Ciclo Celular

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR UNIDAD 4: REPRODUCCIÓN CELULAR

SEMINARIO N° 2. CICLO CELULAR

Trujillo - Perú 2018 - 10 1

Seminario 2: Ciclo celular y Cáncer

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR SEMINARIO N° 2 CICLO CELULAR Y CÁNCER Fecha:

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1. COMPETENCIAS ESPECÍFICAS 1.

Explica los eventos celulares y moleculares que ocurren en la célula eucariota durante las fases G1,S y G2 del ciclo celular. Describe los eventos celulares y moleculares que ocurren en la fase M del ciclo celular. Comprende el sistema de regulación del ciclo celular y los mecanismos moleculares que participan en él. Describe la estructura y función de p53 y sus alteraciones durante el cáncer Comprende los mecanismos por el cual los protoncogenes se convierten en oncogenes Explica los puntos de control del ciclo celular. Conoce las características principales de las células tumorales, que la diferencian del resto de las células del organismo.

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2. TEMARIO  Ciclo celular. Concepto. El estado de reposo o G0. Fases del ciclo celular: G1, S, G2 y M. Duración y principales acontecimientos en cada una de las fases.  Clasificación de las células de acuerdo a su capacidad de proliferación: células lábiles, quiescentes y permanentes  La mitosis. Fases: profase, prometafase, metafase, anafase, telofase y citocinesis. Principales acontecimientos celulares y moleculares en cada fase de la mitosis.  Genes del Ciclo de División Celular: a. Genes que codifican proteínas para la progresión del ciclo b. Genes que regulan positiva o negativamente.- Genes que regulan positivamente:  Ciclinas. Características y tipos.  Kinasas dependientes de ciclinas (Cdk). Características y tipos. Regulación de los complejos ciclina/CDK. Actividad del complejo ciclina B/Cdk1 (FPM)  Protoncogenes. Mutación de protoncogenes. - Genes que regulan negativamente:  Genes supresores tumorales o genes de verificación (checkpoint): p53, retinoblastoma (Rb). Alteraciones en genes supresores de tumores.  Inhibidores de kinasas p16, p21.  Puntos de control del ciclo celular.  Características distintivas de las células cancerosas. - Características clásicas: autosuficiencia en las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento, evasión de la muerte celular programada, potencial replicativo ilimitado, desarrollo de angiogénesis sostenida, capacidad de invadir y generar metástasis. 2

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Qué es el ciclo celular ?. Describa cada una de las fases de la interfase. El ciclo celular: es la secuencia cíclica de procesos en la vida de una célula eucariota, que por lo general conserva la capacidad de dividirse. El ciclo de la división de la mayoría de las células consiste en cuatro procesos coordinados: crecimiento celular, replicación del ADN, distribución de los cromosomas duplicados a las células hijas y división celular. El ciclo se encuentra dividido en dos grandes etapas: la interfase o preparación de la célula para la división de material genético y celular y la fase M, la división por mitosis (células somáticas) o meiosis (células sexuales). La progresión a través de cada etapa del ciclo celular está controlada mediante un sistema regulador conservado, que no sólo coordina los diferentes procesos del ciclo celular sino que también acopla el ciclo celular con las señales extracelulares que controlan la proliferación celular. La interfase es la etapa que se sitúa entre dos divisiones celulares y es la más larga del ciclo celular, ocupando casi 95% del ciclo (~ 23 horas). Durante esta etapa, la célula es muy activa desde el punto de vista metabólico, crece mediante la síntesis de nuevas macromoléculas y organelos y duplica su ADN. La interfase se divide en tres fases secuenciales; G1, S y G2. a. Fase o intervalo G1 (del inglés gap = intervalo). Es la primera fase del ciclo celular que transcurre entre el fin de una mitosis y el inicio de la síntesis de ADN. Durante este tiempo existe crecimiento celular con síntesis de proteínas y de RNA. Comenzando a partir de la citocinesis de la división anterior, la célula hija resulta pequeña y posee un bajo contenido de ATP resultante del gasto efectuado en el ciclo anterior, por lo que en este periodo se produce la acumulación del ATP necesario y el incremento de tamaño celular. El aumento de tamaño responde al desarrollo de los distintos organelos y requiere un metabolismo anabólico activo, caracterizado por la síntesis de lípidos de membrana, proteínas, ARNm, etc. Las mitocondrias se originan por división de otras estructuras preexistentes. El nucléolo es visible y su presencia se relaciona con la síntesis y maduración de las subunidades ribosomales. En esta fase, la célula es diploide o 2n y el contenido de ADN es 2C. Las células que no se dividen nuevamente (como las neuronas o las del músculo esquelético) pasan toda su vida en este periodo, que en estos casos se denomina G0. Esta etapa es la más variable en duración. Tiene una duración entre 6 y 12 horas b. Fase S (del inglés synthesis = síntesis). Es la segunda fase del ciclo celular, en esta se produce la síntesis o replicación del ADN, permitiendo la formación de las cromátides hermanas. Con la replicación del ADN, el núcleo contiene el doble ADN que al principio. En esta etapa se sintetizan también las histonas, encargadas del empaquetamiento del ADN. Además, los centriolos del centrosoma se separan entre si y se dividen, generando por lo tanto cuatro centriolos (dos por centrosoma) Tiene una duración promedio de 8 a 10 horas. Durante la fase S a medida que los cromosomas se duplican para formar cromátides hermanas, se unen entre sí mediante vínculos proteicos. Las uniones entre las cromátides hermanas establecidas durante la fase S serán esenciales para su segregación precisa durante la mitosis. Los complejos proteicos que establecen cohesión entre las cromátides hermanas se llaman cohesinas, un complejo que pertenece a la familia de proteínas para el mantenimiento estructural de cromosomas (Smc, structural maintenance of chromosomes). El complejo de las cohesinas está compuesto por cuatro subunidades: Sc1, Smc3, Sec1 y Sec3. El mecanismo estructural por el cual las cohesinas vinculan a las cromátides hermanas no se comprende, pero es probable que los anillos de cohesina abracen una o ambas copias del ADN replicado. Las cohesinas se asocian con los 3

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR cromosomas durante G1. Durante la replicación del ADN, son cargadas sobre los cromosomas. De modo tal que puedan mantener a las cromátides hermanas juntas. Probablemente esto ocurre a medida a medida que las horquillas de replicación duplican el ADN. Las cohesinas son esenciales para unir con precisión las cromátides hermanas replicadas al huso mitótico y para su segregación durante la mitosis. Las kinasas dependientes de ciclina (CDKs) de la fase S desempeñan un papel esencial para regular la replicación del ADN. Las kinasas inician la replicación del ADN sólo en las transiciones de fase G1/S y evitan la reiniciación a partir de orígenes que ya se han iniciado. Las CDK de fase S no solo son esenciales para iniciar la replicación del ADN, sino que también son responsables de asegurar que cada origen se inicie solo una vez durante la fase S. Para evitar el reinicio de los orígenes durante la fase S se requiere la fosforilación de varios componentes de la maquinaria de carga de la helicasa MCM (proteínas de mantenimiento del minicromosoma, MCM (minichromosome maintenance protein complex) y de la propia helicasa MCM. c. Fase G2 Es el tiempo que transcurre entre la replicación del ADN y el inicio de la mitosis. En esta etapa la célula culmina su crecimiento y sintetiza los factores necesarios para iniciar la mitosis. Los cromosomas vistos al microscopio óptico aparecen como larga hebras emparejadas. Dado que el proceso de síntesis consume una gran cantidad de energía, la célula entra nuevamente en un proceso de crecimiento y adquisición de ATP que proporcionará energía durante el proceso de mitosis. En esta fase el contenido de ADN es 4C. Tiene una duración de aproximadamente 4 horas.

Fig 1. Fases del ciclo de división celular eucariota d. Fase M. La mitosis ocurre mediante el inicio y la compleción de dos procesos separados y distintos. En el primero, que a veces se denomina cariocinesis (gr. karyo = núcleo; kinesis = acción), los cromosomas replicados son separados hacia dos núcleos hijos distintos. Durante el segundo proceso, llamado citocinesis, el citoplasma se divide entre estos dos 4

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR núcleos para formar dos células hijas independientes. La mitosis cumple la función de distribuir los cromosomas duplicados de tal modo que cada nueva célula obtenga una dotación completa, y similar de cromosomas a la célula progenitora y a su célula hermana. La duración de estas fases del ciclo celular varía considerablemente según los distintos tipos de células. Para una célula de proliferación rápida humana típica, con una duración total del ciclo de 24 horas, la fase G1 dura unas 11 horas, la fase S unas 8 horas, la fase G2 cerca de 4 horas y la fase M 1 hora, aproximadamente. Sin embargo, otros tipos celulares pueden dividirse más rápidamente en células embrionarias tempranas tras la fecundación del óvulo tienen lugar ciclos celulares más cortos (30 minutos o menos). Pero en este caso no se produce crecimiento celular. Por el contrario, mediante estos ciclos celulares en el embrión temprano el citoplasma del huevo se divide rápidamente en células más pequeñas. En estos ciclos celulares en el embrión temprano no hay fase G1 ni G2 y el ADN se replica rápidamente, por lo que consisten en fases S muy cortas alternando con fases M

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Como se clasifican las células según su capacidad proliferativa ? La capacidad proliferativa de las células y su potencial de regeneración son dos propiedades relacionadas entre sí que se han empleado para distinguir tres grupos de tejidos adultos: lábiles, estables y permanentes. a. Células lábiles (células en división continua) Estas células entran continuamente al ciclo celular y permanecen proliferando a lo largo de toda la vida, sustituyendo a las células que mueren y manteniendo la homeostasis tisular. Los tejidos que tienen células lábiles son los epitelios de superficie como el de la piel, tracto digestivo, respiratorio, genito-urinario, conductos excretores de todas las glándulas, y el tejido hematopoyético. En la mayor parte de estos tejidos, la proliferación celular proviene de una población de células madre que poseen una capacidad ilimitada de proliferación y cuya descendencia puede seguir diferentes vías de diferenciación. Estos tejidos son muy sensibles a la radiación ionizante y la quimioterapia antitumorales y son muy altamente susceptibles de desarrollar neoplasias.

