Técnica Histológica

TÉCNICA HISTOLÓGICA HISTOLOGÍA I - MEDICINA

TÉCNICA HISTOLÓGICA

1. Introducción.El presente trabajo de investigación presenta una introducción a las técnicas histológicas. Es de esta manera que se refiere a los conceptos más básicos, asi como a todo el procedimiento que implica la preparación de las muestras para ser observadas a través del microscopio. El trabajo se divide en tres grandes partes: objetivos general y específicos, desarrollo, el cual contiene toda la información respecto a las técnicas histológicas: definición general, métodos de la técnica histológica, material requerido en laboratorio y técnicas de tinción de tejidos; y las conclusiones de la investigación; los mismos que se presenta a continuación. 2. Objetivos.2.1 Objetivo general. Comprender el proceso de aplicación de las técnicas histológicas, asi como los conceptos básicos y términos propios de Histología. 2.2 Objetivos específicos. Conocer los materiales que se utilizan en un laboratorio de Histología.  Conocer las características de la infraestructura de un laboratorio de Histología.  Establecer cuáles son los pasos para la preparación de una muestra de laboratorio de Histología.  Determinar qué técnicas o métodos pueden emplearse en la tinción o coloración de cortes histológicos. 3. Desarrollo.3.1 Definición de técnica histológica.Una técnica histológica comprende el conjunto de procedimientos a los que se somete una muestra para su análisis microscópico. La elaboración de preparaciones histológicas sensibles de ser observadas tanto por microscopía fotónica como electrónica, obedece a una serie de principios generales que son comunes para ambas. Para obtener una preparación histológica es necesario procesar el material siguiendo una serie de pasos o etapas, las cuales se detallan a través de esta investigación, estas son: 1. 2. 3. 4. 5.

Obtención de tejido Fijación Lavado Deshidratación y aclaramiento Preinclusión o impregnación

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6. 7. 8. 9.

Inclusión Corte o sección Tinción o coloración Montaje

3.2 Material requerido en laboratorio.Un laboratorio de Histología, al igual que otros, debe cumplir con una serie de condiciones, en lo que se refiere a infraestructura e instrumentos de trabajo con los cuales se debería contar. A continuación, mencionaremos algunas de ellas: 3.2.1

Infraestructura.-

Un laboratorio de Histología debe contar con:     

Sistema de ventilación, que funcione constantemente durante las horas de trabajo. Buena iluminación, este factor puede ayudar a una mejor observación de las muestras. Revestimiento de los suelos y paredes con cerámica que sea de fácil aseo Presencia de contenedores de desechos, clasificados por colores en comunes, biológicos, infecciosos y corto punzantes, respectivamente. Una zona de aseo y lavados de manos para la limpieza del estudiante, docente, investigador, etc.

3.2.2

Instrumentos de trabajo.-

Un laboratorio de Histología deberá contar con: microscopio, micrótomo, estufa de inclusiones, procesador automático de tejidos, criostato, baño María, balanza analítica, moldes para inclusión (Leuckart), varillas de vidrio y pipetas, reactivos apropiados, estufas histológicas, porta objetos y cubre objetos, entre otros. 3.2.3

Unidades de medida.-

Las unidades de medida más utilizadas en Histología son: el micrómetro (um- 0,001mm) y el nanómetro (nm-0,001 um). Por otro lado, podemos añadir que, recientemente, a través de un Congreso Internacional, se ha desaconsejado el uso del Angstrom (A), además se sustituyó el termino milimicra por designación de nanómetro (nm). Otra modificación importante fue la sustitución de la micra (u) por el micrómetro (um), ambos de igual valor. 3.3 Métodos de la técnica histológica.3.3.1 Obtención de tejidos.Los fragmentos de órganos ó tejidos a observar, deben ser extraídos inmediatamente después de la muerte del animal, ó mediante técnicas quirúrgicas, tales como: a. Biopsia: consiste en tomar un fragmento de tejido de un organismo vivo, generalmente con fines diagnósticos y terapéuticos. Existe una variedad de métodos o tipos, entre los más empleados están: la biopsia por incisión o encisión, biopsia por sacabocados, biopsia

