordre de 4 unités logarithmiques. Ils ont aussi montré que l’addition d’osmo-protecteurs, tel que du lait écrémé a eu peu d’effet sur la viabilité d’A. brasilense, pendant le stockage. Ces résultats montrent que l’encapsulation à base d’alginate-amidon favorise la survie des bactéries. La taille des capsules et probablement la composition de la matrice jouent un rôle important dans la survie des cellules.

120

IV. Résultats & Discussion

Selon Cassidy et al. (1996) la perte de viabilité pourrait être liée à la lente pénétration de l’oxygène ou de la vapeur d’eau au sein des capsules. Nos capsules d’alginate-amidon ayant un diamètre de 2,3 mm supérieur au diamètre des capsules de Bashan et ses collaborateurs (0,3 mm), la diffusion de l'oxygène au coeur des capsules est donc réduite et limitée.

Ivanova (2006) a montré que la viabilité d’A. brasilense après 6 mois de stockage dans des capsules d’alginate-amidon sèches était peu différente entre un stockage à 4°C et un stockage à 20°C. En effet, elle a observé moins d’une unité logarithmique de différence dans les capsules stockées a 4°C.

Donc, la température de stockage ne semble pas avoir un impact important sur la diminution de la survie chez A. brasilense. Par contre, le niveau d’hydratation des capsules a un effet primordial sur le taux de survie. Si le séchage est une étape létale pour une partie des cellules, il permet cependant un stockage de longue durée des capsules avec une densité en cellules vivantes importante. Par la suite, nous avons cherché à optimiser le niveau de déshydratation qui permettait de minimiser les pertes cellulaires tout en assurant un bon niveau de survie des cellules au stockage (voir partie IV.2.2.3).

La partie suivante concerne la dernière étape de la caractérisation de la survie des rhizobactéries, il s’agit d’évaluer l’influence de l’échelle de production.

1.4 Influence de l’échelle de production Afin de permettre des essais en champs par deux des partenaires du projet Rhibac, nous avons réalisé une production à l’échelle pilote de capsules pour notre partenaire de l’Université Austral du Chili (UACH) et pour notre partenaire industriel d'Angleterre (Masstock). Les méthodes employées pour ces deux productions de capsules à grande échelle sont décrites dans la partie III.6.2 de Matériel et Méthodes. Nous reportons ici les résultats de densités en cellules vivantes obtenues pour différentes espèces bactériennes.

121

IV. Résultats & Discussion

1.4.1. Production des capsules pour l’UACH La production de la biomasse et l’immobilisation de 3 souches de rhizobactéries ont été mises en oeuvre pour satisfaire la demande de capsules pour les essais en champs de notre partenaire. Nous nous sommes déplacés à Valdivia, Chili pour produire environ 14 kg de capsules d’alginate humides pour une application immédiate sur le sillon de plantation des semences de blé (session de plantation septembre 2009).

Production de la biomasse

Différentes souches de rhizobactéries ont été utilisées: R. terrigena TFi08, B. pumilus C26, et P. fluorescens C139 (souches isolées en climat tempère). L’amorce de l’inoculum de R. terrigena a été fournie par l’Austrian Research Center, Vienne, Autriche (ARC) et le B. pumilus et P. fluorescens C139 ont été fournis par l’UACH sous la forme d’inoculum lyophilisé. Pour chaque type des rhizobactéries, une fermentation a été nécessaire pour produire la biomasse. La fermentation a été réalisée à l’UACH dans le fermenteur de type Biotron de 8 litres de capacité (III.5.2 de Matériels & Méthodes).

L’extrusion de la matrice d’alginate sur le système de dripping multi buses a permet de produire billes d’alginate avec une concentration élevée en rhizobactéries. Le système de dripping utilisé a été confectionné avec 40 buses d’acier inoxydable présentant un diamètre interne de 1,5 mm. Le diamètre des billes produit a été de 3 mm. Les capsules obtenues sont présentées sur la figure IV.10.

122

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.10. Capsules humides d’alginate d’un diamètre de 3 mm produit par dripping avec le système goutte à goutte « Multi buses ».

Les tableaux IV.6, 7, 8, et 9 montrent l’évolution du taux de survie bactérienne.

Tableau IV.6. Concentration en cellules vivantes à différentes étapes du procédé d’encapsulation pour la souche Bacillus pumilus C26

Culture

Matrice

Capsules humides

UFC/ml

4,0x109

6,1x1010

-

UFC/total

3,2x1013

5,0x1014

7,8x1015

UFC/g

-

-

1,51x1012

Tableau IV.7. Concentration en cellules vivantes à différentes étapes du procédé d’encapsulation pour souche P. fluorescens C139

123

IV. Résultats & Discussion

Culture

Matrice

Capsules humides

UFC/ml

1,69x1010

1,0x1010

-

UFC/total

1,4x1014

8,2x1013

3,5x1015

UFC/g

-

-

6,74x1011

Tableau IV.8. Concentration en cellules vivantes à différentes étapes du procédé d’encapsulation pour souche R. terrigena TFi08

Culture

Matrice

Capsules humides

UFC/ml

5,0x109

6,8x109

-

UFC/total

4,0x1013

5,6x1013

4,5x1014

UFC/g

-

-

8,75x1010

La masse moyenne de chaque capsule humide a été d'environ 14 mg, la production totale a été de 4,5 kg de capsules humides. La concentration des bactéries encapsulées par capsule et pour chaque souche a été dénombrée et est reportée dans le tableau IV.9.

Tableau IV.9. Concentration des rhizobactéries par capsule d’alginate

UFC/capsule

B. pumilus

P. fluorescens

R. terrigena

2,12x1010

9,71x109

1,26x109

D’après le tableau IV.9, nous obtenons par cette méthode une concentration en rhizobactéries très élevée pour les trois souches immobilisées. Avec cette concentration, une capsule est suffisante pour fournir un nombre de cellules vivantes optimal pour une semence de blé, car, la densité optimale d'Azospirillum pour promouvoir la croissance des plantes est de 105-106 UFC/plante pour le blé (Kapulnik et al. 1985) et 107 UFC/plante pour le maïs (Arsac et al. 1990). Il est à noter que des concentrations plus faibles de bactéries n’auraient aucun effet sur la croissance des plantes. À contrario, des densités plus élevées n’auraient pour but que de

124

IV. Résultats & Discussion

réduire la surface des racines; critère le plus discriminant pour évaluer les effets favorisant de l’inoculation des rhizobactéries (Fallik et al. 1994). En utilisant ce système d'encapsulation multi buses, nous avons obtenu des capsules d'alginate avec une forte concentration en micro-organismes allant jusqu'à 2,12x1010 UFC/capsule humide, avec une capacité de production de 780 g de capsules/h.

La différence entre la production des capsules dans le laboratoire et l'échelle pilote ont été la densité cellulaire, le rendement d’encapsulation et le temps de production. La fermentation des rhizobactéries dans le laboratoire (Erlenmeyer) a donné 3,0x109 UFC/ml et 5,0x109 UFC/ ml pour R. terrigena TFi08 et jusqu'à 1,7x1010 UFC/ml pour la souche P. fluorescens C139 à l’échelle pilote (fermenteur). Une production des cellules plus élevée a été obtenue, car nous avons contrôlé la température (30°C), le pH (7,0), le volume d’oxygène et l’agitation (350 tours/min), pendant toute la période de fermentation, alors que dans le cas de la production dans l’Erlenmeyer, seulement l’agitation et la température ont été régulées.

Une concentration plus élevée en rhizobactéries immobilisées a été obtenue à l’échelle pilote, car la quantité de cellules initiale a été plus élevée. Par ailleurs, le débit d’extrusion a été de 0,8 kg/h. La masse totale de la matrice par souche a donc été de 8 kg, avec un temps de production suffisant (10 h) pour permettre une croissance et augmenter encore le nombre de bactéries dans la matrice. Le temps d’extrusion à l'échelle de laboratoire, a été de moins de 30 min, temps assez réduit pour obtenir une croissance de bactéries durant le temps d’immobilisation des cellules.

Le passage d’une production de capsules humides à l’échelle laboratoire (30 g de matrice) à une production à échelle pilote (14 kg de matrice) présente plusieurs difficultés. Tout d’abord, la manipulation de grandes quantités de produits pour la fabrication du milieu de culture, ainsi que pour la production de la biomasse et la production de la matrice d’encapsulation exige des précautions particulières afin d’éviter toute contamination par d’autres microorganismes. Nous avons travaillé stérilement pendant le procédé de fermentation et nous avons utilisé un bec Bunsen dans l’étape de dripping, pour éliminer les contaminants microbiologiques. Le système de dripping réalisé en acier inoxydable a permis néanmoins un 125

IV. Résultats & Discussion

nettoyage facile de l'appareil pour empêcher le développement et l’accumulation des microorganismes dans le système de production.

L’extrusion de la matrice d’alginate sur le système de dripping multi buses a permis de produire 0,8 kg/h de billes humides d’alginate avec une concentration élevée en rhizobactéries (109-1010 UFC/capsule). D’autre part, il est possible d’améliorer encore la capacité de production des capsules grâce à une augmentation du nombre de buses. Nous pouvons également utiliser des buses avec un diamètre interne de 2-3 mm pour obtenir des billes d’une taille de 4-6 mm, ce qui correspond à la taille moyenne des semences de blé. En utilisant des billes de cette taille, l’ensemencement peut être réalisé simultanément avec la plantation de semences à l’aide du semoir.

Nous avons choisi de produire des billes humides car celles-ci ont été déposées dans le sol le jour suivant la production. Cependant, ces billes ne peuvent être stockées pour une période supérieure à 3-4 semaines. Toutefois, nous savons que le séchage des billes aurait fortement diminué le taux de survie des rhizobactéries donc l’utilisation des billes humides a permis d’inoculer le sol avec une concentration très élevée de 1,5x1012 UFC/g.

Actuellement, les entreprises qui produisent des inoculants biologiques d’Azospirillum utilisent principalement des inoculants liquides. L’utilisation de la microencapsulation comme technique de production de bioengrais n’est pas couramment utilisée. Le coût de production de 1 kg de capsules sèches d’alginate-amidon est de 2,1 euros (Ivanova, 2006). Pour l’inoculation des capsules (106 UFC/semence) dans le champ, il est nécessaire d’utiliser environ 60 kg de capsules (126 €/ha). En comparaison, le coût d’un inoculant liquide est d’environ 3 €/ha, mais avec une très faible concentration de 104 UFC/semence, avec un augmentation du rendement de graines du blé de 7 % selon les informations du produit « Bonus » de l'entreprise Nitragin à base d’A. brasilense destiné à la culture de blé (Nitragin 2010). Néanmoins, si on produit des capsules pour inoculer les graines avec une concentration de 104 UFC/semence, le prix de capsules sera de 1,26 €/ha, coût qui est moins cher que les inoculants liquides proposés par Nitragin.

126

IV. Résultats & Discussion

L’utilisation de l’encapsulation des rhizobactéries pourrait apporter aux agricultures des avantages non négligeables :

- Une concentration élevée en rhizobactéries inoculées pour chaque graine. - Une manutention plus aisée des inoculants. - Une protection des rhizobactéries dans le sol. - Une libération progressive des bactéries dans le sol.

Les résultats des effets sur la croissance de la culture de blé en plein champ obtenu avec ces capsules seront présentés dans le dernier paragraphe de la partie résultats et discussions. La partie qui suit présente la deuxième réalisation de capsules de rhizobactéries pour notre partenaire industriel Masstock.

1.4.2. Production de capsules sèches d’alginate-amidon pour le partenaire industriel Masstock. Nous avons fabriqué des capsules d’alginate-amidon de la souche Bacillus pumilus C26 à l’échelle pilote au sein de notre laboratoire à ONIRIS et dans la halle technologique du même établissement. Afin de permettre des essais d’inoculation de rhizobactéries en plein champ, nous avons produit des bactéries encapsulées que nous avons envoyées à notre partenaire industriel du projet Rhibac en Angleterre (voir chapitre III.5.2).

a) Séchage sur lit fluidisé Les billes ont été sèches à l’aide du lit fluidisé de grande capacité (10 kg des capsules) situé au hall technologique de l’ONIRIS de Nantes (figure III.14). Néanmoins, l’humidité de l’air n’a pas été contrôlée comme les essais de séchage dans le lit fluidisé de 0,5 kg de capacité (chapitre IV. 2.2.3). Les résultats obtenus pour le séchage des capsules par lit fluidisé sont donnés dans le tableau IV.10.

