Virus

El capítulo que van a leer a continuación corresponde a los aspectos generales de los virus. Pertenece al Libro de la Dra. Guadalupe Carballal “VIROLOGIA MEDICA”. Editorial El Ateneo. 2° edición. Si bien es del año 1996 los conceptos generales están vigentes, mientras que las consideraciones más modernas, de cada virus en particular, se abordarán en los diferentes capítulos de este módulo Virología del curso. Capitulo 1 VIROLOGIA: ASPECTOS GENERALES Dra. Carballal 1. PROPIEDADES DE LOS VIRUS 1.1. Concepto y características Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los animales y plantas, que pueden afectar también a las bacterias. En este libro analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano. Debido a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo intracelular obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.). Los virus pueden definirse como agentes infecciosos caracterizados por: a) ser parásitos intracelulares obligados; b) su pequeño tamaño, 20 a 250 nanómetros (nm) c) poseer una estructura elemental y un mecanismo especial de replicación. Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y multiplicación, tales como los que poseen las células procarióticas o eucarióticas (sistemas enzimáticos productores de energía, o necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos y de proteínas, ribosomas, etc.) deben necesariamente utilizar los sistemas de la célula que parasitan y por ello se denominan parásitos intracelulares obligados. Sin embargo, la mayoría de los virus poseen enzimas especiales necesarias para iniciar su replicación (transcriptasas) u otras enzimas y, a veces, ribosomas de origen celular. 1.2. Tamaño La mayoría de los virus poseen un tamaño muy inferior al de las bacterias, por ello, solo pueden observarse adecuadamente en el microscopio electrónico; sin embargo, los virus más grandes son de mayor tamaño que ciertas bacterias pequeñas o que los

micoplasmas (fig. 1). Dado su pequeño tamaño, es necesario utilizar para su medición una medida inferior al micrón, llamada nanómetro (nm) o milimicrón (m). Los virus más pequeños, por ejemplo los que integran la familia Picornaviridae, donde se incluye el virus de la poliomielitis y el virus de la hepatitis A, entre otros, , miden alrededor de 27 nm y los más grandes, como los de la familia Poxviridae, donde se encuentran por ejemplo el virus de la viruela y el del molusco contagioso, miden aproximadamente 250 nm (tabla 1).

Fig. 1. Tamaño comparativo de los virus con otros agentes infecciosos. Tabla 1. Equivalencias de las unidades de medida y límites de resolución de los microscopios utilizados en microbiología Milimicrón (mμ) o nanómetro (nm) 10 -9 metros Ángstrom (Ǻ) 10-10 metros Micrón (μm) 10-6 metros Microscopio óptico = 250 nm Microscopio de fluorescencia =125 nm Microscopio electrónico 0,5 a 0,05 nm Tamaño promedio de los virus 20 a 300 nm Tamaño promedio de las bacterias 0,7 a 10 μm

Linfocito

10 μm

1.3. Estructura La composición química de un virus se conoció por primera vez en el año 1933 y se determinó que estaba constituida por ácidos nucleicos y proteínas. Posteriormente, se demostró que todos los virus poseen un solo tipo de ácido nucleico ya sea ácido desoxirribonucleico (ADN) o ribonucleico (ARN). Una partícula vírica esta constituida por el ácido nucleico que se encuentra protegido por una cubierta proteica denominada cápside y a veces, por una envoltura de composición lipoproteica (fig. 2). La partícula viral completa e infectante se denomina virión. El ácido nucleico, ya sea ADN o ARN constituye el nucleoide y, asociado a proteínas se designa como core viral. En éste se encuentra toda la información genética del virus y es el responsable de la infectividad. El core está protegido por la cápside y, en ciertos casos, por una envoltura lipídica. La cápside está formada por subunidades proteicas denominadas capsómeros o unidades morfológicas que se encuentran en la superficie de la partícula. Los capsómeros están formados por subunidades proteicas denominadas protómeros. Los capsómeros pueden ser estructuras esferoidales huecas (por ej. en los adenovirus) o en forma de prisma con una zona hueca central (por ej. en los herpesvirus). La cápside tiene las siguientes funciones: a) la protección del ácido nucleico de la desecación y de las enzimas titulares b) la de presentar estructuras que permitirán la unión del virus a los receptores de membrana de la célula que infectarán. Esto sucede en los virus desnudos, es decir carentes de envoltura. c) la de actuar como complejo antigénico, estimulando la respuesta inmune del huésped. La mayoría de los virus desnudos son resistentes al medio externo, a la desecación y a los solventes de lípidos. Algunas familias de virus poseen, fuera de la cápside, una envoltura lipoproteíca. Aquellos virus que la poseen se denominan envueltos. Dado que la envoltura está constituida por lipoproteínas, todos los virus con envoltura son muy sensibles a los solventes de lípidos, tales como el éter y sales biliares. En la envoltura se encuentran glicoproteínas que constituyen importantes antígenos del virus. Las funciones de la envoltura son similares a las de la cápside.

En los virus envueltos es la envoltura la que presenta estructuras que permitirán la unión a receptores de la célula huésped. Se trata de glicoproteínas ancladas en la membrana a modo de espículas (tabla 2). Tabla 2. Estructura de un virión NUCLEOCAPSIDE nucleoide ADN o ARN

* información genética * infectividad

Cápside

proteínas

* protección del nucleoide * unión a receptores celulares * determinantes antigénicos

ENVOLTURA

lipoproteínas

* protección del nucleoide * unión a receptores celulares * determinantes antigénicos

1.4. Diferencias con bacterias, micoplasmas, clamidias y rickettsias Los virus se diferencian de otros agentes patógenos en su organización, composición química y mecanismos de replicación (tabla 3). Los virus poseen un solo tipo de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN pero nunca ambos. No crecen ni se multiplican por fisión binaria y su replicación siempre produce más de una copia. Todos los virus se replican por síntesis y ensamble de los componentes recientemente formados en el interior de la

célula huésped. Por esta razón, son parásitos intracelulares obligados y no pueden replicar en medios inertes como lo hacen las bacterias, ya que estos medios carecen de células vivas. La unión a la célula que infectarán es el paso inicial de la replicación viral y se produce por interacción de las estructuras presentes en la superficie del virión con receptores de la membrana de la célula huésped. Algunos viriones contienen polimerasas, enzimas necesarias para iniciar el ciclo replicativo; otros pocos, poseen ribosomas de origen celular (leucovirus y arenavirus), cuya función en el virión no se conoce con exactitud. Una vez formados los nuevos viriones, estos saldrán de las células donde replicaron e iniciaran nuevos ciclos de infección en otras células. Las principales diferencias entre los virus y otros agentes que producen patología en el ser humano se resumen en la tabla 3. Tabla 3. Diferencias entre virus, bacterias, micoplasmas, clamidias y rickettsias Virus Rickettsia Clamidia Micoplasma Bacteria Ácido nucleico ADN o ARN Ambos Ambos Ambos Ambos Fisión binaria No + + + + Enzimas met.energético No + + + Ribosomas No + + + + Replicación en medios inertes No No No + + Tamaño 20-250mm 300 nm 250 nm 0,7 a 10 1 m m * Algunos virus, excepcionalmente, poseen ribosomas de origen celular, por ejemplo arenavirus . 1.5. Composición química: ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y glúcidos Ácidos nucleicos: Los virus se clasifican en dos grandes grupos de acuerdo con el tipo de su ácido nucleico. Si este es ADN se denominan desoxirribovirus y, si es ARN, ribovirus. Los ribovirus constituyen junto con los viroides, los únicos organismos hasta ahora conocidos en la naturaleza, en que el ARN es el portador de toda la información genética. Los ácidos nucleico s pueden ser monocatenarios, es decir estar formados por una sola cadena de nucleótidos, o bicatenarios, es decir doble cadena de nucleótidos. En los ribovirus, el ARN es generalmente monocatenario (togavirus, mixovirus, picornavirus) siendo la excepción los reovirus que poseen ARN bicatenario. Los desoxirribovirus presentan en general un ADN bicatenario (adenovirus, poxvirus y herpesvirus), con la excepción de los parvovirus y algunos fagos en que el ADN es monocatenario.

Los pesos moleculares del ácido nucleico y, por ende su longitud, dependen de la complejidad del virus y pueden variar desde 1,6 a 160 millones de daltons. Los ácidos nucleicos pueden ser moléculas continuas lineales o circulares, o bien segmentadas. Las moléculas circulares pueden a su vez ser planas o hiperenrolladas (fig. 3).

Fig. 3. Tipos de ADN. ADN bicatenario: I, forma lineal; II, forma circular; III, forma circular hiperenrollada.

Los virus se clasifican por convención en virus de polaridad positiva o negativa, según tengan o no polaridad de mensajero. En los ribovirus monocatenarios, el ARN puede ser de cadena positiva, es decir, con polaridad de ARN mensajero o por el contrario, presentar cadena negativa, con polaridad de antimensajero. También existen ARN virus con polaridad mixta o ambisense, por ejemplo los arenavirus. Los desoxirribovirus monocatenarios tienen en general cadena positiva; los bicatenarios poseen una cadena positiva y otra negativa. Los retrovirus, son una excepción y poseen dos cadenas idénticas de ARN que están invertidas, lo que se denomina dímero invertido. La proporción de ácidos nucleicos en el virión varía mucho de acuerdo con la familia que se considere. La proporción de ácido nucleico es del 1 % en el virus de la influenza y puede llegar a un 50 % en algunos bacteriófagos. La cantidad de información genética contenida varía de acuerdo al tamaño del genoma. Pueden tener 1.000 a 100.000 codones. Si consideramos que un gen posee alrededor de 300 codones se puede concluir que los virus más pequeños pueden tener 4 a 8 genes y los mayores varios centenares. A mayor tamaño del genoma, mayor será la información para gran diversidad de proteínas específicas. La composición de bases es variable. La proporción de guanina citosina varía mucho. En los virus de mayor tamaño (ej. herpes), esta proporción difiere en mayor grado con la

célula huésped que en aquellos virus de menor tamaño en que es más parecida al ADN celular. Los ácidos nucleicos constituyen la base de la infectividad del virus. Estas moléculas son, en general, muy frágiles y pierden su actividad rápidamente si no están protegidas por la cápside y/o la envoltura. Sin embargo, en algunos virus (por ej. los poliovirus) que poseen un ARN con polaridad de mensajero, el ARN puro, separado de las cubiertas del virión e introducido artificialmente en los cultivos, es capaz de infectar y dar lugar a la formación de nuevos viriones. Esto se denomina ácido nucleico infeccioso. Por el contrario, en la mayoría de los virus, el ácido nucleico puro separado del virión no es capaz de dar origen a progenie ya que necesita de las actividades de polimerasas presentes en el virión, sin las cuales la replicación no puede iniciarse. Proteínas: Las proteínas constituyen la parte cuantitativamente más importante de los virus (50 a 90 %). Según el tamaño y complejidad del virión éste puede contener desde 2 a 30 polipéptidos estructurales diferentes. Las proteínas del virión pueden ser estructurales o no estructurales. Se define como proteína estructural a aquella que está presente en el virión generalmente en proporción importante y manteniendo la estructura del mismo. El virión puede contener proteínas de superficie y proteínas internas. Las proteínas de superficie constituyen los capsómeros que dan lugar a la cápside, así como también las proyecciones de la envoltura, denominadas peplómeros (del griego peplos = túnica). En aquellos virus que presentan simetría icosaédrica, los capsómeros están formados por polipéptidos (1 a 6 moléculas) de la misma clase (homopolímeros) o de clase diferente (heteropolímeros) (mero = parte). La cápside constituye como un recipiente formado por los capsómerosn en número variable según el tamaño del virus que se trate. En los virus con simetría helicoidal, los capsómeros están constituidos por un único tipo de proteína y se denominan protámeros. Las cápsides así constituidas son muy resistentes a la digestión por enzimas proteolíticas y al medio externo. Las proteínas de la envoltura, que son proyecciones denominadas peplómeros son glicoproteínas que pueden tener, en determinados casos, funciones biológicas importantes tales como actividad de hemaglutinina o de neuraminidasa. Las hemaglutininas virales, en general se unen a receptores mucoproteicos presentes en ciertas células (glóbulos rojos, células del tracto respiratorio, etc.) permitiendo así la adsorción, mientras que la enzima neuraminidasa en general es la que cliva esa unión permitiendo la liberación del virus. En algunos virus existen otras glicoproteínas que actúan como factor de fusión, etc. Las proteínas de superficie de los virus tienen las siguientes funciones: a) constituyen un mecanismo de protección del genoma contra la acción de las nucleasas bacterianas o titulares

b) presentan afinidad con receptores celulares, lo que iniciara la adsorción y penetración del virus a la célula huésped; esta afinidad selectiva será la que determine el tropismo del virus por determinados tejidos c) poseen capacidad antigénica, ya que las proteínas externas constituyen potentes inmunógenos, que inducirán en un huésped inmunocompetente una respuesta inmune, mediada fundamentalmente por anticuerpos neutralizantes. Estos anticuerpos son los responsables de la protección del huésped. Las proteínas estructurales internas del virión pueden ubicarse: a) en la cara interna de la envoltura, por ejemplo la proteína M de los paramixovirus b) entre capas de capsómeros colocados debajo de la cápside (cápside interna) c) en el centro del virión, asociadas al core. Estas últimas suelen ser histonas. Un ejemplo de proteínas no estructurales lo constituyen las enzimas requeridas para el ciclo de replicación que se sintetizan en las fases tempranas de la replicación: pueden detectarse en las células infectadas, pero no se incorporan al virión, como ocurre por ejemplo con la polimerasa del virus polio. En otros casos, algunas de esas enzimas son constituyentes virales, por ejemplo la polimerasa ARN dependiente del virus de la influenza o la transcriptasa reversa de HIV. Las proteínas internas son, en general, menos antigénicas y los anticuerpos que inducen no son protectores. La enorme diversidad de proteínas que pueden presentar los virus permite distinguir entre virus de los diferentes grupos y, aun dentro de un mismo grupo, identificar diferentes serotipos (tipos antigénicos). Esto constituye una de las bases de la clasificación viral. Glúcidos y lípidos: Algunos virus poseen glúcidos y lípidos en pequeñas cantidades. Los virus con envoltura contienen lípidos o glicolípidos de origen celular, ya que adquieren su envoltura por brotación en la membrana celular o nuclear de la célula huésped. Todos los virus con envoltura son sensibles a los solventes de lípidos como éter, cloroformo, sales biliares y detergentes. Otros virus poseen pequeña cantidad de lípidos de origen viral (poxvirus) y glúcidos que forman parte de las glicoproteínas presentes en la envoltura (mixovirus y paramixovirus). 1.6. Concepto de simetría: helicoidal, icosaédrica y compleja La simetría, es decir la forma que adopta un virus en el espacio está dada por la estructura de su nucleocápside. La simetría puede ser helicoidal, icosaédrica o compleja (tabla 4).