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por aspiración- para retirar liquido de cavidades o espacios celómicos-, punción, biopsia por endoscopia, etc. b. Autopsia o necropsia: es el estudio macroscópico y microscópico de un organismo que ha fallecido. Generalmente tiene fines de diagnóstico y de investigación. Tanto en la biopsia como en la autopsia, los fragmentos de tejido que se estudiarán deben tener un centímetro cúbico de volumen, y obtenerse sin alterar el mismo físicamente. c. Citología exfoliativa: es el estudio de células epiteliales superficiales que se descaman, como la mucosa oral, respiratoria, urinaria, digestiva, etc. Tiene fines diagnósticos. Un ejemplo es la técnica de Papanicolaou. d. Frotis e improntas: es el estudio de capas delgadas de líquidos orgánicos como la sangre, médula ósea o exudados. Tiene fines diagnósticos. Posteriormente, se inicia un proceso de autólisis que conduce a la pérdida de la estructura propia de la materia viviente, por consiguiente es de fundamental importancia proceder con rapidez, colocando la pieza lo más pronto posible en el líquido fijador. 3.3.2

Fijación.-

Tiene por objetivo preservar la estructura celular y tisular, de modo que ésta se mantenga lo más similar posible a la observada en el animal vivo. La efectividad de cada líquido fijador estará dada por su capacidad para lograr esta preservación. Fijar significa inmovilizar, y esto puede lograrse empleando medios físicos,químicos ó una combinación de ambos. Como medios físicos podemos mencionar: Congelación con CO2 -el material puede estar previamente fijado o no-, enfriamiento rápido a -20ºC con Criostato, calor- se hierve la pieza en un líquido especial durante más o menos un minuto-, y desecación. Como medios químicos podemos mencionar: ácido crómico, ácido ósmico, bicloruro de mercurio, bicromato de potasio, ácido acético, ácido tricloracético, ácido pícrico, formol, acetona, alcohol etílico, alcohol metílico. 3.3.2.1 Formas de fijación.a. Inmersión: se sumerge la pieza en un determinado volumen de líquido fijador. En este caso existen una serie de reglas prácticas que son importantes: - El volumen del líquido fijador debe ser de 20 a 40 veces mayor que el del fragmento a fijar. - El tiempo de fijación debe regularse empíricamente ya que depende de factores diversos, como por ej. el tamaño de la pieza, la constitución del tejido, el poder de penetración del líquido fijador, el objetivo final de la técnica a emplear, la temperatura de fijación, etc. - El fijador debe estar en contacto con todas las superficies disponibles de la pieza. En el caso de órganos huecos, la cavidad también debe rellenarse con fijador. b. Inyección: se realiza utilizando el sistema vascular del órgano ó por otras vías. c. Perfusión: el fijador se gotea a través de una cánula insertada en el sistema vascular del animal anestesiado, a temperatura corporal, de manera que la propulsión del líquido fijador se lleve a cabo con el propio flujo sanguíneo del organismo viviente.

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3.3.3

Lavado.-

Al concluir la fijación, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, así, que los tejidos se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una adecuada obtención de secciones delgadas o la coloración correcta de sus componentes celulares. 3.3.4

Deshidratación y aclaramiento.-

En este paso se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina; y se efectúa mediante tres cambios sucesivos de una hora y media cada uno; de algún disolvente como: el xilol, el cloroformo, el toluol benzol, etc. El más usado es el xilol (xileno) ya que como la muestra está deshidratada, este disolvente entrará hasta lo más profundo del tejido. De esta manara el proceso de aclaración tiene por objeto, volver el tejido, soluble a la parafina y hacerlo translucido. Para que finalmente el preparado se encuentre; listo para su impregnación con la parafina. 3.3.5