127

IV. Résultats & Discussion

Tableau IV.10. Évolution de la température, teneur en eau, activité de l’eau (l’Aw) et du taux de viabilité au cours de séchage.

Temps séchage (min)

T°C

Teneur en eau %

Aw

Viabilité UFC/g MS

0

16

65

1,00

1,48x108

15

16

48

0,98

2,84x108

25

23

28

0,94

2,34x108

35

25

19

0,80

0,00E+00

45

25

13

0,45

0,00E+00

55

25

12

0,37

0,00E+00

65

24

13

0,35

0,00E+00

75

24

12

0,25

0,00E+00

La température initiale de séchage est de 16 °C et au fur et à mesure que les capsules sèchent la température monte jusqu’à 25 °C à l’intérieur du lit. Puis, la température diminue jusqu’à 24°C, lorsque les capsules ont été séchées (12-13 % de teneur en eau). La vitesse de séchage est ici très rapide par rapport au séchage en couches minces à l’étuve utilisée à échelle du laboratoire. En effet, une grande partie de l’eau libre des capsules est perdue durant les 35 premières minutes de séchage. Après qu’une grande partie de l’eau libre ait été entraînée, c’est l’eau liée des capsules qui est lentement entraînée vers l’extérieur pendant les 40 dernières minutes du séchage. Après l’évaporation de l’eau libre l’activité de l’eau a été de 0,8, valeur trop élevée pour stocker les capsules durant une période supérieure à 6 semaines (voir partie IV.2.2.3). Pour arriver à obtenir une valeur d’Aw de 0,25 et ainsi permettre d'assurer un stockage de longue durée (Faiveley 2009), il faut 75 minutes de séchage (tableau IV.10).

Néanmoins, il s’avère que le séchage rapide et efficace des capsules ne permet pas de préserver un nombre de cellules vivantes important, puisqu’après 25 minutes de séchage, aucune bactérie vivante n’était détectée dans les capsules.

128

IV. Résultats & Discussion

Nous avons donc cherché une méthode de séchage plus douce qui permettait le traitement de grandes quantités de capsules. Le choix s’est porté sur le séchage en couche mince à l’étuve.

b) Séchage à l’étuve

Au cours du séchage en couches minces à l’étuve, les capsules de la surface de la claie ont été les premières à être séchées. Après 72 h., l'ensemble des capsules sont sèches avec une teneur en l’eau et un Aw compatibles avec un stockage de longue durée. Ce séchage est moins homogène que le précédent, mais permet néanmoins d’assurer le maintien d’une concentration bactérienne élevée par gramme de capsules. En effet, le séchage lent de la souche B. pumilus à l’étuve a même permis une augmentation du nombre total de bactéries de 159% par rapport au nombre de bactéries comptabilisées dans le milieu de culture (8,2x1012 UFC/total). Nous avons obtenu un augmentation du nombre de B. pumilus, car nous avons ajouté 1 l du lait écrémé au 9 l de milieu de culture YEP. Les capsules ont été formées en mélangeant le milieu de culture, l’alginate et l’amidon. Donc, la présence des nutriments dans la capsules et une conditions de température de 30°C a permis la croissance de bactéries dans les capsules pendant le procédé de séchage.

La production des rhizobactéries encapsulées à échelle pilote n’est pas un sujet simple, car un équipement « ad hoc » doit être requis pour la production d’une grande quantité de biomasse. Malgré les difficultés que nous avons pour produire la biomasse des rhizobactéries, nous nous sommes équipés d’une bonbonne en plastique pour faire la fermentation de la souche B. pumilus. La concentration des bactéries finale a été de 109 UFC/ml. L'agitation irrégulière produite par le barreau magnétique à l'intérieur de la bonbonne a été un frein pour obtenir une concentration bactérienne plus élevée.

Nous avons séché les capsules en utilisant le lit fluidisé et l’étuve. Toutes les bactéries étaient mortes après de 35 minutes de séchage en lit fluidisé. La température de séchage maximale a été de 33 °C. Cette température pourrait être la cause de la chute du taux de survie des rhizobactéries, car B. pumilus est une rhizobactérie résistante aux températures élevées. En effet, le genre Bacillus est capable de former des spores de résistance lorsque la température

129

IV. Résultats & Discussion

augmente (Dworkin et al. 2006). Mais, si le temps de séchage est réduit (35 min) les bactéries ne sont pas capables de former des spores de résistance pendant le procédé de séchage.

La vitesse du séchage peut être la cause aussi de la diminution de la viabilité cellulaire. Nous avons observé une diminution trop accélérée du pourcentage de la teneur en eau des capsules. La diminution d’une grande quantité d’eau libre en moins de 30 minutes a été trop agressive pour l’obtention d’une stabilisation des bactéries pendant l’opération de séchage. Selon la revue bibliographique sur l’immobilisation des bactéries de Cassidy et al. (1996), un grand nombre de bactéries immobilisées est placé à la surface des billes, car la diffusion de l’oxygène à l'intérieur des billes est trop limitée. Si c’est le cas, une grande partie des bactéries ne sont pas protégées et elles sont susceptibles d’être soumises directement au flux d’air de séchage. Une diminution de la vitesse de séchage pourrait garantir le maintien de l'intégrité des rhizobactéries.

Le séchage à l’étuve a été fait sous des conditions moins agressives pour les bactéries. La température de séchage à 35 °C a permis la multiplication des bactéries B. pumilus durant cette étape. La durée de l’opération et la consommation d'énergie ont été le principal inconvénient de cette méthode, car pour l’obtention des 4 kg de capsules sèches, la période de séchage a été de 72 h. Un autre inconvénient a été l’homogénéité du séchage des capsules. Seulement les capsules de la surface de la claie de séchage ont été sèches après 24 h. Un mélange manuel à l’aide d’une spatule a été nécessaire pour sécher l'ensemble des capsules. Le séchage des capsules à l’échelle pilote a permis une concentration finale des bactéries de 2,9x109 UFC/g suffisante pour l’inoculation des semences de blé. Néanmoins, le séchage à l’étuve a plusieurs types d’inconvénients, tels que l'hétérogénéité de séchage, la durée de temps de séchage et une capacité de séchage limitée en terme de masse de capsules par batch. Il y a également un risque important de contamination par d’autres germes étant donné la longueur et la température de cette étape.

En choisissant les matériaux de base les moins onéreux, le coût de production de ces capsules pourrait être abordable pour leur utilisation dans l’amendement des sols. L’application des capsules dans les champs peut être réalisée simultanément avec l’épandage des semences à l’aide de matériels couramment employés dans l’agriculture. 130

IV. Résultats & Discussion

L’inoculum bactérien immobilisé à l'aide de cette méthode présente un potentiel prometteur pour une agriculture utilisant un minimum de produits chimiques. Cette étude mérite toutefois d’être poursuivie pour améliorer encore la survie cellulaire durant l’encapsulation, mais également pendant la période de stockage. Le choix des matériaux constituant la matrice peut être encore optimisé.

Nous avons étudié l’évolution du nombre de cellules vivantes de 4 rhizobactéries à chaque étape du procédé de bioencapsulation. L’encapsulation d’E. ludwigii, de R. terrigena, de B. pumilus, et d’A. brasilense dans des capsules alginate-amidon permet de maintenir une forte viabilité. En revanche, au cours de l’étape de séchage, le nombre de bactéries vivantes diminue pour toutes les souches testées. Cette diminution de viabilité montre que l’évolution de la survie des bactéries durant la phase d’immobilisation dépend de chaque souche de rhizobactérie. Certaines bactéries présentent un rendement de 10% de survie (A. brasilense et B. pumilus) et d’autres présentent un très faible taux de survie final comme E. ludwigii (0,04%). Au cours de cet essai, nous avons observé que le séchage constituait l'étape la plus critique du procédé d'encapsulation en ce qui concerne la survie cellulaire.

L’étape de stockage est très délicate pour R. terrigena, par contre pour A. brasilense on peut obtenir un taux de 86% de survie après 400 jours. La production à grande échelle a permis d’obtenir un débit de 0,8 kg/h de matrice et une concentration très élevée de bactéries immobilisées.

Par la suite, nous allons tester différentes stratégies permettant d’améliorer la survie des bactéries au procédé d’encapsulation. Cela passera à la fois par la modulation de l’état physiologique des cellules au moment de l’encapsulation et par le procédé d’encapsulation en lui-même. L’objectif visé est d’améliorer la protection des cellules au cours du séchage.

131

IV. Résultats & Discussion

2. Optimisation de la survie des rhizobactéries au procédé dʼencapsulation Nous avons démontré que le procédé de séchage est l’étape la plus critique de l’immobilisation des bactéries. En effet, le taux de survie diminue de plus d’une unité logarithmique pour les 4 souches de rhizobactéries testées.

Nous avons cherché à améliorer le taux de survie des bactéries au séchage en travaillant sur la physiologie des bactéries. Pour cette étude, nous avons choisi de travailler spécifiquement avec les rhizobactéries A. brasilense et R. terrigena. Ces deux souches appartiennent aux bactéries modèles sélectionnées dans le cadre du projet Rhibac.

2.1 Optimisation par la modulation de l’état physiologique des bactéries Afin d’augmenter le taux de survie au procédé d’encapsulation, nous avons étudié le taux de mortalité des souches A. brasilense Sp245 et R. terrigena TFi08 en fonction de leur protection pendant le séchage.

2.1.1 L’influence de la phase de croissance sur la survie des cellules pendant l’opération de séchage à l’étuve. Nous avons récolté les bactéries en phase exponentielle (12 h) ou en phase stationnaire de croissance (24 h) et nous avons mesuré l’évolution du nombre de bactéries vivantes au cours du procédé d’encapsulation.

La production de la biomasse d’A. brasilense et R. terrigena a été réalisée dans l’Erlenmeyer contenant 30 ml de milieu de culture YEP. Pour chaque souche, deux périodes de fermentation ont été nécessaires: 12 h pour les bactéries en phase de croissance logarithmique et 24 h pour celles en phase de croissance stationnaire.

132

IV. Résultats & Discussion

Tableau IV.11. Nombre de cellules vivantes d’A. brasilense et R. terrigena immobilisées dans des capsules d’alginate-amidon.

Type de capsules

Culture initiale CFU total

A.brasilense logarithmique

(1,3 ± 0,3)x1010

A.brasilense stationnaire

(3,3 ± 1,4)x1010

R. terrigena logarithmique

(4,3 ± 1,3)x1011

R. terrigena stationnaire

(2,5± 0,3)x1011

Billes humides CFU total

Rendement d'encapsulation

(3,0 ± 4,0)x109

22,2 %

(2,3 ± 0,2)x1010

90,0 %

(1,9 ± 0,6)x1011

(2,0± 0,3)x1011

43,8 %

78,4 %

Billes sèches CFU total (3,7 ± 0,5)x107

(3,4 ± 2,3)x109

(2,6± 0,4)x1010

(1,1 ± 0,4)x1010

Rendement du séchage

1,2 % b

11,5 % a

14 % b

5,4 % b

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type de ses répétitions).

D’après le tableau IV.11 nous observons un fort rendement d’encapsulation pour les deux souches testées à l’état stationnaire (entre 78 et 90 %) et un faible rendement d’encapsulation à l’état logarithmique. La viabilité d’A. brasilense en état logarithmique chute après séchage d’environ 2 unités logarithmiques. En revanche, les cellules en état stationnaire ont été plus résistantes à l’étape de séchage. En effet, le nombre de cellules vivantes diminue seulement d’une unité logarithmique pour A. brasilense en phase stationnaire croissance. Selon le test statistique de Cochran (p<0,05) il existe différences significatives entre l’encapsulation d’A. brasilense en phase logarithmique par rapport à la phase exponentielle.