Tabla 4. Simetría de algunas familias de virus Los virus con simetría helicoidal son aquellos que presentan una nucleocápside cilíndrica que puede estar extendida, como en el virus del mosaico del tabaco (que infecta las plantas de tabaco) o en el bacteriófago M13 —ambos son virus desnudos— o bien arrollada sobre sí misma y recubierta por una envoltura, como por ejemplo en el virus de la influenza (fig. 4). Los virus con simetría icosaédrica son poliedros regulares con 20 caras triangulares, 30 aristas y 12 vértices. Los virus con esta simetría pueden ser desnudos, por ejemplo el virus de la poliomielitis o el adenovirus, o estar recubiertos de envoltura como los herpesvirus o los togavirus (fig. 5). Fig. 4. Simetría helicoidal: A, desnuda, virus del mosaico del tabaco; B, envuelta, ortomixovirus.

Fig. 5. Simetría icosaédrica: A, desnuda, adenovirus; B, envuelta, herpesvirus. Se denominan virus de simetría compleja a aquellos que presentan una nucleocápside helicoidal o icosaédrica recubierta por una envoltura laxa. Pueden ser ovoides, esféricos o pleomórficos dado que la envoltura no es rígida. Los poxvirus poseen forma de ladrillo y son ejemplo de esta simetría. También se incluyen como de simetría compleja a algunos bacteriófagos que poseen una cabeza con simetría icosaédrica y una cola con simetría helicoidal (fig. 6).

Fig. 6. Simetría compleja. 2. CONCEPTO DE REPLICACIÓN VIRAL: ETAPAS Al carecer de las enzimas biosintéticas necesarias para su replicación los virus no crecen, no aumentan de tamaño ni su división es por fisión binaria. Por esta razón, no pueden replicarse en medios de cultivo inertes (como los usados para las bacterias) sino que necesitan de células vivas. La replicación se hace en el interior de una célula huésped susceptible. En los comienzos de la virología, se utilizaron embriones de pollo o de pato y o animales de experimentación (ratones, cobayos o conejos). Posteriormente, con el advenimiento de las técnicas para mantener vivas células in vitro se pudieron desarrollar infinidad de cultivos celulares, aptos para la replicación de la mayoría de los virus que causan patología humana y animal. En la actualidad, para el aislamiento de los virus humanos se utilizan casi exclusivamente los cultivos celulares (ver ítem 7.2). Luego de la penetración del virus en una célula susceptible, la replicación se lleva a cabo utilizando los mecanismos biosintéticos de la célula, dirigidos por la información contenida en el ácido nucleico viral (ADN o ARN). Este actúa como codificador de los mecanismos enzimáticos de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. De esta forma, la célula parasitada por un virus en vez de producir sus propios ácidos nucleicos y proteínas, recibe órdenes codificadas en el genoma viral para sintetizar productos virales que, luego de su ensamble darán lugar a la formación de nuevos viriones. Estos saldrán de la célula donde replicaron para iniciar nuevos ciclos de replicación en otras células susceptibles. La replicación viral puede dividirse en las siguientes fases o etapas: 1) Adsorción: que depende de la interacción de proteínas de superficie del virus con receptores celulares específicos.

2) Penetración y descapsidación: La penetración a través de la membrana plasmática de la célula puede efectuarse por diversos mecanismos. Puede ocurrir un pasaje directo (ej. adenovirus y picornavirus) o una fusión de la membrana celular con la envoltura viral (ej. paramixovirus, herpes) o bien un mecanismo conocido como endocitosis o viropexis, que es el más frecuente. Este consiste en un fenómeno similar a la fagocitosis en el cual el virus es incluido en una vacuola fagocítica. Luego de la penetración se produce la descapsidación, es decir la liberación del nucleico viral de la nucleocápside. 3) Eclipse: En esta etapa no pueden observarse viriones en el interior de la célula, ni se recupera virus infeccioso. 4) Latencia: Este período va desde que se pierde la infectividad inicial hasta que se la recupera debido a la aparición de los nuevos viriones. Durante las fases de eclipse y latencia ocurre la biosíntesis de los ácidos nucleicos y de las proteínas virales. 5) Maduración: Se produce el ensamble de los ácidos nucleicos neoformados con las proteínas de la cápside. 6) Liberación: Los viriones recién formados pueden salir de la célula por lisis de la misma (ej., poliomielitis) o bien por brotación a través de la membrana celular (ej., paramixovirus, arenavirus); de la membrana nuclear (herpesvirus) o del retículo endoplásmico (togavirus). 3. TIPOS DE HUÉSPEDES Si bien casi todos los seres vivos pueden ser infectados por virus, la relación virushuésped es claramente específica. Cada virus afecta solamente a un grupo bien definido de especies biológicas (hombre, animales, vegetales o bacterias) y dentro de ellas, solamente a algunas células. Esto se debe a la especificidad de la unión del virus a receptores ubicados en la membrana celular, cuya presencia se debe tanto a factores genéticos como fisiológicos. Por estas razones, aún antes de que se conociera la estructura y formas de replicación de los virus, se los clasificaba teniendo en cuenta las especies y los tejidos que afectaban. Así, se hablaba de virus dermotropos, neumotropos, hepatotropos, neurotropos y pantropos. Actualmente, se ha reconocido que esta clasificación es artificial ya que muchos virus afectan a diversos tejidos, aunque las manifestaciones de la infección sean más evidentes en un determinado tejido u órgano. Por ejemplo, el virus del sarampión produce manifestaciones evidentes en piel y mucosas, pero puede infectar también otros órganos como pulmón o cerebro. Los virus que afectan animales y plantas no infectan en general al hombre. Constituyen una excepción aquellos virus que son productores de zoonosis (enfermedad común al hombre y animales). En estos casos los virus pueden replicar tanto en el hombre como en animales reservorios y en artrópodos vectores. Como ejemplos de zoonosis podemos

mencionar a la rabia, las enfermedades producidas por arbovirus (fiebre amarilla, encefalitis equinas) y por arenavirus (fiebre hemorrágica Argentina, fiebre de Lassa, etc.). La clasificación actual de los virus toma en cuenta no solamente los huéspedes, sino también otros aspectos tales como el tipo de ácido nucleico, la simetría, la presencia o no de envoltura, las diversas proteínas constitutivas del virión, el lugar de replicación, etc. (ver ítem 4). Sin embargo, el médico debe ensamblar la clasificación moderna con el tropismo de cada virus porque la acción patógena viral dependerá de su tropismo y según ella se orientará la confirmación etiológica dentro de un espectro limitado de virus causantes de una patología determinada. 3.1. Interacción de los virus con la célula huésped El efecto de la infección viral sobre las células depende tanto de las características del virus como de la sensibilidad de las células. Al igual que sucede con los bacteriófagos, los virus animales se clasifican en citocídicos o no citocídicos (citocidales o no citocidales). También se de denomina efecto o acción citopatogénica (ECP o ACP) Se denominan virus citocídicos aquellos que producen la lisis de la célula en que replican, lo cual se puede observar histológicamente (por ej., el virus de la poliomielitis si afecta la médula espinal, lesionará en forma irreversible las motoneuronas del asta anterior, ocasionando así una parálisis permanente de los músculos inervados por dichas neuronas). Otros virus, en cambio, se denominan no citocídicos, porque pueden replicar sin destruir a la célula huésped. Esto sucede por ejemplo con los arenavirus. Sin embargo, esto no significa que no existan alteraciones de algunas funciones celulares que no son indispensables para la vida de la célula y por ello denominadas de lujo, como la producción de hormonas. Por ejemplo, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCM) que puede inhibir la producción de la hormona de crecimiento (somatostatina) en ratones infectados. Dentro de los virus no citocídicos se encuentran también aquellos capaces de integrarse al genoma celular como los retrovirus o los herpesvirus e inducir estados de portador (periodos de latencia). Se denomina infección productiva a aquella que da origen a nuevos viriones como consecuencia de la replicación. Las infecciones productivas son las que se producen habitualmente cuando un virus infecta células susceptibles. Por el contrario, cuando un virus infecta células no totalmente susceptibles o bien cuando el virus presenta defectos en su replicación se producen infecciones abortivas es decir, sin producción de nuevos viriones. Las infecciones abortivas pueden detectarse mediante la búsqueda de antígenos virales en las células infectadas.

3.2. Los virus: ¿son seres vivos? Si la vida se define como una serie compleja de procesos resultantes de plasmar la información codificada por los ácidos nucleicos, los virus son seres vivos solo cuando invaden una célula huésped y pueden replicarse. Desde este punto de vista, no serían seres vivos cuando cristalizan o cuando se encuentran conservados en congeladoras a -70°C o en nitrógeno líquido a -196°C. En estas circunstancias, es decir fuera de una célula, son metabólicamente inertes, si bien conservan su potencialidad de infección. Cuando en 1953 Stanley pudo cristalizar el virus del mosaico del tabaco se suscitaron discusiones sobre el hecho de que los virus fueran o no seres vivos. Al respecto, podría aplicarse a ellos la frase del Evangelio:...Los conoceréis por sus obras"... Es decir, por sus efectos sobre la célula que infectan. 4. FUNDAMENTOS DE LA CLASIFICACIÓN ACTUAL DE LOS VIRUS Todos los seres vivientes pueden ser parasitados por virus. Los virus pueden clasificarse de acuerdo con sus huéspedes, forma de transmisión o por sus propiedades fisicoquímicas. De acuerdo con sus huéspedes, los virus pueden ser clasificados como virus de vertebrados, virus de insectos, virus de plantas, virus de bacterias (bacteriófagos) y de parásitos. Anteriormente, los virus se clasificaban de acuerdo con su especificidad de huésped, con el tipo de enfermedades producidas o bien con su tropismo tisular. Así, por ejemplo, los arbovirus replican en un artrópodo vector, los poliovirus producen poliomielitis, los adenovirus se aislaron de adenoides, etcétera. Desde un punto de vista epidemiológico, los virus pueden transmitirse por vía respiratoria, digestiva, cutáneomucosa o ingresar directamente a la sangre a través de picaduras de artrópodos (arbovirus) o bien por inoculación de sangre (transfusiones) o materiales contaminados con sangre (virus de hepatitis B, C, Delta, virus HIV). Los virus entéricos son aquellos que penetran y replican primariamente en el tracto gastrointestinal. Este grupo incluye numerosos virus desnudos y por ello resistentes al ácido y a las sales biliares, como los enterovirus (virus de poliomielitis, Coxsackie y virus de la hepatitis A), rotavirus, calicivirus, etc. Los virus respiratorios penetran a través de la mucosa respiratoria, por inhalación o por contacto con materiales contaminados (manos, pañuelos, etc.) y producen patología localizada exclusivamente en el aparato respiratorio. Este grupo incluye a los ortomixovirus, muchos de los paramixovirus, coronavirus, rinovirus y algunos adenovirus. Otros virus, si bien penetran por vía respiratoria se diseminan a otros órganos por viremia, como el virus del sarampión, el de paperas, rubéola y viruela.

El termino arbovirus se aplica a aquellos virus que infectan a artrópodos hematófagos y replican en ellos. Se transmiten al hombre o a los animales por picadura del vector (por ej., mosquito). El nombre proviene del inglés (arthropod-borne viruses). Dentro de los arbovirus se incluyen cuatro familias que se trasmiten por artrópodos; togavirus, flavivirus, bunyavirus y orbivirus. Actualmente, existe un Comité Internacional de Taxonomía que se encarga de la clasificación de los virus y de la inclusión de los nuevos agentes virales que se descubren, en el lugar que les corresponde. Los virus se agrupan en familias y estas se subdividen en géneros. La subdivisión de los géneros en especies esta todavía en discusión. Los criterios para definir una familia son: 1) tipo de ácido nucleico, características del mismo y mecanismos de replicación; 2) tamaño del virión y simetría de la cápside; 3) número de capsómeros en el caso de los virus desnudos o diámetro de la hélice en los virus helicoidales; 4) presencia o no de envoltura; 5) lugar de ensamble de las partículas virales (núcleo o citoplasma); 6) forma de salida de la célula huésped (por lisis o por brotación). Los virus que causan patología en el hombre se agrupan actualmente en 17 familias que incluyen aquellos virus con características similares (tabla 5 y fig. 7). Las características generales de cada familia así como sus integrantes se detallaran al comienzo de cada capítulo. La subdivisión de las familias en géneros depende de criterios diferentes según las familias. Cada género puede tener cientos de especies distintas, las que se identifican por diferencias serológicas. Tabla 5. Clasificación de los virus y principales características de las familias

#: ácido nucleico infeccioso; •: pasan a ADN por medio de la transcriptasa reversa. pol: polaridad del genoma; segm.: genoma segmentado; PM; peso molecular expresado en daltons.? desconocido. capsomeros o hélice: número de capsomeros o diámetro de la hélice.