Preinclusión o impregnación.-

Consiste en colocar el tejido aclarado en un recipiente con parafina liquida, con un punto de fusión de 56 a 58°C, dentro de la estufa histológica con temperatura fija. Para que el tejido quede bien impregnado se requieren cuatro cambios de una hora en esta sustancia. La parafina penetra en los vasos, en los espacios intercelulares y también en el interior de las células embebiendo el tejido y haciendo más fácil la obtención de cortes en el micrótomo. 3.3.6

Inclusión.-

La finalidad de este paso es confeccionar un bloque con el tejido incluido, utilizando moldes de diferentes tamaños de metal (Leuckart) y papel de plástico. Al enfriarse, la parafina se solidifica, y forma, junto con el trozo de tejido bien orientado un bloque sólido denominado “taco” que queda listo para ser cortado en el micrótomo. 3.3.7

Corte.-

Los tejidos incluidos en bloques de parafina deben ser cortados en láminas lo suficientemente delgadas- usualmente entre 5 a 10 micrómetros- para permitir el paso de la luz, de manera que puedan observarse con el microscopio. Este proceso es denominado también Microtomía. Los instrumentos utilizados para esta tarea son los micrótomos. El micrótomo es un aparato mecánico que permite la obtención de secciones de tejido de espesor micrométrico que pueden ser empleadas posteriormente para su estudio al microscopio. Los micrótomos poseen cuchillas de metal y mecanismos para regular el grosor de los cortes y el

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avance de la muestra que se coloca en él. Se utilizan para estudiar secciones de tejidos potencialmente patológicos de los que se pretende obtener un diagnóstico. Sus partes más importantes son:       

Portabloques: dispositivo donde colocamos el material tisular sumergido en algún medio de inclusión, generalmente parafina. Avanza de forma discontinua sobre una cuchilla gracias a un mecanismo regulable de cremallera. Portacuchillas: pinza que sujeta y orienta adecuadamente la cuchilla. Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejido a partir del bloque. Actualmente se consiguen cortes de hasta 1µm. Caja: también llamada carcasa, aloja el mecanismo de engranajes de precisión y el mecanismo para seleccionar el espesor de la sección. Manivela: está situada a la derecha del aparato; consiste en un volante con una manilla y un freno. Freno: es un tornillo que, accionándolo hacia afuera y/o girándolo sobre sí mismo un cuarto de vuelta, libera la manivela. Manivela de recuperación: está situada a la izquierda del micrótomo. Una vez utilizado el micrótomo es conveniente hacerle volver a la posición de inicio.

Los cortes así obtenidos presentan pequeños pliegues y arrugas que pueden eliminarse si se los flota en agua tibia, debido a la elevada tensión superficial del agua. Este proceso se denomina Baño María, preparado con agua y a una temperatura que fluctúa entre los 45- 55 C, evitando los pliegues y las burbujas ocasionadas por una temperatura demasiado baja del agua, o los desgarros por una temperatura my alta. Luego de ello se recogen sobre delgadas láminas de vidrio llamada portaobjetos, a las cuales se adhieren generalmente a través de adhesivos como el silane o la poli-L-lisina, se deja escurrir el agua, o bien, se coloca en la estufa histológica a 57 C durante 30 minutos. Los cortes se secan y luego se los pasa por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno y se los hidratada en alcoholes de concentración decreciente hasta llevarlos al agua destilada para su posterior coloración. También es posible efectuar los cortes en especímenes congelados, sea en nitrógeno líquido o en un portamuestras para congelación rápida en un criostato. Estos cortes se montan con un medio para montaje de congelación rápida y se seccionan a temperaturas inferiores a cero mediante una hoja de acero enfriada con anterioridad. Los cortes se colocan en portaobjetos de vidrio previamente enfriados, se permite que alcancen la temperatura ambiente y se tiñen después con colorantes específicos, o bien, se tratan para estudios histoquímicos o inmunocitoquímicos. Se utilizan también para obtener rápidamente cortes histológicos durante una cirugía para realizar un diagnóstico intraoperatorio, por medio de micrótomos de congelación refrigerados por la expansión de dióxido de carbono líquido, o bien para conseguir cortes de tejido con su estructura química prácticamente inalterada, para los cuales se emplea generalmente el denominado criostato.