Les résultats obtenus avec la souche R. terrigena sont très différents, en ce qui concerne le rendement du séchage. Pour cette souche, nous observons un fort taux de viabilité pour les cellules récoltées en phase logarithmique de croissance. Par contre, R. terrigena récoltée en phase stationnaire voit sa survie diminuée d’une unité logarithmique après séchage. Néanmoins, nous n’avons pas observé différences statistiques significatives, selon le test de Cochran (p<0,05).

133

IV. Résultats & Discussion

Nous avons constaté que l’étape physiologique optimale pour le séchage des rhizobactéries dépend de chaque rhizobactéries. A. brasilense a montré 11,5% de rendement du séchage, par contre R. terrigena a montré 14% de rendement en phase logarithmique. Il est couramment admis que la phase de croissance optimale aux contraintes hydriques est liée essentiellement au micro-organisme. Néanmoins, de nombreux travaux montrent que les bactéries en phase stationnaire sont plus résistantes à la déshydratation, que les mêmes cellules pendant la phase exponentielle (Vriezen et al. 2006).

A. brasilense est capable de produire en phase stationnaire des niveaux élevés de polyhydroxyalcanoates (PHA) (Kadouri et al. 2003). Ces composés de stockage du carbone produits à l'intérieur de la cellule, pourraient améliorer la survie bactérienne aux stress hydriques et nutritionnels. La production de ces composés de stockage interne pourrait expliquer l’augmentation du taux de viabilité.

Dans le cas de R. terrigena TFi08, ses caractéristiques physiologiques sont peu connues, car c’est une bactérie dont les propriétés de promotion de la croissance des plantes n’ont été mises en évidence et isolées que très récemment par ECOWORK situé à Vienne, en Autriche (Institut partenaire dans le projet européen MICRO-N-FIX, projet précédent à RHIBAC). Néanmoins, la bactérie R. terrigena est capable de produire des exopolysaccharides (Leone et al. 2007). Les polysaccharides peuvent soit être excrétés dans le milieu environnant, soit rester liés à la surface de la cellule. Le rôle des exopolysaccharides le plus souvent proposé est la protection de la cellule vis-à-vis de son environnement. La capacité de s'enrober dans une couche d'EPS avec une forte teneur en eau la rend plus résistante à la dessiccation. Mais, le travail de Leone et al. (2007) ne spécifie pas les conditions qui permettent une production maximale des dits polysaccharides, qui pourrait expliquer le taux élevé de rendement du séchage en phase logarithmique. Des études plus précises seront nécessaires pour comprendre le comportement de la souche R. terrigena vis-à-vis du procédé de séchage.

La connaissance de la phase de croissance optimale de chaque rhizobactérie encapsulée par rapport aux contraintes hydriques, présente un important potentiel pour permettre la diminution du taux de mortalité des cellules durant le procédé d’immobilisation cellulaire.

134

IV. Résultats & Discussion

2.1.2 Influence de l'adjonction d’osmo-protecteurs dans le milieu de culture La protection des rhizobactéries pendant le séchage est la partie la plus sensible du procédé d’encapsulation. C'est pourquoi nous avons ajouté des substances osmo-protectrices dans le milieu de culture des bactéries. Le principe a été de protéger la membrane des cellules à partir de l’étape de la fermentation des bactéries.

Certains sucres sont connus pour leurs effets protecteurs sur de nombreuses espèces bactériennes, telles que Rhizobium et Bradyrhizobium (Streeter 1985; 2007). Les molécules principalement concernées sont des glucides, comme le fructose et le tréhalose (Morgan et al. 2006). C'est pourquoi ces deux glucides ont été testés en tant que molécules osmoprotectrices.

Le milieu YEP (yeast extract peptone) a ainsi été enrichi avec 3 mmol L-1 de tréhalose ou 3 mmol L-1 de fructose. Le but était de comparer le taux de survie des cellules cultivées en milieu standard YEP avec ou sans osmo-protecteurs dans les capsules sèches. Les résultats sont présentés dans les tableaux IV.12 et IV.13.

Tableau IV.12. L’influence de l'addition du tréhalose et du fructose dans le milieu de culture sur la viabilité d’A. brasilense Sp245.

Type de capsules Culture initiale CFU total

Billes humides CFU total

Rendement d'encapsulation

Billes sèches CFU total

Rendement du séchage

A.brasilense YEP

(3,3 ± 1,4)x1010

(2,3± 0,2)x1010

90,0 %

(3,4 ± 2,3)x109

11,5 % a

A.brasilense YEP + fructose

(2,7± 0,6)x1010

(7,9 ± 5,8)x109

28,7 %

(1,1 ± 5,1)x108

14,1 % a

A. brasilense YEP + tréhalose

(5,2± 0,4)x1010

(2,9± 0,5)x1010

55,3 %

(6,5 ± 1,6)x109

22,6 % a

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type de ces répétitions).

135

IV. Résultats & Discussion

On a observé que l'adjonction de fructose et de tréhalose dans le milieu de culture initial permet l’augmentation du taux survie. L’utilisation des sucres dans le milieu de culture suppose une protection des bactéries. Dans le milieu standard, le taux de survie au séchage a été de 11,5%. En utilisant le milieu de culture additionné de fructose, le rendement a augmenté jusqu’à 14%. Le résultat le plus probant est le rendement du séchage de la souche A. brasilense qui est deux fois supérieur à celui obtenu avec le milieu standard, lorsqu’on utilise le tréhalose comme molécule d’osmo-protection. Néanmoins, nous n’avons pas observé différences statistiques significatives, selon le test de Cochran (p<0,05).

Tableau IV.13. Influence de l'addition du tréhalose et du fructose dans le milieu de culture sur la viabilité de R. terrigena TFi08.

Type de capsules

Culture initiale CFU total

Billes humides CFU total

Rendement d'encapsulation

Billes sèches CFU total

Rendement du séchage

R. terrigena YEP

(2,5± 0,3)x1011

(2,0± 0,3)*1011

78,4 %

(1,1 ± 0,4)x1010

5,4 % b

R. terrigena YEP+fructose

(1,3 ± 0,2)x1011

(6,4 ± 0,8)x1010

47,8 %

(8,9 ± 3,9)x109

13,9 % b

R. terrigena YEP+tréhalose

(8,4± 0,2)x1011

(2,1 ± 0,4)x1011

24,3 %

(4,2 ± 5,7)x1010

20,4 % a

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type de ces répétitions).

Dans le cas de la souche R. terrigena, l’effet est similaire, car l’effet de l’adjonction des sucres a augmenté le rendement du séchage jusqu’à 14% en utilisant le fructose et jusqu’à 20% avec le tréhalose. Selon le test statistique de Cochran (p<0,05) il existe différences significatives entre l’encapsulation de R. terrigena dans le milieu de culture+tréhalose par rapport à YEP standard et YEP+ fructose.

Nos résultats nous montrent que le taux de survie bactérien chute après le séchage, raison pour laquelle, nous avons choisi comme stratégie la protection des bactéries depuis l’étape de fermentation, afin d’assurer une protection des rhizobactéries tout au long du procédé 136

IV. Résultats & Discussion

d’encapsulation. L’adjonction des sucres a été formulée par de nombreux chercheurs comme une méthode de protection de la membrane interne des bactéries (Caesar et Burr 1991; Crowe et al. 1998; Streeter 2003). L’utilisation des sucres pour protéger les bactéries des contraintes dues aux procédés de séchage pour la production des inoculants biologiques a été étudiée par Streeter (1985).

Le principe consiste à ajouter des sucres cumulables dans le cytoplasme, que les bactéries ne peuvent pas dégrader, par leur batterie enzymatique. Ceci est le cas du tréhalose, ce sucre ne se dégrade pas, donc il reste dans la partie intérieure des cellules d’A. brasilense et de la R. terrigena. Lorsque le séchage des bactéries a été effectué, le tréhalose protège la membrane cellulaire d’une dessiccation. En effet, la perméabilisation de la membrane pourrait être ainsi évitée (Streeter 1985).

Dans cette étude, le rendement le plus élevé a été obtenu en utilisant du tréhalose ajouté dans le milieu de culture en tant qu’osmo-protecteur. Nous obtenons plus de 20% de rendement après séchage pour A. brasilense et R. terrigena. Les deux souches ne sont pas capables de dégrader le tréhalose en tant que source de carbone et d’énergie. Donc, nous supposons que le stockage de tréhalose à l'intérieur des cellules pourrait contribuer à la stabilisation de la membrane pendant la dessiccation.

Nous avons ajouté également, le fructose en tant que substance d’osmo-protection. Le taux de survie d’A. brasilense et de R. terrigena, après séchage a été d’environ 14%. L’utilisation de fructose a permis une légère ’augmentation de la survie des rhizobactéries. Néanmoins, cette protection n’a pas été significative, car A. brasilense et R. terrigena sont toutes les deux capables d’utiliser le fructose en tant que source de carbone et d’énergie (Krieg et Döbereiner, 1984).

Dans la suite de l’étude, nous nous sommes aussi intéressés à l’utilisation de glycérol incorporé dans la matrice d’encapsulation, car le glycérol permet de diminuer la microporosité des billes d’alginate-amidon et par conséquent d'augmenter la protection des rhizobactéries pendant le séchage.

137

IV. Résultats & Discussion

2.2 Optimisation par la modulation des paramètres du procédé d’encapsulation 2.2.1 Influence de l'adjonction de glycérol dans la matrice d’encapsulation

Nous avons essentiellement utilisé dans cet essai la souche R. terrigena TFi08. Le principe a été d’utiliser le glycérol en tant que molécule osmo-protectrice pour augmenter la protection des rhizobactéries pendant le séchage.

La matrice d’encapsulation a été faite avec la recette classique alginate-amidon. Nous avons ajouté 10 ml glycérol avec une concentration de 40 % dans 90 ml de matrice d’encapsulation d’alginate-amidon. Ensuite, nous avons séché les capsules à l’étuve à 35 °C pendant 24 h. Le prochain tableau montre les résultats de survie de la souche R. terrigena à l’encapsulation, dans une matrice d’alginate-amidon et d’alginate-amidon-glycérol.

Tableau IV.14. Taux de survie de R. terrigena (UFC total) immobilisé dans des capsules d’alginate-amidon et l’alginate-glycérol-amidon.

Composition

Culture

Capsules humides

Rendement Capsules sèches d’encapsulation

Rendement de séchage

alginate-amidon

2,52x1011

1,98x1011

78,6 %

1,07x1010

4,2 %

alginate-glycérolamidon

7,10x1010

3,70x1010

52,1 %

1,40x1010

19,7 %

Nous avons pu constater que l’adjonction de glycérol à la matrice d’encapsulation a permis d’augmenter cinq fois le rendement de la viabilité de la souche R. terrigena au séchage.

Le glycérol pourrait augmenter la matière sèche des capsules et permettrait de remplir les pores des capsules. Ce remplissage des pores pourrait protéger les rhizobactéries durant la contraction des capsules pendant le procédé de séchage. La dessiccation engendre la contraction membranaire pouvant entraîner la plasmolyse chez les organismes qui ont une paroi rigide comme les bactéries Gram négatif (Mille et al. 2002), tel que R. terrigena. Le

138

IV. Résultats & Discussion

glycérol pourrait intervenir également comme un agent de charge qui espace les cellules et renforce la protection de la membrane cellulaire pendant le séchage.

Cette expérience a été faite à la fin du travail de thèse, raison pour laquelle nous n’avons pu continuer avec cette formulation, malgré un rendement de 20 % sur le taux de survie de R. terrigena au séchage.

Le coût actuel du glycérol est peu onéreux ce qui le rendrait compatible pour une application dans le domaine industriel en tant que bioengrais pour une agriculture durable et respectueuse de l'environnement.

La partie qui suit présente l’influence d’un changement du sel de calcium, utilisé durant le procédé de gélification de billes. 2.2.2 Modification du sel de calcium utilisé pour la gélification de l’alginate L'agent de gélification des capsules d’alginate le plus couramment employé a été le CaCl2. En revanche, l’utilisation du gluconate de calcium, qui n’a pas encore été testé, pourrait agir à la fois comme un agent gélifiant et aussi en tant qu’osmo-protectant.