Existen muchos virus aún en proceso de clasificación y los nuevos métodos pueden ser variados.

5. VIRIONES, VIROIDES Y PRIONES Se denomina virión a la partícula viral completa e infectarte. Es decir a aquella partícula que posee todas sus características intactas y, por ende, es capaz de infectar a una célula huésped (fig. 2). Existe otro tipo de partículas virales que se denominan defectivas porque son defectuosas en algún aspecto de su replicación. Por ello, no pueden dar lugar a nuevos viriones pero pueden interferir con la replicación normal; esto se denomina fenómeno de autointerferencia. Las partículas defectivas pueden competir con los viriones por los receptores celulares (fenómeno de von Magnus); ésto se ha descripto con el virus de la influenza y con el de la hepatitis B, entre otros. Cuando el genoma viral se encuentra integrado al genoma de la célula huésped se denomina provirus. Esto ocurre por ejemplo, en la familia Retroviridae. Este genoma puede quedar en estado latente durante años, o bien transcribirse luego de la inducción que puede ser espontánea u ocurrir como consecuencia de diversos estímulos. No se conocen con exactitud cuales son los mecanismos de inducción pero se postula que estarían controlados por genes celulares (Retrovirus). De todas formas, la existencia de un provirus puede modificar la membrana de la célula huésped y además es capaz de inducir la transformación celular. Dentro de los agentes que producen enfermedades en las plantas, se ubican los viroides, descubiertos por Dienner en 1971. Los viroides presentan como los virus un único tipo de ácido nucleico y son parásitos absolutos. Sin embargo, se diferencian de los virus en que carecen totalmente de cápside y de envoltura y no poseen información para la síntesis de proteínas. Son altamente resistentes a los agentes externos como calor y su ácido nucleico es siempre infeccioso en condiciones naturales. Producen enfermedades en diversas plantas (pepino, crisantemo, cítricos, etc.). Finalmente, existen agentes virales llamados no convencionales. Estos comparten algunas propiedades con los virus, pero se diferencian en su estructura y en su extraordinaria resistencia a los agentes que inactivan a los virus como el calor, luz ultravioleta, formol, glutaraldehído, etc. Carecen de cápside o envoltura y no se conoce su ácido nucleico, por lo que serian los primeros agentes infecciosos sin ácido nucleico detectable hasta el momento. Son productores de infecciones lentas del sistema nervioso central que afectan al hombre (kuru o ataxia degenerativa endémica; y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o demencia presenil) y al ganado ovino (scrapie). Inicialmente se pensó que estas enfermedades eran producidas por viroides, pero recientemente se pudo aislar de la sustancia amiloide de estos enfermos unas glicoproteínas capaces de transmitir la enfermedad a ratones. Se las denominó priones y se observan como fibrillas de 20-200 nm al microscopio electrónico. Son muy resistentes a todos los agentes inactivantes de virus y no poseen capacidad antigénica. No se

conoce su mecanismo de replicación pero algunos autores postulan que dado su pequeño tamaño no poseen la información genética necesaria para su propia síntesis, por lo que esta estaría codificada en el ácido nucleico de la célula huésped. Normalmente esa información estaría reprimida y la infección con priones produciría su desrepresión y por lo tanto la replicación del prión y el desarrollo de enfermedad. 6. EFECTO DE AGENTES FISICOQUIMICOS SOBRE LOS VIRUS Diversos agentes fisicoquímicos pueden actuar sobre los constituyentes del virión produciendo su inactivación. En general, los virus son más sensibles que las bacterias o los hongos a la acción de los agentes físicoquímicos. El conocimiento de la sensibilidad de los virus a las condiciones ambientales es importante para determinar la viabilidad de muestras clínicas para diagnóstico virológico, para la conservación de vacunas virales a virus vivo y para estimar la infectividad a temperatura ambiente. Asimismo, es fundamental conocer la viabilidad de los virus para poder lograr una inactivación adecuada de aquellos materiales contaminados que necesitan desinfección o para efectuar el tratamiento indicado para un correcto abastecimiento de agua potable, etc. Entre los inactivantes físicoquímicos pueden mencionarse la temperatura, luz ultravioleta, el pH, medio iónico y los solventes de lípidos. 6.1. Temperatura La mayoría de los virus son lábiles al calor. En general es suficiente una hora a 55-60° C para inactivar a la mayoría de los virus por desnaturalización de las proteínas de la cápside, lo que impide la adsorción y la decapsidación. Constituyen excepciones a esta regla el virus de la hepatitis B, los adenoasociados y viroides, que resisten esa temperatura. Como regla general, la vida media de la mayoría de los virus puede ser medida en segundos a 60°C, en minutos a 37°C, en horas a 4°C, en días a -20°C, en meses a -70°C y en años a -196°C. La esterilización por calor seco en estufa (1 ½ hora a 180°C) o por calor húmedo en autoclave (30 minutos a 120°C y 1 1/2 atmósfera de presión por encima de la presión atmosférica), destruyen a todos los virus, incluyendo a los más resistentes como el de hepatitis B. Por esta razón la esterilización en estufa o autoclave es el procedimiento de elección. La temperatura ambiente, destruye muchos virus aunque el tiempo requerido para la inactivación depende de las características de la familia. Por ejemplo, el virus de hepatitis B y los poxvirus (viruela) pueden conservar su infectividad a temperatura ambiente durante meses. En cambio, otros como los ortomixovirus (influenza) o los paramixovirus (sarampión) se inactivan en pocas horas.

Por estas razones, es fundamental que las muestras clínicas para diagnóstico virológico por aislamiento sean conservadas a la temperatura adecuada, es decir a 4°C en hielo granizado y enviadas al laboratorio en el menor tiempo posible. Es importante evitar la congelación ya que muchos virus, en especial aquellos con envoltura como el virus sincicial respiratorio, o el citomegalovirus son muy sensibles a la congelación y descongelación. Solamente deberán congelarse aquellas muestras que necesitan ser transportadas largas distancias que no permitirían el mantenimiento del hielo granizado. Por ello, el empleo de sal para descender el punto crioscópico del mismo debería ser añadido al hielo, conservándolo como tal durante más tiempo. En el laboratorio habitualmente deben conservarse las cepas virales semillas o stocks. Esto se hace mediante congelación en pequeñas alícuotas con medios protectores conteniendo suero o dimetilsulfóxido. Las alícuotas se descongelan una sola vez para su utilización. Los stocks virales se conservan en congeladoras a -70°C o en tanques de nitrógeno líquido a -196°C durante meses o años. Otro procedimiento empleado en el laboratorio para preservar la infectividad es la liofilización (desecación al vacío). Este método se utiliza habitualmente para la conservación de vacunas virales. El hecho de que la vacuna antivariólica liofilizada pueda ser conservada durante meses, aun a temperatura ambiente, fue un factor fundamental que permitió la eficacia de las campañas de vacunación que lograron erradicar la viruela del planeta. 6.2. pH y medio iónico La mayoría de los virus se conservan mejor en medios isotónicos y a pH fisiológico, aunque algunos virus pueden soportar un amplio rango de pH y fuerzas iónicas. Por ejemplo, los enterovirus resisten el pH ácido del estomago y, por esa razón pueden penetrar por vía digestiva. En la preparación de vacunas a virus vivo y atenuado es imprescindible la preservación de la infectividad, Para ello, se adicionan ciertas sales (MgCl 2), que aumentan la resistencia a la inactivación térmica. 6.3. Radiaciones La radiación ultravioleta y las radiaciones ionizantes (rayos X o radiaciones gamma) al producir alteraciones en el genoma son capaces de inactivar los virus, en especial aquellos con ácidos nucleicos monocatenarios. Para inactivar algunas vacunas se utiliza luz ultravioleta, por ejemplo, en la vacuna antirrábica de uso humano en Argentina (Fuenzalida-Palacios). Las radiaciones ionizantes (provenientes del cobalto 60) se utilizan para esterilizar materiales plásticos de uso médico (sondas, catéteres, etc.) o de laboratorio (botellas,

tubos y policubetas para cultivos celulares). En la actualidad, la mayoría del material descartable se esteriliza por ese método. Las radiaciones ionizantes actúan alterando irreversiblemente el genoma viral. Dado que este es mucho más pequeño que el genoma bacteriano, la dosis de radiación necesaria para inactivar virus es mayor que para matar a las bacterias. La luz ultravioleta se emplea para esterilizar áreas de trabajo (flujos laminares para cultivos celulares, etc). La fuente emisora es un tubo denominado tubo germicida y la radiación emitida actúa formando dímeros entre cadenas adyacentes de pirimidinas. Dado que la luz ultravioleta posee escaso poder de penetración, sólo puede emplearse en la esterilización de superficies que reciban directamente la luz emitida. 6.4. Solventes de lípidos La presencia o no de envoltura determina la sensibilidad de los virus a los solventes lipídicos. Todos los, virus con envoltura se inactivan fácilmente con solventes de lípidos como éter, cloroformo, sales biliares, o detergentes aniónicos. Por el contrario, los virus carentes de envoltura son resistentes a estos agentes y por ello son infectivos por vía digestiva, ya que no son sensibles a las sales biliares (por ej., los integrantes de la familia Picornaviridae, que incluye a los virus d poliomielitis, Coxsackie, etc.). La sensibilidad a los solventes de lípidos es también empleada en la clasificación preliminar de virus aislados de muestras clínicas. 6.5. Esterilización y desinfección La esterilización se define como la ausencia total de microorganismos viables, mientras que la desinfección es la destrucción de la infectividad potencial de un material determinado. Un factor fundamental para prevenir las infecciones nosocomiales es el uso de los procedimientos adecuados de esterilización y desinfección. Para esterilización pueden utilizarse métodos físicos o químicos. Los métodos físicos son la temperatura, las radiaciones o los agentes mecánicos (filtración). El método a elegir depende del material a esterilizar. Por ejemplo para ropas, material de goma y soluciones tamponadas sin proteínas debe utilizarse el autoclave, ya que no resistirían el calor seco de la estufa. Para aquellos materiales que resisten el calor (vidrio, instrumental quirúrgico metálico) puede emplearse la estufa de esterilización. En caso de materiales que no resistan el calor (plásticos, sondas, etc.) se utiliza el óxido de etileno o la radiación ionizante. Para medios de cultivo que contienen proteínas, sueros animales, vitaminas, enzimas, etc., se emplea habitualmente la filtración a través de membranas especiales que

seleccionan por tamaño; es decir, al pasar la solución por un filtro de 0,2 m este retendrá a todas las bacterias y los hongos presentes. En todos los casos debe tenerse en cuenta que sólo se logrará una esterilización adecuada cuando se logre la exposición requerida en cuanto a temperatura y/o presión. La temperatura adecuada en una estufa de esterilización es 180°C durante 1 1/2 hora y, en el autoclave es 120°C durante 20 minutos a 1 1/2 atmósfera de presión por encima de la presión atmosférica. Para desinfección de superficies y material de laboratorio contaminado se utiliza hipoclorito de sodio al 10% (comúnmente llamado agua lavandina, de uso doméstico) o 1 al 5% de cloro activo. También puede emplearse glutaraldehído al 2% o ácido peracético. Es importante recordar que la solución de hipoclorito de sodio debe prepararse diariamente a la concentración adecuada, ya que se evapora y así disminuye su concentración y, por lo tanto, su efectividad como desinfectante. Para antisepsia de manos y piel no pueden utilizarse los productos recién mencionados por ser tóxicos. En este caso deberán utilizarse alcohol iodado al 2%, cloroheximida al 0,5 -1%, o bien etanol al 70%. 6.6. Vacunas a virus inactivados Las vacunas a virus inactivados están constituidas por suspensiones de virus en las que se inactiva la capacidad infecciosa conservándose la antigenicidad. El formaldehído es un inactivante clásico y fue usado por Jonas Salk para preparar la primera vacuna antipoliomielítica. El formaldehído reacciona con los grupos amino de las proteínas y los ácidos nucleicos. Para lograr una correcta inactivación de una vacuna, la suspensión no debe contener agregados de viriones que impedirían la acción del inactivante en el interior del agregado, quedando así partículas sin inactivar. Otros inactivantes utilizados para vacunas de uso humano son la luz ultravioleta y la betapropiolactona. Para inactivar vacunas animales se pueden usar, además, otros inactivantes que no están permitidos para vacunas de uso humano. 7. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LOS VIRUS (tabla 6) Los virus pueden estudiarse por métodos fisicoquímicos o bien por medio de procedimientos que demuestren su interacción con las células vivas, es decir su capacidad infecciosa.

Tabla 6. Métodos de estudio de los virus Métodos fisicoquímicos detección y * partícula virales posible caracterización de: * unidades hemaglutinantes * antígenos (proteínas o glicoproteínas) * ácidos nucleicos

Métodos para dilección de infectividad

* el virus como agente infeccioso, mediante demostración de la replicación en animales de experimentación, huevos embrionados o cultivos de células (o cultivo de tejido).

Los métodos fisicoquímicos pueden detectar a los virus como partículas virales por microscopía electrónica; como unidades hemaglutinantes por hemaglutinación; como antígeno, mediante técnica inmunoquímicas; o como ácidos nucleicos mediante hibridización molecular. También pueden estudiarse las características de sus proteínas y ácidos nucleicos. De ellos puede determinarse su peso molecular contenido en guanina-citosina, secuencia nucleotídica, longitud y polaridad. Estos últimos métodos se emplean solamente con fines de investigación en laboratorios de virología básica. Los demás métodos se usan también para diagnóstico virológico en forma habitual, junto con aquellos tendientes a determinar la infectividad. Los estudios de infectividad son fundamentales tanto en virología básica como en virología clínica. En la primera, para obtener la cantidad necesaria de viriones para estudios de sus constituyentes, su forma de replicación, etc.; en la segunda, para determinar la presencia del agente infeccioso viable en muestras clínicas provenientes del paciente. El fundamento de los estudios de infectividad es detectar al virus contenido en una muestra clínica o inóculo como agente infeccioso. Para ello, un requisito esencial es lograr la replicación y propagación del virus en células vivas, ya sea en animales de experimentación, huevos embrionados o cultivo de células in vitro, dado que los virus no pueden cultivarse en medios acelulares. 7.1. Métodos fisicoquímicos 7.1.1. Observación de partículas virales por microscopía electrónica. El microscopio electrónico permite observar la morfología de las partículas virales y este procedimiento se utiliza con fines de investigación y, en algunas ocasiones, como método de diagnostico. (fig. 8).