Fig. 2. Tipos de células según su capacidad proliferativa 5

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR b. Células estables (células quiescentes) Muestran normalmente un índice de replicación bajo. No obstante, pueden desarrollar una división rápida en respuesta a estímulos, por lo que son capaces de regenerar un determinado tejido. Son células que están en fase G 0, pero por influencia de señales, sobre todo extracelulares, son estimuladas a regresar a la fase G 1 e iniciar un ciclo celular. En este grupo se incluyen células de tejidos del hígado, riñón, páncreas, músculo liso y vascular, así como los fibroblastos. El mejor ejemplo de la capacidad de regeneración de las células estables es el potencial del hígado para regenerarse tras una hepatectomía parcial o después de una lesión ocasionada por agentes químicos y/o agentes virales. c. Células permanentes (células indivisibles) Son tipos celulares altamente especializados, que abandonan el ciclo celular y no pueden desarrollar o realizar una división mitótica en la vida post-natal. A este grupo pertenecen las células del músculo estriado y las neuronas, que se encuentran en un estado G0 irreversible. Estos tejidos presentan una capacidad de regeneración escasa o nula y la muerte de sus células conlleva su sustitución por una cicatriz fibrosa y una pérdida reversible de la función. Por ejemplo, neuronas que han sido lesionadas letalmente se pierden para siempre, y son sustituidas por la proliferación de los elementos de soporte del sistema nervioso central, las células gliales. No obstante, recientemente se han identificado poblaciones de células madre tanto en el tejido muscular estriado como en el tejido nervioso, con capacidad de división y regeneración tisular in vitro. 3.

Cuáles son los eventos celulares y moleculares que ocurren en una célula durante la profase y prometafase de la mitosis ? En la mitosis se pueden distinguir morfológicamente las siguientes cinco etapas: profase, prometafase, metafase, anafase, telofase y citocinesis. a. Profase (gr. pro = antes de; phasis = fase ) La profase dura aproximadamente un 40% del tiempo total de la mitosis (~ 24 minutos). Cambios nucleares: En la profase, se produce la condensación de los cromosomas, los cuales están constituidos por dos cromátides hermanas emparejadas en toda su longitud, por lo que son difíciles de individualizar al microscopio. En su tendencia progresiva a la condensación de la cromatina, los cromosomas mitóticos cada vez son más cortos, gruesos y compactos. El empaquetamiento es indispensable para que los cromosomas no sufran alteraciones generadas por el estrés mecánico al que son sometidos debido a los movimientos del huso mitótico durante la segregación cromosómica. La condensación de los cromosomas no se comprende muy bien, pero resulta central para este proceso un complejo proteico conocido como complejo de condensinas. La condensación de los cromosomas es desencadenada por las CDK mitóticas. La fosforilación de las dos subunidades de las condensinas por la ciclina B/Cdk1 estimula su entrada al núcleo y su asociación con la cromatina. La cromatina que está en fibra de 30nm en interfase comienza a condensarse por la intervención del complejo proteico de condensina y toposiomerasa II, que superenrollan la fibra de 30nm formando asas de ADN superenrollado a lo largo de cada cromátide. Para mantener unidas a las cromátides hermanas del cromosoma replicado y condensado, intervienen otro complejo proteico llamado cohesina, que las mantiene unidas a lo largo de los brazos cromosómicos, dando la apariencia de una sola hebra al cromosoma mitótico temprano. También, las mantiene unidas por el centrómero. Una gran fracción de las cohesinas es eliminada de los cromosomas durante la profase. Este proceso es mediado por la fosforilación de las cohesinas, por la kinasa polo y la aurora kinasa B. En la mayoría de los organismos, las cohesinas solo se mantienen alrededor de los centrómeros. 6

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR También, el inicio de la condensación se correlaciona con la fosforilación de las histonas H1 por la ciclina B/Cdk1 y la histona H3 por la proteína aurora kinasa B. Cuando la cromatina tiene la mayor condensación del ciclo celular, la transcripción se inhibe. Debido a esto, el nucléolo se disgrega y, en consecuencia, también la traducción se detiene. Cambios citoplasmáticos: El citoesqueleto sufre cambios importantes, los microtúbulos de interfase se desensamblan debido a la modificación de proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs), y se reorganizan para contribuir a la formación del huso mitótico. El primer paso para formar el huso mitótico es la aparición o nucleación de microtúbulos alrededor de los centrosomas para formar el áster, cuyos microtúbulos tienen un extremo menos (-) asociado al centrosoma y un extremo más (+) al cual se adicionan dímeros de tubulina a mayor velocidad. Cada áster migra a posiciones opuestas dentro de la célula, estableciendo así los polos celulares a partir de donde se formará un huso mitótico bipolar. Los microtúbulos que se denominarán interpolares, continúan creciendo por su extremo (+) hasta que se encuentran y se superponen con los extremos (+) de los microtúbulos del polo contrario. Otros elementos citoesqueléticos que se desensamblan en la profase incluye a varias, pero no todas, las clases de filamentos intermedios y especializados filamentos de actina, tales como las fibras de estrés. Como resultado de la reorganización del citoesqueleto, muchas células se hacen redondas durante la profase. Esto es particularmente evidente para células cultivadas en un sustrato plano. El retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi se desintegra en pequeñas vesículas independientes, las que se segregarán en las células hijas y volverán a integrar sus estructuras originales dentro de ellas. El retículo endoplásmico podría no fragmentarse hasta vesículas y, simplemente, segregarse en fragmentos de éste hacia las dos células hijas. La fragmentación del Golgi es llevada a cabo por ciclina B/Cdk1, la cual fosforila la proteína de membrana GM130. El reensamblaje del Golgi empieza durante la anafase, después de la inactivación de la ciclina B/Cdk1. Otros componentes membranosos, como las mitocondrias, lisosomas y peroxisomas no se disgregan y, simplemente se segregan de manera generalmente simétrica a las células hijas. La fosforilación de varias proteínas nucleolares desensambla el nucleólo. La síntesis proteica se detiene como resultado de la acción de ciclinaB/Cdk1. La fosforilación del factor de elongación ribosomal EF2 detiene regularmente la síntesis proteica y el ensamble de nuevos ribosomas.

Fig 3. Eventos de la profase de la mitosis b. Prometafase La prometafase dura muy poco tiempo y el rasgo que la caracteriza es la completa desorganización de la envoltura nuclear, con lo que los cromosomas prometafásicos quedan inmersos en el citoplasma y presentan un movimiento activo que los dirige al 7

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR ecuador celular. El desensamble de la envoltura nuclear es desencadenado por las Cdk mitóticas. Una vez que se activan las Cdk mitóticas al final de G2, fosforilan residuos de serina específicos de las tres láminas nucleares (láminas A, B y C). Esto provoca la despolimerización de los filamentos intermedios de la lámina. Los dímeros de lámina A y C fosforilados son liberados a la solución, mientras que los dímeros de lámina B fosforilados permanecen asociados con la membrana nuclear. La despolimerización de las láminas nucleares lleva a la desintegración de la red de lámina nuclear y contribuye al desensamblaje de la envoltura nuclear. Las Cdk mitóticas afectan también otros componentes de la envoltura nuclear. Las Cdk fosforilan nucleoporinas específicas, que hacen que los complejos del poro nuclear se disocien a subcomplejos durante la profase. La fosforilación de proteínas integrales de la membrana interna del núcleo ocurre a través de la disminución de su afinidad por la cromatina y contribuye adicionalmente al desensamblaje de la envoltura nuclear. El debilitamiento de las asociaciones entre las proteínas de la membrana nuclear interna y la lámina nuclear y la cromatina permite que las hojas de la membrana nuclear interna se retraigan al retículo endoplásmico, que se continúa con la membrana nuclear externa. La masa esférica de fibras característica del cinetocoro (griego kineto = movible; chora = espacio) en profase es reemplazada por una placa o “tapete” fibroso circular o a veces rectangular muy delgado, sobre la superficie del centrómero. Varias proteínas que son importantes para el montaje apropiado de la placa, se encuentran en la superficie del centrómero a la cual está fijo el tapete. Los extremos (+) de los microtúbulos de los ásteres se mueven mediante polimerización hacia el centro de la célula buscando cromosomas en un movimiento que se piensa es al azar y cuando hacen contacto con un cinetocoro se estabilizan reduciendo el nivel de catástrofe, promoviendo así la posibilidad de persistencia de la unión. Los microtúbulos del huso mitótico que se unen a los cromosomas reciben el nombre de microtúbulos cinetocóricos o cromosómicos. Una vez que un cinetocoro se ha unido en posición lateral o terminal a un microtúbulo, la proteína motora dineína-dinactina se asocia con el cinetocoro para mover el cromosoma duplicado a lo largo del microtúbulo hacia el polo del huso. Esto resulta en una unión final del microtúbulo a un cinetocoro. Este movimiento ayuda a orientar a la cromátide hermana, de modo tal que el cinetocoro no ocupado del lado opuesto señala hacia el polo distal del huso. Finalmente, un microtúbulo de polo distal capturará el cinetocoro libre, en este momento se dice que el par de cromátides hermanas está biorientado. Con los dos cinetocoros unidos a polos puestos, el cromosoma duplicado ahora está bajo tensión, siendo traccionado en ambas direcciones por los dos conjuntos de microtúbulos de los cinetocoros Durante la prometafase, los cromosomas se ubican en el punto medio entre los dos polos del huso, es un proceso conocido como congregación de los cromosomas. Durante este proceso, los pares de cromosomas biorientados con frecuencia avanzan y retroceden oscilando hasta llegar al punto medio. La congregación de los cromosomas involucra a la actividad coordinada de varios motores basados en los microtúbulos, junto con reguladores del ensamblaje y desensamblaje de ellos. La conducta oscilatoria de los cromosomas implica el alargamiento de los microtúbulos unidos a un cinetocoro y el acortamiento de los unidos al otro, todo esto sin perder sus adhesiones. En los metazoos existen varios motores basados en los microtúbulos y asociados a los cinetocoros que contribuyen a este proceso. En primer lugar la dineína-dinactina provee la fuerza más intensa que tracciona el par de cromosomas hacia el polo más distante. Este movimiento requiere el acortamiento simultáneo del microtúbulo que se incrementa por la kinesina-13 localizada en el cinetocoro. Los microtúbulos asociados con el otro cinetocoro tienen que crecer a medida 8

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR que el cromosoma se mueve. En este cinetocoro se encuentra anclada la kinesina 7 que se mantiene en el extremo en crecimiento (+) del microtúbulo que está alargándose. También contribuye a la congregación la kinesina 4, que se asocia con los brazos del cromosoma, ella interactúa con los microtúbulos polares para traccionar los cromosomas hacia el centro del huso. Cuando los cromosomas se han congregado en la placa metafásica, se libera la dineína-dinactina desde los cinetocoros y se desplaza por los microtúbulos cinetocóricos hacia los polos. Durante el proceso de unión al azar cinetocoromicrotúbulo, es posible que se cometan errores; por ejemplo, ambos cintecoros de un par de cromátides hermanas podrían unirse a los microtúbulos desde el mismo polo del huso. Si estas uniones persisitieran durante la metaFig. 4 Captura y congregación de los cromosomas fase, el resultado sería una en la prometafase célula con un cromosoma menos y otra con uno de más, ambas alteraciones letales. Las células cuentan con dos mecanismos importantes para asegurarse que todos los cromosomas estén adecuadamente biorientados antes de que se inicie la anafase. El primero de los mecanismos asegura que las interacciones entre los cinetocoros y los microtúbulos sean débiles mientras se produce la biorientación. Cuando un cromosoma está correctamente biorientado, se produce tensión a lo largo del cromosoma y esta hace que se estabilice la unión entre el cinetocoro y el microtúbulo. El segundo mecanismo es el punto de control del ensamblaje en el huso, un circuito de señalización que interrumpe el avance del ciclo celular en la anafase hasta que haya tensión presente en todos los cinetocoros. Este mecanismo garantiza que todos los cromosomas estén correctamente biorientados antes de que la célula avance a la anafase.