L'utilisation du CaCl2 (0,1 M) et du gluconate de calcium (0,1 M) comme source du Ca2+ a été employée dans le procédé de gélification des billes d’alginate-amidon. Le tableau IV.15, montre les résultats du dénombrement d’A. brasilense et de R. terrigena encapsulées dans des billes d’alginate-amidon.

139

IV. Résultats & Discussion

Tableau IV.15. L’influence de la source de calcium sur la viabilité de l’A. brasilense et R. terrigena.

Type de capsules

Culture initiale CFU total

Billes humides CFU total

Rendement d'encapsulation

Billes sèches CFU total

Rendement du séchage

A.brasilense CaCl2

(3,3 ± 1,4)x1010

(2,3 ± 0,2)x1010

90,0 %

(3,4 ± 2,3)x109

11,5 % a

A.brasilense Gluconate Ca

(2,8± 0,1)x1010

(7,7 ± 0,4)x109

R. terrigena CaCl2

(2,5± 0,3)x1011

(2,0± 0,3)x1011

R. terrigena Gluconate Ca

(2,7 ± 0,1)x1011

(2,0± 0,4)x1011

28,0 %

(6,5± 0,8)x106

0,08 % b

78,4 %

(1,1± 0,4)x1010

5,4 % a

75,8 %

(8,4 ± 2,9)*1010

40,9 % a

(Cette expérience a été répétée trois fois, les données de ce tableau sont la moyenne et l’écart-type de ces répétitions).

Les résultats du dénombrement initial d’A. brasilense du milieu de culture a donné la valeur de 2,8x1010 UFC total. Le nombre de cellules revivifiables a diminué après le séchage à 6,5 x106 UFC total, ce qui représente un rendement de 0,08%. Cette valeur est significativement plus faible que celle obtenue lors de l'utilisation du CaCl2 (agent traditionnel de gélification des billes de l’alginate). En revanche, la souche R. terrigena a montré un taux de survie élevé en utilisant le gluconate de calcium en tant qu’agent de gélification. Selon le test statistique de Cochran (p<0,05) il existe différences significatives entre l’utilisation de CaCl2 et gluconate de Ca pour l’encapsulation d’A. brasilense. Néanmoins, nous n’avons pas observé différences statistiques significatives en utilisant différente source de Ca pour l’encapsulation de R. terrigena.

L'utilisation de gluconate de calcium en tant qu'agent gélifiant n’a eu aucun effet négatif sur la survie d’A. brasilense dans les étapes du procédé d'encapsulation de formation des billes d’alginate et de séchage de ces billes.

140

IV. Résultats & Discussion

La diminution de la viabilité chez A. brasilense a été surprenante, car la viabilité a chuté de 3 unités logarithmiques. Le gluconate de calcium est utilisé dans l’industrie agroalimentaire, en tant que régulateur d’acidité. Le pH optimal de croissance d’A. brasilense est compris entre 6,0 et 7,8 (Krieg et Döbereiner 1984). Notre hypothèse est que la rhizobactérie A. brasilense n’est pas très résistante au changement de pH. Nous supposons que l’étape de formation des capsules, dans laquelle ces dernières rentrent en contact avec la solution de gluconate, pendant plus de 30 min, pourrait diminuer la survie des bactéries. Donc, l’utilisation de ce sel de calcium pourrait avoir des effets nocifs sur la viabilité d’A. brasilense.

Dans le travail de Bashan et al. (2002) sur l’encapsulation d’A. brasilense Cd, il est observé que l’étape de gélification de l’alginate de calcium entraîne la mortalité d’une partie des cellules d’A. brasilense. Ces auteurs font l’hypothèse que la formation d'un ou de plusieurs réseaux par voie ionique, pourrait affecter négativement la viabilité des rhizobactéries. Cependant, le pH de travail n’est pas précisé dans cette étude et l’utilisation d’une matrice acide pourrait être la cause de ces observations.

L'utilisation du gluconate de calcium est préjudiciable à la survie d’A. brasilense, entre les étapes de formation des billes jusqu’à l’étape de séchage. Ce résultat confirme le fait que l'utilisation d'un gélifiant comme agent de protection cellulaire dépend de chaque microorganisme et il doit être évalué individuellement pour chaque cas.

En revanche, les résultats pour R. terrigena immobilisée dans un support gélifié avec du gluconate de calcium ont montré une augmentation du rendement. Le dénombrement initial des cellules du milieu de culture a présenté la valeur de 2,7x1011 UFC total, qui a chuté après séchage à une valeur de 8,4x1010 UFC total, ce que représente un rendement de 41% de viabilité cellulaire. Ce résultat et significativement plus élevé que celui du rendement obtenu lors de l'utilisation du CaCl2.

Le gluconate de calcium pourrait donc être utilisé comme un agent gélifiant et osmo protectrice, car il fournit une protection efficace pour certaines rhizobactéries, tel que la R. terrigena.

141

IV. Résultats & Discussion

Par la suite, l’objectif a été de proposer une solution adéquate pour optimiser la survie des rhizobactéries durant l’étape de stockage.

2.2.3 Modulation du niveau de séchage et stockage des capsules Nous avons immobilisé la souche de B. pumilus C26 dans une matrice d’alginate-amidon, donc le principe de production a été décrit dans le chapitre 2 de la partie Matériel & Méthodes. Les capsules ont été séchées à l’aide d’un système de lit fluidisé construit au sein de notre laboratoire. La température de séchage a été de 25 °C, la vitesse de l’air de 2 m/s et l’humidité de l’air de séchage de 11%. Les conditions de séchage ont été différentes par rapport au séchage à l’échelle pilote pour notre partenaire industriel Masstock (chapitre IV. 1.4.2).

Le séchage des capsules a été arrêté, selon les valeurs de l’Aw souhaitées (tableau III.11). À la suite du séchage, les capsules ont été déposées dans des dessiccateurs à une température ambiante de 25°C. Nous avons également ajouté différents types de sel saturés pour maintenir la valeur de l’Aw choisie (tableau III.10 de Matériel et Méthode). 50 g de capsules déshydratées contenant 109 UFC/g ont été stockés dans des dessiccateurs à l’Aw préalablement régulé.

Tableau IV.16. L’influence du temps de séchage des capsules sur la perte de l’activité de l’eau et sur la viabilité de R. terrigena.

Temps de séchage (min) 80

Aw 0,84

Viabilité UFC/g des capsules 8,9x107 ± 3,0x106

85

0,75

3,0x107 ± 3,4x106

90

0,55

3,1x107 ± 2,6x106

105

0,31

3,4x107 ± 4,4x106

110

0,11

1,12x107 ± 2,0x105

142

IV. Résultats & Discussion

La figure IV.11 montre l’évolution de la perte de la viabilité exprimée en réduction décimale des bactéries durant une période de stockage de 16 semaines à 25°C pour différente valeur d’Aw.

Figure IV.11. L’influence de l’Aw sur la perte de viabilité de B. pumilus pendant les conditions de stockage.

On a constaté que la viabilité de B. pumilus stockée à un Aw de 0,84 diminue entre la deuxième et sixième semaine de stockage. Après 6 semaines, nous n’avons détecté aucune bactérie vivante dans ces conditions. En revanche, la conservation de bactéries avec un Aw de 0,3 a permis de maintenir une concentration de B. pumilus après 16 semaines supérieures à 1x106 CFU/g des capsules. Nous observons cependant une réduction décimale supérieure à 1 par rapport à la concentration de bactéries initiale. Le stockage de B. pumilus dans les dessiccateurs à un Aw de 0,11 a permis d’obtenir une concentration de bactéries stable tout au long de la période de stockage. Après 16 semaines, le nombre des B. pumilus a été supérieur à 1x108 CFU/g des capsules.

Les résultats obtenus au cours du stockage des cellules encapsulées dans des billes d’alginate-amidon ont montré que le taux de mortalité cellulaire semble avoir un rapport avec la quantité d’eau disponible. Une forte diminution de la viabilité cellulaire a été 143

IV. Résultats & Discussion

observée au-dessus d'un Aw de 0,55. Le stockage des bactéries à un Aw de 0,75 et de 0,84 facilite la forte contamination par des champignons entrainant une diminution rapide du taux de survie des cellules. Il est reconnu que le fonctionnement des protéines est affecté dans un certain intervalle d’Aw, dans duquel certaines fonctions essentielles des cellules se détériorent. En particulier, les activités enzymatiques diminuent fortement avec l’Aw dans la gamme de 0,6 - 0,8 (Marshall et al. 1974). Un déséquilibre physiologique serait à l’origine de la mort cellulaire au cours du stockage dans cette gamme d’Aw.

Notre résultat est en accord avec ceux qui sont obtenus pour l’encapsulation en billes d’alginate de la souche Azospirillum lipoferum (Paul et al. 1993). Les auteurs ont observé qu’au-dessus d'un Aw de 0,55 la mortalité des bactéries est d’environ 2 unités logarithmiques après 12 semaines de stockage. En revanche, un Aw de 0,11 maintenue durant le stockage n'a eu aucune incidence sur la survie cellulaire. Il peut aussi être conclu que, lors d’un stockage à un Aw de 0,11, la présence d'une petite quantité d'eau d'hydratation n’a pas d’effet sur la viabilité de B. pumilus, très probablement parce que l'intensité des réactions induites n'était pas assez élevée.

Ainsi, la mortalité des bactéries est liée avec la quantité de l’eau résiduelle dans les capsules. Le stockage des capsules dans un environnement avec un Aw >0,2 entraînera une chute du taux de viabilité de B. pumilus. Il est recommandable le séchage des capsules jusqu’à une valeur d’Aw comprise entre 0,1-0,2. Une valeur d’Aw supérieure limitera la période de stockage jusqu’à 6 semaines.

144

IV. Résultats & Discussion

L’état physiologique optimal pour le séchage des rhizobactéries encapsulées dépend de chaque bactérie. A. brasilense a montré un meilleur rendement au séchage en phase stationnaire de croissance (11,5%), alors que R. terrigena a montré un meilleur rendement au séchage en phase logarithmique (14%). Par ailleurs, il est également possible de modifier l’état des cellules et ainsi les rendre plus résistants au séchage en ajoutant des osmo-protectants dans le milieu de culture. Le tréhalose est la molécule qui a permis d’obtenir les meilleurs résultats.

Pour les deux espèces A. brasilense et R. terrigena, nous avons obtenu plus de 20% de rendement de survie après séchage en ajoutant du glycérol dans la matrice d’encapsulation. Le gluconate de calcium pourrait également être utilisé comme un agent gélifiant et osmo-protecteur, car il fournit une protection efficace pour certaines rhizobactéries, comme R. terrigena.

Enfin, pour une survie des bactéries optimale pendant le stockage des capsules, nos résultats confirment qu’un séchage à un Aw>0,2 entrainera une diminution de la survie des cellules. Un séchage de B. pumilus encapsulées jusqu’à une valeur d’Aw entre 0,10,2 est donc recommandé.

Ce travail de caractérisation et d’optimisation de la survie est suivi d’un travail de recherche de compréhension. Dans le chapitre 3 de résultats et discussion nous avons étudié l’adhésion des différentes souches de rhizobactéries aux granules d’amidon afin de corréler ce phénomène à une protection cellulaire au procédé d’encapsulation et/ou à une libération contrôlée des bactéries.

145

IV. Résultats & Discussion

3. Étude de lʼadhésion des rhizobactéries sur lʼamidon Le phénomène mécanique d'adhésion des bactéries sur les granules d'amidon a été mis en évidence pour le genre Bifidobacterium utilisé dans les préparations probiotiques (Wang et al. 1999). Ces travaux suggèrent que l'incorporation d'amidon diminue la mortalité prématurée des cellules, car l’adhésion de bactéries sur l’amidon protège les bactéries pendant leur passage dans le transit intestinal.

On a également observé que ces cellules adhérées aux granules d'amidon ont été mieux protégées lors du stockage, ainsi que pendant le transit intestinal (Wang et al. 1999; Crittenden et al. 2001). Nous avons donc voulu tester la capacité d’adhésion des rhizobactéries aux grains d’amidon pour la mettre en relation avec la survie des cellules pendant le procédé d’encapsulation dans une matrice alginate-amidon.