Existen dos técnicas básicas: la tinción negativa de las partículas virales y los cortes ultrafinos (obtenidos con micrótomo) de células o tejidos infectados, seguido de tinciones especiales 7.1.2. Recuento de partículas. Los viriones pueden identificarse claramente con el microscopio electrónico aunque no es posible distinguir entre partículas infecciosas y no infecciosas. Para averiguar el número de partículas virales en una suspensión viral el método más empleado es mezclar la suspensión con un número conocido de partículas de látex y luego contar al microscópico electrónico los viriones y las partículas de látex y así determinar mediante un simple cálculo el número de viriones presentes. 7.1.3. Hemaglutinación viral. Muchas familias de virus poseen la capacidad de aglutinar glóbulos rojos de diversas especies animales. Esta propiedad, descubierta en 1941 para el virus de la gripe (familia Orthomyxoviridae) es un método sencillo para cuantificar virus y se ha usado durante muchisimo tiempo hasta el advenimiento de cuantificaciones moleculares . Algunas familias de virus (Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Togaviridae) y los arbovirus poseen en las espículas de la envoltura, glicoproteínas con capacidad de aglutinar glóbulos rojos, que se denominan hemaglutininas. Otros virus (Adenoviridae) son desnudos, ADN y poseen esta sustancia en proyecciones de la cápside. Aunque las condiciones en que se produce la hemaglutinación varían para los distintos virus, el fenómeno básico es la unión de las moléculas de hemaglutinina viral a receptores mucoproteicos presentes en los glóbulos rojos (fig. 9). Si la concentración de viriones es suficiente, se formarán múltiples puentes entre ellos y los glóbulos rojos y los agregados de glóbulos rojos se depositarán en forma de retículo en el fondo del tubo. El borde de este depósito tiene una forma de sierra característica. En cambio, los glóbulos que no fueron aglutinados se depositarán en forma de botón. La lectura de la reacción es visual (fig. 10).

Habitualmente, se realizan diluciones dobles de la suspensión viral las que se mezclan con glóbulos rojos (107 x ml). La última dilución que presenta hemaglutinación completa es el título hemaglutinante. El mecanismo responsable de la hemaglutinación es la unión de las hemaglutininas virales a receptores que se encuentran en la membrana de muchas cé1ulas y que son especialmente abundantes en los glóbulos rojos. Los receptores son mucoproteínas que contienen ácido N-acetil-neuramínico (NANA). Estos receptores también se encuentran en las cé1ulas del tracto respiratorio y son los que permiten la absorción de los mixovirus y paramixovirus. Los receptores son inactivados por el peryodato que oxida los grupos glicol del azúcar y por la enzima neuraminidasa que cliva el NANA. Esta enzima se encuentra, como proteína estructural, en los mixovirus y paramixovirus y actúa separando los viriones del eritrocito. Este fenómeno se denomina elución y ocurre a 37°C. Por el contrario, a 0°C la enzima no actúa y la unión del virión a los glóbulos rojos es estable. Los viriones eluídos pueden volver a aglutinar otros eritrocitos, en cambio los eritrocitos eluídos no pueden volver a ser aglutinados ya que su receptor ha sido destruido por la neuraminidasa. Por esta razón, esta enzima se llama enzima destructora de receptores. La neuraminidasa se encuentra en las espículas de los mixovirus y paramixovirus y también puede obtenerse de filtrados de cultivos de vibrión colérico (bacteria). En muchos líquidos biológicos (suero, orina, saliva) están presentes mucoproteínas con ácido síalico con residuos terminales de NANA y pueden unirse a las hemaglutininas virales inhibiendo competitivamente la Hemaglutinación de los eritrocitos. 7.1.4. Reacción de inhibición de la hemaglutinación. Si se hace reaccionar un virus con capacidad de hemaglutinación con su anticuerpo especifico, este anulara su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las hemaglutininas presentes en la envoltura del virión. Este fenómeno se llama inhibición de la hemaglutinación y es utilizado con frecuencia como método diagnóstico tanto para identificar virus como para estudios serológicos para determinar la presencia de anticuerpos específicos inhibidores de la hemaglutinación en el suero del paciente. 7.1.5. Detección de antígenos virales. La determinación de antígenos virales en células o tejidos infectados por virus es un método de extraordinaria importancia para el diagnóstico rápido de muchas infecciones virales. El fundamento es detectar en las muestras clínicas, la presencia de antígenos virales mediante métodos inmunohistoquímicos tales como inmunofluorescencia (fig. 11), inmunoperoxidasa o enzimoinmunoensayo. Fig. 11. Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales. Cerebro de ratón lactante infectado con virus Junín (fiebre hemorrágica Argentina). Inmunofluorescencia indirecta. 400X. Se observa antígeno viral intracitoplasmático

Fig. 12. Métodos de aislamiento de virus 7.1.6. Estudio de los ácidos nucleicos. Algunos de estos métodos se emplean sólo con fines de investigación pero otros, como la detección de genomas virales en muestras clínicas ya están comenzando a ser utilizados con fines diagnósticos. 7.2. Estudios de la infectividad. Dado que los virus sólo replican en células vivas, en todo estudio de infectividad deben utilizarse células vivas susceptibles al virus en estudio, ya sean provenientes de animales de experimentación, huevos embrionados o cultivos celulares in Vitro (fig-12). La infectividad se mide determinando la cantidad de inóculo necesario para obtener en determinado huésped una respuesta específica. La determinación puede ser cuali o cuantitativa. La determinación cuantitativa de la infectividad de una preparación viral se denomina titulación. Por lo tanto un título, es el número de unidades infecciosas presentes en el inóculo por unidad de volumen. Se denomina unidad infecciosa a la minina cantidad de material que es necesario inocular a un huésped para obtener una respuesta determinada.

Esta respuesta puede ser localizada o generalizada. Según el tipo de respuesta, los métodos para cuantificar un virus se clasifican en 3 grupos: a) titulación de punto final; b) enumerativos; c) degradación. 7.2.1. Animales de experimentación. La inoculación de animales es el método más antiguo para aislar y conservar los virus. La inoculación de virus en animales puede producir enfermedad con lesiones típicas y/o muerte. Los animales habitualmente utilizados en el laboratorio son ratones lactantes o adultos, cobayos, conejos y en algunos casos, primates. Numerosos virus pueden aislarse en animales de experimentación como los mixovirus por instilación nasal en hurones, los arbovirus y los arenavirus por inoculación intracerebral en ratones lactantes, etc. Sin embargo, debido al alto costo del mantenimiento de los animales, a la complejidad de las instalaciones necesarias (bioterios), al riesgo de manipulación de animales infectados y a la presencia de virus latentes en los mismos, los animales de experimentación se utilizan cada vez menos en estudios de infectividad ya que fueron reemplazados por los cultivos de células in vitro. A pesar de ello, todavía se utilizan animales en el aislamiento de algunos virus (ratones para aislamiento de virus rábico, togavirus, arenavirus y algunos Coxsackie). Por el contrario, los animales resultan indispensables para trabajos de investigación sobre patogenia e inmunidad de las enfermedades virales, para ensayos de vacunas y estudios sobre virus oncogénicos así como para la preparación de antisueros, para fines diagnósticos. 7.2.2. Huevos embrionados. Los virus pueden inocularse en las diferentes estructuras de los huevos embrionados de pollo o de pato. Así, los mixovirus se inoculan en cavidad alantoidea, los paramixovirus y mixovirus en cavidad amniótica, los herpesvirus en saco vitelino y los poxvirus en membrana corioalantoidea (fig. 12). Para la inoculación, se practica un pequeño orificio en la cáscara de los huevos embrionados de 7-14 días, previa antisepsia y se inyecta el inóculo con aguja y jeringa. Luego se tapa el orificio con tela adhesiva y se incuban los embriones a 37°C. La replicación viral puede producir la muerte del embrión (herpes y parotiditis) o puede no inducir lesiones aparentes aunque se pueden detectar antígenos virales (por ej. hemaglutininas). La inoculación en membrana corioalantoidea de los poxvirus y herpesvirus produce lesiones focalizadas que se denominan pocks. Los huevos embrionados presentan la ventaja de ser bacteriológicamente estériles, de poseer escasos virus latentes y de carecer de respuesta inmune. Además, son de fácil manipulación. Sin embargo, actualmente el uso de huevos esta restringido al aislamiento y propagación de mixovirus y poxvirus y a la producción de vacunas para mixovirus y algunos paramixovirus. 7.2.3. Cultivo de tejidos. Los cultivos de células in vitro fueron descubiertos por Alexis Carrel a mediados del siglo XX. Para ello fue necesario el descubrimiento previo de los antibióticos, imprescindibles para evitar la contaminación bacteriana de los cultivos. Los cultivos de tejidos pueden obtenerse a partir de trozos de tejidos (explantes) o de células aisladas (cultivos celulares) o de cortes de órganos (cultivos de órganos).

Enders fue quien descubrió que los virus podían desarrollarse en cultivos de células in vitro y esto constituye un hito fundamental en el desarrollo de la virología. Los cultivos celulares constituyen el método de elección para la replicación de la mayoría de los virus. En todos ellos se mantienen las células vivas en botellas o tubos en condiciones de esterilidad, con medios nutritivos enriquecidos con sueros y antibióticos y a 37° C. Existen diversos tipos de cultivos celulares tales como cultivos primarios, cepas de células diploides y líneas celulares (fig. 13). Los cultivos primarios se obtienen por tratamiento con tripsina de pequeños trozos de tejidos del hombre o animales. Las células disgregadas se lavan, se cuentan en cámaras cuentaglóbulos (tipo Neubauer) y se siembran en tubos, botellas o policubetas de vidrio o de plástico. Todo el material a emplearse debe ser estéril. Se añade el medio nutritivo con antibióticos y las células se colocan a 37°C. Luego de pocas horas las células se adhieren a la superficie del recipiente y posteriormente multiplican formando islotes que van cubriendo toda la superficie hasta formar una monocapa Cuando dos islotes se unen se inhibe su crecimiento, fenómeno que se denomina inhibición por contacto. Los medios de cultivo, que aportan nutrientes a dichas células, deben cambiarse 2 o 3 veces por semana. Estas células pueden usarse para infección con virus o bien para repicar, es decir obtener nuevos cultivos mediante tratamiento con tripsina de las monocapas y siembra de nuevos cultivos. Esto se denomina pasaje o subcultivo. El mayor inconveniente de los cultivos primarios es que al cabo de unos pocos pasajes (cultivos secundarios) las células mueren y es necesario obtener un nuevo cultivo primario a partir del animal (u hombre). Por ello los cultivos primarios son muy costosos. Sin embargo, presentan un amplio espectro de sensibilidad a los virus por lo que son sumamente útiles en el laboratorio de diagnóstico virológico. Los cultivos primarios más utilizados son los fibroblastos de riñón de mono, células embrionarias (de pollo o de riñón humano) o células amnióticas. Los cultivos pueden tener el aspecto de células epiteliales o fibroblásticas normales. 7.2 3.1. Cultivos de células diploides. A partir de cultivos celulares primarios es posible seleccionar células que conserven intacta su morfología y su número normal de cromosomas (número diploide) así como su capacidad de crecimiento durante un número limitado de pasajes. Esto se denomina cepa de células diploides. Habitualmente pueden repicarse un número limitado de veces (50-100) sin perder sus caracteres normales. Las cepas diploides tienen una alta sensibilidad a muchos virus y son aptas para producción de vacunas de uso humano, ya que habitualmente no están contaminadas con virus latentes. Las cepas mas usadas son las denominadas MRC-5 (provenientes de riñón de mono Rhesus) o las WI38 (Wistar Institute) de origen humano. Se utilizan como sustrato para el aislamiento de diferentes virus (citomegalovirus, varicela, rinovirus) así como sustrato para la replicación de cepas vacúnales (fig. 14).