Fig 5. Eventos de la prometafase de la mitosis 9

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Cuáles son los eventos celulares y moleculares que ocurren en una célula durante la metafase y anafase de la mitosis ? a. Metafase (gr. meta = en medio de) La metafase supone el 20% de la duración de la mitosis (~12 minutos). Se caracteriza porque los cromosomas alcanzan su máximo grado de empaquetamiento y se disponen en el plano central o ecuatorial de la célula, perpendicular a las fibras del huso. Los cromosomas metafásicos se observan con una cromatina perfectamente empaquetada que le permite al material genético mantener su integridad durante el estrés mecánico de los movimientos de anafase. Los cromosomas se colocan en el centro, entre los dos ásteres y forman la llamada placa metafásica. En la que los cromosomas se posicionan de tal manera que los cinetocoros de cada cromátide hermana están orientados hacia los polos opuestos. Estrictamente hablando, son realmente los centrómeros los que se disponen en el plano ecuatorial, de modo que los cromosomas quedan divididos como por un plano, que deja una cromátide a un lado y la otra hacia el otro lado. La vista polar de la metafase permite determinar el número, las dimensiones y la forma de los cromosomas. Contrario a la creencia popular, los cromosomas son altamente móviles durante la metafase. Aunque ellos permanecen, en su conjunto, balanceados a la mitad del huso, los cromosomas se empujan unos a otros y experimentan pequeñas excursiones hacia uno y otro polo, Estas oscilaciones cromosómicas dependen del movimiento activo de proteínas motoras y fluctuaciones en la longitud de los microtúbulos cinetocóricos. Mantener a los cromosomas en el ecuador celular implica un equilibrio entre las fuerzas de los microtúbulos que tienden a mover a los cinetocoros hacia los polos opuestos de manera que posicionarlos en el centro implica una gran cantidad de energía. La energía de los movimientos cromosómicos proviene de la polimerización/despolimerización de los microtúbulos en los que se utiliza la conversión de GTP a GDP y de las proteínas motoras en la que utiliza la conversión de ATP a ADP. En cada cinetocoro se pueden anclar entre 20-40 microtúbulos que ejercen fuerza de tracción hacia el polo del que provienen, por lo que la placa metafásica se mantiene por el equilibrio entre las fuerzas opuestas de los polos sobre los cromosomas, que mantiene juntas a sus cromátides hermanas por la cohesina centromérica, de manera que cuando esta proteína se retira del centrómero, la metafase termina y se inicia la anafase.

Fig. 6. Eventos de la prometafase de la mitosis 10

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR b. Anafase (gr. ana = hacia arriba) Representa el 10% de la duración de la mitosis (~ 6 minutos). El proceso clave de esta etapa es la segregación o disyunción de las cromátides hermanas (o cromosomas hijos) y su distribución equitativa entre los dos polos celulares. La anafase se divide en anafase A y anafase B. Anafase A, se caracteriza por la segregación de los cromosomas. Cuando se ha cumplido con el punto de control del ensamblaje en el huso, la activación del complejo promotor de la anafase/ciclosoma (APC/C), induce la proteólisis de las cohesinas remanentes que aún mantienen a las cromátides hermanas unidas. Repentinamente las dos cromátides hermanas apareadas se separan una de la otra y se dirigen a sus respectivos polos. Las cromátidas, adquieren así forma de V, con brazos iguales o desiguales, dependiendo del tipo de cromosoma. El movimiento es repentino por que los microtúbulos del cinetocoro están en tensión y tan pronto como se liberan las uniones de las cohesinas entre las cromátides, los cromosomas separados están en libertad de moverse. En Drosophila dos proteínas kinesina-13, proteínas que despolimerizan microtúbulos, también contribuyen al movimiento de los cromosomas en la anafase A. Una de las proteínas kinesina-13 se localiza en el cinetocoro e incrementa el desensamblaje, y la otra se localiza en el polo del huso, aumentado la despolimerización en ella. En consecuencia, se acortan los microtúbulos del cinetocoro tanto en sus extremos (+) como (-), traccionando los cromosomas hacia los polos. Este proceso requiere hidrólisis del ATP. Los microtúbulos cinetocóricos se acortan hasta 1/3 ó 1/5 de lo que medían en la metafase. En todos los organismos analizados hasta la fecha, la pérdida de cohesinas desencadena el movimiento de los cromosomas en la anafase. Una proteasa conocida como separasa corta una subunidad de la cohesina llamada Scc1 rompe los círculos proteicos que vinculan a las cromátides hermanas. Una vez que este vínculo se ha roto. Se inicia la anafase como una fuerza hacia los Fig. 6. Movimiento de los cromosomas y separación polos ejercida sobre los cinetocoros, de los polos del huso en la anafase que mueven las cromátides hermanas escindidos hacia los polos del huso. Anafase B, se caracteriza por el aumento de la distancia entre los centrosomas y la elongación de las fibras del huso mitótico (hasta el doble de su longitud en la metafase). De esta manera, la célula adquiere una conformación elíptica. El compromiso de las proteínas bipolares Kinesina-5 es un contribuyente principal para este movimiento. Estos motores se asocian con los microtúbulos polares que se superponen y dado que son motores dirigidos al extremo (+), empujan a los polos, separándolos. Al tiempo que esto ocurre, los microtúbulos polares deben crecer para acomodarse a la distancia creciente entre los polos del huso. Otro motor (la dineína dirigida al extremo (-), localizada y anclada en la corteza 11

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR celular) ejerce su acción sobre los microtúbulos del áster y de este modo contribuye a la separación de los polos del huso. Al final de este período se observan más microtúbulos en el ecuador. Esto es debido al alargamiento de los microtúbulos polares por adición de nuevas tubulinas en sus extremos (+), con el consiguiente entrecruzamiento de los microtúbulos provenientes de un polo con los que vienen del polo opuesto.

Fig. 7. Eventos de la anafase de la mitosis 5.

Cuáles son los eventos celulares y moleculares que ocurren en una célula durante la telofase y la citocinesis ? a. Telofase (gr. telo = fin) Abarca el 30% de la duración de la mitosis (~18 minutos). Una vez que cada paquete de cromátides llega a los polos de la célula, el huso mitótico se desensambla, los cromosomas comienzan a descondensarse y la envoltura nuclear se reintegra. Básicamente, las células son impulsadas hacia fuera de la mitosis mediante una reversión de los eventos que la impulsaron hacia ella. Los eventos asociados con la salida de la mitosis son llevadas a cabo por la defosforilación de los sustratos de las Cdk, lo que puede considerarse como la inversa del ingreso en la mitosis. Los eventos de fosforilación que desencadenaron los diferentes eventos mitóticos deben deshacerse para que la célula revierta al estado G1. La defosforilación de los sustratos Cdk mitóticos es provocada por la inactivación de las Cdk mitóticas, En la mayor parte de los organismos, la inactivación de las Cdk mitóticas desencadenada por la degradación mediada por APC/CCdc20 de las ciclinas mitóticas. En levaduras en gemación y quizá también en vertebrados participa la proteína fosfatasa Cdc 14 en la inhibición de la Cdk mitótica, para que ocurra la salida de esta fase. La reversión de la fosforilación de las Cdk mitóticas cambia las actividades de muchas proteínas nuevamente a su estado de interfase. La defosforilación de las condensinas, la histona H1 y otras proteínas asociadas a la cromatina conduce a la descondensacióm de los cromosomas mitóticos en telofase. Se desconocen las dianas de las Cdk, cuya defosforilación es importante para el desensamblaje del huso mitótico. En relación a la envoltura nuclear, se cree que las proteínas de la membrana nuclear interna defosforiladas se unen nuevamente a la cromatina. Como resultado de ello, se piensa que múltiples proyecciones de la membrana del retículo endoplásmico (RE) que contienen estas proteínas se asocian con la superficie de los cromosomas en descondensación y luego se fusionan unas con otras, dirigidas por un mecanismo desconocido para formar una doble membrana continua alrededor de cada cromosomas. La defosforilación de los subcomplejos del poro nuclear les permite reensamblarse en complejo del poro nuclear 12