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3.3.8

Tinción.-

Dado que la mayoría de los tejidos son incoloros, lo que hace difícil su observación al microscopio óptico, es necesario dar características cromáticas a los componentes tisulares, que permitan distinguir sus elementos. A este paso se le denomina tinción, y se basa en la afinidad química que tienen determinados elementos celulares por los colorantes. Debido a esto, se introdujeron diversos métodos para la coloración de los tejidos a fin de hacer a sus componentes estructurales visibles y diferenciables unos de otros. Para realizar la tinción respectiva de la muestras, se necesita eliminar la parafina previamente mediante un tratamiento con xilol y luego rehidratarse mediante pasajes por concentraciones decrecientes de alcohol etílico. La mayor parte de colorantes utilizados son sales solubles que se ionizan en el agua. Aunque son sales, se dice que son colorantes ácidos o colorantes básicos. La mayor parte de los cortes usuales se emplean para la observación directa con el microscopio, están teñidos con un colorante básico y con un colorante ácido, uno después de otro. Actualmente, estos colorantes se conocen como ácidos y básicos o de acidofilia y basofilia. Los colorantes asimismo pueden clasificarse en:  

Colorantes naturales: que a su vez se clasifican en animales- ejemplo: carmín-, y vegetales- hematoxilina, orceína, azfrán, etc.-. Colorantes artificiales o sintéticos – Colores de Anilina: Ácidos, Básicos, Neutros e indiferentes. 3.3.8.1 Colorantes básicos.-

Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro, tales como: azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno, verde de metileno, Pironina G, azul de toluidina y la hematoxilina. Los tejidos que reaccionen con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es Basófilo y que presenta Basofilia. Son basofilos la heterocromatina y los nucleólos del núcleo por los grupos fosfato ionizados, ergatoplama- parte del citoplasma-, matriz del cartílago por grupos sulfato ionizados. 3.3.8.2 Colorantes ácidos.Sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado, tales como: eosina o eosinato de sodio, orange G, fucsina ácida. Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son Acidófilos y que presentan Acidofilia. Son acidofilos la mayor parte del citoplasma no especializado, filamentos Citoplasmáticos, y fibras extracelulares.

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3.3.9

Montaje.-

Después de que se ha teñido el corte convenientemente hay que tratarlo de manera que se pueda convertir en una preparación definitiva, para lo cual se necesita protegerlo con una delgada laminilla de vidrio llamada cubreobjetos; mediante el siguiente procedimiento, los cortes se someten a un proceso de deshidratación en alcoholes de concentración creciente pasándolos después por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno. El medio de montaje clásico es el Bálsamo del Canadá, se pone una gota de bálsamo de Canadá o una resina sintética en un extremo del corte y cuidadosamente se deja caer el cubreobjetos sobre el bálsamo o resina para que este se extienda por capilaridad, evitando que queden burbujas, de manera que el medio para montaje cubra la sección de tejido. Se deja secar y al solidificarse el medio de montaje traba fuertemente el cubreobjetos con el portaobjetos, constituyendo de esta forma su adhesión. 3.4 Técnicas de tinción.3.4.1 Métodos histoquímicos.La histoquímica es el conjunto de técnicas de coloración destinadas a visualizar sustancias específicas en los tejidos. Este propósito es tanto cualitativo como cuantitativo. Puede realizarse con fines diagnósticos y/o pronósticos de enfermedades. En sentido estricto es microscópico debiendo cumplirse varias condiciones: a) la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su localización celular original. b) la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea específico para ella o para el grupo químico al que pertenece. 3.4.2

