Vjezbe Iz Molekularne Biologije 1

Molekularna biologija Vježba 1. DNK ekstrakcija iz bioloških uzoraka Ekstrakcija DNK predstavlja jedan od primarnih postupaka u genetičkom inženjerstvu i molekularnoj biologiji uopće. To je prvi korak u karakterizaciji genetičkog materijala. Budući da je DNK (tj. nukleinske kiseline) osnovni nosilac nasljednih informacija, za bilo kakvu direktnu genetičku karakterizaciju neophodno je poznavati metode i tehnike izolacije DNK. Kao izvor DNK može nam poslužiti bilo kakav organski dio ili ostatak koji sadrži ćelije sa jedrom. DNK podliježe izvjesnim organskodegradacijskim procesima, što u velikoj mjeri oteževa izolaciju iz zastarjelih uzoraka (ali je moguće!). Postupak izolacije i karakterizacije nasljednog materijala se široko primjenjuje u fundamentalnoj, istraživačkoj biologiji i njenim primijenjenim granama: medicini, farmaciji, hortikulturi, šumarstvu, forenzici, veterinarstvu, itd. za dijagnostičke analize i transformaciju svojstava odabranih resursa npr. dobijanje biljaka otpornih na sušu, dijagnostika sklonosti za tumor, dijagnostika AIDS-a tj. zaraženosti HIV-om i drugih infekcija, provjera rodoslova i čistokrvnih linija npr. pasa ili konja, itd. Miller-ov protokol za ekstrakciju DNA (isoljavanje) iz brisa bukalne sluznice 1. Princip Ova procedura sadrži osnovne upute za izolaciju DNK iz oralnih briseva. Protokol se bazira na lizi nukleiranih ćelija pomoću ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen proteinazom. Nakon digestije slijedi serija isoljavanja sa 6M NaCl-om. NaCl uklanja zaostale proteine. DNK se konačno izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi. 2. Uzorak Bris bukalne sluznice, osušen na zraku ili uronjen u izopropanol. 3. Kvalitet postupka a. Prije započinjanja procedure uvjerite se da su svi reagensi, instrumenti i aparati ispravni i da zadovoljavaju bar minimalne standarde za kontrolu kvaliteta procesa.

b. Minimalno jedna negativna kontrola mora biti zastupljena i proći cijelu proceduru od početka do kraja i analizirana zajedno sa ostalim uzorcima. 4. Sigurnost a. Svi uzorci moraju biti tretirani kao infektivni. Radi lične sigurnosti preporučuje se korištenje zaštitne opreme u laboratoriji. b. Odbacivanje biohazardnog otpada se vrši na za to predviđenom mjestu. c. Dobro se upoznati sa protokolima o sigurnosti i pouzdanosti procedure, prije samog početka rada. 5. Procedura Potrebni materijal i reagensi (po uzorku):  -tubice vol. 1,5 ml – 3 kom  -PVC rukavice – par  -99% etanol – oko 500 μl  -70% etanol – 200 μl  -TE pufer ili ddH2O – 50 μl  -pufer za ekstrakciju – 550 μl  -Qiagen Pronase – 100 μl Potrebna oprema:  -srednjeturažna centrifuga  -vorteks  -pipetori 20, 200 i 1000 μl  -frizeri –20 a. Sakupljanje uzoraka Uzorci se uzimaju brisom, tj. vatiranim štapićem trljajući po unutrašnjosti usne duplje.

b. protokol za ekstrakciju: Štapić sa bukalnom sluznicom potopiti u sljedeći pufer: REAGENSI Kern Lysis pufer 20% SDS Qiagen Pronase UKUPNO

KOLIČINA 500 l 50 l 100 l 650 l

Inkubirati 1 sat na temp. 60 C Dodati 200 l 6M NaCl-a, snažno protresti 1 minut, Centrifugirati na 2500 rpm 15 min., Nakon centrifugiranja supernatant prebaciti u novu tubicu, Protresti 15 sekundi, Centrifugirati na 2500 rpm 15 min., Supernatant prebaciti u novu tubicu, Dodati 2 x vol. hladnog apsolutnog etanola, Okrenuti tubicu par puta, Centrifugirati 10 min na 10 000 rpm, Dekantirati etanol, Dodati 200 l 70 % etanola, promućkati 10 sekundi, Centrifugirati 5 min. na 13 000 rpm, Dekantirati etanol, Staviti u speedvac i osušiti. Dodati 50 l dest. H2O. Ostaviti preko noći da se resolubizira, ili staviti 30 minuta u termoblok na 37 oC.