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR (CPN) completos que atraviesan las membranas internas y externa, poco después de la fusión de las proyecciones del RE. Los cromosomas muestran tumefacción y se descondensan. Al mismo tiempo, el huso se desmonta y los microtúbulos de los ásteres se hacen más largos y se forma una nueva estructura basadas en microtúbulos llamada cuerpo intermedio en el área entre los dos grupos separados de cromosomas. En la telofase tardía los cromosomas empiezan a transcribir y reaparecen los nucléolos a partir de los organizadores nucleolares. El citoesqueleto se reorganiza y reaparece la forma propia de la célula. b. Citocinesis La citocinesis, o división del citoplasma, es la última fase de la división celular; en ella el citoplasma se divide para dar lugar a dos células hijas completamente independientes. Fig. 8. Modelo para reensamblaje de la Sin embargo, la citocinesis empieza desde envoltura nuclear en telofase la anafase, cuando se forma, inmediatamente por debajo de la membrana plasmática a nivel del ecuador celular, un cinturón de proteínas filamentosas (anillo contráctil). El anillo contráctil es una banda delgada de filamentos de actina de polaridad mixta, intercalados con filamentos bipolares de miosina II. Al recibir la señal el anillo se contrae, en primer lugar para generar un surco de escisión (cleavage furrow) y luego para separar esta célula en dos. Hay dos aspectos del anillo contráctil que resultan esenciales para su función. El primero, es que debe estar adecuadamente ubicado en la célula. Se sabe que la ubicación está determinada por señales que provienen del huso de tal modo que el anillo se forma equidistante a ambos polos del huso. El segundo aspecto importante del anillo contráctil es el momento de su contracción (si esta se produjera antes de que todos los cromosomas hubiesen llegado a sus respectivos polos habrían consecuencias genéticas desastrosas). El anillo se contrae de modo similar a la contracción muscular, tracciona la membrana hacia adentro y finalmente cierra la conexión entre las dos células hijas. El ensamblaje y al contracción del anillo actina-miosina parece depender (al menos en parte) de la fosforilación de las moléculas de miosina por kinasa activada por rho (del inglés Rho kinase). A su vez, esta enzima es activada por la proteína RhoA, una GTPasa de la familia de Ras que se concentra en el lugar en el que aparece el surco de segmentación. La citocinesis debe estar coordinada con otros eventos del ciclo celular en tiempo y espacio, para que la división celular produzca dos células hijas, cada una de las cuales contendrá los componentes necesarios para la sobrevivencia, el plano de división debe estar ubicado de modo tal que cada célula reciba aproximadamente la mitad del contenido citoplasmático de la célula madre y exactamente la mitad del contenido genético. La citocinesis también debe estar coordinada con la secuencia temporal de los eventos del ciclo celular, la finalización de la mitosis. Las células hijas reciben aproximadamente la misma cantidad de organelos citoplásmicos. En células con muchas mitocondrias o peroxisomas, estos organelos, que han proliferado antes de la mitosis, se reparten en partes iguales. Las mitocondrias y el retículo endoplásmico tienden a acumularse alrededor del huso, y los lisosomas en los polos. Parece que los organelos y los fragmentos membranosos se unen a microtúbulos del 13

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR huso mediante proteínas motoras que, durante la anafase, les permiten dirigirse hacia lo que serán las células hijas.

Fig. 9. Eventos de la anafase de la mitosis 6.

Cuál son los genes que regulan el ciclo celular? Qué son las ciclinas y kinasas ? La progresión del ciclo de división celular está controlada por un grupo de genes que pueden dividirse en dos grandes grupos: a. Los genes que codifican proteínas necesarias para la progresión del ciclo (como las enzimas y precursores de la síntesis de ADN y las enzimas para la síntesis y ensamblaje de las tubulinas del huso). b. Los genes que codifican proteínas que regulan positiva o negativamente el ciclo celular. Estos genes, a su vez, pueden dividirse en dos tipos: - Genes que regulan positivamente el ciclo. Son los denominados protooncogenes en los mamíferos. Sus productos activan la proliferación celular, consiguiendo que células en G0 salgan de este estado, pasen a la fase S y entren en división. Entre estos genes están los que codifican las proteínas del sistema de ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas. Algunos se denominan genes de respuesta temprana, porque se expresan muy rápidamente luego de adición de suero: Muchos de éstos codifican para factores de transcripción, como Fos, Jun y Myc, que activan la transcripción de otros genes llamados genes de respuesta tardía. Un gen de respuesta tardía es una ciclina de G1, la ciclina D. - Genes que regulan negativamente el ciclo. Se denominan genes de verificación o, en los mamíferos, genes supresores tumorales. Las Ciclinas y Kinasas Dependientes de Ciclina. Las ciclinas son una familia de proteínas que, como indica su nombre, son sintetizadas y destruidas durante una determinada fase del ciclo celular, ellas son reguladores claves en la transición del ciclo celular. Las kinasas dependientes de ciclina mantienen sus niveles constantes, mientras su actividad fluctúa a lo largo del ciclo celular, en parte a consecuencia de su asociación con distintas proteínas activadoras de tipo ciclina, que les confieren especificidad de sustrato. Estas oscilaciones de la actividad Cdk no sólo dependen de la formación de los complejos Ciclina/Cdk, sino también de procesos de fosforilación y desfosforilación, y de la presencia de proteínas inhibidoras de kinasas, CKI (del inglés Cyclin-dependent Kinase Inhibitor). Las ciclinas y las Cdk constituyen una sola macromolécula con actividad de kinasa; ninguna de las dos son funcionales cuando están separadas. Todas las Cdk están estructuralmente 14

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR relacionadas unas con otras, y requieren estar asociadas con sus respectivas ciclinas para constituir la holoenzima y ejercer su actividad. El papel de las ciclinas en la actividad de las kinasas es doble. Por un lado, asegura una ventana temporal para la activación de su respectiva kinasa, y por otro lado, es la ciclina la que mantiene el orden de los eventos del ciclo celular. A continuación se detallan las ciclinas y Cdk en cada una de las etapas del ciclo celular: a. Ciclinas y kinasas de G1. Las ciclinas presentan un pequeño pico de acumulación al final de la fase G1 y promueven el paso por el punto de restricción en células animales, lo que en definitiva conlleva la entrada de la célula en un nuevo ciclo celular. Están representadas principalmente por la ciclina D. Existen tres isoformas de ciclina D: D1, D2, D3, y cada una es expresada de manera distinta en diferentes tipos celulares. Las ciclinas D forman complejos con kinasas (Cdk4 y Cdk6). El complejo ciclina D/Cdk4,6 se encarga de hiperfosforilar a la proteína pRb y activar así la expresión de genes necesarios para la entrada en la fase S. Esta proteína desfosforilada bloquea el ciclo celular en la transición G1/S, por lo que su fosforilación permite a la célula entrar en fase S. En células G0, los niveles de ciclina D son bajos; probablemente, es por esto que la célula se mantiene en esta fase. La expresión de ciclina D se estimula por factores de crecimiento. Se ha encontrado una sobreexpresión de ciclina D en adenoma paratiroideo, linfomas y algunos carcinomas de células escamosas. Más del 50% de los cánceres de mama han mostrado una amplificación en región cromosomal que codifica para ciclina D. b. Ciclinas y kinasas de G1/S. Las ciclinas se activan al final de la fase G1 y comienzos de la S. Están representadas por la ciclina E. Esta ciclina se asocia con la kinasa Cdk2. El complejo ciclina E/Cdk2 actúa cooperativamente con el complejo ciclina D/Cdk4,6. El complejo ciclina E/Cdk2, fosforila la proteína pRb. Además, fosforila la histona H1, lo que produce un reacomodo de la cromatina. Existe sobreexpresión de ciclina E en adenocarcinoma de mama, carcinomas de próstata, colon, páncreas y estómago. c. Ciclinas y kinasas de S. Las ciclinas actúan durante la fase S y son necesarias para iniciar la replicación del DNA. Su representante es la ciclina A. Esta ciclina se asocia con dos kinasas: Cdk2 y Cdk1. El complejo ciclina A/ Cdk2 se requiere para la progresión de G 1/S y, actúa fundamentalmente fosfo-rilando y activando helicasas, las cuales a su vez actúan abriendo la doble hélice de ADN. El complejo ciclina A/Cdk1 se requiere para la transición G2/M. La ciclina A, se ha encontrado alterada en los cánceres de adenocarcinoma de mama, riñón y páncreas, así como en las leucemias linfocítica aguda y mielocítica aguda. d. Ciclinas y Kinasas de M. La ciclina de esta fase promueven la mitosis. Su representante es la ciclina B. En mamíferos existen tres isoformas de ciclina B: la ciclina B1 y B2 son citoplásmicas mientras que la ciclina B3 es nuclear. La ciclina B1 es necesaria en la mitosis. La ciclina B3 se encuentra restringida a células germinales durante el desarrollo y a testículos en adultos. Fig. 10. Ciclinas y kinasas del ciclo celular 15

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR Esta ciclina forma complejos con la kinasa Cdk1 cuya acción es la de controlar la formación del huso mitótico y la correcta distribución de los cromosomas en la placa ecuatorial de la célula. Finalmente, para que la célula pueda completar la mitosis y abandonar el ciclo celular, la ciclina B se degrada por el complejo promotor de la anafase.

7.

Cómo se regulan los complejos ciclina/kinasa ? Las kinasas dependientes de ciclinas se describen como las “máquinas” que impulsan el ciclo celular por sus diversas etapas. Las actividades de estas enzimas están reguladas por diversos “frenos” y “aceleradores” que operan en combinación. Estos comprenden: a. Estado de fosforilación de la kinasas dependientes de ciclina. Cuando una ciclina está presente en la célula, se une con la subunidad catalítica de Cdk, lo que ocasiona un cambio importante en la conformación del centro activo de la Cdk que conducen a una elevación de su actividad catalítica. Una manera de controlar la actividad de los complejos ciclina/Cdk es la fosforilación. Las Cdk pueden ser fosforiladas en dos superficies distintas; la fosforilación en una de ellas activa la kinasa, y la fosforilación en la otra la inhibe. La fosforilación activadora ocurre en un residuo de treonina dentro del asa T de la kinasa, y causa un cambio conformacional en la Cdk que se requiere para que se haga activa. La fosforilación inhibidora ocurre en otra región de la Cdk sea en un residuo de tirosina, o en residuo de treonina adyacente. b. Proteólisis controlada. Las concentraciones de ciclina oscilan durante cada ciclo celular, lo que produce cambios en la actividad de las Cdk. Las células regulan la concentración de ciclinas y otras proteínas clave del ciclo celular mediante el ajuste tanto de la síntesis como de la velocidad de destrucción de la molécula en diferentes puntos del ciclo celular. La degradación se logra por la vía de la ubiquitina-proteosoma. A diferencia de otros mecanismos que controlan la actividad de Cdk, la degradación es un proceso irreversible que ayuda a impulsar el ciclo celular en un solo sentido. La regulación del ciclo celular requiere de complejos con múltiples subunidades, el complejo promotor de la anafase, APC (anaphase promoting complex) que funcionan como ligasas de ubiquitina. Este complejo reconoce las proteínas que se van a degradar y las unen a una cadena de poliubiquitina, lo que asegura su destrucción en un proteosoma. El complejo APC actúa en la mitosis y degrada varias proteínas clave de la mitosis, entre ellas las ciclinas mitóticas. La destrucción de las ciclinas mitóticas permite a la célula salir de la mitosis e iniciar un nuevo ciclo celular.

Fig. 11. Inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas. 16

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR c. Inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas. Diversos inhibidores pueden bloquear la actividad de kinasa dependiente de ciclina. Dos familias de proteínas inhibidoras, llamadas inhibidoras de kinasas, CKI (cyclin-dependent kinase inhibitors). Actualmente las CKI se clasifican en dos grupos: la familia de p16 INK (p15, p16, p18, p19) y la familia Cip/Kip (p21, p27 y p57). La familia Ink tiene actividad contra las kinasas Cdk2 y Cdk4. Su mecanismo de acción se basa en la unión a las Cdk bloqueando así su unión a la ciclina. Los Ink actúan para inhibir la progresión a través de G 1. Por otra parte, la familia Cip/Kip actúan formando complejos terciarios con las unidades ciclina/CdK y al contrario que las anteriores, parecen interactuar con casi todos los complejos ciclina/Cdk. Además p21 y p57 también se unen al antígeno nuclear de proliferación celular, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) que es una subunidad de la ADN polimerasa, con lo que se bloquea su acción y resulta así una inhibición de la síntesis de ADN y la interrupción del ciclo celular.