Método de la hematoxilina-eosina.-

Es uno de los métodos más empleados en técnica histológica. El tipo de tinción es bicrómica y de esta manera se colorea el núcleo, sus componentes y el retículo endoplasmático rugoso en azul o morado por la acción de la hematoxilina; y los citoplasmas y la mayoría de los elementos fibrilares del espacio intercelular toman un color rosado por la acción de la eosina. La hematoxilina se extrae de la pulpa del Palo Campeche- árbol centroamericano-, se presenta en polvo ó en forma de cristales de color amarillo pardo, solubles en agua y alcohol. No colorea por sí sola, necesitando entonces de un oxidante, tales como: iodato de sodio, iodato de potasio, permanganato de potasio o agua oxigenada; y de un mordiente, como por ejemplo: alumbre de potasio. Una vez sumada al oxidante se denomina Hemateína, que al mismo tiempo forma un complejo laca-hematoxilina-colorante, que sí es capaz de colorear distintos tejidos. Las eosinas son xantenos ácidos o colorantes de ftaleína. Las más comunes son: eosina amarilla- la más utilizada-, eosina B- azul-, floxina, eritrocina, safranina, y Rosa de Bengala. Su punto de solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol. Proporciona una buena coloración citoplasmática ó de fondo. Se usa disuelta en agua destilada o alcohol al 1:100 o 1:200.

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3.4.3

Tricrómico de Masson.-

Esta técnica se llama de tejido conectivo. Se utiliza para demostrar elementos del tejido de soporte, principalmente colágeno. Como su nombre implica, la técnica de tinción produce tres colores: núcleos y otras estructuras basófilas se tiñen de azul, el colágeno se tiñe de verde o azul, dependiendo de qué variante de la técnica se utiliza, y el citoplasma, el músculo, los eritrocitos y la queratina se tiñen de rojo brillante. 3.4.4

Método de Van Giesson.-

Tipo de tinción tricrómica, éste es otro método de tejido conectivo, en el cual el colágeno se tiñe de rojo, los núcleos se tiñen de azul y los eritrocitos y citoplasmas de un tono amarillento. Cuando se una en combinación con una tinción elástica, la elastina se tiñe de negro o azul, además de los datos descritos anteriormente. Esta técnica de tinción es particularmente útil para el estudio de vasos sanguíneos y piel. 3.4.5

Método de Mallory.-

Este es un método de tinción tricrómica. Permite distinguir fibras colágenas, reticulares, elásticas así como fibrillas neurogliales. Se usan tres colorantes ácidos: azul de anilina, para la tinción selectiva hacia el colágeno; fucsina ácida, para la tinción del citoplasma en general y también de núcleos; y naranja G, para la tinción de eritrocitos. 3.4.6

Método de impregnación argéntica.-

Es un método que se emplea para teñir las fibras reticulares y las membranas basales. Es una técnica especial de tinción de tejidos del sistema nervioso. Dentro de esta encontramos otras técnicas, entre las que se puede mencionar: 3.4.6.1 Técnica de Golgi.Esta técnica fue la precursora de todas las técnicas de impregnación argéntica. La impregnación se realiza sobre el tejido fijado en bloque, es decir, sin cortarlo previamente, en dicromato de potasio y posterior impregnación con nitrato de plata. Luego se lo incluye en celoidina y se lo corta. Como resultado, se observan neuronas, glía y vasos de color negro sobre un fondo amarillo de aspecto semejante al acrílico. La coloración es selectiva, impregnándose entre el 5 y el 20 % de las neuronas y células gliales; pero las que lo hacen, se impregnan completamente, con todas sus prolongaciones. Se utiliza para el estudio de campos dendríticos y colaterales axonales. No se observan detalles citológicos. 3.4.6.2 Técnica de Cajal.Técnica de impregnación argéntica, la impregnación se hace con nitrato de plata y la reducción con solución reductora de Cajal- hidroquinona, formol y acetona-. El núcleo se tiñe de un color amarillo pálido y las prolongaciones neuronales y gliales y algunos vasos aparecen impregnados de color marrón.