7.2.3.2. Líneas celulares. A partir de un cultivo primario es también posible adaptar las células a crecer in vitro durante un número ilimitado de pasajes. Estas células adaptadas al cultivo in vitro poseen características similares a las del cultivo primario que les dio origen, generalmente de tipo epitelial. Sin embargo, su número de cromosomas es variable (aneuploidía). Es decir, pueden tener un número mayor o menor de cromosomas que el número normal de la especie que los originó. La gran ventaja que presentan estas líneas celulares es que pueden repicarse un número ilimitado de veces en el laboratorio (múltiples pasajes), no siendo necesario recurrir a tejidos animales como es necesario hacer con los cultivos primarios. Se las denomina por ello líneas inmortales. Actualmente existen numerosas líneas celulares, tanto de origen normal como neoplásico. De origen normal son las células VERO, provenientes de riñón de mono verde africano, las LLC-MK2 de riñón de mono, las BHK de riñón de hámster o las RK-13 de riñón de conejo. Dentro de las de origen neoplásico podemos mencionar a las células HeLa, derivadas de un carcinoma de cérvix, o las HEP-2 de un carcinoma de laringe. La sensibilidad a los virus es limitada y se utilizan para aislamiento de virus sincicial respiratorio, herpes, rubéola, poliovirus, Coxsackie, adenovirus, etcétera. 7.2.3.3. Cultivo de órganos. Para el aislamiento de ciertos virus tales como coronavirus o rotavirus, se pueden utilizar cultivos de órganos. Estos consisten en cortes de tejidos embrionarios que conservan su estructura y función durante un cierto tiempo, mantenidos en medios especiales adecuados. 7.2.4. Detección de los virus en cultivos celulares. El desarrollo de la replicación viral, es decir la amplificación del virus inoculado en el cultivo puede identificarse por medio de diferentes procedimientos. Todos ellos tienden a detectar las modificaciones producidas en el cultivo por efecto de la replicación viral. Muchos virus replican con producción de acción citopatogénica (ACP), es decir alteraciones de las monocapas celulares que se pueden observar directamente al microscopio óptico invertido in vivo, sin necesidad de efectuar ninguna coloración. Existen diversos tipos de ACP que son características de algunos virus. Por ejemplo, los poliovirus y los herpes producen en cultivo una ACP rápida (horas) que consiste en redondeamiento de las células, desprendimiento de la monocapa de la superficie en que crece y por lo tanto, liberación de las células alteradas al medio de cultivo (fig. 15). Esta acción suele observarse en forma generalizada a toda la monocapa celular. Por el contrario, otros virus como el citomegalovirus, tienen una ACP lenta (días o semanas) que comienza en forma de focos bien delimitados de células redondeadas. Otros virus producen inclusiones características localizadas en el núcleo o en el citoplasma de las células. Estas inclusiones pueden ser visualizadas mediante tinciones histológicas o por métodos inmunohistoquímicos. Aquellos virus que tienen en su

envoltura proteínas de fusión, son capaces de inducir la fusión de células vecinas formando sincicios (células gigantes multinucleadas). Esto se observa con el virus sincicial respiratorio y el virus sarampión. El desarrollo de ACP en un cultivo celular permite reconocer que se ha aislado un virus. Sin embargo, es imposible en esta etapa poder afirmar de qué virus se trata, ya que la ACP es solamente orientadora debido a que muchos virus pueden desarrollar ACP de características similares. La identificación del virus aislado será la que permitirá el diagnóstico definitivo y se realiza, en general, por procedimientos inmunoquímicos. Dentro de ellos, los más utilizados son la inmunofluorescencia, el enzimoinmunoensayo y la inmunoperoxidasa (fig. 16) Fig. 15, Acción citopatogénica generalizada. Virus polio.

Fig. 16. Inmunofluorescencia. sobre cultivos infectados para identificación del virus. Antígeno de adenovirus en células Hep-2. Inclusiones intranucleares.

Algunos virus, si bien son capaces de replicar en cultivos celulares, no producen acción citopatogénica visible directamente al microscopio óptico. Sin embargo, como producto de la replicación viral se liberan al medio de cultivo proteínas de origen viral que pueden ser demostradas por diversos procedimientos. Por ejemplo hemaglutininas que pueden detectarse por reacciones de hemoaglutinación u otros antígenos que pueden ponerse en evidencia por reacciones de fijación de complemento, etcétera Los virus que poseen hemaglutininas, en general expresan estos antígenos en la membrana celular de las células que infectan. Esto puede demostrarse por reacciones de hemadsorción, es decir fijación de glóbulos rojos en las células infectadas. Esta reacción se utiliza habitualmente para la identificación de virus respiratorios. En algunos virus la replicación ocurre sin producción de ACP pero, sin embargo, esta replicación es capaz de inhibir la replicación de un segundo virus que se inocule en el cultivo. Este mecanismo se denomina interferencia viral, y se debe a inhibición de la penetración viral. Este método se utiliza principalmente con fines de experimentación y fue empleado para el diagnóstico del virus de rubéola Finalmente, en los últimos años se han desarrollado técnica que permiten detectar los genomas virales en las células infectadas. Estos métodos poseen una alta sensibilidad y consisten en detectar secuencias de ácidos nucleicos virales mediante sondas, es decir secuencias complementarias específicas, marcadas con métodos radioactivos o no radioactivos. Estos métodos se denominan de hibridación molecular y recién comienzan a ser utilizados para diagnóstico en muestras clínicas. 7.2.5. Método de recuento de placas bajo agarosa (plaqueo). El método de recuento de placas bajo agarosa permite cuantificar la cantidad de viriones presentes en un inoculo. Es un procedimiento enumerativo que se utiliza en investigación (fig. 17). Se basa en el recuento de lesiones localizadas, por ejemplo: focos en membrana corioalantoidea de embrión de pollo (pocks), placas de lisis en monocapas de células, focos de proliferación en cultivos celulares (en el caso de los virus tumorales). También puede utilizarse para cuantificar bacteriófagos, contando las placas de lisis en un cultivo bacteriano. De todos estos métodos, el recuento de placas bajo agarosa es un procedimiento de fundamental importancia por ser de fácil realización, reproducible y exacto. Cuando se inocula un virus en un cultivo celular susceptible, este se disemina habitualmente a todas las células del cultivo a través del medio de cultivo. Por lo tanto, no es fácil cuantificar la cantidad de virus presente en el inoculo, a menos que se efectúen diluciones del mismo. Para realizar el recuento de placas bajo agarosa se infectan los cultivos celulares (en botellas o policubetas) con diluciones de virus. Luego de una hora de adsorción a 37°C, se cubre la monocapa celular con un medio de cultivo que contiene agarosa o metilcelulosa, suero y antibióticos y se precede a la incubación de las células durante varios días a 37°C. La cobertura de la monocapa con un medio semisólido impide la diseminación del virus a través del medio de cultivo y hace que los nuevos viriones

formados deban infectar las células vecinas. Es decir, se produce una diseminación de célula a célula. Cada virión se replica y produce un foco o clon de células infectadas. Luego de varios días de incubación, se tiñe la monocapa infectada con un colorante vital (rojo neutro). Solamente se teñirán las células vivas, mientras que las infectadas quedaran sin teñir y formarán una placa, visible a la observación directa. Las placas se cuentan visualmente y mediante una multiplicación por la dilución del virus del inóculo se obtendrá el título viral.

Fig. 17. Método de placas bajo agarosa para recuento y clonado de virus Mediante este método se cuantifican los viriones por medio de unidades formadoras de placas (UFP), plaque forming units (PFU). Este método se emplea en investigación para determinar la cantidad de virus presente en las muestras analizadas con alta precisión. Además, dado que selecciona clones de virus se emplea para la selección de mutantes de virus en la producción de cepas atenuadas para uso en vacunación. 7.2.6. Pruebas de punto final o dilución limite. Algunos virus no producen placas bajo agarosa y, por ello, esa prueba no puede utilizarse para cuantificar la presencia de virus. En estos casos deben emplearse técnicas de punto final o dilución limite. Si bien estos métodos no son tan precisos como el recuento de placas bajo agarosa, permiten determinar en forma aproximada la cantidad de virus presente en una muestra (título viral).

Para esta prueba deben realizarse diluciones seriadas del virus (en general en base 10), las que se inoculan en números iguales de unidades de prueba (tubos con células susceptibles o animales de experimentación). Luego de la incubación, se registra cuidadosamente a lo largo de varios días o semanas, la aparición de lesiones (en cultivos) o de enfermedad o muerte (en los animales). Las unidades de prueba desarrollarán signos de infección en las diluciones más bajas del virus y no en las más altas. En las diluciones intermedias, solamente una parte de ellas mostrará signos de infección. Por razones matemáticas es necesario emplear los datos obtenidos en las distintas diluciones para poder calcular la dilución límite en que el 50 % de las unidades de prueba están infectadas. Para este cálculo existen diversas fórmulas, siendo la más utilizada la de Reed y Müench (1938). Este método se basa en la propuesta de que si una unidad de prueba dio un resultado positivo en una dosis alta de virus, también dará positivo en dosis mayores (es decir en diluciones más bajas del inóculo). Coincidentemente, la unidad de prueba que dio resultado negativo con cierta dosis, dará negativo con dosis más bajas. La estimación de las dosis infectantes de cultivo 50 (DICT 50) se basa en las acumulativas de las respuestas positivas y negativas. Tabla 7, Método Reed de Müench para estimación del título viral Dilución de virus

N° de cultivos con ACP/N° de cultivo inoculados

N° acumulativo de cultivos infectados

N° acumulativo de cultivos no infectados

Infectividad cociente

%

4/4 3/4 2/4 0/4

9 5 2 0

0 1 3 7

9/9 5/6 2/5 0/7

100 83 40 0

10-3 10-4 10-5 10-6

El método de Reed y Müench toma en cuenta los resultados obtenidos en varias diluciones del inóculo. La dilución que infecta el 50 % de las unidades de prueba se denomina DICT 50, si se trata de cultivos, o bien dosis letal 50 (DL50), si se trata de animales. Analicemos el siguiente ejemplo: en él se infectaron con 0,1 ml de cada dilución decimal de virus (10-3, 10-4, 10-5,10-6) 4 tubos conteniendo monocapas de células en cultivo. Luego de varios días de incubación a 37°C, se observó y registro la aparición de acción citopatogénica (ACP) (tabla 7). En este ejemplo, la distancia entre 2 diluciones donde se encuentra la DICT 50 (diluciones 10 y l0-5 se calcula mediante la siguiente fórmula: Infectividad mayor de 50 % - 50% = Infectividad mayor de 50 % - infectividad debajo de 50 %



83  50  0,7 83  40

Por lo tanto, una suspensión viral diluida 10 -4,7 contenida en 0,1 ml (volumen del inóculo) representa 1 DICT 50. Esto significa que en esa dilución la mitad de los cultivos se infectarán con el virus. Consecuentemente, una suspensión diluida 10 -2,7 contendrá 100 DICT 50/0,1 ml; una dilución de 10-1,7 contendrá 1000 DICT 50, etcétera. Este método no es tan exacto como el recuento de placas bajo agar, pero es sumamente útil para estimar el título de los virus en el laboratorio. Actualmente las cuantificaciones virales se realizan con técnicas moleculares en la mayor parte de los centros de referencia. BIBLIOGRAFÍA Fields BN, Knipe DM. Virology 2nd Edition. Raven Press, 1990 Hsiung GD. Diagnostic Virology. 3rd Edition. Yale University Press New Haven and London, 1982. Matthews RE F: Classification and nomenclature of viruses. 3rd Report of the International Committee on Taxonomy of viruses. Intervirology, 12: 129, 1979 White DO and Fenner F. Medical Virology, 3rd edition. Academic Press. Orlando, 1986 Capítulo 4 MECANISMOS DE DEFENSA DEL HUESPED FRENTE A LAS INFECCIONES VIRALES José R. Oubiña y Guadalupe Carballal Los mecanismos de defensa del huésped contra las infecciones virales han sido descriptos como una sinfonía de factores específicos e inespecíficos. La información obtenida del estudio de infecciones virales naturales o experimentales permitió evaluar la importancia relativa de ambos mecanismos, ya que estos varían de acuerdo con los diferentes virus que se consideren. Uno da los mayores avances en la medicina moderna ha sido el desarrollo de vacunas contra muchas de las infecciones virales severas y aun mortales. Las vacunas actúan en general induciendo la formación de anticuerpos específicos contra el virus y, en algunos casos promoviendo también el desarrollo de inmunidad celular; de esa manera, cuando el huésped es expuesto a la infección natural, los anticuerpos preformados neutralizarán al virus infectante y acortarán el curso de la infección. Clásicamente, se consideraba a los anticuerpos como el único factor de defensa contra los virus. Sin embargo, en las últimas décadas se demostró que factores inespecíficos y

la inmunidad celular específica tienen un papel fundamental en la recuperación del paciente en muchas enfermedades virales. Los mecanismos con los que el huésped se defiende de las infecciones virales dependen fundamentalmente del modo por el cual los virus se diseminan dentro del huésped (tabla 1). Tabla 1. Formas de diseminación de los virus y mecanismos de resistencia. Tipo de diseminación 1-lisis 2-Brotación 3-Integración al genoma celular

Mecanismo de resistencia más importante Inmunidad humoral Inmunidad celular ?

Ejemplo Polio Varicela zoster Retrovirus

Los virus pueden diseminarse por 3 rutas. El primer tipo de diseminación es a través del líquido extracelular (tipo 1). Los nuevos viriones formados son liberados por lisis al líquido extracelular, de allí se dirigen a la sangre y por medio de ella (viremia) pasan a infectar nuevas células susceptibles. El ejemplo típico de esta forma de diseminación es el virus polio. El segundo tipo de diseminación es por brotación de célula a célula, es decir por contigüidad (tipo 2). El virus varicela zoster se disemina de célula a célula por brotación en las membranas de células contiguas, sin necesidad de pasar por el líquido extracelular. El tercer tipo de diseminación es por integración al genoma celular. El provirus queda integrado al genoma de la célula huésped y puede permanecer en ese estado por un cierto tiempo. Cuando la célula se divide, dará lugar a nuevas células hijas que llevarán en su genoma el provirus integrado. Por mecanismos no bien conocidos, el provirus puede activarse dando lugar a la formación de nuevos viriones que irán a infectar a otras células. Los retrovirus (por ej. el virus de la inmunodeficiencia humana, así como diversos virus productores de leucemias murinas y humanas) son ejemplos de este tipo de diseminación. 1. RESISTENCIA INESPECÍFICA Los factores de resistencia inespecífica a los virus son los siguientes: la edad del huésped, su estado nutricional, la función de las células macrófagas, factores genéticos y los fenómenos de interferencia, sean estos mediados por virus o por el sistema interferón. La edad del huésped puede determinar la susceptibilidad o la resistencia a determinados virus. Por ejemplo, los neonatos infectados con el virus de la hepatitis B, mediante transmisión perinatal desarrollan infecciones persistentes ya que no son capaces de eliminar el virus de su organismo, probablemente por una inadecuada respuesta de su sistema inmunológico frente a la infección.