Fig. 12. Regulación de la actividad de los complejos ciclina/kinasa d. Localización subcelular. La célula contiene varios compartimientos distintos en los que las moléculas reguladoras pueden unirse o separarse de las proteínas con las que interactúan. La localización subcelular es un fenómeno dinámico en el que los reguladores del ciclo celular se mueven a distintos compartimientos en diferentes etapas. Por ejemplo, una de las principales ciclinas mitóticas de las células animales (ciclina B1) se desplaza entre el núcleo y el citoplasma hasta G2. Inmediatamente antes del inicio de la mitosis, las señales de exportación nuclear, NES (nuclear export signal) son desactivadas mediante fosforilación, lo que permite que la mayor parte de la ciclina B/cdk1 se acumule en el 17

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR núcleo. Se supone que la fosforilación bloquea la exportación posterior de la ciclina de regreso al citoplasma. Si la acumulación nuclear de la ciclina se bloquea, las células no inician la división celular.

8.

Describa cómo se regula el complejo FPM (ciclina B/kinasa Cdk1) ? El factor promotor de la maduración, MPF (maturation promoting factor) es un dímero constituido por la ciclina B y la kinasa Cdk1. La ciclina B es una subunidad reguladora que se requiere para la actividad catalítica de la CDk1. La regulación del FPM ocurre mediante la fosforilación y la desfos-forilación de Cdk1. En las células de mamífero, la ciclina B es sintetizada y forma complejos con Cdk1 durante G2. A medida que se forman estos complejos, la Cdk1 es fosforilada en dos posiciones reguladoras críticas. Una de estas fosforilaciones ocurre en la treonina-161 (thr 161) y es necesaria para la actividad de la Cdk1. Esta fosforilación es llevada a cabo por el complejo quinasa activadora de Cdk, CAK (Cdk activating kinase). La segunda es una fosforilación de la tirosina-15 (en algunos organismos, también en treonina 14) por la proteína kinasa Wee1 (en español, pequeñita), que inhibe la actividad de Cdk1 y da lugar a la acumulación de complejos de ciclina/Cdk1 inactivos durante la fase G2. La transición de G2 a M se produce mediante la activación del complejo ciclina B/Cdk1 como resultado de la desfosforilación de la treonina-14 y tirosina-15 por la acción de una fosfatasa denominada Cdc25 (cell division cycle 25). El equilibrio entre las actividades de la kinasa Wee1 y la fosfatasa Cdc25, que en condiciones normales determina si la célula permanece en G2 o avanza a la mitosis, está regulado por otras kinasas y fosfatasas adicionales.

Fig. 13. Regulación de la actividad de los complejos ciclina/kinasa El complejo FPM fosforila aproximadamente 70 sustratos mitóticos que actúan en la separación de los centrosomas, la fosforilación y activación de enzimas reguladoras de la condensación de la cromatina, fosforilación de la histona H 1, reorganización del citoesqueleto de microtúbulos y de actina y fosforilación de los residuos específicos de serina en las tres láminas nucleares, lo que causa la rotura de los filamentos de lámina en dímeros individuales de lámina, desencadenando directamente la despolimerización de la lámina nuclear; y la fosforilación de diversas proteínas de la matriz del Golgi (GM130 y GRASP-65) que son necesarias para el acoplamiento de las vesículas recubiertas de COP1 a la membrana del 18

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR Golgi; su fosforilación inhibe el acoplamiento y la fusión de las vesículas, lo que provoca la fragmentación de dicho aparato. Además, la actividad de Cdk1 provoca la degradación de la ciclina B que se produce por una proteólisis mediada por ubiquitina. Esta destrucción proteolítica de la ciclina B inactiva a Cdk1, lo que lleva a la célula a salir de la mitosis, a sufrir la citocinesis, y a volver a la interfase.

Fig. 14. Dianas de la ciclina B/Cdk1 9.

Qué es un proto-oncogen ? Cómo se activan los proto-oncogenes a oncogenes ? Un oncogén, es un gen cuya presencia puede desencadenar el desarrollo del cáncer. Los oncogenes codifican proteínas que estimulan la proliferación celular excesiva y/o promueven la supervivencia celular. Ellos surgen por mutación de genes celulares normales denominadas proto-oncogenes. Los proto-oncogenes, son genes celulares normales que realizan contribuciones esenciales a la regulación del crecimiento celular y la supervivencia. La activación de los oncogenes implica un incremento en la función de proto-oncogenes que participan en la estimulación del crecimiento, la división y la supervivencia celular. La ganancia de función puede ser a nivel cuantitativo (incremento en la generación del producto inalterado) o a nivel cualitativo (generación de un producto modificado a consecuencia de una mutación o producción de un producto distinto a partir de un gen quimérico creado por reordenamiento cromosómico). En todos los casos los cambios sufridos por los protooncogenes son dominantes y normalmente afectan a uno de los dos alelos de un gen. Los protooncogenes pueden ser activados por los siguientes mecanismos moleculares: a. Mutaciones puntuales. La mutación puntual, es la sustitución de un único nucleótido en el ADN que causa la sustitución de un único aminoácido en la proteína codificada por el protooncogén normal. Los oncogenes de este tipo que se encuentran con mayor frecuencia son los oncogenes RAS que codifican formas anormales de la proteína Ras. Las mutaciones puntuales crean formas anormales, hiperactivas de la proteína Ras, que provocan que la ruta de Ras esté continuamente activada, conduciendo a una proliferación celular excesiva. Los oncogenes Ras se han detectado en varios cánceres humanos, incluyendo a los de colón, pulmón, mama y vejiga. Las mutaciones que activan los oncogenes se producen a nivel somático. Las mutaciones en células germinales suelen ser letales. b. Amplificación génica. La amplificación de los genes produce aumento del número de copias de un proto-oncogen. Cuando el número de copias génicas aumenta, provoca que la 19

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR proteína codificada por el proto-oncogén se produzca en cantidades excesivas, aunque la proteína en sí misma es normal. Ej. ERBB2 y MYC son genes que se encuentran frecuentemente amplificados en cáncer de mama. Pueden existir cientos de copias extra en una sola célula. El resultado es un gran aumento en el nivel de concentración de la proteína, que, a cambio, desencadena una proliferación celular excesiva. c. Traslocación cromosómica. Durante la traslocación cromosómica, una porción de un cromosoma se retira físicamente y se liga a otro cromosoma. Las translocaciones cromosómicas pueden crear genes quiméricos que no existen en condiciones fisiológicas. El cromosoma Philadelphia es la translocación más conocida y consiste en un pequeño cromosoma acrocéntrico presente en el 90% de los pacientes con leucemia mieloide crónica. Es el resultado de la translocación entre los cromosomas 9 y 22. El punto de ruptura en el cromosoma 9 se localiza en un intrón del oncogén ABL y en el cromosoma 22 implica la localización del gen BCR. El gen BCR/ABL produce una proteína con actividad tirosina kinasa relacionada con la proteína Abl pero con propiedades transformantes. d. Reordenaciones locales del ADN. En las reordenaciones locales las secuencias de bases de los proto-oncogenes se alteran por delecciones, inserciones, inversiones o transposiciones. Un ejemplo son los cánceres de tiroides y los de colon que ilustran cómo una simple reordenación puede crear un oncogén a partir de dos genes normales. 5. Mutagénesis insercional. Los retrovirus que no poseen sus propios oncogenes a veces pueden causar cáncer integrando sus genes en un cromosoma huésped en una región en donde se localice un proto-oncogén huésped. En tales casos, la integración del DNA viral, convierte al proto-oncogén en un oncogén o bien porque altera la estructura del gen provocando la producción de una proteína anormal o bien provocando la sobreexpresión del gen. Este fenómeno denominado mutagénesis insercional, se encuentra con frecuencia en cánceres animales pero en raras ocasiones en cánceres humanos.

Fig. 15. Mecanismos para convertir proto-oncogenes en oncogenes. 10.

Describa el papel del gen supresor tumoral p53 Los genes supresores de tumores, deben su nombre a la capacidad que poseen de hacer que una célula cancerosa pierda su habilidad de proliferación, se dividen en dos tipos: gatekeepers y caretakers. Los primeros actúan directamente como inhibidores de la proliferación celular o como promotores de apoptosis (ej. p53 y Rb). Mientras que los caretakers no actúan directamente sobre la regulación del crecimiento celular, pero al mutarse causan 20

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR inestabilidad genética (ej. BRCA1 y BRCA2), aumentando la tasa de mutación de otros genes (p53 y APC) y promoviendo así el crecimiento celular de una forma indirecta. El gen supresor tumoral gatekeeper más estudiado y mejor descrito es p53, cuya pérdida de función se debe a una mutación puntual localizada en el dominio central de unión a DNA en cuando menos uno de los alelos del gen. En un principio, si sólo un alelo del gen p53 es mutado, el otro alelo sería capaz de controlar el ciclo celular; al estar el alelo mutado p53 es incapaz de unirse a las proteínas normales con las que forma el tetrámero activo, atenuando su actividad supresora. A este tipo de defecto se le denomina mutación con pérdida de función La proteína p53 es un factor de transcripción codificado por el gen Tp53 (tumor suppressor protein 53). El gen p53 se localiza en el cromosoma 17p13.1. La proteína p53 funciona como un guardián crítico contra la formación del cáncer, pues actúa como un «policía molecular» que impide la propagación de células genéticamente dañadas. p53 frustra la transformación neoplásica mediante tres mecanismos entrelazados: activación de la detención transitoria del ciclo celular (quiescencia), desencadenamiento de la muerte celular programada (apoptosis) o inducción de una detención permanente del ciclo celular (senescencia). En células sanas no sometidas a tensión, p53 tiene una vida media corta debido a su asociación con MDM2, una proteína de la que es diana para su destrucción. Cuando la célula está sometida a tensión, por ejemplo por una agresión a su ADN, p53 sufre modificaciones postranscripcionales que la liberan de MDM2 y aumentan su vida media. Separada de MDM2, p53 también llega a activarse como un factor de transcripción. Se han encontrado cientos de genes cuya transcripción está desencadenada por p53. Pueden agruparse en dos categorías amplias: los que causan detención del ciclo celular y los que causan apoptosis. Si el daño del ADN puede repararse durante la detención del ciclo celular, la célula revierte a su estado normal; si la reparación fracasa, p53 induce apoptosis o senescencia.