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Permite el estudio de prolongaciones neuronales, dando una imagen más completa del tejido nervioso. No es posible observar detalles citológicos ni el núcleo celular. 3.4.7

Métodos inmunohistoquímicos.-

Se fundamenta en la capacidad de las células de responder ante sustancias extrañas o antígenos, produciendo compuestos llamados anticuerpos. De esta manera se utiliza un anticuerpo específico, que se marca mediante un enlace químico con una sustancia que se puede ver sin que se afecte la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno. Estos métodos son muy útiles para clasificar tumores malignos indiferenciados, clasificar leucemias y linfomas, determinar el origen de tumores metastáticos y detección de moléculas con significado pronóstico o terapéutico como por ejemplo receptores hormonales. 4. Conclusiones.

 





La técnica histológica comprende un proceso detallado de pasos para la preparación de muestras, los cuales deben ser seguidos fielmente y sin omitir ninguno de ellos, para así obtener buenos resultados una vez que las muestras sean estudiadas a través del microscopio. Debe tomarse en cuenta las recomendaciones en cuanto a la obtención de tejidos, esto para no alterar las muestras antes de que estas puedan ser sometidas al proceso de preparación para su posterior estudio. Deben de tomarse en cuenta los puntos señalados en lo que son la etapa de sección y de coloración o tinción de tejidos. En el primer caso, debe seguirse el margen de grosor impuesto para las láminas cortadas por el micrótomo, ya que esto determinará que la muestra pueda ser vista posteriormente por medio del microscopio. En el segundo caso, se conocen diversos colorantes para los tejidos de acuerdo a una clasificación en ácidos y básicos, se debe tomar en cuenta para su uso, el tipo de tejido que va a someterse a coloración, de modo que la sustancia pueda adherirse al tejido correctamente y la tinción o coloración sea efectiva. Respecto a la investigación en sí, concluimos que esta fue positiva en general, con un trabajo equitativo por parte de la mayoría de los integrantes del grupo, los cuales se desenvolvieron en todas las fases de desarrollo de la investigación: recolección de datos, asignación de partes para la exposición, elaboración de diapositivas, etc. Finalmente, consideramos que esta investigación tiene mucho valor e importancia, puesto que, nos introduce no solo a la aplicación de las técnicas histológicas, sino a la asignatura en sí, la cual estamos actualmente abordando.

5. Bibliografía.-

GARTNER P. Leslie; HIATT L. James; Texto Atlas de Histología; Segunda edición; Edit. Mc Graw Hill Interamericana; Distrito Federal; México; 2002; Pág. 1-11. PADILLA V. Alfonso; La técnica de histología y citología; La Paz; Bolivia, 2012; Págs. 1-13. MONTALVO A. César E.; Técnica histológica; Agosto 2010; doc. Formato PDF. MORA V. Gustavo; Ténicas histológicas y coloraciones; disponible en: http://es.vbook.pub.com/doc/55731070/Tecnicas-histologicas-y-coloraciones

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ROMERO P. José A.; Introducción al estudio de la histología y morfología celular; Febrero 2009; doc. Formato PDF. Atlas de Histología animal y vegetal; Tinciones generales; Octubre 2009; disponible en: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/5-general.php La microtomía; disponible en: http://es.vbook.pub.com/doc/53678729/Tema-5-El-Microtomo Sección Biología Celular- Biología del desarrollo; Técnica histológica de rutina; 2008; doc. Formato PDF. Técnicas de tinción del Sistema Nervioso; disponible en: http://medicinauba.blogspot.com/2009/05/tecnicas-de-tincion-del-sistema.html

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