Desde el punto de vista de las infecciones experimentales, se ha observado diferente susceptibilidad de ratones a la infección con arenavirus según su edad. Los ratones lactantes de 24-48 hs de vida inoculados por vía intracerebral con el virus Junín -agente de la fiebre hemorrágica argentina- son altamente sensibles y mueren como consecuencia de una encefalomielitis mediada por linfocitos T. Por el contrario, los ratones adultos (más de 20 días) de casi todas las cepas estudiadas hasta el presente exhiben resistencia a la infección con el mismo virus, desarrollando una infección inaparente con síntesis de anticuerpos específicos. Esta diferencia en el comportamiento se atribuye a la maduración de la respuesta inmune y al desarrollo en los animales adultos de una respuesta específica supresora. En niños desnutridos, muchas infecciones virales revisten mayor gravedad que en niños eutróficos. Ello se observa, por ejemplo, en la evolución más severa de diversas infecciones gastrointestinales o respiratorias. Esto se debe a que la desnutrición implica una desventaja para el normal desarrollo de la respuesta inmune. Sorprendentemente, recientes estudios efectuados en ratones infectados con Coxsackie B5 demostraron también una alteración de la respuesta a dicho virus, como consecuencia de la alimentación hipercolesterolémica, habiéndose sugerido que la susceptibilidad aumentada sería debida a la disfunción de macrófagos hepáticos y a trastornos de la movilización de monocitos desde el lecho sanguíneo. Los factores genéticos condicionan la presencia o ausencia de receptores en las membranas celulares que permitirán la adsorción de los virus, es decir, el primer paso de la replicación viral. Por esta razón, el ser humano no se infecta generalmente con virus de animales (excepto en el caso de zoonosis) o con virus de plantas o bacterias. La susceptibilidad a formas graves de algunas infecciones virales se ha asociado a ciertas estructuras genéticas: por ejemplo existe mayor frecuencia de hepatitis crónicas en individuos que expresan alelos específicos del complejo mayor de histocompatibilidad, como B8 o DR3. 1.1. Fenómeno de interferencia viral La interferencia viral consiste en el bloqueo de la replicación de un virus por acción de otro virus que actúa en primer término. Esta interferencia puede ser homóloga (es decir producida por virus integrantes de la misma familia) o heteróloga (por virus de familias diferentes). El mecanismo del fenómeno de interferencia no se conoce con exactitud, si bien se ha determinado que puede realizarse a nivel de receptores de membrana (bloqueándolos o destruyéndolos) o bien a nivel intracelular, mediante síntesis de productos de origen viral que interfieren con la replicación de un segundo virus. Un ejemplo bien conocido de autointerferencia es el producido por las cepas atenuadas de virus polio que constituyen la vacuna Sabin. Estas cepas, al ser administradas por vía oral replican en el intestino e interfieren con la adsorción de las cepas salvajes de virus

polio. Este mecanismo es de corta duración, ya que ocurre solamente cuando hay activa replicación viral en los primeros días posteriores a la administración de la vacuna. Posteriormente, se induce inmunidad local (IgA secretoria) y generalizada (IgM e IgG séricas), las que producen una protección duradera. 1.2. Interferones El estudio de los fluidos de cultivos celulares infectados con virus permitió a Isaacs y Lindenmann en 1957 demostrar la presencia de una proteína que protegía contra una amplia variedad de virus y que fue entonces designada con el nombre de interferón. Hoy se sabe que los interferones son péptido que promueven la actividad antiviral en células tratadas. Los efectos antivirales de los interferones son inespecíficos, ya que activan las células sobre las que actúan, contra todos los virus. La inducción de esta activación es genéticamente restringida: a diferencia de las interleuquinas, los interferones solamente pueden ser activos en limitado grado sobre células de una especie diferente a la de las que originaron su síntesis. Los interferones constituyen el primer mecanismo defensivo contra la infección viral que opera en el huésped. Su acción comienza al cabo de pocas horas de iniciada la infección. Los interferones participan significativamente en la limitación de las infecciones virales, lo cual contribuye a la ocurrencia de un gran número de infecciones subclínicas. Hasta la fecha se reconocen en el ser humano tres proteínas o glicoproteínas con actividad de interferón: son denominadas alfa, beta y gamma interferón, respectivamente (tabla 2). Todas ellas poseen diverso grado de las siguientes funciones: 1) antiviral; 2) inmunorregulatoria; 3) inhibitoria del crecimiento celular; 4) antitumoral; 5) activadora de macrófagos; 6) aumentadora de la citotoxicidad linfocitaria; 7) reguladora de la producción de interferón; 8) modificadora de las membranas celulares; 9) activadora celular por mecanismos "tipo hormona". 1.2.1. Tipos de interferón inducidos por virus. La producción de interferón alfa, beta o gamma depende del tipo de virus infectante y de las interacciones celulares participantes. Los virus pueden inducir la síntesis de interferón alfa humano a través de 3 mecanismos: 1) mediante la infección e inducción directa de linfocitos (T, B o nulos) o macrófagos; 2) mediante la infección de cualquier tipo de célula nucleada con expresión de antígenos sobre la membrana citoplasmática seguida de interacción e inducción de linfocitos B o nulos; 3) a través de la adsorción de virus o alguno de sus componentes sobre la membrana celular con posterior interacción e inducción de linfocitos B o nulos. La síntesis de interferón beta es debida fundamentalmente a la infección de células epiteliales o fibroblásticas.

A su vez, el interferón gamma se produce como resultado de la interacción de los antígenos virales con linfocitos T sensibilizados y posiblemente nulos (nunca linfocitos B). Como ocurre con otras linfoquinas, la síntesis de interferón gamma requiere la producción de interleuquina 1 y la presentación del antígeno por células accesorias singeneicas. La estimulación no inmunológica de linfocitos T induce la producción de interferón alfa más que de interferón gamma pero nunca una mezcla de ambas. Sin embargo, dependiendo del tipo de célula involucrada, pueden producirse uno o más tipos de interferón simultanea o consecutivamente. 1.2.2. Inducción viral del interferón. Hasta el presente se desconocen los mecanismos íntimos de inducción celular de interferón, aunque se han propuesto diversos modelos. Ante la infección viral de una célula, se produce la liberación del genoma viral (ADN o ARN). La presencia o replicación genómica viral se asocia con fenómenos de desrepresión génica celular (20 genes del brazo corto del cromosoma 9 para interferón alfa; 1 gen para interferón beta en el mismo cromosoma; y 1 gen en el brazo largo del cromosoma 12 para el interferón gamma). Ello induce la síntesis de ARN mensajero para interferón y traducción mediante, en la producción de interferón. Este es secretado al fluido extracelular, donde podrá interactuar con receptores para interferón expresados en las células ya infectadas que le dieron origen, así como en aquellas células vecinas o ubicadas a distancia que aún no hubieran sido infectadas. El interferón alfa y el beta comparten receptores, pero el interferón gamma tiene el propio. Los receptores para el interferón alfa y beta son codificados por el cromosoma 21; para el receptor de interferón gamma se requieren 2 componentes codificados por los cromosomas 6 y 21. El complejo interferón-receptor se moviliza hacia el interior celular, donde el interferón es degradado en los lisosomas. Se ignora si la internalización es necesaria para la actividad antiviral. Los receptores para interferón no son reciclados ni reexpuestos sobre la membrana externa celular. Los interferones son capaces de disminuir el cuantum viral en las células ya infectadas, aunque generalmente son más efectivos en la inhibición de la replicación viral de las células vecinas o aquellas ubicadas a distancia, a medida que aumenta el nivel de interferón y el tiempo de exposición celular al mismo. Mientras se produce la síntesis de interferón, ciertos virus pueden completar su ciclo replicativo en una célula dada, dejar ésta e infectar células vecinas. La síntesis de interferón puede producirse al cabo de pocas horas de iniciada la infección viral y muchas veces precede o es concomitante con la liberación del virus. Dicha síntesis disminuye merced a un efecto combinado de retroalimentación negativa y por eliminación de inductores virales.

1.2.3. Respuesta celular inducida por interferón a la infección viral. Los interferones inducen la degradación del ARN viral y la inhibición de la síntesis proteica a través de diferentes vías metabólicas. Una vez producida la unión interferón-receptor, se inicia un proceso de inducción celular probablemente mediado por moléculas señales. Estas moléculas inducen la desrepresión génica celular de moléculas efectoras antivirales: se sintetiza nuevo ARN mensajero y traducción mediante, se producen dichas moléculas efectoras. Las funciones de estas moléculas no se conocen totalmente, pero estarían relacionadas a enzimas inducidas por el interferón y a otras moléculas que se mencionan en la figura 1. Se desconoce el mecanismo de acción por el cual las moléculas efectoras antivirales inhiben más los ARN mensajeros virales que los de la célula infectada. Tabla 2. Caracteres diferenciales de los interferones alfa, beta y gamma. Interferones Característica

Alfa

Estructura Peso molecular Agente inductor

Producido por

17.000

Beta

Gama

Proteína

Proteína

17.000

17.000

Infección viral Infección viral Mitógenos (linfocitos no ARN de doble ARN de doble sensibilizados); antígenos cadena cadena específicos (linfocitos sensibilizados) Leucocitos

Fibroblastos

Linfocitos

Genes identificados

20

1

1

Ubicación cromosómica

9

9

12

Estabilidad a pH 2

Sí

Sí

No

Efectos sobre el sistema inmune

+

+

+++

+++

+++

+++

+

+

+++

Efecto antiviral Efecto inhibidor de la multiplicación celular

El nivel de la actividad antiviral de las moléculas efectoras parecería ser regulado por las concentraciones de interferón que interactúan con los receptores y con la producción de un inhibidor de la actividad de interferón. 1.2.4. Transferencia de la actividad antiviral inducida por interferón. Además de la clásica vía de inducción de actividad antiviral mediada por interferón, se ha observado un segundo mecanismo por el cual células colindantes no expuestas a interferón adquieren también un estado antiviral. Este proceso requiere del contacto intercelular para su desarrollo. Se ha demostrado que si se cocultivan células efectoras tratadas inicialmente con interferón (activadas) con células alogeneicas o xenogeneicas sin tratar se produce un estado antiviral en estas últimas. Teniendo en cuenta que la actividad antiviral en las células sin tratar es anterior a la síntesis de ARN mensajero de moléculas efectoras antivirales en las células activadas, se ha postulado que estas producirían moléculas -de naturaleza desconocida- responsables de la inducción de la síntesis de moléculas efectoras antivirales en las células receptoras. De estos hallazgos se desprende que la transferencia de la actividad antiviral amplía el espectro de acción primitivo del interferón, ya que células que responden lentamente a éste o que no han sido expuestas al mismo pueden también desarrollar un estado antiviral. Si bien se desconoce la importancia de este fenómeno en la limitación de las infecciones virales in vivo, se ha sugerido que podría ser fundamental en tejidos avasculares (epitelios del tracto respiratorio, digestivo u ocular) y en aquéllos accesibles al tránsito de leucocitos (áreas de infección e inflamación). 2. RESISTENCIA ESPECÍFICA La infección viral desencadena en el huésped inmunocompetente el desarrollo de mecanismos específicos de inmunidad adquirida tanto a nivel humoral (anticuerpos), como a nivel celular, dirigidos contra distintos constituyentes del virión, así como contra proteínas no estructurales expresadas durante la infección. La magnitud de la respuesta dependerá de muchos factores, tales como la naturaleza del virus, la puerta de entrada del mismo, su forma de diseminación, etcétera. Tanto la inmunidad humoral como la celular son fundamentales para limitar y terminar con la infección e inducir resistencia duradera a las reinfecciones. Diferentes estructuras virales antigénicas pueden ser expuestas al sistema inmune del huésped como consecuencia de una infección viral. Ello puede deberse a la circulación linfohemática de virus libres (o de algún componente subviral particulado o soluble) o a la "expresión" en la superficie celular de péptido virales procesados o de glicoproteínas de envoltura ancladas en aquella. En el caso de las partículas virales intactas en circulación se produce la estimulación del sistema inmune humoral por parte de los antígenos de superficie (presentes en la

envoltura de algunos virus o bien en la cápside de aquellos que son desnudos). En otros casos, también se detectan anticuerpos contra productos de degradación o clivaje de componentes virales circulantes. Los linfocitos T citotóxicos no pueden reconocer las proteínas virales (aisladas) en circulación, ya que no están presentadas en el contexto de antígenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad. La expresión de antígenos de superficie del virión, o bien de proteínas internas (por ejemplo, nucleoproteínas de virus envueltos y algunas polimerasas) o no estructurales producidas durante la replicación viral luego de su procesamiento, como péptidos en la membrana citoplasmática de las células infectadas -en el contexto de antígenos de histocompatibilidad de clase I- inducirá el reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos de aquellas células infectadas, lo que permitirá la lisis de estas. Es por ello que las infecciones causadas por virus que salen de la célula al líquido extracelular mediante lisis (diseminación de tipo 1) son fundamentalmente controladas por la respuesta humoral, mientras que aquellos que lo hacen por brotación -sin lisis(diseminación de tipo 2) son limitadas principalmente por mecanismos de inmunidad mediada por células. En este caso, los anticuerpos pueden participar en la neutralización viral si existe viremia, o en la lisis de células infectadas con participación del complemento o de ciertas células citotóxicas asesinas -killer o K- (fenómeno no demostrado fehacientemente in vivo). Si bien se describirán a continuación separadamente los componentes humoral y celular de la respuesta inmune, es menester tener presente su interrelación: los linfocitos B son ayudados por una subpoblación de células T y, en ciertas circunstancias, suprimidos por otra subpoblación T. A su vez, las células K podrían ejercer sus efectos dependiendo de la presencia de anticuerpos como mediadores. 2.1. Inmunidad humoral La respuesta sérica de anticuerpos que se produce luego de un primer contacto con un virus (respuesta primaria) es bifásica, presentando un pico a los 5-8 días postinfección, seguido de otro pico a los 15-20 días (fig. 2). Esto se debe a la aparición secuencial de IgM y luego de IgG específicas. La IgA aparece en suero en menor cantidad, después de la IgM e IgG. La IgM decae a niveles no detéctables en tiempos variables para cada infección viral, en general al cabo de 2 ó 3 meses. Por ello, su detección permite realizar un diagnóstico de infección reciente. Por el contrario, la IgG específica dura en circulación meses o años, y a veces durante toda la vida. La intensidad y duración de esta respuesta depende de la puerta de entrada y de la forma de diseminación del virus. Si éste se disemina mediante viremia, la estimulación antigénica será intensa y afectará a todo el tejido linfoide del organismo (ganglios, bazo, médula ósea). Por ello, la respuesta de anticuerpos será de gran magnitud. En las respuestas secundarias a las infecciones virales (reinfecciones) puede haber una

respuesta anamnésica de IgM (de corta duración), seguida de una importante producción de IgG. Fig. 2. Infección viral aguda. Producción de anticuerpos e interferón