Fig. 16. Papel de p53 en el mantenimiento de la integridad del genoma. 21

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR La detención del ciclo celular mediada por p53 puede considerarse la respuesta primordial a un daño del ADN. Se produce tardíamente en la fase G1 y está causada principalmente por la transcripción dependiente de p53 del inhibidor de CDK, la p21. p21 inhibe los complejos ciclina/CDK y la fosforilación de RB, impidiendo así que las células entren en fase G 1. Esta pausa en el ciclo celular es bienvenida, porque da a las células un «tiempo de respiro» para reparar el daño del ADN. p53 también ayuda en el proceso mediante la inducción de ciertas proteínas, como detención del crecimiento y daño del ADN, Gadd45 (growth arrest and DNA damage), que ayudan a la reparación del ADN. p53 también puede estimular las vías de reparación del ADN mediante mecanismos independientes de la transcripción. Si el daño del ADN se repara con éxito, p53 regula positivamente la transcripción de MDM2, conduciendo a su propia destrucción y, por tanto, liberando el bloqueo del ciclo celular. Si la lesión no puede repararse, la célula puede entrar en senescencia o sufrir apoptosis, ambas inducidas por p53. La apoptosis inducida por p53 de las células con daño irreversible del ADN es el mecanismo protector final contra la transformación neoplásica. p53 dirige la transcripción de varios genes proapoptóticos, como Bax (Bcl-2 associated X rotein), PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis), NOXA y se reprime la expresión del gen antiapoptótico bcl-2 (B-cell lymphoma 2). No está claro exactamente cómo decide una célula si reparar su ADN o entrar en apoptosis. Parece que la afinidad de p53 por los promotores e intensificadores de los genes de reparación del ADN es más fuerte que su afinidad por los genes proapoptóticos. Por ello, primero se estimula la vía de reparación del ADN, mientras p53 continúa acumulándose. Finalmente, si el daño del ADN no se repara, se acumula suficiente p53 para estimular la transcripción de los genes proapoptóticos y la célula muere. Aunque este esquema generalmente es correcto, también parecen existir importantes respuestas específicas del tipo celular y algunos tipos de células sucumben precozmente a la apoptosis, mientras que otros optan por la senescencia. La senescencia inducida por p53 es una detención permanente del ciclo celular caracterizada por cambios específicos en la morfología y la expresión génica que la diferencia de la quiescencia o detención reversible del ciclo celular. La senescencia requiere la activación de p53 y/o Rb y la expresión de sus mediadores, como los inhibidores de CDK, y generalmente es irreversible, aunque puede requerir la expresión continuada de p53. Como todas las respuestas a p53, la senescencia puede estimularse en respuesta a una variedad de tensiones, como señales oncógenas sin oposición, hipoxia y telómeros acortados. Las células que carecen de p53 no sufren apoptosis en respuesta a agentes que dañan al ADN, incluyendo la radiación y muchos de los principios activos empleados en la quimioterapia contra el cáncer. Este fallo a sufrir apoptosis en respuesta al ADN dañado contribuye a la resistencia de muchos tumores a la quimioterapia. Alrededor de un 50% de cánceres humanos presentan mutaciones en Tp53. La pérdida homocigótica de p53 se encuentra virtualmente en todos los tipos de cáncer, incluyendo carcinomas de pulmón, colon y mama, las tres causas principales de muerte por cáncer. Pero la pérdida de la función de esta proteína no solo puede deberse a una mutación en el gen que la origina, sino que existen otros mecanismos que pueden provocar que la célula carezca de un control tan importante como éste. Un ejemplo bien estudiado es la infección por ciertos virus como el papilomavirus humano (HPV), el cual presenta una proteína temprana denominada E6, la cual se une a la proteína p53 y potencia su degradación mediada por ubiquitina. 11.

Describa el papel del gen supresor tumoral Rb La proteína pRb, el producto del gen Rb, es una fosfoproteína nuclear que se expresa de forma ubicua y tiene un papel clave en la regulación del ciclo celular. Rb pertenece a una familia de tres miembros (pRb, p107 y p130), los cuales presentan múltiples sitios que son fosforilados por las Cdks.

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR La función de pRb viene determinada por su situación de fosforilación. Normalmente, los niveles de proteína pRb no se modifican durante el ciclo celular. En una célula que se encuentra en reposo, la pRb permanece hipofosforilada (estado activa), la cual fija el factor de transcripción génico E2F. el factor E2F está a su vez unido a una secuencia específica de nucleótidos en el ADN genómico, impidiendo así la transcripción de ARN mensajeros que codifican para proteínas necesarias para la proliferación celular. Sin embargo, a medida que progresa el ciclo celular, la pRb se va hiperfosforilando (estado inactiva) merced a la acción de los complejos ciclina D/Cdk 4,6 y ciclina E/Cdk2. Así permanecerá durante el resto del ciclo. Las señales mitógenas conducen a la expresión de ciclina D y la activación de complejos de ciclina D-Cdk4/6. Estos complejos fosforilan Rb, inactivando la proteína y liberando E2F, permitiendo la expresión de algunos genes que codifican proteínas involucradas en la progresión del ciclo celular y síntesis de ADN. Entre los primeros productos que se sintetizan, se encuentran la ciclina E y A. La acumulación de complejos ciclina E/Cdk2 se traduce en una mayor fosforilación de pRb y el aumento de la transcripción de los genes diana de E2F. El sistema está regulado mediante el inhibidor de Cdk, p27, que pertenece a la familia Cip/Kip, que inhiben la actividad de ciclinaE/Cdk2 temprano en G 1. De esta forma pRb no se fosforila, inhibiéndose así la transcripción de los genes dependientes de E2F. Por tanto, la sobreexpresión o mutación de ciclinas, CDKs o inactivación de CKIs, conduce a la progresión del ciclo celular y a que se produzcan alteraciones patológicas como el cáncer.

Fig. 17. Papel de RB en la regulación del punto de control G 1 -S del ciclo celular. pRb puede ser inactivado por otros mecanismos como, la inactivación genética de Rb, tal y como se observa en el caso del retinoblastoma, o a través de la acción de ciertas oncoproteínas virales, como la proteína E7 del VPH que se une a la forma hipofosforilada de pRb, promoviendo su degradación vía del proteosoma. La unión es particularmente potente para algunos tipos víricos, como el VPH tipo 16, que confieren un alto riesgo para el desarrollo de carcinomas cervicales. Si pRB está ausente (como resultado de mutaciones génicas) o su capacidad para regular los factores de transcripción E2F está descarrilada, se liberan los frenos moleculares del ciclo 23

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR celular y la célula se desplaza a través del ciclo. Si bien el tumor clásico derivado de la mutación del gen de Rb es el retinoblastoma, se han encontrado mutaciones en el gen Rb en otros tumores humanos, tales como osteosarcomas, cáncer de pulmón, próstata o mama. 12.

Cuáles son los puntos de control del ciclo celular ? Las células normales tienen la capacidad de interrumpir el ciclo celular, cuando ocurre un daño celular y se afecta la maquinaria bioquímica o la información genética involucrada en el ciclo. Con el fin de minimizar posibles errores, el ciclo celular posee una red de puntos de control o verificación (en inglés, checkpoint). Los puntos de control son cascadas de señalización que aseguran la estabilidad, la correcta replicación y la distribución adecuada del material genético en las células, además de garantizar el mantenimiento de la homeostasis interna de éstas, fundamentalmente por medio de la regulación de su progresión por el ciclo celular. La célula evalúa su estado y/o las condiciones del medio y detecta posibles aberraciones. Entonces es capaz de detenerse, poner los medios pertinentes para solucionar dichos problemas y proseguir o, por el contrario, activar las cascadas intracelulares de muerte celular programada. Si la célula no muere y queda con un ADN alterado entonces continúa hacia la transformación maligna. La integridad de los diferentes puntos de control se considera clave en el mantenimiento de la estabilidad genética, ya que una de las causas más frecuentes de su activación es, precisamente, la alteración del ADN. Existen tres puntos de control principales, que coinciden con la transición de una fase a otra: el punto G1, el punto G2 y el punto M. a. Punto de control de G1 Se corresponde con la transición de la fase final del período G1 a la fase S. Este punto de control se encarga de: revisar las condiciones del medio buscando factores externos que induzcan el progreso del ciclo celular; revisar que la célula haya crecido lo suficiente; y que el material genético esté intacto. La búsqueda de factores externos es muy importante pues éstos estimulan la síntesis de proteínas como algunas cdk’s y ciclinas, y sin estas la continuación y el control del ciclo celular serían imposibles. Las células que rebasan el punto G 1 quedan «comprometidas» a completar el ciclo. De esto deriva que el punto G1sea considerado el inicio del ciclo celular y otros nombres que los designan son punto de restricción o punto R. En cambio, si las células no sobrepasan este punto de control, se detendrán en la fase G 1 Fig. 18. Punto de control en el ciclo celular de forma transitoria o permanente (G 0). Cuando se estimula una célula para entrar en proliferación por factores externos, tales como hormonas, factores de crecimiento, etc., se inicia una serie de eventos moleculares que la llevarán a pasar el punto R. El punto de restricción se alcanzará siempre que los niveles de ciclina D estén elevados. Las moléculas que participan en el punto de control G 1 son: los complejos ciclina D/Cdk4,6, los inhibidores de kinasas p16 y p21 y las proteínas pRb y p53. El complejo ciclina E/Cdk2, se encarga de inactivar a la proteína Rb y de favorecer el trabajo de E2F para que estén listas las enzimas necesarias para iniciar la síntesis de ADN en la fase S. 24