L’adhésion des bactéries sur l’amidon est un phénomène naturel. Jusqu’à présent les recherches scientifiques ont démontré deux causes pour le même phénomène. D’un côté, selon le travail de Crittenden et al. (2001) les mécanismes d’adhésion du genre Bifidobacterium sur l’amidon, semblent impliquer une protéine de surface cellulaire. D’un autre côté, il a été montré précédemment que certaines bactéries intestinales peuvent adhérer aux granules d'amidon et que l'adhésion est parfois nécessaire pour une utilisation efficace de l’amylose (Reeves et al. 1997). L'évaluation du degré d’adhésion des rhizobactéries sur les granules d’amidon s’inscrit dans un travail fondamental de recherche des mécanismes de protection des bactéries au procédé d’encapsulation et de libération progressive permises par l’amidon. Plusieurs travaux ont mis en évidence l’intérêt de l’adhésion de bactéries aux granules d’amidon pour leur protection au procédé d’encapsulation (Jankowski et al. 1997; Forssell et al. 2004; Lahtinen et al. 2007), pour la protection de bactéries probiotiques pendant le passage dans l’estomac (O'Riordan et al. 2001). Notre objectif n’était pas d’expliquer les phénomènes d’adhésion, mais plutôt d’évaluer la capacité d’adhésion des différentes souches de rhizobactéries par rapport au type d’amidon et à la taille de granules d’amidon.

146

IV. Résultats & Discussion

3.1. Influence de la souche de rhizobactéries sur l’adhésion à la surface des granules d’amidon L’adhésion des rhizobactéries sur la surface des granules d’amidon a été mesurée à l'aide de la méthode de cosédimentation, proposée par Crittenden et al. (2001). Selon lui, si le pourcentage d'adhésion est de plus de 70% les bactéries sont considérées comme fortement adhérentes, entre 40 et 70%, les bactéries sont considérées comme modérément adhérentes et celles dont la valeur est inférieure à 40% sont faiblement adhérentes.

La capacité d’adhésion des cellules sur l'amidon de maïs a été mesurée avec six souches de rhizobactéries différentes (E. Ludwigii BNM0357, R. terrigena TFI08, Paenibacillus polymyxa MXC5, B. pumilus C26 et A. brasilense Sp7 et Sp245).

Figure IV.12. L’adhésion des rhizobactéries dans granules d’amidon standard de maïs.

La figure IV.12 montre le pourcentage d’adhésion à l’amidon de maïs de 6 souches rhizobactériennes. Les deux souches d’A. brasilense et B. pumilus peuvent être considérées comme faiblement adhérentes avec des pourcentages d’adhésion inférieurs à 35%.

147

IV. Résultats & Discussion

Les souches P. polymyxa et R. terrigena, quant à elles présente une capacité d’adhésion d’environ 50 %. Enfin, ces résultats montrent que la souche E. ludwigii est la rhizobactérie la plus adhérente parmi les souches testées avec 65 % de bactéries adhérées.

3.2. Influence de l’état physiologique d’Enterobacter ludwigii sur sa capacité d’adhésion aux granules d’amidon Dans le but de mieux comprendre le phénomène d'adhésion cellulaire sur la surface des granules d’amidon nous avons choisi d’approfondir la recherche avec la souche E. ludwigii, car celle-ci est la rhizobactérie qui présente la meilleure adhésion aux granules d’amidon. La figure suivante montre l'adhésion cellulaire en phase stationnaire et exponentielle de cette souche.

Figure IV.13. Pourcentage d’adhésion d’Enterobacter ludwigii en phase stationnaire et exponentielle sur les granules d’amidon standard de maïs.

Il semble toutefois évident que l'adhésion des E. ludwigii a été influencée par l’état physiologique des cellules. En phase stationnaire, l’adhésion a été de 65 % et en phase exponentielle seulement de 35 %. Nous pouvons supposer que la substance d'adhésion est surtout produite en phase stationnaire de croissance cellulaire. Ce phénomène pourrait être expliqué par la production de substance d’adhésion dans la membrane externe de E. ludwigii connu comme exopolysaccharides (voir figure IV.24). 148

IV. Résultats & Discussion

3.3. Effet du type d’amidon sur l’adhésion cellulaire Précédemment, nous avons montré que l’adhésion dépendait du type de souche et de leur état physiologique. Mais, ce ne sont pas les seuls paramètres qui peuvent influencer le taux d’adhésion. Dans cette partie, nous nous intéressons à l’impact du type d’amidon sur le pourcentage d’adhésion. Pour cela, nous avons évalué l’adhésion de trois souches bactériennes à l’amidon de pomme de terre, de maïs et de blé.

Les figures suivantes montrent le taux d’adhésion sur les trois amidons pour les souches E. ludwigii, R. terrigena et B. pumilus.

Figure IV.14. Pourcentage d’adhésion de B. pumilus sur l’amidon de pomme de terre, de maïs et de blé.

149

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.15. Pourcentage d’adhésion cellulaire de R. terrigena sur l’amidon de la pomme de terre, de maïs et de blé.

Figure IV.16. Pourcentage d’adhésion cellulaire d’E. ludwigii sur l’amidon de la pomme de terre, de maïs et de blé.

Les résultats montrent que le pourcentage d’adhésion des souches R. terrigena et B. pumilus ne varie pas énormément en fonction de rhizobactéries ni du type d’amidon utilisé. Ces dernières bactéries, qui sont moyennement adhérentes, le sont quelle que soit l’origine

150

IV. Résultats & Discussion

botanique de l’amidon. Par contre, nous observons que la souche E. ludwigii présente un pourcentage d'adhésion sur les granules d'amidon dépendant de leur origine botanique.

Les caractéristiques des granules telles que la taille et le pourcentage d’amylose des grains d’amidon pourraient influencer le pourcentage d’adhésion des bactéries très adhérentes. Dans cette première partie, nous avons évalué trois types d’amidon avec des diamètres de granules très différents (tableau IV.17). Nous pouvons observer que le pourcentage d’adhésion de la souche E. ludwigii est inversement proportionnel à la taille des granules. L’adhésion des bactéries pourrait donc être liée aux tailles des granules. Nous pouvons émettre l’hypothèse qu’une taille plus petite des granules permet un pourcentage d’adhésion beaucoup plus important, que celles des granules de plus grandes tailles, celle d’amidon de pomme de terre, grâce à un plus grand rapport surface/volume. Cet effet a déjà été décrit par Crittenden et al (2001), qui ont trouvé une forte corrélation entre l’adhésion cellulaire et la taille des granules d’amidon.

Tableau IV. 17. Type d’amidon et le diamètre des granules.

Type d’amidon

Diamètre des granules (µm)

Blé

5-15

Maïs

5-25

Pomme de terre

15-100

Les figures suivantes montrent l’adhésion sur l’amidon avec les souches E. ludwigii, R. terrigena et B. pumilus vis-à-vis de l’amidon de pomme de terre, maïs et blé.

Nos expérimentations montrent que les pourcentages d’adhésion de R. terrigena et B. pumilus sont indépendant de l’origine botanique de l’amidon pour les amidons testés dans ce travail. Néanmoins, l'adhésion de E. ludwigii est très fortement liée à la taille des granules et cela pourrait être dû à un rapport surface/volume plus important des granules de blé par rapport à l’amidon de pomme de terre. Néanmoins, cet effet n’a pas été démontré en utilisant B. pumilus et R. terrigena, les deux rhizobactéries ont été considérées comme faiblement 151

IV. Résultats & Discussion

adhérentes par rapport à l’adhésion vis-à-vis de la taille des granules d’amidon. Nous avons observé que la capacité d’adhésion des rhizobactéries dans la surface des granules d’amidon dépende très fortement de la production d’exopolysaccharides des bactéries, cela a été plus important que du rapport surface/volume des granules d’amidon.

Après avoir vérifié la corrélation entre le pourcentage d’adhésion des rhizobactéries et la taille des granules d’amidon, nous avons vérifié la relation entre l'adhésion cellulaire et le pourcentage d’amylose dans l’amidon.

3.4. Pourcentage d’adhésion cellulaire en fonction de la concentration de l’amylose dans les granules d’amidon. Nous avons testé l’effet de la concentration en amylose de l’amidon sur l’adhésion de trois souches de rhizobactéries en utilisant trois amidons de maïs avec des teneurs en amylose connues (tableau IV.18).

Tableau IV.18. Concentration en amylose des amidons testés

Type d’amidon

% de l’amylose

maïs waxy

1

maïs standard

25

maïs high (hylon)

70

152

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.17. Pourcentage d’adhésion de B. pumilus sur l’amidon de maïs waxy, standard et hylon.

D’après la figure IV.17, il n’y a pas de différence d’adhésion significative de B. pumilus aux trois types d’amidon testés.

Figure IV.18. Pourcentage d’adhésion de R. terrigena sur l’amidon de maïs standard, waxy et hylon.

153

IV. Résultats & Discussion

La figure IV.18 nous indique que globalement la souche R. terrigena est plus adhérente que la souche B. pumilus. Aucun effet significatif du type d’amidon n’est observé.

Figure IV.19. Pourcentage d’adhésion de E. ludwigii sur l’amidon de maïs standard, waxy et hylon.

La figure IV.19 permet d’observer dans le cas de la souche E. ludwigii, un pourcentage d’adhésion supérieur à 50 % pour les trois types d’amidon testés. De nouveau, nous n’avons pas trouvé de différences d’adhérence des cellules sur les granules d’amidon par rapport à leur concentration en amylose. Cet effet pourrait être due au fait que B. pumilus, R. terrigena et E. ludwigii ne dégradent pas l’amidon en tant que source de carbone; ces micro-organismes ne font pas partie des bactéries amylolytiques (absence de leurs enzymes amylolytiques, comme l’amylase). Comme le montre les figures précédentes, les résultats mettent en évidence que le pourcentage d’amylose dans les granules d’amidon testée ont peu d'influence sur l’adhésion des B. pumilus, R. terrigena et E. ludwigii.

L'adhésion des bactéries à la surface des grains d'amidon est une caractéristique commune des bactéries qui utilisent celui-ci comme substrat de carbone. L’adhésion des bactéries à la surface du substrat des granules est reconnue comme le début du processus de dégradation de l’amylose par les enzymes de la paroi de la membrane des micro-organismes (Wang et al. 1999). Il existe une relation entre le pourcentage d’adhésion des bactéries sur l’amidon et son

154

IV. Résultats & Discussion

utilisation en tant que source de carbone. Il a été démontré que dans le cas de la dégradation de l’amylose par Lactobacillus amylovorus, la séquence est d'abord adhésion cellulaire sur les granules de l’amidon, puis leur dégradation (Imam et Harry-O'Kuru 1991). Néanmoins, le travail de Crittenden et al. (2001) a montré montré qu’il n’est pas nécessaire pour une bactérie d’être très adhérente à l’amidon pour le dégrader. Ces auteurs montrent également que l’adhésion est liée à la présence de protéines de surface spécifiques. Dans notre cas, l'aptitude à l’adhésion importante de la souche E. ludwigii n’est pas liée à sa capacité à utiliser l’amidon. Elle pourrait être due à une production d'EPS ou de "polysaccharide exocellulaire" (voir figure IV.24). Les mécanismes d'adhésion utilisés par les bactéries pour s'adhérer à l'amidon ne sont néanmoins pas encore bien connus. C’est pourquoi nous avons complété cette étude par des observations par microscopie électronique.

3.5. Observation au microscope électronique à balayage des bactéries adhérées sur la surface des granules de l’amidon. La microscopie électronique à balayage est une technique puissante d’observation de la morphologie des bactéries. Nous avons aussi utilisé cette technique pour l’observation de la souche R. terrigena et E. ludwigii adhérées entre elles et à la surface des granules d’amidon (figures IV. 20, 21, 22, 23 et 24).

Figure IV.20. Granule d’amidon sans rhizobactéries (à gauche) et avec R. terrigena adhérées à la surface des granules d’amidon (à droite).

155

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.21. Photo au microscope électronique à balayage qui montre des bactéries de la souche R. terrigena adhérées à la surface des granules d'amidon.

Figure IV.22. Photo au microscope électronique à balayage de cellules d’E. ludwigii adhérées aux granules d’amidon de maïs.