Por el contrario, cuando el virus penetra por vía mucosa y queda restringido a ella, por ejemplo en infecciones respiratorias o intestinales, existirá una producción local de IgA secretoria pero la respuesta sérica será de escasa magnitud. Es menester destacar que la estimulación producida por pequeñas dosis de antígeno(s) viral(es) durante períodos cortos induce la síntesis de IgM solamente. Una vez que el estímulo cesa, el nivel de IgM disminuye hasta niveles no detectables. Por el contrario, la estimulación viral intensa, induce la síntesis de IgM y luego de IgG e IgA. Al cesar dicha estimulación, el nivel de IgM decae como en el primer caso, pero el de IgG se mantiene por períodos variables. Ante un segundo contacto con el mismo antígeno viral, en el primer caso se producirá nuevamente una respuesta primaria de IgM, mientras que en el segundo habrá una respuesta inmune aumentada de tipo anamnésica. Se ha detectado IgA secretoria específica antiviral en secreciones respiratorias, oculares, intestinales, genitales y en la leche materna. La IgA se sintetiza localmente en los nódulos linfoides de la submucosa. Muchos virus inducen la síntesis de IgA, como por ejemplo se observa en infecciones producidas por virus cuya puerta de entrada es respiratoria (ortomixovirus, paramixovirus, adenovirus, rubéola, etc.), o entérica (hepatitis A, rotavirus, etc.). La producción local de IgA puede estimularse como consecuencia de infecciones naturales o de inmunizaciones por vía mucosa (tal como se observa en la prevención antipoliomielítica empleando la vacuna Sabin).

La respuesta de IgA será más intensa si se inmuniza con un virus capaz de replicar. En este caso habrá producción de IgA secretoria y también de IgA sérica. Por el contrario, si el virus no es capaz de replicar y se inmuniza por vía mucosa, la respuesta será solamente de IgA secretoria y de escasa magnitud. Esto sucede en la administración experimental de vacunas inactivadas por vía mucosa. La IgA tiene importancia en la resistencia a reinfecciones con virus respiratorios. La leche materna, que contiene IgA específica protege contra numerosos virus respiratorios y entéricos. 2.1.1. Papel de los anticuerpos en el control de las infecciones virales. Los anticuerpos desempeñan en las infecciones virales diversas funciones: 1) eliminación de la infección primaria; 2) limitación de la viremia; 3) limitación de la enfermedad y prevención de las reinfecciones. Como respuesta a los antígenos virales circulantes o asociados a células infectadas se pueden producir anticuerpos específicos contra todos los constituyentes inmunogénicos del virión con los que el organismo toma contacto. Los anticuerpos dirigidos contra constituyentes externos del virión serán capaces de "neutralizar" la acción del virión por lo que se denominan neutralizantes. Estos anticuerpos están dirigidos contra glico y/o lipoproteínas (en los virus envueltos) y contra polipéptidos de la cápside (en los virus desnudos). Los anticuerpos circulantes constituyen una barrera para evitar que los virus libres en el espacio extracelular o en la sangre, puedan alcanzar los "órganos blancos". Estos anticuerpos también previenen las reinfecciones, lo cual constituye el fundamento de la inmunización activa mediante vacunación o de la inmunización pasiva mediante la transferencia de anticuerpos específicos, para disminuir la morbimortalidad de numerosas enfermedades virales. Cuando la infección viral es generalizada (sarampión, poliomielitis, rubéola, etc.) la inmunidad específica que se desarrolla luego de la infección es de larga duración, en general de por vida y se debe a la presencia de anticuerpos neutralizantes en circulación. Habitualmente, la inmunidad es tipo-específica lo que significa que protege contra el mismo tipo antigénico, pero no contra serotipos diferentes, los que serán capaces de producir reinfecciones en ese huésped. Cuando las infecciones quedan localizadas en las mucosas (por ejemplo en infecciones del tracto respiratorio), la IgA secretoria es la que previene la colonización y evita las reinfecciones mediante la neutralización del virus infectante. Esta respuesta local de IgA es de corta duración (1 a 4 años); por ello se pueden producir reinfecciones por el mismo serotipo y se selecciona en la comunidad la circulación de cepas que presentan mínimas diferencias antigénicas: es el caso de las variaciones menores observadas en el genoma del virus influenza. 2.1.2. Mecanismos de neutralización. La neutralización se define como la perdida de la infectividad causada por los anticuerpos.

El mecanismo de neutralización viral no se conoce con exactitud pero la interacción virusanticuerpo puede actuar en uno o más de los siguientes pasos de la replicación: 1) inhibiendo la adsorción del virión a receptores celulares previniendo la penetración; 2) inhibiendo la descapsidación; 3) provocando la lisis inmune de las partículas mediante anticuerpos y complemento (C), activado por la vía clásica; 4) favoreciendo la fagocitosis mediante opsonización y agregación de las partículas virales. El primer paso es la unión del anticuerpo a la superficie del virión, seguido de un cambio conformacional en ambos reactivos La superficie viral posee estructuras indispensables para mantener la infectividad de las partículas, denominadas sitios críticos y otras, importantes para mantener la integridad estructural que se denominan sitios "no críticos". Algunos virus poseen un sólo sitio crítico (bacteriófago T), otros poseen múltiples sitios (influenza) y en otros toda la superficie se considera crítica para la infectividad (virus del mosaico del tabaco). Los sitios críticos son los blancos para los anticuerpos neutralizantes y su número, tamaño y localización en el virión tienen importancia en la reacción de neutralización. Si el anticuerpo esta dirigido contra un sitio no critico, cuando aquel se una al virión, éste retendrá su infectividad. Actualmente se están desarrollando numerosas vacunas compuestas por subunidades del virión. Para que estas vacunas sean efectivas deberán contener el sitio crítico para la inducción de anticuerpos neutralizantes. Para el virus de influenza A se observó que es fundamental mantener la integridad antigénica de dos glicoproteínas de envoltura, la hemaglutinina, y la neuraminidasa; en los virus de aftosa (virus que afectan al ganado) sólo una de las cuatro proteínas de la cápside (VP1) es importante en la inducción de anticuerpos neutralizantes. Cuando los anticuerpos neutralizantes se unen a las partículas virales se produce una agregación de las mismas y por lo tanto se disminuye la infectividad. Por ello la agregación es un mecanismo de neutralización, aunque esto es dependiente de muchos factores tales como concentración viral, tamaño de la partícula, tipo de anticuerpos, etc. En algunas ocasiones (por ej. en el suero de etapas tempranas de la infección, conteniendo anticuerpos de baja afinidad) es posible disociar las partículas y recuperar la infectividad. En otros casos, esta última puede persistir: es la fracción persistente aún en presencia de exceso de anticuerpos (anticuerpos no neutralizantes), hecho que se atribuye a diversos factores como agregados de partículas, anticuerpos de baja afinidad o factores estéricos. Estas fracciones persistentes se observan en ratones infectados con virus de coriomeningitis linfocítica y en pacientes infectados con hepatitis B o con virus Epstein-Barr. Existen factores accesorios en la neutralización viral que ayudan a los anticuerpos en dicha función. Dentro de ellos, el más importante es el complemento (C), debiéndose mencionar también los llamados factores reumatoideos.

El C al unirse a los anticuerpos, a su vez unidos a una partícula viral, puede producir una "virólisis inmune" o bien puede provocar alteraciones en la superficie de las partículas y/o agregación de las mismas. Las partículas opsonizadas y agregadas son más fácilmente fagocitadas por los macrófagos. Los anticuerpos antivirales, unidos a las membranas de las células que expresan antígenos virales también pueden activar el C, y como consecuencia lisar las células infectadas. El sistema de C puede ser activado por la vía clásica: las células infectadas cubiertas con anticuerpos promueven la activación de C1 y subsiguientemente la cascada de fenómenos de clivaje enzimático que culminan con la formación de un gran complejo multimolecular (C5, C6, C7, C8 y C9). Sin embargo, la lisis celular no se produce si la vía de activación alternativa del C esta alterada, indicando la incapacidad de la vía clásica para lisar las mismas per se. Los anticuerpos no son requeridos para la activación por vía alternativa del C. Sin embargo, paradójicamente, la IgG podría participar en este sistema aumentando el depósito de C3b sobre la superficie celular, lo cual generaría más sitios para el clivaje de C5 y el posterior ensamblaje e inserción del complejo C5b-9, con la consecuente lisis celular. A este fenómeno se suma la respuesta inflamatoria producida por diversos factores que se liberan en la activación del C (factores quimiotácticos, anafilotoxinas, etcétera), el aumento de la fagocitosis, y la presencia de células NK., entre otros. 2.2. Inmunidad celular En términos generales, las proteínas solubles inducen una adecuada respuesta humoral, pero raramente desencadenan una respuesta citotóxica celular. La participación de esta última requiere de la síntesis del material inmunogénico en el huésped. La naturaleza de los virus permite la intervención de ambas respuestas. Como contrapartida, la utilización de vacunas virales inactivadas o de péptidos sintéticos no induce generalmente la participación de linfocitos T citotóxicos. En la figura 3 se esquematizan las interacciones celulares que operan en la respuesta inmune celular y humoral frente a la infección viral. Los linfocitos T pueden expresar el fenotipo CD4 + (ayudadores o de hipersensibilidad retardada) o bien CD8 + (citotóxicos o supresores). La subpoblación ayudadora de los linfocitos CD4+ colabora en las funciones de otras células T o con los linfocitos B. La actividad ayudadora de los linfocitos CD4 + sobre los linfocitos T CD8 + supresores puede contribuir a través de estos últimos a restringir la actividad de los linfocitos B y por ende, limitar la producción de anticuerpos.

Fig. 3. Mecanismos de resistencia a la infecci6n viral. 1. Infección viral de una célula epitelial. Replicación viral y expresión de antígenos virales en la membrana celular: diferentes péptidos pueden ser presentados en la ranura formada por los dominios 1 y 2 de las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (Ag-I CMH). Los inductores del interferón —Ifn— (ácidos nucleicos —genoma— y antígenos —Ag— virales y las células infectadas como tales) promueven la desrepresión de los genes del Ifn . 2. Producción de ARNm para Ifn . 3. Síntesis de Ifn . 4. Secreción de Ifn  al líquido extracelular. 5. Unión a receptores de Ifn  en la célula productora y en una célula contigua, que es entonces activada. 6. Las células estimuladas desreprimen genes codificadores de moléculas efectoras antivirales (MEAV), necesarias para establecer la resistencia antiviral. 7. Síntesis de ARNm de las MEAV. 8. Síntesis de las MEAV. 9-11. Las células activadas estimulan a otras células contiguas por un mecanismo desconocido a producir también MEAV. 12. La infección viral de leucocitos o el aflujo de estos a la zona de colonización viral promueve la síntesis de Ifn . 13. Este Ifn  circulante puede proteger células blanco de órganos distantes. 14-15. Si el virus estimula ciertos linfocitos

nulos, es mitogénico para linfocitos o esta presente ante la expansión clonal de linfocitos T activados se sintetiza Ifn γ. En éste último caso, ello ocurre sólo luego de la liberación de interleuquina-1 (IL-1), IL-6 y el factor de necrosis tumoral (FNT) por las células presentadoras de antígenos (CPA), cuya acción se cumple en el contexto de sus Ag de clase II del CMH. 16. El Ifn γ potencia los efectos del Ifn α y del Ifn β. 17. Todos ellos inducen además una mayor expresión de Ag-I del CMH. 18. El Ifn γ potencia también otros sistemas de defensa mediados por macrófagos y células NK. 19. Las células NK pueden lisar las células infectadas.