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR En la detención del ciclo celular intervienen dos proteínas kinasas relacionadas, denominadas proteína mutado en ataxia telangectiasia (ATM, ataxia-telangiectasia mutated) y proteína relacionado con ATM y Rad3 (ATR, ataxia-telangiectasia and Rad3 related), que se activan como consecuencia de daños al ADN. ATM y ATR activan una vía de señalización que no solamente induce la detención del ciclo celular, sino también la activación de los mecanismos de reparación del ADN y, en algunos casos, la muerte celular programada. Tanto ATM como ATR forman parte de complejos proteicos que reconocen ADN dañado o sin replicar. ATM se activa fundamentalmente por roturas de la doble cadena, mientras que ATR lo hace por roturas de la cadena sencilla o secuencias de ADN sin replicar. Tras su activación por una lesión en el ADN, ATM y ATR fosforilan y activan a las kinasas de los puntos de control Chk1 y Chk2, respectivamente. Chk1 y Chk2 inducen la detención del ciclo celular a través de la fosforilación y la inhibición o la inducción de la degradación de las fosfatasas Cdc25, que son necesarias para activar a Cdk1 y Cdk2 a través de la eliminación de los residuos fosforilados inhibitorios durante la progresión del ciclo celular. De este modo, las lesiones del ADN dan lugar a la inhibición de Cdk2, que induce la parada del ciclo celular en G1 y S. Fig. 19. Detención del ciclo celular en puntos de control En las células de mamífero, la detención en el punto de control G1 también está mediada por la acción de p53 que es fosforilada tanto por ATM como por Chk2. La p53 usualmente se encuentra en la célula pero es muy inestable en condiciones normales ya que se encuentra unido a otra proteína llamada Mdm2 que funciona como un marcador para que la p53 se degrade. La fosforilación estabiliza a p53, resultando en un incremento rápido de los niveles de p53 en respuesta al ADN lesionado. La expresión incrementada de p53 da lugar a la inducción de p21. La proteína p21 inhibe los complejos Cdk2/ciclina E, desencadenando la detención del ciclo celular en G 1. b. Punto de control de la fase G2 El punto de control G2 se encuentra en la transición entre la fase G 2 y la fase M. En este punto se evalúan: el tamaño celular, las condiciones del medio extracelular y si el ADN ha sido replicado correctamente, si detecta algún error, el ciclo celular se detiene, y si no detecta errores, la célula progresará hacia mitosis. Las células evitan que se llegue a la mitosis con daño cromosómico, de manera que mientras se efectúa la reparación del ADN, el punto de control G 2 bloque la actividad del factor promotor de la mitosis, FPM (inglés MPF, Maturation Promoting Factor). La actividad del FPM puede ser inhibida por la señalización a través de ATM/ATR, mediante dos actividades principales: - Inhibición de la fosfatasa Cdc25, que es la que activa al complejo FPM en el límite de las G2/M por lo que al ser inhibida no se entra a mitosis. - Las kinasas Chk1/Chk2 pueden activar a Wee1, que es un regulador negativo del complejo FPM, o bien activar secuencialmente a p53 y a GADD45, un secuestrador de ciclina B. De este modo, se evita que la ciclina B entre al núcleo y no se forma el FPM.

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR Otro aspecto a considerar en este punto de control es la regulación de la localización subcelular del complejo ciclina B/Cdk2 el cual está presente normalmente, en citoplasma y posteriormente pasa a núcleo, conforme la célula progresa de la fase G 2 a M. Los complejos ciclina B son retenidos en el citoplasma en respuesta a radiación ionizante, con lo cual se detiene el ciclo celular en G 2, sugiriendo que la localización diferencial puede formar parte de las funciones del punto de control G 2. c. Punto de control del huso mitótico La mayoría de las células tienen un punto de control del huso mitótico que se encuentra entre la metafase y anafase que detiene la evolución del ciclo celular en la mitosis hasta que todos los cromosomas están unidos apropiadamente al huso mitótico. Por este motivo, el punto M es conocido también como el punto de control del ensamblaje del huso, SAC (spindle assembly checkpoint) o punto de control mitótico. El punto de control M se activa en cada ciclo celular inmediatamente después de la entrada a mitosis y funciona retrasado la entrada a anafase hasta que todos los cromosomas están correctamente alineados en la placa metafásica, biorientados y con tensión adecuada.

Fig. 20. El complejo promotor de la anafase y el punto del control del huso. Antes de la anafase, una proteína conocida como segurina se une a la separasa y la inhibe, una vez que todos los cinetocoros se han unido a los microtúbulos del huso del modo biorientado correcto, el complejo promotor de la anafase/ciclosoma (APC/ C) ubiquitina ligasa, dirigida por un factor específico Cdc20, ubiquitina la segurina. Este proceso se inicia cuando el cofactor proteico Cdc20 se une y activa al APC/CCdc20. El APC/CCdc20 es activado en la profase por la fosforilación, por acción de las Cdk mitóticas. Sin embargo, este APC/CCdc20 fosforilado no es activo hasta que todos los cromosomas estén biorientados sobre el huso mitótico. El APC/C Cdc20 es inhibido por una vía de puntos de control que asegura que la mitosis no procederá hasta que todos los cromosomas hayan logrado una unión adecuada al aparato mitótico. La Cdc20 está inhibida hasta que cada cinetocoro se haya unido a los microtúbulos y exista tensión aplicada a los cinetocoros de todas las cromátides hermanas, traccionándolos hacia los polos opuestos del huso. En las células de los vertebrados, también está regulada la separasa por fosforilación. La actividad de las Cdk mitóticas inhibe la separa durante la profase y la 26

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR metafase. Solo cuando la actividad de la CDK mitótica comienza a declinar en la transición metafase/anafase, a través de la degradación proteica medida por APC/CCdc20,, la separasa puede volverse activa y desencadenar la segregación cromosómica. Cuando el APC/CCdc20 se activa, transfiere tres ubiquitinas a la ciclina B1 y a la proteína segurina, marcándolas de ese modo para su degradación vía proteosoma. La segurina es importante porque se encarga de mantener secuestrada a la proteasa separasa; cuando ésta es liberada, gracias a la degradación de la segurina, tiene lugar a la degradación de la cohesina, que mantiene unidas a las cromátides hermanas. La degradación de la cohesina permite la segregación cromosómica, mientras que la degradación de la ciclina B1 tiene como resultado la inactivación de Cdk1; gracias esto se consigue salir de la mitosis Los componentes del punto de control de ensamblaje del huso reconocen y unen sitios de unión no ocupados por microtúbulos en los cinetocoros y crean una señal inhibidora de la anafase. Una proteína conocida como proteína deficiente en la detención mitótica, Mad2 (mitotic arrest-deficient 2) es central para la reacción de esta señal inhibidora. La Mad2 es reclutada a los cinetocoros que no están unidos a los microtúbulos, la Mad1 parece crítica para este proceso. La Mad2 unida al cinetocoro rápidamente se intercambia con una forma soluble de Mad2, que inhibe todas las Cdc20 de la célula. Cuando los microtúbulos se unen a los cinetocoros, estos liberan la Mad2 unida y cesan el proceso por el cual se produce la forma inhibidora, soluble de la Mad2. Si embargo, cuando incluso un único cinetocoro está desprendido de los microtúbulos, desde el polo opuesto del huso con respecto al de su hermano, se produce suficiente Mad2 inhibidora soluble en el cinetocoro desprendido como para inhibir toda la Cdc20 de la célula. La entrada a la anafase también se inhibe cuando la unión a los micrótúbulos por los cinetocoros es defectuosa.

F i g. 21. Vías de puntos del control del ensamblaje del huso. Estas proteínas son constituyentes de los cinetocoros libres que secuestran a la proteína Cdc20 sintetizada al inicio de la mitosis e impiden que se una y active el APC/C. de este modo, la segurina no será marcada para su degradación, la separasa no se liberará y los cromosomas no segregarán hasta que los requerimientos del punto M se satisfagan. 13.

Qué otras señales regulan el ciclo celular ? A continuación se verán algunas señales que también regulan el ciclo celular Tamaño celular La importancia del tamaño celular para sobrepasar G1 ha sido destacada desde hace tiempo. Este paso se logra en muchas células cuando alcanzan el tamaño adecuado, que se expresa en la relación de Hertwig (Vn/Vc-Vn), donde Vn= volum. nuclear y Vc= volum. citoplasmático. El factor crítico sería la relación Vcelular/número de copias de DNA. De hecho, las células 27

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR poliploides mantienen un tamaño proporcional a la cantidad de ADN. Esto no es aplicable a las células que se encuentran en G0. Algunas de ellas, por ejemplo las neuronas, no cumplen la relación de Hertwig, pues pueden alcanzar grandes tamaños del citoplasma sin que se produzca la replicación. Anclaje al sustrato Muchas células en cultivo, además de factores de crecimiento, necesitan estar ancladas a un sustrato para dividirse. La unión de las moléculas de la matriz extracelular a las integrinas de la superficie celular provoca la activación de quinasas como la quinasa de adhesión focal (FAK), que activa señales intracelulares que promueven la supervivencia, crecimiento y división celular. Estos contactos son también decisivos en la ordenación de los filamentos de actina del citoesqueleto, el cual desempeña una función primordial en la mitosis. Las células requieren este anclaje para pasar de G1 aunque no para el resto del ciclo; es más, adquieren forma redondeada y se sueltan al entrar en M. Limitación de la expansión por contacto En los cultivos celulares, las células dejan de crecer y dividirse cuando ocupan toda la superficie de la placa (inhibición por contacto). Esto explica por qué, en los cultivos celulares, donde las células se encuentran fuera del ambiente normal de crecimiento, el comportamiento resulta diferente del que tienen en su localización normal en el organismo. Así en cultivo el cartílago sintetiza menos sustancia intercelular y se divide más rápidamente, que cuando está en el organismo, donde las células estaban rodeadas por otras que limitaban su expansión. Sin embargo esta inhibición por contacto no parece ser simplemente una limitación física a la expansión, pues si se añaden factores de crecimiento continúa loa proliferación celular. Parece que el efecto de inhibición se debe a la competencia por los factores de crecimiento, de modo que las células en contacto no reciben los suficientes. Temperatura. La temperatura modifica la frecuencia de la división celular. Amoeba proteus a 23°C se divide cada 36-40 horas, pero a 17°C lo hace cada 48-55 horas. Por encima o por debajo de temperaturas límites se detiene el ciclo. Experimentos con hongos sugieren que este efecto de la temperatura se ejerce sobre la actividad de las ciclinas y Cdk. Edad La edad también interviene en la frecuencia de la división. La proliferación celular se hace más lenta y el número de células de muchos órganos disminuye. La capacidad de división de las células en cultivo es limitada y, tras varios ciclos celulares, las células alcanzan la senescencia celular. Los fibroblastos de pulmón humano en cultivo se dividen un determinado número de veces, que es inversamente proporcional a la edad del individuo del que han sido tomados. Así, estos fibroblastos se dividen hasta 50 veces si se han tomado de fetos, 40 veces si son de adultos, y 30 veces si pertenecen a ancianos. Las células en cultivo de pacientes con síndrome de Werner se dividen muy pocas veces. Si se intercambian los núcleos entre un fibroblasto de un joven y un fibroblasto de un anciano, el número de divisiones que realiza cada célula depende de la edad del núcleo, no de la del citoplasma. Según estos experimentos, las células de un embrión obtenido por clonación a partir de células somáticas pueden ser células genéticamente viejas aunque se acaben de formar. Características intrínsecas del tipo celular Las características propias de cada tipo celular determinan su comportamiento en el ciclo. Algunas células, como las células hematopoyéticas y las epiteliales, se dividen continuamente, se diferencian con gran facilidad y, una vez diferenciadas, tienen vida corta. Otras células, como las neuronas y las células musculares cardíacas, no se dividen nunca y, si mueren, su pérdida no puede ser reparada por el individuo. En otros casos, las células no se dividen nunca 28