156

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.23. Photo au microscope électronique à balayage de cellules d’Enterobacter ludwigii adhérées aux granules d’amidon de maïs.

Figure IV.24. Photo au microscope électronique à balayage de cellules d’E. ludwigii adhérées aux granules d’amidon de maïs.

157

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.25. Photo au microscope électronique à balayage de Bacillus pumilus.

La figure IV.25 montre la souche B. pumilus (65 % d’adhésion aux granules d’amidon) sans présence de substance dans la partie extérieure de la membrane. En revanche les figures IV.23 et IV.24 montre l’E. ludwigii (35 % d’adhésion aux granules d’amidon) avec de connections entre les bactéries (biofilms) et possible présence d’exopolysaccharides.

L'adhésion cellulaire à la surface des granules d’amidon est une caractéristique commune pour les cinq genres des rhizobactéries testés (Enterobacter, Raoultella, Paenibacillus, Bacillus et Azospirillum). Néanmoins, un fort pourcentage d'adhésion cellulaire a été mis en évidence seulement pour l'une des souches bactériennes, E. ludwigii. Malgré un pourcentage d’adhésion de 65 %, la bactérie ne présente pas un taux élevé de survie pendant le procédé d’encapsulation. C’est même la bactérie qui nous est apparue comme la plus sensible au stress généré par le séchage. De ce point de vue, nous n’avons pas constaté une protection des bactéries par l’adhésion aux granules d’amidon. Cependant, ces résultats doivent être nuancés. En effet,nous pensons que les bactéries fortement adhérées ne sont pas facilement séparées des granules d’amidon. Il est donc possible que pour cette raison que le dénombrement des cellules revivifiables ait été sous-évalué. Un grain d’amidon étant associé

158

IV. Résultats & Discussion

avec un nombre important de bactéries, ces bactéries adhérées au granule d’amidon pourraient donner lieu à la croissance d’une seule colonie en surface du milieu de culture.

Imam et Harry-O’Kuru (1991) ont proposé d’utiliser du formaldéhyde (2 %; pH 2) et de la glycine (1M; pH 2) pour détacher les bactéries adhérées aux granules d’amidon. Cependant, l’utilisation des solutions au pH très faible a un effet bactéricide, et ne permet donc pas de répondre à notre problématique. Néanmoins, l’utilisation de l’hydrolyse enzymatique, en utilisant par exemple des amylases, pourra être une alternative pour la dégradation des granules d’amidon, et une méthode pour connaître le nombre total de bactéries, à la suite du procédé d’encapsulation (Communication personnelle avec Paul Colonna, INRA, Nantes). Cela nécessite un travail de mise au point important qui pourrait faire l’objet d’une étude ultérieure. Par ailleurs, le rôle de l’adhésion des bactéries à l’amidon dans la libération progressive des bactéries de leur support reste à déterminer.

D’après nos images acquises par microscopie électronique, l’adhésion pourrait être liée à la présence d’exopolysaccharides et à l’aptitude des bactéries à former des films bactériens, présence de connexions entre les bactéries (voir figure IV.23). Il semble également que la substance responsable de l’adhésion chez les bactéries soit plutôt produite en phase stationnaire de croissance puisque E. ludwigii adhère significativement plus à l’amidon dans cette phase de croissance.

Le phénomène d'adhésion des bactéries à la surface des granules d’amidon a été utilisé pour la protection des bactéries probiotiques destinées à l'alimentation humaine contre les stress rencontrés lors du transit intestinal (Wang et al., 1999). Notre travail montre qu’il existe un potentiel d’adhérence des rhizobactéries aux granules d’amidon. Une seule bactérie a pu être considérée comme très adhérente, mais cette qualité n’a pu être liée à une meilleure résistance au procédé d’encapsulation et plus particulièrement au séchage. Une étude approfondie sur la survie d’E. ludwigii au procédé de séchage en lien avec son adhésion aux granules d’amidon sera nécessaire pour conclure sur ce point. Cela passera par la mise au point d’une technique complexe d’évaluation du taux de survie des bactéries après séchage.

159

IV. Résultats & Discussion

Par la suite, nous allons évaluer la libération progressive des différentes souches de rhizobactéries dans l’eau physiologique et le sol. Puis, nous montrerons les résultats de tests en champs des capsules produits à l’échelle pilote.

160

IV. Résultats & Discussion

4. Libération progressive des rhizobactéries et efficacité en champs L’encapsulation des cellules n’a de sens que si l’on peut obtenir leur libération progressive dans le sol. Pour une efficacité maximale, on souhaitera avoir une libération rapide au début de la période d’application, mais aussi avec un effet prolongé dans le temps. Nous avons étudié la libération des cellules de R. terrigena et de B. pumilus encapsulées dans une matrice d’alginate-amidon, dans l’eau et dans le sol. Dans le sol, nous avons pu comparer l’évolution du nombre de cellules libres avec un sol inoculé directement par une culture cellulaire. Puis, les résultats d’essais en plein champ réalisés dans deux conditions climatiques et sur des sols différents seront présentés.

4.1 Libération des rhizobactéries dans l’eau et dans le sol 4.1.1 Libération des B. pumilus et R. terrigena dans l’eau La méthode pour mesurer la libération des bactéries dans l’eau a été proposée par Bashan et al. (2002). Elle consiste à placer 0,5 g des capsules d’alginate-amidon sèches sous agitation dans de l’eau physiologique pendant 80 h. Après cette période, les capsules ont été désagrégées. Régulièrement, des prélèvements ont été réalisés pour dénombrer le nombre de cellules vivantes présentes dans l’eau physiologique.

L’objectif était d’évaluer la libération des souches B. pumilus C26 (rhizobactéries mobile) et R. terrigena TFi08 (rhizobactérie non mobile) encapsulées et inoculées dans un milieu liquide. La figure IV.26 montre la libération dans l’eau physiologique des bactéries encapsulées.

161

IV. Résultats & Discussion

Figure IV.26. Évolution du nombre de bactéries dans l’eau physiologique en présence de capsules contenant B. pumilus ou R. terrigena.

On observe une augmentation rapide du nombre des bactéries libérées. La souche B. pumilus a montré une libération relativement faible de 104 UFC/g des capsules après 10 h dans l’eau physiologique. Puis, elle montre une diffusion des cellules maximales de 1010 UFC/g de capsules après 60 h d’agitation dans l’eau physiologique. Après cette période, la libération de B. pumilus à partir des capsules commence à diminuer. Par contre, la libération de la souche R. terrigena a montré un profil constant de libération à partir d’au plus 20 h d’agitation dans l’eau physiologique, en effet la concentration des bactéries dénombrée a été comprise entre 107 à 109 UFC/g des capsules pendant les 80 h.

La libération plus importante de B. pumilus dans l’eau physiologique par rapport à R. terrigena pourrait être due à la mobilité des cellules de B. pumilus qui possèdent des flagelles permettant le déplacement en milieu liquide (Maplestone et Campbella 1989). En revanche, R. terrigena est considéré comme une bactérie immobile (Drancourt et al. 2001). La mobilité des bactéries pourrait augmenter la libération de ces dernières. Malgré la non-mobilité de R. terrigena, sa libération a été plus rapide au début de l’essai que celle de B. pumilus. Il est possible qu’un grand nombre des cellules de R. terrigena aient été placées proches de la

162

IV. Résultats & Discussion

surface des capsules, ce qui expliquerait cette libération rapide dans la première partie de l’essai. Le premier aspect à considérer est l’influence de l’amidon sur la le comptage de B.pumilus, cette rhizobactérie a montré un faible pourcentage d’adhésion sur les granules d’amidon (40%), c’est-à-dire un pourcentage élevé des bactéries libres non adhérées. Un deuxième aspect à considérer est le taux de croissance accélérée de R. terrigena par rapport à B. pumilus. Finalement, la différence de concentration initiale des bactéries par capsules. La concentration de R. terrigena dans les capsules initiales était de 8,2x105 UFC/capsule et pour B. pumilus de 1,4x108 UFC/capsule. Cette différence, de nombre des bactéries encapsulées, due à la plus grande résistance au procédé de séchage de B. pumilus (possible formation de spores). Donc, une concentration plus forte des B. pumilus encapsulées, pourrait provoquer une libération des bactéries jusqu’à 1x1010 UFC/g des capsules après 60 h d’essai.

Les essais de libération dans l’eau pendant 80 h ont été très délicats. En effet, il est apparu que les capsules ont été désagrégées ce qui a rendu le dénombrement des bactéries libérées depuis les capsules difficiles à mesurer. Pour conclure, le temps de dégradation des matériaux des capsules, la porosité des capsules et la mobilité des rhizobactéries, pourraient affecter la libération progressive des rhizobactéries dans l’eau et dans le sol. La partie suivante s'intéresse à la libération des rhizobactéries encapsulées dans le sol.

4.1.2 Libération dans le sol de B. pumilus encapsulée Pour les essais de libération des bactéries dans le sol, des capsules sèches de B. pumilus ont été introduites dans un sol humide (voir conditionnes de sol dans le chapitre 4.2 de Matériel & Méthodes) et le nombre de cellules présentes dans le sol, préalablement stérilisé, a été dénombré au cours du temps pendant 24 jours. Nous avons comparé nos résultats avec un sol ensemencé directement avec un inoculum liquide.

De manière à comprendre l’évolution de la densité cellulaire dans le sol pour les bactéries inoculées sous forme de capsules, des capsules résiduelles ont été prélevées au cours du temps après l’inoculation et le nombre de bactéries présentes dans les capsules a été dénombré. Les résultats sont présentés sur la figure suivante et sont exprimés en CFU total par essai de 20 g 163

IV. Résultats & Discussion

de sol. La figure suivante montre le nombre de cellules par g de sol pour deux types d’inoculation : liquide et capsules.

Figure IV.27. Inoculation de B. pumilus dans le sol en forme liquide et capsules.

Nous observons une augmentation du nombre de cellules de B. pumilus dans le sol inoculé en forme liquide durant les jours 6-15 qui suivent l’inoculation. Ce résultat montre que les bactéries sont capables de se réactiver et de se multiplier dans le sol. Le nombre de rhizobactéries contenu dans le sol est alors de 107 UFC/g de sol et il reste stable jusqu’au jour 15. Cependant, après cette période la concentration des bactéries diminue progressivement d’une unité logarithmique du jour 15 au jour 24.

Concernant la concentration des B. pumilus dans le sol inoculé avec les capsules, le nombre de bactéries reste stable au cours de notre essai.

164

IV. Résultats & Discussion

A

B

Figure IV.28. Capsules d’alginate-amidon avant d’être mis dans le sol (A) capsules d’alginate-amidon après 24 jours d’inoculation dans le sol (B).

On a constaté après 24 jours d’inoculation des capsules dans le sol, une coloration noire sur la surface des capsules d’alginate-amidon, comme le présente la figure IV.28. Ces colorations selon notre observation au microscope ont été dues à la contamination par les mycéliums des champignons. Cette contamination et un éventuel affect antagonique entre micro-organismes pourrait expliquer la diminution du nombre de cellules de B. pumilus à l'extérieur des capsules. D’autre part, le sol ayant au préalable été stérilisé, la contamination peut avoir pour origine la surface des capsules qui n’était pas stérile.

L’inoculation liquide a montré une multiplication des bactéries au début de la période d’application, due à la croissance des bactéries dans le sol. Le nombre de bactéries encore présentes dans les capsules diminue tout au long de la période d’essai (figure IV.27). Cela peut être dû à la contamination par un champignon à la surface des capsules. Cette contamination fongique pourrait empêcher ou diminuer la multiplication des bactéries à cause des affects antagoniques des microorganismes. Dans des conditions réelles d’inoculation des bactéries dans le sol, il existe une variété et un nombre important de microorganismes qui interfèrent entre eux. Il serait donc intéressant de renouveler ces essais dans plusieurs types de sols non stériles et d’observer de quelle manière les capsules sont biodégradées par les rhizobactéries encapsulés. Les capsules seraient alors de véritables bio165

IV. Résultats & Discussion

réacteurs dans le sol. Pour éviter le problème de contamination du support par d’autres microorganismes, une décontamination de la surface des capsules pourrait être efficace et reste à tester.