Fig. 3 (continuación) 20. Linfocitos T (LT) de ayuda CD4 + colaboran con el montaje de la respuesta específica celular y humoral, liberando IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IFn  y FNT. 21-23. Se produce la proliferación clonal de LT CD8+ y de LB, bajo la estimulación de IL-2 e IL-6, con diferenciación hacia células citotóxicas y plasmocitos, respectivamente. 24. La expresión aumentada de Ag-I del CMH en las células infectadas juntamente con la presentación de péptidos virales por dichas moléculas, permite el reconocimiento de LT citotóxicos CD8+, los cuales lisan las células mediante la liberación de perforinas (PF) y un factor de desintegración nuclear (FDN). 25-26. Los plasmocitos sintetizan y liberan Igs M/G que pueden neutralizar el virus circulante. Si estos anticuerpos no están dirigidos contra sitios críticos, podrán promover igualmente la neutralización en presencia de complemento (C), factor reumatoideo o anticuerpos antiglobulinas mediante la formación de agregados de partículas. 27-28. Estos anticuerpos pueden reconocer antígenos virales expresados en las superficies celulares y unirse a ellos. El sistema del complemento -a través de la vía alternativa (C')- puede también lisar la célula infectada. El papel de las Igs en este mecanismo no esta determinado fehacientemente. 29. Un mecanismo de citotoxicidad anticuerpo dependiente (CAD) mediado por diferentes células (Killer –K-, NK, M o polimorfonucleares –PMN-) con receptor para el fragmento Fc de las Igs podría participar en la lisis celular con la consiguiente limpieza viral. Sin embargo, recientemente se han detectado linfocitos CD4 + citotóxicos y CD8+ ayudadores tanto en estudios in vitro como en reacciones de rechazo de injertos in vivo. Ello demuestra las dificultades de identificar las células citotóxicas únicamente mediante dichos marcadores. La estimulación viral del componente celular del sistema inmune del huésped pone en funcionamiento la actividad citolítica de las células NK y posteriormente de los linfocitos T citotóxicos. 2.2.1. Células NK. La actividad de las células NK es de inducción rápida (mediada por el interferón o directamente por las glicoproteínas virales), inmunológicamente inespecífica y autolimitada. Su mecanismo probable de acción consistiría en la liberación de una sustancia antigénicamente relacionada a la fracción C9 del sistema de complemento, la cual ejercería similares efectos que dicha fracción sobre las membranas celulares alterando su integridad. Esta sustancia se conoce como perforina. Se ha sugerido que el receptor para transferrina -ubicuamente distribuido en células metabolitamente activaspodría ser el blanco para la citólisis mediada por células NK. La administración de interferón alfa a pacientes incrementa la actividad de las células NK. A su vez, se detectan células NK activadas en el curso de diversas infecciones agudas: sarampión, mononucleosis infecciosa, parotiditis y enfermedad citomegálica, entre otras. Recientemente se ha sugerido una correlación entre la mortalidad asociada a infección por citomegalovirus y un defecto de la actividad de estas células en pacientes inmunosuprimidos sometidos a transplante de medula ósea. Diversos virus son capaces de inhibir la capacidad citotóxica de las células NK in vitro. Ello podría constituir un

importante mecanismo de modulación negativa de la respuesta del huésped contra las infecciones virales in vivo. El linaje de las células NK se desconoce. Pueden reconocerse mediante su marcador de superficie asialo GM 1. 2.2.2. Linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T citotóxicos reconocen sobre la superficie de la membrana celular infectada un producto del antígeno viral procesado -asociado a una molécula de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH)- a través del receptor de linfocitos T. Recientemente se ha demostrado en el ser humano que una minoría de linfocitos T citotóxicos esta también restringida por moléculas de clase II del CMH. El significado operacional de este fenómeno de restricción ejercido por las moléculas del CMH es que los linfocitos T citotóxicos migran hacia sitios donde reconocen células infectadas como no propias, pero no pueden ser bloqueados o estimulados en su actividad por la presencia de virus libre en sangre u otro fluido. Como ya fuera expresado, los viriones libres, en cambio, son controlados por los anticuerpos neutralizantes, los que pueden producirse en exceso rápidamente. La velocidad de la respuesta de linfocitos T citotóxicos es dependiente del porcentaje de linfocitos T precursores y del tiempo de duplicación de los linfocitos efectores. Contrariamente a postulados anteriores, el antígeno viral no es presentado al linfocito T citotóxico inmerso en la membrana citoplasmática. Si esto último ocurriera, implicaría que sólo los antígenos virales externos (por ejemplo de glicoproteínas de la envoltura de aquellos virus que se liberan de la célula por brotación) podrían expresarse en las membranas, y por ende, ser reconocidos como extraños. Sin embargo, muy recientes experimentos demostraron que dichos antígenos virales no se encuentran anclados en la membrana en proteínas intactas, sino en péptidos cortos, productos de su procesamiento, presentados al linfocito T citotóxico por las moléculas de clase I. Estos péptidos están unidos a la ranura ubicada entre los dominios alfa 1 y alfa 2 de las moléculas de clase I pueden originarse en cualquier proteína viral, no sólo en las glicoproteínas de los antígenos externos, sino también en las nucleoproteínas, las polimerasas o las proteínas tempranas no estructurales. Ello implica el reconocimiento de la célula infectada -como extraña- aún antes de producirse la progenie viral. Todos los productos codificados por el genoma viral quedan de esta forma sometidos a la vigilancia del sistema inmune: los linfocitos citotóxicos reconocen la asociación entre el péptido del antígeno viral procesado y la molécula de clase I del CMH. Este reconocimiento induce una transducción de la señal a través de la membrana del linfocito T, de la cual resultara la lisis de la célula infectada. Los linfocitos citotóxicos liberan al menos 2 sustancias: la perforina y un factor de desintegración nuclear. Se ha observado que pacientes infectados con citomegalovirus, varicela zoster o herpes simples exhiben la respuesta antiviral más importante de los linfocitos citotóxicos dirigida contra proteínas expresadas inmediatamente en la infección.

En el caso de la mononucleosis infecciosa la infección de los linfocitos B por el virus de Epstein-Barr produce la transformación de los mismos. Esta población celular se encuentra también bajo el control de linfocitos T citotóxicos. Se detectan linfocitos T citotóxicos en infecciones por virus influenza, sincicial respiratorio, sarampión, parotiditis, de la inmunodeficiencia humana (HIV) y otros. En la infección por virus de influenza existen linfocitos T citotóxicos dirigidos contra la mayoría de las proteínas virales, y principalmente contra la nucleoproteína. Esta proteína determina el tipo viral: A, B o C. Aquellos linfocitos T reaccionan in vitro produciendo la lisis no sólo frente a células infectadas por la misma cepa viral de un subtipo determinado, sino también contra células infectadas por un subtipo diferente de un mismo tipo (por ej. B1, B2 o B3 del tipo B), con el único requisito de compartir antígenos de clase I del CMH. Estos resultados demostraron que en esta infección, la mayoría de los linfocitos T citotóxicos -aunque no todos- son tipo específicos y no dependientes de antígenos de la superficie viral (hemaglutinina o neuraminidasa). Estos antígenos determinan a su vez el subtipo de virus. Sorprendentemente, la minoría de linfocitos T citotóxicos que son subtipo-específicos no parecen tampoco estar relacionados con la expresión de dichos antígenos glicoproteicos de la superficie viral en la membrana de la célula infectada. Se desconoce el motivo por el cual los linfocitos T citotóxicos que reaccionan cruzadamente con diferentes subtipos virales in vitro no protegen frente a la infección por un segundo subtipo in vivo. Fue precisamente con el virus de influenza que A. R. M. Townsend y colaboradores demostraron en 1986 que los receptores de los linfocitos T citotóxicos reconocen pépticos de antígenos virales internos procesados por la célula infectada, y presentados en asociación con moléculas de clase I del CMH. Este trascendental descubrimiento fue recientemente confirmado en infecciones con citomegalovirus, virus de la coriomeningitis linfocitaria y otros agentes. En pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o con complejo relacionado al SIDA, se han detectado linfocitos citotóxicos contra proteínas codificadas por los genes gag, pol y env aunque se desconoce si desempeñan algún papel en la patogenia de la infección. Hasta el presente existe una sola evidencia experimental de linfocitos T citotóxicos que reaccionan con hepatocitos infectados con virus de hepatitis B (VHB): linfocitos T de sangre periférica de pacientes con hepatitis crónica activa son capaces de lisar in vitro hepatocitos autólogos infectados con VHB. Dicha lisis es inhibida con anticuerpos antiantígeno de core (anti HBc = anti-nucleocápside) pero no con anticuerpos anti-antígeno de superficie (anti HBs). Aunque estos resultados concuerdan con estudios de inmunofluorescencia demostrando antígeno HBc pero no HBs sobre la membrana de los hepatocitos, los mismos son sorprendentes pues, con pocas excepciones, los anticuerpos dirigidos hacia proteínas virales no inhiben habitualmente el reconocimiento por linfocitos

T citotóxicos. Por lo tanto, debe aguardarse una prueba definitiva de la existencia de esta población celular en un sistema mejor definido. Sin embargo, es casi universalmente aceptada la hipótesis que postula que la injuria hepática en la infección viral aguda esta mediada por linfocitos T citotóxicos -dirigidos contra uno o más productos codificados por el genoma del HBV y expresados sobre la membrana celular. 3. CONTROL DE LA INFECCIÓN VIRAL Una vez producida la implantación viral en la puerta de entrada al organismo (por ej. la superficie del epitelio respiratorio o digestivo) se sintetizan elevados niveles de interferón beta. Este interferón se une a sus receptores e induce un estado antiviral en las células vecinas. A su vez, sensibiliza células colindantes y dístales para producir más interferón luego de producirse la infección viral. Simultáneamente, se inicia el mecanismo de transferencia de la actividad antiviral inducida por interferón a células contiguas cuya respuesta al mismo es más lenta, o está limitada por el grado de accesibilidad de aquel. La infección de leucocitos, a su vez, puede producir la liberación de interferón alfa. Este interferón puede ser también liberado por dichas células en el sitio inicial de implantación viral, una vez que las mismas confluyen en dicha zona. El interferón alfa difunde hacia la circulación con mayor eficacia que los tipos beta y gamma. La interferonemia puede conferir protección a órganos ubicados a distancia donde podría replicar el virus. La producción de interferón gamma puede ocurrir ante alguna de las siguientes situaciones: 1) efecto mitogénico del virus sobre leucocitos; 2) estimulación viral de linfocitos nulos; o 3) mantenimiento de la presencia viral ante la aparición de linfocitos T sensibilizados. El interferón gamma es entonces capaz de potenciar los efectos de los tipos alfa y beta. La resultante de dichas interacciones es la amplificación general del sistema: se producen más moléculas efectoras con actividad antiviral y se potencian otros mecanismos defensivos mediados por la activación de células NK y macrófagos y de citotoxicidad mediada por anticuerpos. La actividad máxima de las células NK tiene lugar a los 3 días de iniciada la infección. En segundo término el interferón induce la expresión de antígenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad. Ello implica para estas células dos efectos inmediatos: 1) disminución de la sensibilidad a las células NK; 2) la célula infectada se convierte en blanco para los linfocitos T citotóxicos CD8 + que aparecen aproximadamente a los 7 días de iniciada la infección. Los linfocitos circulantes expuestos al interferón o que migran desde la zona de implantación del virus son capaces de inducir cierto grado de actividad antiviral en diversos tejidos mediante el mecanismo de transferencia, aún en ausencia de interferonemia.

Recientemente se ha demostrado el sinergismo existente entre el sistema interferón y los anticuerpos séricos antivirales: la coexistencia de ambos es capaz de potenciar más de mil veces el efecto que cada uno de ellos ejercería individualmente sobre la infección. Todas estas interacciones funcionan en plenitud si el virus continúa su replicación y diseminación a distancia a órganos blanco. Debido a la respuesta inespecífica y específica del huésped, esta situación existe en un número limitado de casos. Es menester subrayar, sin embargo, que el interferón no es la única ni la más importante causa de recuperación de una infección viral. Si así fuera, la producción del mismo ante una primera infección sistémica, o bien ante la administración de una vacuna viral atenuada, debería conferir protección contra cualquier virus no relacionado, al menos durante un cierto lapso de tiempo. Sin embargo, este fenómeno no ocurre generalmente. Sólo parecería ser responsable de cierta protección temporal al ocurrir infecciones por un virus en el tracto respiratorio o digestivo frente a otros agentes que penetran por la misma puerta de entrada. Esto sugiere una limitación temporoespacial del efecto del interferón: su principal mecanismo antiviral sería la protección de células vecinas a las del sitio inicial de implantación viral durante un período restringido de tiempo. 4. INFECCIONES CONGÉNITAS

VIRALES

EN

PACIENTES

CON

INMUNODEFICIENCIAS

Las inmunodeficiencias congénitas tienen escasa frecuencia en la población general. Por el contrario, existe un alto número de pacientes bajo distintos tratamientos inmunodepresores debido a neoplasias o a transplantes de órganos. En los últimos años, el incremento extraordinario de casos clínicos de SIDA y de pacientes con infección asintomático con este virus hace que cada vez sea mayor el número de pacientes con inmunodepresión adquirida. Muchos virus pueden producir infecciones graves, y aún mortales en estos pacientes. En pacientes con defectos de la inmunidad humoral (agammaglobulinemia en su forma común o ligada al sexo) pero con función T normal se observa una incidencia mayor de poliomielitis paralítica. Recordemos que este virus se disemina al medio extracelular mediante viremia (tipo 1 de diseminación). Se ha establecido que esos pacientes serían 10.000 veces más susceptibles a desarrollar poliomielitis luego de la vacunación con vacuna a virus vivo y atenuado (vacuna Sabin) que los sujetos normales. También son más susceptibles a desarrollar infecciones persistentes con virus ECHO. El virus del sarampión puede producir infecciones fatales (neumonía a células gigantes) en pacientes con inmunodepresión T o B. En pacientes con defectos de la inmunidad celular suelen ser graves, y aun fatales las infecciones por virus que se diseminan por brotación (mecanismo tipo 2 de diseminación), tales como herpes simplex, varicela-zoster y citomegalovirus. Estos pueden producir neumonías intersticiales, infecciones del sistema nervioso central o infecciones diseminadas.

BIBLIOGRAFÍA Baglioni C, Nilsen TW. Mechanisms of antiviral action of interferon, en Gresser I (ed): Interferon 5. Academic Press Inc. New York. 1983. Fields Virology. Fields BN, Knipe DM. 2nd Edition. Raven Press, New York. 1990. Mims CA, White DO. Viral pathogenesis and immunology. Blackwell Scientific Publications. 1984. Stanton GJ, Baron S. Interferon and viral pathogenesis. En: Concepts in viral pathogenesis. Notkins AL, Oldstone MBA. (ed). Springer Verlag. New York. 1984.