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR en principio, pero si se suprime gran parte del tejido entran en división; esto ocurre en el tiroides y el hígado. Una hepatectomía del 70% del hígado induce una rápida actividad mitótica. En general, puede decirse que la frecuencia de la división es inversamente proporcional al grado de diferenciación de las células. Así, las células procariotas se dividen mucho más rápidamente que las eucariotas, y las células cultivadas lo hacen más rápidamente que esas mismas células cuando se encuentran en los tejidos habituales donde están más diferenciadas. Los embriones se dividen rápidamente al principio. Sus células son grandes y, como se dividen sin apenas tiempo para crecer, las células resultantes son cada vez más pequeñas. Pero llega un momento en que las divisiones son cada vez más lentas. Las células tienen más tiempo de crecer, se tornan cada vez más grandes y se hacen más diferenciadas. Estas características intrínsecas pueden residir en el citoplasma, pues se ha comprobado que si se trasplanta el núcleo de una célula al citoplasma enucleado de otra, cambia la frecuencia de división de ese núcleo con respecto a la que tenía en la célula donde originariamente estaba alojado. Sí, si se traslada el núcleo inactivo de un eritrocito de pollo a un fibroblasto enucleado de pollo en cultivo, el núcleo del eritrocito se vuelve activo e incluso se divide. 14.

Cuáles son los características “clásicas” de las células tumorales ? En los años 2000 y 2011, Hanahan y Weinberg definieron las características que una célula, inicialmente normal, adquiere en el proceso de transformación tumoral. Las características que poseen las células neoplásicas, son las siguientes: a. Autosuficiencia en las señales de crecimiento. (inglés, sustaining proliferative signaling). Las células normales requieren ciertos factores para su crecimiento, los cuales son transmitidos al interior celular mediante receptores transmembranas que se unen a distintas clases de moléculas de señalización tales como factores de crecimiento difusibles, componentes de matriz extracelular y moléculas responsables de la adhesión célula-célula. Ninguna célula humana normal puede dividirse en ausencia de estas señales estimuladoras. Muchos de los oncogenes que participan en la carcinogénesis actúan simulando el efecto de estas señales de crecimiento. Las células normales en cultivos requieren la suplementación del medio con mitógenos, en el caso de las células tumorales esta dependencia de factores mitógenos externos es muy reducida. Las células tumorales sin capaces de producir sus propias señales de crecimiento, rompiendo de esta manera la homeostasis necesaria para el correcto mantenimiento de los distintos tipos de células dentro de un tejido. Las células generalmente reciben las señales de crecimiento de otro tipo celular. Los tumores esquivan esta dependencia generando sus propias señales de crecimiento. Frecuentemente, presentan alteraciones ya sea en los receptores de factores de crecimiento o en las cascadas de transducción de estas señales. Ain embargo, se ha demostrado que las señales de crecimiento heterotípicas (de distinto tipo celular) son muy importantes para el tumor; esta señales son generadas por células normales del organismo que forman parte del estroma que rodea al tumor, células tales como, fibroblastos, células endoteliales, etc. b. Insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento. (evading growth suppressors). En el tejido normal existen multitud de señales antiproliferativas que garantizan la homeostasis del tejido y mantienen la quiescencia de las células. Estas señales pueden ser solubles, o estar unidas a la matriz extracelular de las células vecinas. Como pasa con las señales de crecimiento, su acción se realiza mediante la unión a receptores transmembrana y transducción de señal al interior mediante una cascada. Esta cascada desemboca en la proteína del retinoblastoma (pRb). El retinoblastoma es un represor del paso de G 1 del ciclo celular. Las células tumorales evitan la quiescencia mediante la reducción del número de receptores o mutaciones de los mismos, pérdida o mutación de Rb1, etc. 29

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR c. Evasión de la muerte celular programada (apoptosis). (inglés, resisting cell death). El crecimiento desmesurado de las células tumorales no depende sólo de la proliferación celular, de la activación de oncogenes promotores del crecimiento o a la inactivación de genes supresores del crecimiento tumoral, sino también depende de una muerte programada o apoptosis reducida. La apoptosis puede desencadenarse por diferentes señales, la cuales pueden ser fisiológicas o por estimulaciones exógenas ambientales. Estas señales pueden actuar sobre receptores de superficie y causar la activación en cascadas de proteínas citoplasmáticas; ello trae como resultado la activación de un programa genético que conduce generalmente a la nucleólisis por acción de las endonucleasas. La p53 es el sensor y regulador principal de la apoptosis. p53 se ha visto que está inactiva en un 50% de los cánceres humanos. Muchas células tumorales aumentan la expresión de factores antiapoptóticos, como Bcl-2, e inhiben la de factores proapoptóticos, como Bax, por lo que alteran el balance normal que se requieren para inducir la muerte celular.

Fig. 22. Características “clásicas de las células tumorales. d. Potencial replicativo ilimitado (inglés, enabling replicative inmortality). Las células normales tras un número limitado de divisiones entran en senescencia. En estado de crisis se da una muerte celular masiva, además aparecen reorganizaciones cromosómicas originadas por la fusión entre cromosomas y debidas principalmente al acortamiento de los telómeros. Una de cada 10 7 células adquiere la capacidad de dividirse sin límite, esta capacidad se denomina inmortalización. Esta inmortalización se logra mediante la activación de la telomerasa, que restaura los telómeros, evitando que se acorten en cada división. La telomerasa es una transcriptasa reversa que añade nuevas secuencias de ADN en los telómeros. Los telómeros consisten de muchas repeticiones de una secuencia de seis pares de bases (TTAGGG), asociadas a un complejo de proteínas llamadas “caperuzas”, que protegen a las secuencias teloméricas. La telomerasa es detectada en aproximadamente el 90% de los tumores malignos. e. Desarrollo de angiogénesis sostenida. (inglés, inducing angiogenesis). Todas las células requieren para su correcto desarrollo oxígeno y nutrientes. Los tumores en desarrollo para progresar a un mayor tamaño necesitan de un sistema vascular desarrollado. Para ello los tumores en crecimiento adquieren capacidad angiogénica. 30

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Los tumores presentan un expresión elevada de determinadas factores de crecimiento, el factor de crecimiento endotelial vascular (VRGF, vascular endotelial growth factor) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGFs, fibroblast growth factor) en comparación a los tejidos normales. Estas proteínas son moléculas inductoras de angiogénesis. La angiogénesis o vascularización consiste en la capacidad que tiene un tejido para formar una red vascular propia mediante el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes. Capacidad de invadir y generar metástasis (inglés, activating invasion and metastasis). Tarde o temprano en el desarrollo de la mayoría de tumores, algunas células adquieren la capacidad de invadir tejidos adyacentes o moverse a lugares más lejanos y dar lugar a nuevas colonias de células tumorales. Estos nuevos tumores lejanos, las metástasis, son la causa de muerte de un 90% de los casos. La adquisición de ésta capacidad por parte de las células tumorales viene dada principalmente por cambios en las moléculas de adhesión célula-célula, como las cadherinas o inmunoglobulinas, o moléculas de adhesión célulamatriz extracelular, como las integrinas. La propagación ocurre por invasión de los vasos sanguíneos o vasos linfáticos, o debido a que las células cancerosas penetran la cavidad corporal o espacios alrededor de órganos.

Cuáles son los características “emergentes” y “promotoras” de las células tumorales ? A las propiedades “clásicas” se han añadido otras dos llamadas “emergentes” a. Reprogramación del metabolismo energético. (inglés, deregulating celular energetics). La proliferación celular crónica y descontrolada de las células cancerosas no sólo está causada por una desregulación en el control de la proliferación celular, sino también por un ajuste en el metabolismo energético que permite la mayor tasa de crecimiento y división que tiene lugar en este tipo de células en comparación con las células sanas. Las células cancerosas son capaces de reprogramar su metabolismo y la producción de energía incluso en presencia de oxígeno, favoreciendo la glicólisis y limitando el transporte de piruvato a la mitocondria. Este fenómeno se denomina “glicólisis aeróbica” Este tipo de metabolismo provoca que los intermediarios formados durante la glicólisis formen parte de rutas anabólicas, como aquellas en las que se sintetizan nucleósidos y aminoácidos. Esto facilita la biosíntesis de macromoléculas y orgánulos, necesarios para la formación de nuevas células. b. Evasión del sistema inmune (inglés, avoiding inmune destruction), Según la teoría de la vigilancia inmunológica, las células y tejidos se encuentran monitorizados por el sistema inmune constantemente. Esta vigilancia es responsable de reconocer y eliminar la mayor parte de las células cancerosas emergentes, funcionando como una barrera e impidiendo la formación y progresión de un tumor. Acorde con esta teoría, los tumores sólidos que logran evadir la detección por parte del sistema inmune o que consiguen limitar el alcance del mismo consiguen proliferar. Un ejemplo de ello es que las células cancerosas podrían paralizar las células natural killers y los linfocitos T citotóxicos CD8+ mediante la secreción de factor de crecimiento transformante beta (TGF u otros factores inmunosupresores. Aparte de estas, se han añadido un par de características “promotoras”, que originan y posibilitan el desarrollo de las propiedades tanto “clásicas” como “emergentes”. Estas son: c.

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Inestabilidad genómica. (inglés, genome instability). Las células tumorales presentan un índice de mutaciones muchísimo más elevado que las células normales. La inestabilidad genómica explicaría el alto número de mutaciones que se observan en los tumores y facilitaría la evolución tumoral en un entorno de presiones selectivas. La inestabilidad genómica se ha propuesto como motor de la tumorigénesis.

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BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR d. Inflamación promotora de tumor (inglés, tumor-promoting inflammation), El sistema inmune responde ante cualquier amenaza para la homeostasis del organismo. En el caso de un tumor emergente, éste actúa para erradicar el tumor. Sin embargo, la respuesta inflamatoria resultante, llevada a cabo mayoritariamente por parte del sistema inmune innato, tiene un efecto positivo en la tumorigénesis mediante la liberación por parte de las células cancerosas de moléculas bioactivas al microambiente tumoral.

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