Afin de permettre la multiplication des bactéries au sein des capsules, il serait nécessaire que les bactéries utilisent l’amidon comme source de carbone. Néanmoins, les rhizobactéries utilisées ici, telles que B. pumilus et R. terrigena n’utilisent pas l’amidon comme source de carbone. Dans cette perspective, l’encapsulation des rhizobactéries qui dégradent l’amidon pourrait permettre une augmentation du nombre des rhizobactéries dans les capsules. L’adjonction de nutriments (extrait de levure ou peptones par exemple) facilement assimilés par les rhizobactéries dans les capsules pourrait également être testée.

Si la libération des rhizobactéries dans le sol est une étape déterminante, reste à évaluer l'efficacité des inoculant encapsulées dans le champ.

4.2 Étude de l’efficacité des inoculums encapsulés en champs Nous avons réalisé une production à l’échelle pilote de rhizobactéries encapsulées. Au cours de la production, nous avons fabriqué 14 kg de capsules d’alginate humides pour l’essai au Chili et 2 kg de capsules d’alginate-amidon sèches pour les essais en l'Angleterre (MASSTOCK). Nous avons réalisé ces productions à l’Université Australe du Chili (UACH) et à ONIRIS Nantes, France.

La description des méthodes employées pour la fabrication des capsules est donnée dans la partie III.5 de matériel et méthodes et les résultats de densité en cellules vivantes avant utilisation sont présentés dans la partie IV.1.4 de résultats et discussion. Les caractéristiques des capsules produites pour les deux partenaires sont données dans le tableau IV.19.

166

IV. Résultats & Discussion

Tableau IV.19. Caractéristiques des capsules utilisées pour les essais en champs.

Partenaires

Souches

Concentration en Concentration en rhizobactéries (CFU/capsules rhizobactéries (CFU/capsules humides) sèches) 2,90x109

MASSTOCK

B. pumilus

UACH

B. pumilus

2,12x1010

-

UACH

P. fluorescens

9,71x109

-

UACH

R. terrigena

1,26x109

-

Après de 5 mois de culture de blé, le 11 de février de 2011 le blé a été récolté au Chili. Le rendement du blé a été mesuré en g/m2. La figure IV.29 montre le rendement pour chaque traitement.

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Figure IV.29. Effet des traitements sur le rendement de production des graines de blé.

On a observé un rendement de 1220 g/m2 des graines pour le traitement avec 150 kg de P/ha et de 1000 g/m2 pour le traitement sans inoculation phosphatée. Pour les traitements d’inoculation avec les rhizobactéries, la souche B. pumilus a montré la meilleure réponse d’augmentation du rendement de blé génotype Pandora. Néanmoins, aucun traitement d’inoculation avec des rhizobactéries n'a pas montré une différence statistiquement 167

IV. Résultats & Discussion

significative (ANOVA <0,05) avec les traitements témoins. Ainsi, l’inoculation des souches de rhizobactéries (P. fluorescens, R. terrigena et B. pumilus) en billes d’alginate n'a pas été capable d'augmenter le rendement de blé, par l'intermédiaire de la solubilisation de phosphate du sol.

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Figure IV.30. Effet des traitements sur le rendement de la biomasse total des plants de blé.

La figure IV.30 présente les effets des traitements sur le rendement de la biomasse totale qui comprend le poids de la matière sèche des feuilles, de tiges, d’épis et des graines de blé. On a constaté un rendement de 2400 g/m2 dans le traitement avec 150 kg de P/ha et de 2000 g/m2 dans le traitement sans inoculation phosphatée. La biomasse totale n’a pas été modifiée par l’inoculation des rhizobactéries immobilisées en billes d’alginate. Le traitement d’inoculation avec des rhizobactéries n'a pas montré différence significative avec les témoins non inoculés (ANOVA <0,05).

168

IV. Résultats & Discussion

Les rhizobactéries P. fluorescens, R. terrigena et B. pumilus ont été isolés dans le cadre du projet Rhibac. Les trois souches ont été isolées dans des climats tempérés et elles sont donc adaptées à des conditions de faibles températures. R. terrigena a été récemment isolé par notre partenaire ARC en Autriche et jusqu’à présent, elle n’a pas été évaluée au champ. Les genres Bacillus et Pseudomonas sont connus pour augmenter la concentration en phosphore soluble, soit par minéralisation des phosphates organiques, grâce à des phosphatases, soit par solubilisation des phosphates inorganiques, sous l’effet d’acides organiques (Paul et Sundara Rao 1971; Chabot et al. 1993). Néanmoins, l’action des rhizobactéries n’a pas été suffisante pour augmenter la biomasse totale de culture du blé. L’obtention de l’augmentation de la croissance des plantes, grâce à l’inoculation de rhizobactéries capables de solubiliser les phosphates n’est pas un sujet simple. Pendant la première réunion internationale sur la solubilisation du phosphate microbienne, (Goldstein 2007) a déclaré: « les tendances futures dans la recherche sur la solubilisation du phosphate microbienne: cent ans d'insolubilité». Il a mis en évidence la difficulté de développer un inoculant biologique pour la solubilisation des phosphates. Après cent ans, les microbiologistes agricoles et les écologistes du sol ont isolé et caractérisé des bactéries, mais les résultats obtenus sont aléatoires et peu satisfaisants.

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Figure IV.31. Effet de l’inoculation de B. pumilus C26 (liquide et capsules) sur le rendement des plants de blé (tonnes/ha).

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IV. Résultats & Discussion

Notre partenaire Masstock a tout d’abord comparé le rendement de production des grains de blé pour les 2 modes d’application des rhizobactéries : sous forme de capsules et en mélangeant et pulvérisant l’inoculum liquide sur les feuilles. L’inoculation sous forme de capsules a été réalisée avec deux concentrations de bactéries, 107 et 108 UFC/semence. On observe une augmentation du rendement de culture du blé en utilisant des capsules avec une concentration de 107 UFC/semence qui n’est cependant pas statistiquement significative (ANOVA <0,05). Dans ces conditions, le rendement a été de 3,5 tonnes/ha. En revanche, l’inoculation des capsules avec une concentration supérieure de 108 UFC/semences a été de 3 tonnes/ha. Ce dernier rendement est similaire au traitement sans inoculation bactérienne.

La concentration en rhizobactéries par semences de blé utilisées ici a été supérieure à la quantité de bactéries conseillées par la littérature, car selon Kapulnik et al (1985) chaque graine de blé doit être associée à environ 1,0x106 UFC, pour obtenir des effets d’augmentation de la croissance des plantes. On aurait pu penser qu’une concentration bactérienne plus élevée de 1,0x108 UFC/semence pouvait renforcer l’effet des rhizobactéries sur la production. Mais nous n’observons pas ici une augmentation significative de la production pour les cultures inoculées. Donc, il faut pas formuler des inoculants microencapsulées avec une concentration trop élevé des rhizobactéries. Cela pourrait signifier qu’il existe une concentration d’inoculation optimale au-delà de laquelle l’effet sur la croissance serait nul.

Par la suite, l’inoculation a été réalisée en complément avec une fertilisation à base d’azote (0, 60 et 120 kg d’azote/ha). Les résultats sont présentés sur la figure IV.32.

170

IV. Résultats & Discussion

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Figure IV.32. Bilan de l’effet de l’inoculation des B. pumilus C26 (liquide et capsules) par rapport au rendement de plantes du blé (tonnes/ha).

En général, on constate une augmentation du rendement lorsque la concentration en engrais azotés augmente. L’inoculation de B. pumilus sous forme encapsulée avec une concentration de 107 UFC/semence et avec 120 kg d’azote/ha permet d’obtenir un rendement de 3,8 tonnes/ ha. En revanche, l’inoculation de B. pumilus encapsulé à 108 UFC/semence et 120 kg d’azote/ ha ne permet d’obtenir que 3,0 tonnes/ha, rendement similaire à l’utilisation de 0 et 60 kg d’azote/ha pour le même traitement. . Il semble donc qu’il y ait une synergie entre la présence d’azote chimique et de rhizobactéries sur la croissance du blé. Le traitement sans inoculation de rhizobactéries a donné un rendement de 3,0 tonnes/ha, similaire à l’inoculation des capsules de B. pumilus avec une concentration de 108 UFC/semences. Néanmoins, nous n’avons pas trouvé des différences statistiquement significatives (ANOVA <0,05) sur l’augmentation du rendement de la culture du blé en utilisant des rhizobactéries immobilisées par rapport à une inoculation sous forme liquide mélangée aux semences.

Les essais en laboratoire d’inoculation des rhizobactéries sur les plantes ont montré une augmentation de la production des cultures. Principalement dans l’augmentation du développement des racines de plantes, responsables d’une meilleure captation de nutriment et d’eau (Bashan et Holguin 1994). Okon et Labandera-Gonzalez (1994) ont étudié pendant 20 171

IV. Résultats & Discussion

années l’effet de l’inoculation d’Azospirillum sur l’ensemencement de champs. Ils ont observé une augmentation entre 5 et 30% du rendement de différents types de cultures en diverses conditions de sol et de climat. Malgré, les bons résultats montrés par Okon et LabanderaGonzalez (1994), les publications scientifiques qui montrent l’effet de l’inoculation de rhizobactéries en champs ne sont pas nombreuses.

C’est pourquoi nous avons voulu montrer nos résultats d’inoculation obtenus par ensemencement des rhizobactéries encapsulées au Chili et en Angleterre. L’inoculation dans le sol des rhizobactéries n’est pas un sujet simple à évaluer. En effet, au cours des essais sur le terrain, il existe une grande quantité de facteurs difficiles à contrôler, tels que la température, les précipitations pluviométriques et les compétitions microbiologiques. Tous ces facteurs affectent directement la viabilité des cellules incorporées dans le sol. C’est pourquoi nous avons encapsulé cette bactérie pour la protéger des contraintes qui sont susceptibles de diminuer sa survie dans le sol.

Néanmoins, les résultats ont montré une meilleure augmentation du rendement de la culture de blé pour la souche B. pumilus C26 encapsulée par rapport aux cultures inoculées sous forme liquide, mais qui ne sont pas statistiquement significatives. Il est sans doute nécessaire de répéter cette expérience plusieurs fois pour visualiser une amélioration significative de la croissance du blé avec les bactéries encapsulées. De plus, pour améliorer les résultats de l’inoculation des rhizobactéries, il pourrait être envisagé de réduire la distance entre les capsules et les graines, de générer l’inoculation d’un consortium de bactéries et d’enrober des semences de blé avec un exsudat des racines.

La distance entre la capsule et la graine peut jouer un rôle sur la vitesse de colonisation des racines. Tenant compte de la distance entre les semences (2-5 cm), une répartition relativement homogène des graines et des capsules sur le champ devrait conduire à une meilleure répartition de l’apport de l’azote sur l'ensemble des plantes de blé. Un semoir relativement classique permettant la distribution simultanée de graines engrais pourra être adapté pour l’utilisation d’un bioengrais en capsules.

172

IV. Résultats & Discussion

L’inoculation d’un consortium de rhizobactéries, avec des bactéries respectivement chargées de la fixation d’azote, de la solubilisation des phosphates du sol et du contrôle biologique des pathogènes, peut être envisagée. Ce consortium pourrait avoir des effets positifs sur l’augmentation de la croissance des plantes, car rarement une même souche de rhizobactérie peut avoir tous ces effets.

Le principal inconvénient de l’inoculation des rhizobactéries est du à la faible colonisation des racines. L’enrobage des semences de blé avec d’exsuda des racines, pourrait permettre l'attraction des rhizobactéries encapsulées dans les billes d’alginate ou une meilleure colonisation des rhizobactéries natives du sol.

L’inoculum bactérien immobilisé par cette méthode présente donc un potentiel important pour une agriculture utilisant un minimum d’engrais chimique. Cette étude mérite d’être poursuivie pour encore améliorer la survie des cellules durant la période de stockage adapté aux conditions d’utilisation des agriculteurs, principaux utilisateurs de cette technologie.

173

IV. Résultats & Discussion

La libération des bactéries B. pumilus dans l’eau s’accélère après 50 h d’agitation (1010 UFC/g capsules). R. terrigena a montré un profil constant de libération, avec une concentration en bactéries dénombrées comprises entre 107 et 108 UFC/g de capsules durant 80 h. La libération des bactéries encapsulées dans le sol a montré qu’elles sont capables de se réactiver et de se multiplier dans le sol. Le nombre de rhizobactéries contenu dans le sol a été de 107 UFC/g de sol.

L’inoculation des rhizobactéries sous forme de billes d’alginate en plein champ au Chili n'a pas eu des effets positifs vis-à-vis du rendement de la culture de blé par l'intermédiaire de la solubilisation du phosphate. L’inoculation de B. pumilus en Angleterre encapsulée avec des concentrations de 107 UFC/semence et 120 kg d’azote/ha permet d’obtenir le plus haut rendement de 3,8 tonnes/ha à condition d’ajouter un complément azoté chimique. En revanche, l’inoculation de B. pumilus encapsulé à 108 UFC/semences avec 120 kg d’azote/ha n’a permis seulement d’obtenir 3,0 tonnes/ha, rendement similaire à l’utilisation de 0 et 60 kg d’azote/ha pour le même traitement.

174

CONCLUSION & PERSPECTIVES Au cours de cette dernière décennie, beaucoup de travaux de recherche ont été consacrés à identifier les rhizobactéries les plus efficaces pour l'amélioration des cultures. Les données accumulées en ce qui concerne l'inoculation sur le terrain dans le monde entier montrent que les résultats de l’inoculation sont positifs dans 60 à 70% des cas avec des augmentations significatives du rendement de l'ordre de 5-30% (Okon et Labandera-Gonzalez, 1994).

Dans la plupart des cas, les rhizobactéries sont inoculées directement dans le sol sous forme liquide ou en utilisant soit de la tourbe ou soit de l’argile. Néanmoins, le taux de survie des cellules après les périodes d’immobilisation, de stockage et d’inoculation dans le sol est très faible et le nombre de cellules actives décroît rapidement. Or, l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate-amidon peut apporter une meilleure protection de la viabilité des rhizobactéries.

Le but de ce travail de thèse a été axé sur l'amélioration du taux de survie des rhizobactéries encapsulée. Dans les travaux de recherches antérieurs aux nôtres, le taux de survie des cellules diminue jusqu’à une valeur inférieure à 1% au cours du procédé d’encapsulation. La diminution du taux de mortalité cellulaire lors de l'encapsulation n'est pas un sujet scientifique simple. En effet, cette diminution dépend de plusieurs facteurs: le type de rhizobactérie, la formulation du milieu de culture et la matrice d’encapsulation. En combinant ces facteurs, nous avons pu obtenir un inoculant déshydraté, avec une forte densité de bactéries immobilisées. Nous avons de plus montré que les bactéries les plus prometteuses en termes d’effet physiologique sur les plantes, n’étaient pas forcément celles qui avaient les meilleures aptitudes technologiques (i.e. survie au stress entraînés par le procédé d’immobilisation et d’inoculation).

Notre contribution a été essentiellement celle de diminuer le taux mortalité des rhizobactéries, telle que Azospirillum brasilense, Raoultella terrigena et Bacillus pumilus, pendant le procédé d’encapsulation. Cette protection a consisté en à augmenter la teneur en matière sèche des capsules obtenues en ajoutant de l’amidon et du glycérol à la matrice d’encapsulation et à

utiliser du gluconate de calcium, en tant que solution de gélification. Nous avons également recherché l’état physiologique optimal des cellules en les récoltant dans la phase stationnaire de croissance ou en ajoutant du tréhalose dans le milieu de culture.

Ce travail de recherche a permis l’augmentation du taux de survie durant l’étape d’immobilisation; et en particulier durant l’étape de séchage. Nous avons pu ainsi augmenter le taux de viabilité cellulaire jusqu’à une valeur supérieure à 20% avec une teneur en cellules vivantes stable pendant plusieurs mois de stockage. Ceci pourrait permettre de développer un engrais biologique avec une forte concentration en bactéries pouvant se conserver sur une période prolongée. On peut attribuer cet avantage à la formation d’une matrice avec un pourcentage de matière sèche initiale plus élevé grâce à la présence d’amidon.

Par ailleurs, l'adhésion cellulaire sur la surface des granules d’amidon est une caractéristique commune pour les cinq espèces de rhizobactéries testées avec des niveaux d’adhérence différents d’une bactérie à l’autre. Ce phénomène pourrait également être en relation avec la protection des cellules durant le procédé d’encapsulation, de stockage et lors de la période d’inoculation dans le sol.

La nouvelle matrice d’encapsulation contenant 33 % de matière sèche et une concentration en bactéries de l’ordre de 1*109 bactéries/capsule a pu être produite à l’échelle pilote. Nous avons montré que les capsules produites permettaient une libération progressive des bactéries dans l’eau et le sol. Les essais en champs ont effectivement montré des effets positifs de l’inoculation des capsules contenant B. pumilus à une hauteur de 107 UFC par semence en présence d’un supplément azoté chimique. Le gain de rendement par rapport à une inoculation sous forme liquide n’a cependant pas été significatif.

En résumé, ce travail est prometteur et met en évidence des difficultés qui restent à surmonter pour obtenir des inoculums stables, faciles à utiliser et efficaces. La poursuite des collaborations avec des laboratoires et des entreprises en amont (sélection de souches) et en aval (tests réels en champs), mais aussi avec des sociétés pouvant assurer la production des bioengrais est indispensable afin d’atteindre le stade de développement.

V. Conclusion & Perspectives

En choisissant les matériaux de base moins onéreux, le coût de production de ces capsules pourrait être davantage abordable pour leur utilisation d’amendement des sols. Le choix des matériaux constituant la matrice peut certainement être encore optimisé. L’application des capsules dans les champs peut être réalisée simultanément avec l’épandage des semences à l’aide de matériel couramment employé dans l’agriculture. L’incorporation d’un consortium de rhizobactéries pouvant avoir un effet synergique pourrait conduire un effet plus significatif sur le rendement de production du blé. L’inoculum bactérien immobilisé à l'aide de cette méthode présenterait un potentiel prometteur pour une agriculture utilisant un minimum d’intrants chimiques.

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Productions scientifiques Production scientifique pendant les années de la thèse 2007 et 2010:

Publications: Schoebitz, M. Simonin, H. and D. Poncelet Bioencapsulation of Azospirillum brasilense and Raoultella terrigena in alginate-starch beads used as biofertilizers. (in progress)

Schoebitz, M., Ribaudo, C.M., Pardo, M.A., Cantore, M.L., Ciampi, L. and J.A. Cura. (2009) Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacter ludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere. Soil Biology & Biochemistry 41, 1768-1774.

Brevet: Ciampi, L., Fuentes J.R., Costa, M., Nissen, J., Schobitz, R., Schoebitz, M., Aguila, P., C. Vergara (2009) New bacillus subtilis strain ATCC® pta-8805, bioproducts containing said strain and use of the same to control the fungus rhizoctonia solani, an important plant pathogen that attacks economically relevant crops ed. MERCHANT & GOULD PC (P.O. BOX 2903, M., MN, 55402-0903, US) p.7. United State: Universidad Austral de Chile (Valdivia, CL)

Organisation Conférence: Principal organisateur de la Conférence Aquaculture & Microencapsulation, Puerto Varas, Chile, 26-27 novembre 2009. http://bioencapsulation.net/2009_PuertoVaras

Présentation orale: XVI International Conference on Bioencapsulation. Cells viability of plant growth promoting rhizobacteria in alginate-starch beads. M. Schoebitz, H. Simonin and D. Poncelet. Dublin, Ireland 2008.

Posters: VII Simposio de Recursos Genéticos para América Latina y el Caribe. Multi-nozzles system to produce a large amount of rhizobacteria immobilized used as biofertilizer. Schoebitz, M., Poncelet, D. and L. Ciampi. Pucón Chile 2009.

XVII International Conference on Bioencapsulation. Rhizobacteria adhesion to starch granules. Schoebitz, M., H. Simonin and D. Poncelet. Groningen, Netherlands 2009.

Rhizosphere 2 International Conference. Isolation and characterization of plant growth promoting rhizobacteria of ryegrass from volcanic soil. Schoebitz, M., Ribaudo, C., Ciampi L., Poncelet , D. Montpellier, France. 2007

Présentation orale projet européen Rhibac: 2009

Rhibac meeting « Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat » Valdivia, Chile.

2008

Rhibac meeting « Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat » Nantes, France.

2008

Rhibac meeting « Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat » Rio de Janeiro, Brazil.

2007

Rhibac meeting « Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat » Vienne, Austria.

2007

Rhibac meeting « Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat » Istanbul, Turkey.

Résumé: Étude de l’encapsulation de rhizobactéries pour la biofertilisation du blé La biofertilisation des sols est une des voies potentielles pour réduire les intrants chimiques dans l’agriculture. Cette étude a pour objectif d’optimiser la survie des rhizobactéries par encapsulation. Les capsules ont été produites par dripping d’une matrice alginate-amidon dans une solution de chlorure de calcium. La protection des rhizobactéries a été optimisée en jouant sur la phase de croissance, la formulation de la matrice et la nature du calcium. La phase la plus critique est le séchage des billes avec une perte de la viabilité des cellules pouvant aller jusqu'à trois logs. Les paramètres cités ci-dessous mais aussi le choix adéquat du procédé de séchage permet toutefois de réduire les pertes de viabilité. Le taux de survie maximale a été obtenu par R. terrigena cultivée dans le milieu de culture YEP supplémenté avec du tréhalose et le gluconate de calcium comme agent gélifiant. Dans le cas d’A. brasilense, nous avons obtenu la survie maximale lorsqu’elle était cultivée dans le milieu de culture YEP supplémenté avec du tréhalose et le chlorure de calcium comme agent gélifiant. De plus, nous avons obtenu 85% de taux de survie d’A. brasilense dans les capsules après un an de stockage. Nos travaux ont également montré que les capsules formulées à base d’alginate-amidon permettaient bien une libération progressive des bactéries dans l’eau et dans le sol. Une étude d’inoculation en champs a montré une efficacité de l’ensemencement par capsule identique à celle de l’inoculation par un inoculum liquide. Ce travail a permis de mettre au point des capsules dont la concentration en cellules était augmentée d’un facteur 10 voir plus par rapport aux travaux précédents. Toutefois, nous montrons que les conditions optimales d’encapsulation sont très dépendantes des bactéries mises en œuvre. C’est pourquoi les recherches doivent être poursuivies pour permettre une amélioration largement significative du rendement de production de cultures de blé. Mots-clés: bioengrais, bioencapsulation, rhizobactérie, taux de survie, alginate, amidon Abstract: Study of the encapsulation of rhizobacterias for the biofertilization of wheat The biofertilization of soils is a potential approach to reduce the chemichals fertilizers in agriculture. The aim in this study was to optimize the rhizobacteria survival by encapsulation in alginate-starch beads. Immobilized cells were produced by dripping an alginate-starch solution mixed with rhizobacteria were dropped into a calcium solution. Beads were formed by testing different factors such as cell growth-medium, bacteria growth phase, formulation of the encapsulation matrix and nature of calcium. The critical point of the encapsulation process is the drying of beads, three logs in cell viability were observed. The parameters listed below as well as the adequate choice of the drying process, allows to reduce the loss of viability. Maximum cell recovery was obtained for R. terrigena grown in YEP medium supplemented with trehalose and with calcium gluconate as gelling agent. In the case of A. brasilense maximum. cell recovery was obtained grown in YEP medium supplemented with trehalose and with calcium chloride. Furthermore, dried beads containing A. brasilense presented 85% of living cells after one year of storage. Our work also showed that the capsules formulated with alginate-starch allowed a progressive diffusion of bacteria in water and soil conditions. A field study of bacteria showed a success capsule inoculation identical to that a liquid inoculations. This work can help to develop capsules with a concentration of cells increased by a factor of 10 compared to previous work. However, we also showed that the optimum conditions for encapsulation are dependent of bacteria strains. Therefore, research should be pursued to enable a highly significant improvement to production yield of wheat crop. Keywords: biofertilizer, bioencapsulation; rhizobacteria, cell survival, alginate, starch Discipline : Microencapsulation N°: