Bioquímica. Apuntes. (1).docx

BIOQUÍMICA

Enero 2020

CONTENIDO INTRODUCCIÓN……………………………………………………………7 UNIDAD I. FUNDAMENTOS DE LA BIOQUÍMICA Y BIOENERGÉTICA..........................................................................................9 1.1.FUNDAMENTOS..................................................................................................................9 1.1.1. ANTECEDENTES......................................................................................................10 1.1.2.

CIENCIAS AUXILARES........................................................................................11

1.1.3.

ACTUALIDADES………………………………………………………………….13

1.2. CONCEPTUALIZACIÓN EN BIOENERGÉTICA.........................................................14 1.2.1.

TERMODINÁMICA………………………………………………………………..15

1.2.2.PRIMERA LEY DE LA TERMODINÁMICA…………………………………….16 1.2.3. SEGUNDA LEY DE LA TERMODINÁMICA……………………………………16 1.3. ENERGÍA LIBRE...............................................................................................................16 1.4.CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE ESTÁNDAR...............................................................17 1.5.REACCIONES ACOPLADAS............................................................................................20 1.6. REACCIONES DE ÓXIDO-REDUCCIÓN......................................................................21 1.7.ATP Y COMPUESTOS DE ALTA ENERGÍA..................................................................23

UNIDAD II. ESTRUCTURA PROTEICA Y FUNCIÓN DE LAS ENZIMAS........................................................................................................26 2.1. GENERALIDADES............................................................................................................26 2.1.1. AMINOÁCIDOS............................................................................................................26 2.1.2. PÉPTIDOS.....................................................................................................................32 2.1.3. PROTEÍNAS..................................................................................................................34 2.2. ENZIMAS............................................................................................................................40 2.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS.....................................40 2.4. COENZIMAS Y COFACTORES......................................................................................42 2.5. FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS.........................................................................................................................44

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2.6. ENZIMAS REGULADAS Y NO REGULADAS. PROPIEDADES GENERALES.......52

UNIDAD III. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS........................ 59 3.1. GENERALIDADES DE LOS CARBOHIDRATOS.........................................................59 3.2. METABOLISMO (anabolismo y catabolismo).................................................................63 3.2.1. CATEGORÍAS DEL METABOLISMO........................................................................64 3.2.2. LAS TRES ETAPAS DEL METABOLISMO...............................................................65 3.2.3. PRINCIPALES PASOS METABÓLICOS.....................................................................66 3.3. GLUCÓLISIS......................................................................................................................68 3.3.1. VÍA GLICOLÍTICA.......................................................................................................69 3.3.2. BALANCE GLOBAL DE LA VÍA GLUCOLÍTICA....................................................71 3.3.3. REGULACIÓN DE LA GLUCÓLISIS..........................................................................72 3.3.4. ENTRADA DE OTROS AZÚCARES EN LA VÍA GLICOLÍTICA.............................73 3.4. GLUCONEOGÉNESIS......................................................................................................75 3.4.1. REACCIONES, SUSTRATOS Y REGULACIÓN........................................................76 3.5. METABOLISMO DEL GLUCÓGENO............................................................................81 3.5.1. DEGRADACIÓN, BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN...................................................82 3.6. CICLO DE CALVIN...........................................................................................................84 3.6.1 OBTENCIÓN DE GLUCOSA........................................................................................86 3.6.2. REACCIONES Y REGULACIÓN.................................................................................87 3.6.3 FOTORRESPIRACIÓN Y CICLO C4.............................................................................89 3.7 VÍA DE LAS PENTOSAS FOSFATO................................................................................91 3.7.1. BALANCE ENERGÉTICO...........................................................................................91 3.7.2. REGULACIÓN…………………………………………………………………………92

UNIDAD IV. METABOLISMO DE LÍPIDOS............................................94 4.1 GENERALIDADES DE LÍPIDOS......................................................................................94 4.2. OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS...............................................................................99 4.2.1. EXPERIMENTOS PRELIMINARES............................................................................99 4.2.2. ACTIVACIÓN Y TRANSPORTE EN MITOCONDRIA……………………….....…100 4.2.3. LA VÍA DE LA BETA-OXIDACIÓN.........................................................................101 Página |3

4.2.4. OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS………….103 4.2.5. OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS IMPARES.......................................................105 4.2.6. REGULACIÓN DE LA OXIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS..........................105 4.2.7. BETA-OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN PEROXISOMAS..........................106 4.2.8. CUERPOS CETÓNICOS.............................................................................................108 4.3 BIOSÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS.............................................................................109 4.3.1. RELACIÓN CON EL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS............................109 4.3.2. EXPERIMENTOS PRELIMINARES..........................................................................109 4.3.3. BIOSÍNTESIS DE PALMITATO A PARTIR DE ACETIL-S-CoA............................110 4.3.4 ELONGACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS......................................................................113 4.3.5. DESATURACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS................................................................113 4.3.6. REGULACIÓN............................................................................................................116 4.4. TRIACILGLICEROLES..................................................................................................117 4.4.1. DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN.....................................................................................118 4.4.2. TRANSPORTE: LIPOPROTEÍNAS............................................................................119 4.4.3. MOVILIZACIÓN DE LA GRASA ALMACENADA. LIPÓLISIS.............................121 4.4.4. BIOSÍNTESIS..............................................................................................................122 4.5 METABOLISMO DE LÍPIDOS DE MEMBRANA........................................................124 4.5.1. METABOLISMO DE FOSFOGLICÉRIDOS..............................................................125 4.5.2. METBOLISMO DE ESFINGOLÍPIDOS.....................................................................128 4.5.3. METABOLISMO DE ESTEROIDES..........................................................................129 4.5.3.1. BIOSÍNTESIS DE COLETEROL…………………………………………………..132 4.5.3.2. TRANSPORTE Y UTILIZACIÓN………………………………………………….134 4.5.3.3. ÁCIDOS BILIARES………………………………………………………………...134 4.5.3.4. HORMONAS ESTEROIDALES………………………………………………….. 135

UNIDAD V. CICLO DE KREBS.................................................................138 5.1. INTRODUCCIÓN AL CICLO DE KREBS.................................................................138 5.1.1. CONVERSIÓN DE PIRUVATO A Acetil-S-CoA. SISTEMA PIRUVATO . DESHIDROGENASA............................................................................................140 5.2. REACCIONES DEL CICLO DE KREBS.......................................................................141 5.2.1 ENZIMAS PARTICIPANTES......................................................................................143

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5.2.2. MARCAJE ISOTÓPICO DEL CICLO........................................................................144 5.2.3. BALANCE ENERGÉTICO.........................................................................................145 5.2.4 NATURALEZA ANFIBÓLICA DEL CICLO..............................................................145 5.2.5. REACCIONES ANAPLERÓTICAS............................................................................146 5.2.6. REGULACIÓN DEL CICLO DE KREBS...................................................................148 5.3 CICLO DEL GLIOXALATO...........................................................................................149 5.3.1. REACCIONES DEL CICLO DEL GLIOXALATO....................................................151 5.3.2. RELACIÓN CON LA SÍNTESIS DE GLUCOSA.......................................................151

UNIDAD VI. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Y FOTOFOSFORILACIÓN............................................................................152 6.1.

FOSFORILACIÓN OXIDATIVA..............................................................................152

6.1.1.

CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES..............................................152

6.1.2.

SISTEMA MITOCONDRIAL...............................................................................153

6.1.3.

BALANCES ENERGÉTICOS...............................................................................154

6.1.4.

AGENTES DESACOPLANTES E INHIBIDORES..............................................156

6.1.5.

MODELOS PARA EXPLICAR LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA…………157

6.1.5.1.

LA TEORÍA QUIMIOSMÓTICA………………………………………………...158

6.1.5.2.

ATP SINTASAS…………………………………………………………………..158

6.1.6. CONTROL DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA………………………….159 6.1.7.

LA OXIDACIÓN COMPLETA DE LA GLUCOSA.............................................159

6.1.8.

LA OXIDACIÓN COMPLETA DE UN ÁCIDO GRASO....................................160

6.1.9.

ESTRÉS OXIDATIVO..........................................................................................161

6.1.9.1.

ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ERO)………………………………...162

6.1.9.2.

FORMACIÓN DE ERO…………………………………………………………...163

6.1.9.3. SISTEMAS DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES…………………………………164 6.1.9.4. 6.2.

MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES……………………………………………...166

FOTOFOSFORILACIÓN...........................................................................................166 6.2.1. COROFILA Y CLOROPLASTOS...............................................................................169

6.2.1.1. LUZ………………………………………………………………………………….173

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6.2.1.2 CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES FOTOSINTÉTICA, REACCIONES LUMINSAS………………………………………………………………………174 6.2.2. REGULACIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS....................................................................177

VIII. BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 178

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INTRODUCCIÓN. Los seres vivos están constituidos por moléculas inanimadas. Cuando se examinan individualmente, estas moléculas aisladas se ajustan a todas las leyes físicas y químicas que rigen el comportamiento de la materia inerte. Sin embargo, los organismos vivos poseen, además, unos atributos extraordinarios que no exhibe la materia inanimada. Si se examinan algunas de estas propiedades especiales, podremos acercarnos al estudio de la bioquímica con una mejor comprensión de los problemas fundamentales que trata de explicar. El atributo más sobresaliente de los seres vivos es su elevada complejidad y su alto grado de organización. El objetivo de este libro de texto es aportar al estudiante de las carreras de Ingeniería Bioquímica e Ingeniería Ambiental, una guía práctica y sencilla para el curso de Bioquímica que forma parte de la retícula de estas carreras. Si bien es cierto, existe una gran cantidad de obras y fuentes de información que abordan de manera detallada los principales temas de esta asignatura, no hay un libro de texto que, de manera ordenada, puntual y continua, describa cada uno de los temas y subtemas del programa, con un lenguaje sencillo que pueda servir de guía para un mejor aprendizaje de la materia. Esta asignatura aporta al perfil profesional del Ingeniero Bioquímico e Ingeniero Ambiental, los conocimientos que permiten su desarrollo y la utilización en los procesos biotecnológicos en los que se aprovechen de manera sustentable los recursos bióticos, identificar y aplicar tecnologías emergentes relacionadas con su campo de acción, formular y evaluar proyectos con criterios de sustentabilidad, realizar investigación científica y tecnológica difundiendo sus resultados. Además, esta asignatura vincula a las biomoléculas con los procesos bioquímicos que intervienen en un organismo vivo, tanto desde el punto de vista estructural, propiedades, procesos anabólico y catabólico, que permitan desarrollar el quehacer profesional del Ingeniero Bioquímico e Ingeniero Ambiental. De manera adicional, esta asignatura tiene su campo de aplicación en el uso de enzimas en procesos biotecnológicos y en la biotransformación de contaminantes. Así como en la utilización de rutas metabólicas para el diseño de unidades biológicas con capacidad de degradar contaminantes orgánicos, complejos o de carácter xenobiótico. El contenido del presente libro de texto se presenta en seis capítulos, correspondientes a cada uno de los temas de la asignatura, introduciendo al estudio de la bioquímica su aplicación e importancia, conocimiento general de las biomoléculas como bases moleculares para la vida, y los procesos metabólicos. Se inicia el curso con los antecedentes históricos y conceptuales de la bioquímica, permitiendo comprender la importancia del estudio de los procesos bioquímicos que ocurren al interior de la célula independientemente del material biológico de que se trate. Así mismo se brindan los contenidos conceptuales

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sobre los principios químicos y termodinámicos que regulan los procesos energéticos en las células vivas, fundamentales para el metabolismo intermediario. Se analiza desde el punto de vista energético, la molécula del ATP y otras moléculas consideradas de alta energía, y se desarrollan reacciones que permiten comprender y aplicar las ecuaciones del cambio de energía libre y sistemas termodinámicos, acoplados a compuestos de alta energía. En el segundo capítulo, se inicia con las generalidades de las proteínas, sus unidades monoméricas y se profundiza en el estudio de la función biológica catalítica de algunas proteínas (enzimas), su función en las reacciones propias del metabolismo intermediario y los factores que afectan la acción enzimática. El capítulo tres comprende las generalidades de los carbohidratos y el estudio de las vías metabólicas delos mismos, tanto catabólicas como anabólicas, brindando un panorama integrador de los procesos bioquímicos con los cuales se relaciona. El capítulo cuarto contempla el estudio de las características generales de los lípidos y los procesos bioquímicos relacionados con su metabolismo catabólico y anabólico y su relación con el metabolismo de carbohidratos, como principales fuentes de almacenamiento y disposición energética. En el quinto capítulo se estudia el Ciclo de Krebs y su relación con el anabolismo y catabolismo de los diferentes combustibles orgánicos y demás componentes celulares. Además, facilita la comprensión de la respiración, que incluye los procesos de fosforilación oxidativa y cadena de transporte de electrones. En el sexto y último capítulo se describe el proceso de transporte de electrones y el aprovechamiento de la energía liberada para la síntesis de ATP por medio de la fosforilación oxidativa y la fotorrespiración. Finalmente, la intención primordial de este libro de texto es apoyar al estudiante de Bioquímica en el logro de los objetivos educacionales de la asignatura que a la letra dice: “Conocer la composición molecular de los materiales bióticos, identificar la relación existente entre las biomoléculas y su función en los sistemas biológicos, analizar los fenómenos bioquímicos y vincularlos con el estudio integral y comprensión del metabolismo para su aplicación en el aprovechamiento de recursos bióticos y en el diseño de sistemas de tratamiento de efluentes y residuos contaminantes”.

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UNIDAD I. FUNDAMENTOS DE LA BIOQUÍMICA Y BIOENERGÉTICA. 1.1.

FUNDAMENTOS.

La Bioquímica es la ciencia que tiene por objeto el ocuparse de todos los procesos químicos que se efectúan en la materia viva abarcando desde los virus, microorganismos, las plantas y los animales superiores. Conocer y entender la Bioquímica es comprender todos los procesos y transformaciones que sufren los componentes celulares que rigen las leyes de la vida. Un organismo cumple su ciclo de vida realizando las cuatro etapas que lo integran: nace, crece, se reproduce y muere. La Bioquímica se encarga del estudio de todas las transformaciones químicas que suceden durante este ciclo de vida que, en su conjunto, es llamado metabolismo celular. Entender la totalidad de las reacciones y procesos químicos que integran el metabolismo celular de un organismo sería muy difícil por la complejidad misma de algunos procesos. Sin embargo, la forma y función de las rutas centrales no son difíciles de entender puesto que la gran mayoría de ellas son muy similares en casi todas las formas de vida. El metabolismo intermediario es el centro de atención en que se fundamenta el conocimiento de la Bioquímica. Se define como todas las transformaciones químicas y enzimáticas que suceden dentro de una célula viva. Está integrado por sistemas multienzimáticos interrelacionados, altamente coordinados, regulados de manera independiente y que intercambia materia y energía entre el organismo y el medio ambiente. Dentro de las funciones del metabolismo están el de obtener energía a partir de los combustibles orgánicos, convertir nutrientes exógenos en unidades de construcción o precursores de nuevas estructuras celulares, ensamblar tales unidades de construcción para la formación de nuevas biomoléculas y formar y degradar macromoléculas requeridas en funciones especializadas de la célula. El metabolismo intermediario está dividido en dos grandes procesos: anabolismo y catabolismo. El anabolismo son sistemas multienzimáticos conducentes a incrementar la complejidad molecular, es decir, es la síntesis de nuevos compuestos orgánicos. Es uno de los tres Página |9

principales procesos que consume grandes cantidades de energía química en los organismos. Los otros dos son el transporte activo y el trabajo mecánico. Por su parte, el catabolismo son sistemas degradativos conducentes a disminuir la complejidad molecular. Es el principal proveedor de energía química del organismo. Es la degradación de macromoléculas en compuestos de bajo peso molecular algunos de los cuales sirven como precursores de otros componentes celulares y otros son eliminados como desechos orgánicos, la mayoría de ellos, de gran valor e importancia para el ser humano. Es esto último de gran interés para aquellos que se dedican al estudio de la Biotecnología puesto que, entre algunos de estos productos de desecho se pueden mencionar: alimentos, fármacos, vitaminas, alcoholes, aditivos, esencias, proteína unicelular, antibióticos, vacunas, etcétera. De aquí la importancia en conocer e identificar la composición molecular de los organismos vivos y, en general, de los materiales y recursos bióticos describiendo e identificando los procesos bioquímicos y la relación entre la estructura química y función de los sistemas biológicos, y vincular con el estudio integral y la comprensión del metabolismo intermediario para su aplicación en el aprovechamiento de recursos bióticos,

1.1.1. ANTECEDENTES. Relativamente, la Bioquímica es una ciencia joven que inició siendo una rama de la química orgánica y luego recogió conceptos de la fisicoquímica. Desde finales del siglo XVII, cuando Antonio van Leeuwenhoek los observó por vez primera, el conocimiento del comportamiento químico de los microorganismos ha ido creciendo paulatinamente. La Bioquímica, según algunos autores, nace con el descubrimiento en 1897, por parte de los hermanos Buchner, de que la fermentación de la sacarosa podía ser realizada por un extracto de levaduras sin células vivas. A partir de ese momento, los estudios se enfocaron en los sistemas metabólicos utilizados por los microorganismos, encontrándose grandes ventajas en el empleo de estos para el estudio del comportamiento químico de las células vivas. Es por esto que gran parte de los conocimientos en la Bioquímica actual derivan del material experimental proveniente del reino microbiano. Fue hasta el año 1903 que Neuberg utiliza por primera vez el concepto de Bioquímica. Dos años más tarde, Fletcher y Hopkins demuestran que durante la contracción muscular anaerobia se produce ácido láctico a partir a partir de la glucosa. En 1926, Summer purifica y cristaliza por primera vez una enzima, la ureasa, demostrando que las enzimas son proteínas especializadas en catalizar reacciones químicas. Y, para 1933, Northrop confirma el origen proteico de las enzimas al aislar y cristalizar lapepsina y la tripsina. En ese mismo P á g i n a | 10

año, Embdem y Meyerhof identifican algunos de los productos intermediarios de la ruta glucolítica y de la fermentación. Este gran descubrimiento atrajo la atención de algunos bioquímicos más importantes de la primera mitad del siglo XX ya que, con la experiencia adquirida en el estudio de la glucólisis, ofreció una nueva visión y abrió nuevos horizontes para el estudio de la enzimología y el metabolismo intermediario. Para 1937, Hans Krebs, postula el ciclo del ácido cítrico que más tarde llevaría su nombre, con lo cual quedaría resuelto el proceso de respiración, mediante el cual, las células aeróbicas obtienen su energía a partir de la oxidación los combustibles orgánicos por el oxígeno molecular. En 1948, Kennedy y Lehninger descubren que el proceso de respiración que incluye: el ciclo de Krebs, la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa, tiene lugar íntegramente en las mitocondrias. Uno de los más importantes descubrimientos del sigo XX fue, sin duda, la postulación por parte de Wilkins, Watson y Crick del modelo de la estructura de doble hélice para el ADN, en 1953, basándose en los trabajos de Chargaff respecto a la equivalencia de bases de ADN. A partir de este gran suceso se elucidan las etapas principales de las síntesis y degradaciones de aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos, glúcidos complejos, lípidos y compuestos terpenoides. En 1961, Jacob y Monod postulan la función del ARN mensajero que sirvió de base para el estudio de los mecanismos de control y regulación molecular para los procesos de represión y síntesis de proteínas. En la actualidad se conocen ya los principales sistemas metabólicos utilizados por los organismos: las rutas degradativas y sintéticas, los mecanismos de regulación enzimática, los procesos producción de energía química, el control molecular de la reproducción celular, etcétera. Sin embargo, quedan algunos problemas por resolver como son: el control genético de la síntesis de las enzimas y de la actividad enzimática en relación a su eficacia, precisión y especificidad.

1.1.2. CIENCIAS AUXILARES. La Bioquímica es una ciencia multifacética que se apoya en conocimientos obtenidos de investigaciones de otras ramas de la química y la biología. Como ya se mencionó con anterioridad, la inmensa mayoría del conocimiento en Bioquímica deriva del trabajo experimental proveniente del reino microbiano. La Biología es una ciencia auxiliar fundamental para entender y comprender los procesos químicos vitales de la célula. El conocimiento de los componentes estructurales de la célula, los diferentes organelos, su composición química y su función biológica determina, en gran medida, la base de la Bioquímica. P á g i n a | 11

La Química Orgánica es otra ciencia auxiliar elemental para entender y comprender los principios básicos de la bioquímica. El conocimiento de los grupos funcionales tales como los aldehídos, cetonas, ácidos, alcoholes, ésteres, aminas, amidas, etcétera, es determinante para comprender la estructura y función de los componentes estructurales de la célula y la relación de estos con su función biológica. Conocer la estructura, composición, clasificación y propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos, lípidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos es necesario para llegar a comprender los diferentes procesos que integran el metabolismo intermediario. La Química General es otra de las importantes ciencias auxiliares de la Bioquímica. Los conceptos de acidez y alcalinidad determinan en gran medida las propiedades fisicoquímicas de los diferentes compuestos orgánicos. El metabolismo energético está sustentado en las reacciones de óxido-reducción. La pérdida y ganancia de electrones promueve la transferencia de energía que es aprovechada para llevar a cabo los diferentes procesos anabólicos de síntesis y transporte activo. Un aspecto importante que es necesario conocer antes de iniciar el estudio de la Bioquímica, es tener clara la clasificación de los diferentes organismos según su fuente primaria de carbono, energía, electrones, así como de sus requerimientos de oxígeno.

Así tenemos que los organismos se clasifican según su fuente primaria de carbono en: -Autótrofos: que son aquellos que pueden emplear el CO 2 para la síntesis y construcción de todos sus componentes celulares. Todos los organismos fotosintéticos caen dentro de esta clase. -Heterótrofos: que son aquellos que no pueden emplear el CO2 como fuente primaria de carbonoy requieren de compuestos orgánicos previamente elaborados como los carbohidratos, lípidos y proteínas. Los animales superiores incluyendo al -Mixótrofos: son aquellos organismos que pueden emplear tanto el CO2 como compuestos orgánicos previamente sintetizados como fuente primaria de carbono. Las plantas y cierta clase de microorganismos caen dentro de esta clase. Otra clasificación de organismos es según su fuente primaria de energía. Así tenemos a: -Fotótrofos: son aquellos organismos que pueden emplear la luz solar como fuente primaria de energía. Todos los organismos fotosintéticos pertenecen a esta clasificación. -Quimiótrofos: son aquellos organismos que obtienen su energía química a partir de las reacciones de óxido-reducción de los combustibles orgánicos. Los animales superiores P á g i n a | 12

incluyendo al ser humano y los organismos no fotosintéticos pertenecen a esta clasificación. Una tercera clasificación de organismos es de acuerdo a su fuente primaria de electrones. Así tenemos a: -Litótrofos: son aquellos organismos que obtienen sus electrones a partir de compuestos inorgánicos tales como: H2O, H2S, NH3, Fe+2, étc. -Organótrofos: son aquellos que su fuente primaria de electrones son compuestos orgánicos tales como: carbohidratos, grasas y proteínas. Y, finalmente, la clasificación de organismos según sus requerimientos de oxígeno es la siguiente: -Aerobios: son aquellos organismos que emplean el oxígeno molecular como aceptor final de los electrones en el metabolismo energético. Es decir, requieren oxígeno molecular para vivir. -Anaerobiosfacultativos: son aquellos que pueden vivir en presencia o ausencia de oxígeno molecular. Por ejemplo: las levaduras que, en ausencia de O2 producen alcohol y CO2 y, en presencia de O2 producen CO2 y H2O. -Anaerobios estrictos: son aquellos organismos que no pueden vivir en presencia de oxígeno molecular porque los mata. Para estos organismos el O 2 les resulta venenoso y mortal. Los microorganismos del género Clostridium son un ejemplo de esta clase de organismos.

1.1.3. ACTUALIDADES. La Bioquímica, como parte esencial de la Biotecnología, de la Bioquímica Microbiana y de la Ingeniería Bioquímica, tiene un gran reto por delante. Es una de las áreas del conocimiento que más interés tiene y en lo que más invierten su presupuesto los países desarrollados. Es aplicable en los tres problemas de mayor relevancia que actualmente aquejan a la humanidad: producción de alimentos para combatir el hambre; producción de fármacos y vacunas para combatir las enfermedades y, el combate a la contaminación ambiental y control del calentamiento global. Aunque la biotecnología no es del conocimiento generalizado para la mayoría de las personas en el mundo, no es ajena a la cotidianidad en sus vidas. Es utilizada en la agricultura para la producción de alimentos, para la producción de nuevos fármacos y vacunas, e inclusive en la edición genética.

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La siembra modificada genéticamente es necesaria para la mayoría de los investigadores ya que así se puede contar con una mayor producción alimentaria, con mejores propiedades, con una resistencia a plagas y al calentamiento global. En el mundo está muy claro cuál es el alcance de esta tecnología ya que ha sido demostrada su inocuidad en aquellas plantas modificadas genéticamente que han sido aprobadas para siembra y consumo. Hay que entender que no va a ver tecnología alguna que permita aumentar la producción de alimentos para contender con el crecimiento poblacional como a modificación genética. Es muy importante informar a la gente que los alimentos transgénicos debidamente estudiados y aprobados para su producción y comercialización no son dañinos para el ser humano. Por el contrario, son una importante solución al problema del hambre y la falta de alimentos a nivel mundial. Es tan rápido el ritmo de la investigación en estas áreas, que muchos conocimientos quedan obsoletos en poco tiempo y muchos de ellos pierden rápidamente su vigencia.

1.2 CONCEPTUALIZACIÓN EN BIOENERGÉTICA. La bioenergética trata del procesamiento y consumo de energía química dentro de los sistemas biológicos. La energía es la capacidad de realizar un trabajo. Existen diferentes tipos de energía: solar, química, térmica, eléctrica, etc. Para el estudio de la Bioquímica, nos centraremos en la energía química que mueve a los organismos vivos. Es esa clase de energía que se produce en el metabolismo energético mediante la oxidación de los combustibles orgánicos. Se trata de la energía almacenada en los enlaces de cierto tipo de compuestos que, por su naturaleza química, al romperse dichos enlaces, la energía química es liberada y aprovechada para los procesos vitales de la célula. En la lógica molecular de la vida se puede considerar a las células como máquinas químicas capaces de trabajar en condiciones de presión, temperatura y volumen constantes. De igual manera que las máquinas construidas por el hombre, todos los organismos vivos deben obtener su energía del medio ambiente. Los organismos fotosintéticos obtienen su energía de la luz solar, mientras que los organismos heterótrofos utilizan la energía inherente a la estructura de las moléculas orgánicas obtenidas del medio. Estas formas de energía son transformadas por las células en energía química del ATP (trifosfato de adenosina), el cual actúa como transportador energético en aquellos procesos metabólicos que requieren de energía. De ahí que al ATP se le conozca como la moneda energética del metabolismo. A continuación se desarrollarán los principios químicos y termodinámicos que regulan la función del sistema del ATP en la energética de las células vivas, principios que son fundamentales en el metabolismo energético. P á g i n a | 14

1.2.1. TERMODINÁMICA. La Termodinámica tiene varias definiciones, entre otras, la que la describe como la rama de la física que se encarga del estudio de la interacción entre el calor y otras manifestaciones de energía. En otras palabras, es la parte de la física que estudia las transferencias de calor, la conversión de la energía y la capacidad de los sistemas para producir trabajo. Las leyes de la termodinámica explican los comportamientos globales de los sistemas macroscópicos en situaciones de equilibrio. Es muy importante que se esté familiarizado con los componentes de un sistema termodinámico antes de introducirse al estudio de las leyes de la termodinámica que rigen el universo.

El Entorno: la entropía del entorno puede aumentar, permanecer constante o disminuir.

El Sistema (P, V y T constantes): la entropía del sistema aislado puede aumentar, permanecer constante o disminuir, pero su energía libre disminuye siempre hasta un mínimo.

Universo= sistema + entorno. La entropía del universo aumenta siempre y tiende a alcanzar un valor máximo.

Figura 1.1. Resumen de las relaciones de la energía libre y de la entropía entre un sistema y su entorno cuando la presión, temperatura y volumen del sistema son constantes. (1) El sistema es el objeto bajo estudio y está delimitado por límites o fronteras. Estas pueden ser reales o virtuales. El entorno o el medio es todo lo que rodea al sistema fuera de sus fronteras o límites. El universo es el sistema + el entorno.

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1.2.2. PRIMERA LEY DE LA TERMODINÁMICA. Es el principio de la conservación de la energía: en cualquier proceso, la energía total del sistema y la del entorno permanece constante. Es decir, que aunque la energía no se crea ni se destruye durante un proceso determinado, esta puede transformarse de una forma a otra. Por ejemplo: la energía eléctrica puede transformarse en energía térmica, mecánica o radiante.

E. SOLARE. QUÍMICAE. MECÁNICAE. TÉRMICA ENTROPÍA RADIACIÓN FOTOSÍNTESIS TRABAJO FÍSICO CALOR INCREMENTO DE ENTROPÍA.

1.2.3. SEGUNDA LEY DE LA TERMODINÁMICA. La segunda ley de la termodinámica establece que en todos los procesos, la entropía (S) del sistema más la del entorno, es decir, la entropía del universo experimenta siempre un incremento hasta alcanzar el equilibrio, bajo las condiciones de presión, temperatura y volumen prevalecientes en cuyo punto, es la máxima posible. La entropía puede considerarse como un grado de desorden o libertad. En otras palabras, la segunda ley establece que la fuerza inductora fundamental de todos los procesos físicos y químicos es la tendencia del universo a incrementar la entropía hasta alcanzar un valor máximo posible. Sin embargo, los cambios de entropía son de poca utilidad en cuanto a predecir la dirección y posición en equilibrio de las reacciones químicas. Es decir, la entropía no siempre puede medirse ni calcularse directamente en los procesos químicos, además de que se debe tener información no solamente de los cambios del sistema, sino también de los del entorno.

1.3 ENERGÍA LIBRE. Un concepto más útil que el del cambio de entropía es el que se ha derivado para la predicción de la dirección y posición del equilibrio de las reacciones químicas: la energía libre, que se define como la porción de la energía total de un sistema que es capaz de hacer un trabajo mientras el sistema se desplaza hacia el equilibrio, bajo las condiciones de presión, temperatura y volumen constantes. La siguiente ecuación relaciona los cambios de energía libre de un sistema reaccionante y la entropía bajo las condiciones de presión y temperatura constantes tal y como existen en las células vivas,

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∆G = ∆H - T∆S En la que ∆G es la variación de energía libre del sistema, ∆H es el cambio de entalpía, T es la temperatura absoluta y ∆S es la variación de entropía. Los cambios de energía libre y de entalpía se expresan en unidades de energía, calorías por ejemplo, el cambio de entropía en cal grados-1, y la temperatura en grados kelvin. En la figura 1.1 se resumen estas relaciones.

1.4. CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE ESTÁNDAR. El cambio de energía libre en un proceso bioquímico es el mismo, independientemente de la ruta o mecanismo empleado para llegar al estado final. Mientras que la velocidad de una reacción dada depende de la energía libre de activación. Es decir, el cambio de energía libre no está relacionado con dicha velocidad, sino con la constante de equilibrio de tal reacción bajo las condiciones de P, T y V constantes. Consideremos ahora la relación fundamental entre la variación de la energía libre de una reacción química y su constante de equilibrio .relación que es básica para todos los aspectos de la bioenergética. Para la reacción general: aA +bB ====== cC + dD

(1)

en la que a, b, c y d son el número de moléculas de A, B, C y D que participan en la reacción, el cambio de energía libre de la reacción a P y T constantes está dada por la ecuación: ∆G = ∆Go + RTln [C]c[D]d/[A]a[B]b

(2)

En la que los corchetes indican concentraciones molares, R es la constante universal de los gases expresado en cal/moloK T es la temperatura absoluta expresada en grados kelvin, ∆Go es el cambio de energía libre estándar de la reacción el cual es una constante para cualquier reacción química concreta donde los reactivos y los productos están en una concentración 1.0 M Como se puede observar, el cambio de energía libre de una reacción es la suma de dos términos. El primer término, ∆Go, o sea el cambio de energía libre estándar es una constante fija cuyo valor es característico para una reacción química dada. Constituye una medida del descenso de energía libre de dicha reacción cuando se permite que tenga lugar en condiciones estándar definidas arbitrariamente. El segundo término es una variación que refleja las

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concentraciones de los reactantes y productos de dicha reacción. Por tanto, podemos calcular el ∆G para cualquier reacción química a una temperatura determinada si conocemos el ∆Go característico y la concentración de los reactantes y de los productos. Si se permite que la reacción tenga lugar hasta alcanzar el equilibrio, el valor de ∆G será de cero en este punto y el sistema ya no será capaz de efectuar trabajo alguno. Se dice que la energía libre del sistema en este punto se halla en el valor mínimo posible para las condiciones dadas. En el punto de equilibrio la ecuación (2) se transforma en: 0 = ∆Go + RTln [C]c[D]d/[A]a[B]b

(3)

que reordenada se convierte en: ∆Go = - RTln [C]c[D]d/[A]a[B]b (4) Cómo la constante de equilibrio viene dada por: K’eq = [C]c[D]d/[A]a[B]b (5) Al sustituir la constante de equilibrio Kèq en la ecuación (4), tenemos la ecuación general: ∆Go = -RTlnK’eq (6)

Pero cómo casi todos los procesos biológicos se llevan a cabo a presión y temperatura constante, la energía libre se puede expresar cómo la porción de la energía total del sistema que se puede transformar en trabajo útil bajo estas condiciones. Además, cualquier proceso espontáneo se realiza en dirección hacia la disminución de la energía libre, o sea, ∆Ges negativo. Por tanto, si la reacción se lleva a cabo liberará energía al medio. Todas las reacciones biológicas se realizan a pH = 7. Cuando la constante R se expresa en calorías como unidades de energía: (R = 1.987 cal/moloK), el ∆Go se expresa en cal por mol. Existen dos maneras de expresar con mayor precisión el cambio de energía libre estándar de una reacción química: -La primera define que el cambio de energía estándar de una reacción química determinada es la diferencia entre la suma de las energías libres de los productos y la suma de las energías libres de los reactantes, todos ellos deben estar en su estado estándar. Es decir, en concentración 1.0 molar, a una temperatura de 25oC y una presión de 1.0 atmósfera. ∆Go = ∑ Goprod - ∑Goreact P á g i n a | 18

-La segunda forma de definir en cambio de energía libre estándar de una reacción establece que es la cantidad de energía libre absorbida o perdida por mol de reactantes cuando se transforman en productos en condiciones de presión y temperatura estándar. Tabla 1.1. Relación entre la constante de equilibrio y el cambio de energía libre estándar a 25oC.(1) K’eq ∆Go cal/mol 0.001 0.01 0.1 1.0 10 100 1000

+ 4.092 + 2.728 +1.364 0 - 1.364 - 2.728 - 4.092

Reacciones exergónicas y endergónicas. Si la constante de equilibrio de una reacción es 1.0 entonces ∆Go = 0.0 y no se produce cambio de energía libre cuando un mol de reactantes se convierte totalmente en productos. Si la constante de equilibrio es mayor que 1.0, el ∆Go es negativo y la reacción se denomina exergónica. Las reacciones exergónicas se realizan de manera espontánea en la dirección en que están escritas y son aquellas que liberan energía al medio. Pero si la constante de equilibrio es mayor que 1.0, entonces∆Goes positivo y la reacción se denomina endergónica. Las reacciones endergónicas no se realizan de manera espontánea como están escritas puesto que requieren de energía para llevarse a cabo. Por el contrario, tienden a verificarse en dirección opuesta. Los cambios de energía estándar a pH = 7.0 se representan por ∆Go’, por tanto, está será la forma de expresarlo para los sistemas biológicos.

Un ejemplo de cálculo de ∆Go’ Para la siguiente reacción la cual se realiza de manera intensa en un tejido muscular activo: [Glucosa-1-fosfato]======[Glucosa-6-fosfato] Si partimos de una concentración 0.020 M de glucosa-1-fosfato, añadimos la enzima fosfoglucomutasa y dejamos que la reacción llegue al equilibrio, las concentraciones finales

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serán 0.001 M de glucosa-1-fosfato y 0.019 M de glucosa.6-fosfato, a 25 oC y pH = 7.0. Entonces se puede calcular la constante de equilibrio: K’eq = [productos]/[reactantes] = [glucosa-6-fosfato]/[glucosa-1-fosfato] K’eq = 0.019/0.001 = 19 A partir de este valor de la constante de equilibrio podemos calcular el cambio de energía libre estándar de la reacción empleando la ecuación 6. ∆Go’ = - RT ln K’eq ∆Go’= - (1.987 cal/moloK)(298oK) ln 19 ∆Go’ = - 1745 cal/mol Como el signo del cambio de energía libre estándar de la reacción es negativo, se trata de una reacción exergónica, la cual se realiza en el sentido de la dirección en que está escrita y, por tanto, libera energía al medio. Debido a que la magnitud de las variaciones de energía libre estándar de las reacciones bioquímicas son muy altas, resulta más conveniente expresarlas en kilocalorías. Por tanto, si una kilocaloría = 1000 calorías, para la reacción anterior el resultado será de – 1.745 Kcal/mol.

1.5.

REACCIONES ACOPLADAS.

Los cambios de energía libre estándar de las reacciones químicas son aditivas en cualquier secuencia de reacciones consecutivas. Cuando existe una serie de reacciones consecutivas con intermediarios comunes se denominan reacciones acopladas o ligadas. Por ejemplo: ∆Go’

Reacción A ===== B B ===== C

∆Go’1

∆Go’2

C =====D

∆Go’3

La suma de estas reacciones es A ====== D, cuyo cambio de energía libre estándar total, es la suma algebraica de las variaciones de los ∆Go’ de las reacciones individuales, cada una con su signo correspondiente: ∆Go’t = ∆Go’1 + ∆Go’ 2 + ∆Go’3

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Esta propiedad es de mucha utilidad para el cálculo del cambio de energía libre estándar de una reacción cuando su constante de equilibrio no puede determinarse directamente. En esta condición, la reacción puede acoplarse a una o varias reacciones diferentes de constantes de equilibrio conocidas y constituir una secuencia cuyo valor global puede medirse más fácilmente. Del ejemplo anterior, conociendo ∆Go’1, ∆Go’2 y ∆Go’t, podemos conocer ∆Go’3. Cálculo del cambio de energía libre estándar de una secuencia de reacciones acopladas. A continuación se da un ejemplo para calcular la ecuación global de una secuencia de reacciones tal y como se da en el metabolismo intermediario, así coo del cambio de energía estándar final. ∆Go’(Kcal/mol)

Reacción A + B ===== C + D

- 3.4

D

+ 0.4

======

E

E + B ===== C + F

- 1.5

La reacción global se obtiene sumando todos los reactantes y todos los productos de las reacciones individuales eliminando los elementos comunes en ambos lados de las reacciones: A + 2B ======2C + F

∆Go’t = - 4.5 Kcal/mol.

1.6. REACCIONES DE ÓXIDO-REDUCCIÓN. Las reacciones de óxido-reducción, también llamadas reacciones redox, son aquellas en las que se realizan transferencia de electrones desde un donador electrónico (agente reductor) a un aceptor electrónico (agente oxidante). En algunas reacciones de óxido-reducción, como lo veremos en los procesos del metabolismo intermediario más adelante, la transferencia de uno o más electrones se realiza mediante la transferencia de hidrógeno; por lo que, la deshidrogenación es equivalente a la oxidación. Los agentes oxidantes y reductores actúan como pares redox conjugados integrados por un donador de electrones y un aceptor conjugado. HX + B ======== X- + HB Donde HX es el agente reductante y B es el agente oxidante.

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La tendencia de un agente reductor a perder electrones o de un agente oxidante a ganar electrones viene dada por su potencial de oxidorreducción estándar, que se define como la fuerza electromotriz expresada en voltios de un semi-elemento en el que el reductor y el oxidante se hallan presentes en concentración 1.0 M a 25oC y un pH = 7.0, en equilibrio con un electrodo que puede aceptar reversiblemente electrones de las especies reductoras. Es importante mencionar que en cada transferencia de electrones existe liberación de energía química, misma que puede calculada o verificada por diferentes métodos y que es recuperada y transportada por compuestos de alta energía de hidrólisis cómo los nucleósidos trifosfatados en el metabolismo energético. En el metabolismo intermediario existen transportadores de electrones específicos que participan en las reacciones de oxidorreducción conduciendo los electrones desde los agentes reductores (combustibles orgánicos) hasta los agentes oxidantes incluyendo al oxígeno molecular durante la cadena respiratoria. Los transportadores de electrones más importantes que participan en el metabolismo intermediario son: el NAD+, NADP+, FAD, FMN, Coenzima Q y los citocromos. A continuación se mencionarán algunas reacciones de oxidorreducción presentes en los diferentes procesos bioquímicos del metabolismo intermediario: GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO + Pi + ADP + NAD+ ======== 3-FOSFOGLICERATO + ATP + NADH + H+ En esta reacción, el agente reductante es el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y el agente oxidante es el NAD+. La cantidad de energía liberada es tal que una fracción de ella es aprovechada para formar un enlace de alta energía del ATP para ser utilizada en algún proceso o reacción de síntesis que la requiera. Otras reacciones de óxido-reducción: MALATO + NAD+ ======== OXALOACETATO + NADH + H+ SUCCINATO + FAD ======= FUMARATO + FADH2 ISOCITRATO + NAD+====== α-CETOGLUTARATO + CO2 + NADH + H+ FADH2 + Coenzima Q ==== FAD + Coenzima Q + 2e- + 2H+ NADH + H+ + FAD ====== NAD+ + FADH2 En estas últimas cinco reacciones los electrones procedentes de los agentes reductantes o combustibles orgánicos (carbohidratos, grasas, proteínas), son transportados por las coenzimas NAD+, FAD y Coenzima Q hasta la etapa final de transferencia de electrones

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que es la cadena respiratoria hasta el O2, lugar donde se acopla la fosforilación oxidativa que es el principal mecanismo de recuperación de energía química en forma de enlaces de alta energía del ATP. 1.7.

ATP Y COMPUESTOS DE ALTA ENERGÍA.

A continuación, trataremos las relaciones energéticas entre diversos compuestos fosforilados que participan en la transferencia de energía química en la célula. Las moléculas que participan en el intercambio energético que realizan las células durante las fases metabólicas de catabolismo y anabolismo, son moléculas fosforiladas que tienen grupos fosfatos con carga negativa, muy cercanos a los oxígenos que se repelen por sus cargas negativas dando origen a un enlace rico en energía de hidrólisis. En la tabla 1.2, se muestra el cambio de energía libre estándar de hidrólisis de algunos de los principales compuestos fosfatados que participan en el metabolismo intermediario, entre ellos el ATP, el cual, como se puede apreciar, posee un ∆Go’de – 7.3 Kcal/mol, que lo ubica en la parte media de la tabla en cuestión.

Tabla 1.2. Energía libre estándar de hidrólisis de algunos compuestos fosforilados de interés energético.(1)

Compuesto

∆Go’(Kcal/mol)

∆Go’(Kjouls/mol)

Fosfoenolpiruvato - 14.8 - 61.9 3-fosfogliceril-fosfato - 11.8 - 49.3 Fosfocreatina - 10.3 - 43.1 Fosfato de acetilo - 10.1 - 42.3 Fosfoarginina - 7.7 - 32.2 ATP - 7.3 - 30.5 Glucosa-1-fosfato - 5.0 - 20.9 Fructosa 6-fosfato - 3.8 - 15.9 Glucosa-6-fosfato - 3.3 - 13.8 Glicerilo-1-fosfato - 2.2 - 9.2 __________________________________________________________________

Energía libre estándar de hidrólisis del ATP.

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En la figura 2 se describe la estructura química del adenosín trifosfato (ATP), considerada la moneda energética del metabolismo. El hecho de que se encuentre a la mitad de la tabla de las moléculas con una energía libre de hidrólisis negativa le permite actuar como acarreador de los grupos fosfatos desde los compuestos de una elevada energía libre de hidrólisis hasta los de menor rango,

Figura1.2. Estructura del ATP en su estado no disociado.(2) El ATP pertenece a la clasificación de compuestos orgánicos llamados nucleótidos. Los nucleótidos están formados por tres grupos de moléculas, a saber: una base nitrogenada la cual puede ser adenina, guanina, citosina, timina o uracilo; un azúcar que puede ser la ribosa o desoxirribosa y, puede contener 1, 2 ó 3 grupos fosfato. Dependiendo del azúcar se clasifican en: ribonucleótidos, aquellos que tienen a la ribosa como componente estructural y, desoxirribonucleótidos que son aquellos que tienen a la desoxirribosa en su estructura. Para fines de transferencia de energía química en el metabolismo, solo participan los ribonucleótidos. Además del ATP, los otros ribonucleótidos que pueden participar como moneda energética del metabolismo son el guanisín trifosfato (GTP), citidín trifosfato (CTP) y el uridin trifosfato UTP. Cuando un compuesto de alta energía libre estándar de hidrólisis sufre la pérdida de su grupo fosfato libera tal cantidad de energía que una parte de ella puede ser aprovechada para la síntesis de un enlace fosfato en el ATP. Por otra parte, cuando un compuesto de bajo nivel energético va a ser sintetizado, puede acoplarse a la hidrólisis del ATP y, de esta manera, una parte de la energía de hidrólisis del ATP puede ser aprovechada para la síntesis del compuesto en cuestión.

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A continuación se explicará en detalle cómo participa el ATP en la recuperación y transferencia de energía en los diferentes procesos bioquímicos mediante las reacciones acopladas. Cuando el fosfoenolpiruvato se hidroliza: FOSFOENOLPIRUVATO + H2O ------ PIRUVATO + Pi

∆Go’ = - 14.8 Kcal/mol

La síntesis del ATP a partir del ADP y Pi requiere: ADP + Pi ==== ATP + H2O

∆Go’= + 7.3 Kcal/mol

Debido a que la síntesis del ATP es una reacción fuertemente endergónica, es decir, requiere una gran cantidad de energía para que se lleve a cabo, esta puede acoplarse a la hidrólisis del fosfoenolpiruvato y, de esta manera, obtener ATP: FOSFOENOLPIRUVATO + ADP ---- PIRUVATO + ATP ∆Go’= - + 7.5 Kcal/mol La reacción global es altamente exergónica lo cual nos indica que se realiza de manera espontánea en el sentido de la dirección en que está escrita. Desde luego que se requiere de la participación de las enzimas correspondientes para que las reacciones se realicen de manera rápida y eficiente. Por otra parte, la síntesis de la glucosa-6-fosfato a partir de la glucosa y el fosfato inorgánico (Pi), requiere: GLUCOSA + Pi ------- GLUCOSA-6-FOSFATO + H2O

∆Go’= + 3.3 Kcal/mol

Al ser una reacción fuertemente endergónica no puede realizarse de manera espontánea en la dirección de la síntesis de la glucosa-6-fosfato al menos que obtenga energía del medio o que algún compuesto rico en energía de hidrólisis se la proporcione. En estos casos tiene participación el ATP como proveedor de la energía: ATP + H2O ===== ADP + Pi∆Go’= - 7.3 Kcal/mol Al acoplar ambas reacciones tenemos: GLUCOSA + ATP ----- GLUCOSA-6-FOSFATO + ADP ∆Go’= - 4.0 Kcal/mol La reacción global, al ser exergónica, se realiza de manera espontánea en la dirección de la síntesis de la glucosa-6-fosfato. La cual sería imposible obtener en las condiciones arriba descritas.En los ejemplos antes mencionados se puede entender el papel que juega el ATP y los otros nucleósidos trifosfatados, GTP, CTP y UTP, en la recuperación y transferencia de energía química, como monedas energéticas del metabolismo.

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UNIDAD II. ESTRUCTURA PROTEICA Y FUNCIÓN DE LAS ENZIMAS. 2.1. GENERALIDADES. Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos que están unidos por un tipo de enlaces conocidos como enlaces peptídicos. El orden y la disposición de los aminoácidos dependen del código genético de cada persona. Todas las proteínas están compuestas por:Carbono, Hidrógeno, Oxígeno y Nitrógeno. Y la mayoría contiene además azufre y fósforo. Las proteínas suponen aproximadamente la mitad del peso de los tejidos del organismo, y están presentes en todas las células del cuerpo, además de participar en prácticamente todos los procesos biológicos que se producen. Se encuentran en todas las pates de la célula ya que son fundamentales en todos los aspectos de la estructura y función celulares. Además, la información genética es expresada en su mayor parte por las proteínas. 2.1.1. AMINOÁCIDOS. Es muy importante considerar en detalle las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos, ya que son los sillares de la estructura proteica, y determinan la mayoría de las propiedades importantes de las proteínas. En la figura 2.1 se muestra la fórmula estructural de los 20 α-aminoácidos encontrados regularmente en las proteínas, clasificados de acuerdo a su grupo radical R. Todos, excepto la prolina, tienen como denominador común un grupo carboxilo libre y un grupo amino libre primario. La prolina, al tener su grupo α-amino sustituido se denomina α-iminoácido. Se han propuesto varios métodos para clasificar a los aminoácidos con base en sus grupos R. El más usado es aquel que se basa en la polaridad de los grupos R y es, precisamente, el que se ilustra en la figura 2.2. Es importante mencionar que esta clasificación se da únicamente en un rango de pH intracelular que es de 6.0-7.0.

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Figura 2.1. Estructura de los veinte aminoácidos que conforman las proteínas.(5) Existen cuatro grupos principales: a) Grupos R no polares o hidrófobos: alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. b) Grupos R polares sin carga: serina treonina, tirosina, asparagina, glutamina, cisteína y glicina. c) Grupos R polares con carga positiva: histidina, arginina y lisina. d) Grupos R polares con carga negativa: ácido aspártico y ácido glutámico.

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Existen aminoácidos que son poco frecuentes en las proteínas, todos ellos derivados de algún aminoácido corriente. Por ejemplo: La 4-hidroxiprolina derivada de la prolina y la hidroxilisina, derivada de la lisina están presentes en la proteína fibrosa colágeno. La desmosina y la isodesmosina se encuentran en la elastina, por mencionar algunos. Existen otros aminoácidos que no están presentes en las proteínas pero que tienen importancia bioquímica como la ornitina y la citrulina. En la figura 2.3 se ilustran las estructuras de algunos de estos aminoácidos. Es importante mencionar que de los 20 aminoácidos frecuentes en las proteínas, 19 de ellos presentan en su estructura al menos un carbono quiral o asimétrico. Es decir, un átomo de carbono que presenta sus cuatro sustituyentes diferentes. Por lo que pueden existir en dos formas estereoisómeras: D- o L-. Los únicos aminoácidos que pueden formar proteínas son los de la serie L-. Aunque existen aminoácidos de la serie D-, estos no pueden ser empleados para la síntesis de proteínas. En la figura 2.2 se ilustran el par de estereoisómeros de la alanina.

Figura 2.2. Estructura general de los aminoácidos y los estereoisómeros D- y L- de la alanina.(5)

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Figura 2.3. Estructura general de algunos aminoácidos poco frecuente en las proteínas.(1)

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Propiedades ácido-base de los aminoácidos. El conocimiento de las propiedades ácido-básicas de los aminoácidos es muy importante para el análisis y la comprensión de las propiedades de las proteínas. Los aminoácidos tienen la siguiente fórmula general:

R – CH – COOH l NH2 Como se puede apreciar, tienen en su estructura por lo menos un grupo carboxilo y un grupo α-amino libres, los dos potencialmente ionizables. Dependiendo del pH de la solución en que se encuentren será su comportamiento ácido-base. En la figura 2.4 se ilustra el comportamiento ácido-base de los grupos disociables de los aminoácidos.

Figura 2.4. Comportamiento ácido-base de los grupos disociables carboxilo y amino de los aminoácidos.(7) Es muy importante conocer los valores de la constante de disociación pK’ para cada uno de los grupos disociables de los aminoácidos. El pK’ se define como el valor de pH en el cual el ácido se ha disociado en un 50%.

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En la tabla 2.1. se indican los valores de pK’ de los 20 aminoácidos que forman las proteínas, asícomo de su punto isoeléctrico, pI, que nos indica el pH en el cual la molécula es eléctricamente neutra o con carga neta = 0.

Tabla 2.1. Valores de pK’ y pI de los 20 aminoácidos que forman las proteínas.(7) Aminoácido

pK’1 pK’2

pK’R

pI

R-COOHR-NH3+ Glicina 2.34 9.60 5.97 Alanina 2.34 9.69 6.01 Valina 2.32 9.62 5.97 Leucina 2.36 9.60 5.98 Isoleucina 2.36 9.68 6.02 Metionina 2.28 9.21 5.74 Fenilalanina 1.83 9.13 5.48 Tirosina 2.20 9.11 10.07 5.66 Triptófano 2.38 9.39 5.89 Serina 2.21 9.15 5.68 Prolina 1.99 10.96 6.48 Treonina 2.11 9.62 5.87 Cisteína 1.96 10.28 8.18 5.07 Asparagina 2.02 8.80 5.41 Glutamina 2.17 9.13 5.65 Lisina 2.18 8.95 10.53 9.74 Histidina 1.82 9.17 6.00 7.59 Arginina 2.17 9.04 12.48 10.76 Aspartato 1.88 9.60 3.65 2.77 Glutamato 2.19 9.67 4.25 3.22 ________________________________________________________________________________

Como podemos apreciar en la tabla 2.2, a un pH intracelular de 7.0, todos los aminoácidos ya se encuentran disociados en su grupo carboxilo ya sea el del grupo α o el del radical para los aminoácidos ácidos, mientras que los grupos amino, tanto los α como los del radical para los aminoácidos básicos, aún no están disociados. Es por eso que en su fórmulageneral, todos aparecen con cargas positivas y negativas, o en su forma zwitteriónica. Otra manera de clasificar a los aminoácidos es en esenciales y no esenciales. Son aminoácidos esenciales aquellos que el organismo humano no puede sintetizar y los tiene que consumir en los alimentos. Mientras que los aminoácidos no esenciales son aquellos

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que el ser humano puede sintetizar y no es necesario que los alimentos los contengan. (ver Tabla 2.2) Tabla 2.2. Clasificación de los aminoácidos en esenciales y no esenciales.(4) Aminoácidos esenciales Valina Leucina Isoleucina Treonina Triptófano Histidina Lisina Arginina Metionina Fenilalanina

Aminoácidos no esenciales Alanina Glicina Serina Cisteína Tirosina Glutamato Aspartato Glutamina Asparagina Prolina

La presencia de todos los aminoácidos en una proteína en los alimentos es lo que determina que sea de buena calidad. La ausencia de uno o más aminoácidos esenciales en los alimentos la hace ser una proteína de mala calidad. Por lo general, las proteínas contenidas en alimentos de origen animal son proteínas que contienen los 20 aminoácidos por lo que las hace proteínas de buena calidad. Las proteínas vegetales, por lo general, carecen de uno o más aminoácidos esenciales pero, la combinación de ellas nos garantizan el consumo de los 20 aminoácidos por lo que, no es necesario el consumo de alimentos de origen animal para cubrir las necesidades de aminoácidos esenciales.

2.1.2. PÉPTIDOS. Cuando dos aminoácidos se aproximan uno al otro sus grupos amino de uno y el carboxilo del otro reaccionan entre si formando un enlace covalente llamado enlace peptídico. En la reacción de síntesis se desprende una molécula de agua. El compuesto resultante se denomina péptido. Un péptido consiste en la unión de dos o más aminoácidos mediante un enlace peptídico. Los péptidos con más de 10 residuos de aminoácidos se llaman polipéptidos. En la figura 2.5 se representa la formación de un péptido. El resultado de esta reacción es un dipéptido ya que está formado por dos aminoácidos.

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Figura 2.5. Reacción para la formación de un péptido (1) Como se puede apreciar, el grupo carboxilo del primer aminoácido reacciona con el grupo amino de segundo aminoácido formándose un enlace covalente con desprendimiento de una molécula de agua. El resultado es un dipéptido. La adición de un tercer aminoácido siguiendo el mismo procedimiento, daría la formación de un tripéptido y, así sucesivamente. Los péptidos se nombran según el número de aminoácidos que lo integran: 1 2 3 4 5

aminoácidos: dipéptido aminoácidos:tripéptido aminoácidos: tetrpéptido aminoácidos: pentapéptido (Figura 2.6) etcétera.

Cuando la cadena de aminoácidos tiene más de 10 aminoácidos se denomina polipéptido. Los péptidos como tal no son considerados proteínas, pero pueden desempeñar funciones biológicas. Alguno de los poipéptidos e importancia bioquímica son los siguientes: -Dipéptidos: aspartame, edulcorante artificial. -Tripéptidos: glutatión, antioxidante de células animales. Melanostatina, con actividad hormonal. -Nonapéptidos: oxitocina, vasopresina, hormona antidiurética, con actividad hormonal. -Polipéptidos: polipéptido pancreático (36 aa), agente regulador. Glucagón (29 aa), hormona peptídica. Secretina (27 aa), hormona gastrointestinal.

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Figura 2.6. Estructura de un pentapéptido.(1)

Los polipéptidos que contienen de 2 a 10 aminoácidos por lo regular son llamados oligopéptidos. De 10 a 50 aminoácidos son llamados polipéptidos. Y aquellos que tienen más de 50 aminoácidos son llamados proteínas. La insulina, que está formada por 51 aminoácidos, se considera la proteína más pequeña. Para efectos de la nomenclatura, en los péptidos, independientemente de su tamaño, el aminoácido que se encuentren el extremo con su grupo α-amino libre se considera el primer aminoácido de la cadena. Es decir, el aminoácido amino terminal o número 1. Mientras que el aminoácido que se encuentre en el extremo con su grupo α-carboxilo terminal, será el último aminoácido de la cadena. Es decir, el aminoácido carboxilo terminal o aminoácido n, dependiendo de cuantos aminoácidos conformen la cadena peptídica.

2.1.3. PROTEÍNAS. Las proteínas son los componentes más versátiles de la célula. Se caracterizan por tener un alto peso molecular y todas están formadas por solo veinte tipos de aminoácidos. Muchas proteínas contienen los veinte aminoácidos y por ello solo difieren entre sí por el número y secuencia de los aminoácidos que las forman y en cuanto a su configuración tridimensional. De entre todas las biomoléculas, las proteínas desempeñan un papel fundamental en el organismo. Son esenciales para el crecimiento, gracias a su contenido de nitrógeno, que no está presente en otras moléculas como grasas o hidratos de carbono. También lo son para las síntesis y mantenimiento de diversos tejidos o componentes del cuerpo, como los jugos gástricos, la hemoglobina, las vitaminas, las hormonas y las enzimas (estas últimas actúan como catalizadores biológicos haciendo que aumente la velocidad a la que se producen las

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reacciones químicas del metabolismo). Asimismo, ayudan a transportar determinados gases a través de la sangre, como el oxígeno y el dióxido de carbono, y funcionan a modo de amortiguadores para mantener el equilibrio ácido-base y la presión osmótica del plasma. Otras funciones más específicas son, por ejemplo, las de los anticuerpos, un tipo de proteínas que actúan como defensa natural frente a posibles infecciones o agentes externos; el colágeno, cuya función de resistencia lo haceimprescindible en los tejidos de sostén o la miosina y la actina, dos proteínas musculares que hacen posible el movimiento, entre muchas otras. Las proteínas pueden clasificarse de muchas maneras, dependiendo de su función biológica, de su composición, de su conformación tridimensional y de su solubilidad entre otras.

Clasificación por su composición. Las proteínas se dividen en dos grupos principales basándose en su composición: -proteínas simples y -proteínas conjugadas. Las proteínas simples son aquellas que están formadas exclusivamente por aminoácidos y no requieren de otro tipo de compuesto orgánico o inorgánico de origen no proteico para desempeñar su función biológica. En otras palabras, son aquellas que solamente producen aminoácidos por hidrólisis total. Por lo general están formadas por 50% de carbono, 7% de hidrógeno, 23% de oxígeno, 16% de nitrógeno y de 0 a 3% de azufre. Las proteínas conjugadas son aquellas que, además de aminoácidos, requieren de otro tipo de compuesto orgánico o inorgánico para desempeñar eficientemente su función biológica. Es decir, son aquellas que por hidrólisis total producen no solamente aminoácidos, sino también otros componentes de origen no proteico. La porción no proteica de una proteína conjugada se denomina grupo prostético. A su vez, las proteínas conjugadas pueden clasificarse según la naturaleza química de su grupo prostético. En la tabla 2.1 se muestran algunas proteínas conjugadas así como su grupo prostético. Tabla 2.3. Algunas proteínas conjugadas y su grupo prostético.(6) Clase

Grupo prostético

Ejemplos

Fosfoproteínas

Grupo fosfato

Caseína

Metaloproteínas

Minerales Fe, Cu, Zn

Flavoproteínas

FAD, FMN

Ferritina, citocromos Enzimas P á g i n a | 35

Hemoproteínas

Grupo hemo

Hemoglobina, mioglobina

Glicoproteínas

Monosacáridos

Globulinas

Nucleoproteínas

Ácidos nucleicos

Ribosomas, ARN

Lipoproteínas

Lípidos

Seroalbúminas

Clasificación por su conformación tridimensional. La conformación de una proteína es la forma tridimensional característica que toda proteína tiene en su estado nativo. Desde este punto de vista las proteínas pueden clasificarse en: -Proteínas fibrosas y -Proteínas globulares Las proteínas fibrosas están constituidas por cadenas polipeptídicas ordenadas de modo paralelo a lo largo de un eje, en un solo plano. Son proteínas alargadas, filamentosas, insolubles en agua y soluciones salinas y su función es básicamente estructural. Las proteínas fibrosas son los elementos básicos estructurales en el tejido conjuntivo de los animales superiores, el colágeno de los tendones y la matriz de los huesos, la α-queratina del cabello, cuerno, uñas, plumas, y la elastina del tejido conjuntivo elástico son ejemplos de esta clase de proteínas. Las proteínas globulares, por otra parte, son proteínas constituidas por cadenas polipeptídicas plegadas, esféricas, compactas, solubles en agua y soluciones salinas diluidas y, por lo general, tienen funciones biológicas específicas. Las enzimas, los anticuerpos, las proteínas de transporte, algunas hormonas, algunas toxinas pertenecen a esta clase de proteínas.

Niveles estructurales de las proteínas. Las proteínas adoptan diferentes niveles estructurales según su naturaleza química y las condiciones en que se encuentren. A continuación se definirán, de manera general, los diferentes términos con los que se especifican estos niveles estructurales. En la figura 2.1 se ilustran los niveles estructurales de las proteínas. -Nivel primario o estructura primaria: se refiere al esqueleto covalente de la cadena polipeptídica y, establece de manera específica el número, secuencia y orden de sus componentes aminoácidos. Todas las proteínas tienen el nivel primario, sin excepción.

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-Nivel secundario o estructura secundaria: se refiere a la ordenación regular y periódica en el espacio de las cadenas polipeptídicas en un solo plano, a lo largo de una dirección. Las proteínas fibrosas alcanzan este nivel estructural ya que poseen una estructura extendida y enrollada longitudinalmente. Este nivel estructural solo es estabilizado por enlaces de puente de hidrógeno. -Nivel terciario o estructura terciaria: se refiere al modo como la cadena polipeptídica se pliega en tres dimensiones para formar una estructura globular compacta. Las proteínas globulares de una sola cadena polipeptídiica alcanzan este nivel terciario. Este nivel estructural es estabilizado por diferentes fuerzas de atracción como son los puentes de hidrógeno, puentes disulfuro, atracciones electrostáticas de cargas opuestas, fuerzas de van der Waals, etcétera. -Nivel cuaternario o estructura cuaternaria: es la integración espacial de dos o más cadenas polipeptídicas que conforman una proteína. Es decir, cuando una proteína está conformada por dos o más cadenas polipeptídicas, la asociación o integración de estas cadenas nos da como resultado una proteína con actividad biológica. La separación de las cadenas individuales da como resultado la pérdida de su actividad biológica. El término conformación se emplea para referirse a la estructura combinada secundaria, terciaria o cuaternaria de una proteína, En la figura 2.7 se ilustran los cuatro niveles estructurales de las proteínas.

Figura 2.7. Niveles estructurales de las proteínas.(1)

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Clasificación basada en su solubilidad. Dependiendo de su composición en número y secuencia de aminoácidos, es decir, de su estructura primaria, las proteínas responden de manera diferente a las condiciones del medio en que se encuentran dispersas. La s proteínas se clasifican de acuerdo a su solubilidad de la siguiente manera: -Albúminas: son aquellas que son solubles en agua y soluciones salinas diluidas. -Globulinas: son escasamente solubles en agua pero muy solubles en soluciones salinas. -Prolaminas: son solubles en etanol al 70-80%, pero insolubles en agua pura. -Histonas: son proteínas básicas presentes en los cromosomas solubles en soluciones salinas diluidas. -Escleroproteínas: son aquellas insolubles en agua y soluciones salinas.

Clasificación basada en su función biológica. Las proteínas poseen diversas funciones biológicas diferentes. En la tabla 2.4 se dan algunos ejemplos representativos de los diferentes tipos de proteínas clasificados de acuerdo a su función biológica.

Tabla 2.4. Clasificación de proteínas por su función biológica.(2) Tipos y ejemplos

Localización o función

Enzimas Hexoquinasa Fosforila la glucosa Lactato deshidrogenasa Deshidrogena el lactato Proteínas de reserva Caseína Proteína de la leche Ovoalbúmina Proteína de la clara de huevo Ferritina Reserva de hierro en el bazo Proteínas transportadoras Hemoglobina Transporta O2 en la sangre de los vertebrados Mioglobina Transporta O2 en el músculo LipoproteínaTransporta lípidos en la sangre Proteínas contráctiles Miosina Proteína de las fibras musculares

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Actina Proteína de las miofibrillas Proteínas de protección AnticuerposProteínas de defensa en la sangre TrombinaProteína de la coagulación Toxinas Venenos de serpientes Enzimas hidrolasas de lípidos Toxina de C. botulinum Toxina de alimentos procesados Gosipina Toxina de la semilla de algodón Hormonas Insulina Regula el metabolismo de la glucosa Hormona de crecimientoEstimula el crecimiento de huesos Proteínas estructurales Elastina Tejido conectivo elástico α-queratina Cabello, uñas, piel, plumas

Desnaturalización. La mayoría de las moléculas proteicas conserva su actividad biológica dentro de un rango muy limitado de temperatura y pH. La exposición de las proteínas solubles o globulares a temperaturas elevadas o pH extremos las hace experimentar un cambio o pérdida de su estructura nativa u original llamada desnaturalización. El efecto más evidente que se presenta en una proteína desnaturalizada es la pérdida de su solubilidad, adicional a la pérdida de su actividad biológica. Los factores que pueden provocar la desnaturalización de una proteína son: -temperaturas elevadas, por arriba de los 60oC, -pH extremos, fuera del rango comprendido entre 5 y 8, -metales pesados como el plomo, mercurio, plata, etcétera, -solventes orgánicos como el alcohol, acetona, éter, etcétera, -soluciones concentradas de sal o presión osmótica elevada. -radiaciones electromagnéticas. Los daños causados por la desnaturalización a una proteína pueden ser reversibles o irreversibles, dependiendo de la sensibilidad de la proteína y de la intensidad del factor que provoque la pérdida de su estructura nativa.

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2.2. ENZIMAS. El grupo más importante de las proteínas que exhibe actividad biológica es el de las enzimas. Estas proteínas son catalizadores que estimulan reacciones químicas en la célula. A diferencia de los catalizadores inorgánicos, una enzima despliega un grado inusual de especificidad, tanto en lo que respecta al sustrato sobre el cual actúa como a lo que se refiere al tipo de reacción que cataliza. Se puede decir que una célula contiene literalmente cientos de enzimas diferentes, tantas como reacciones químicas tiene su metabolismo intermediario. Gran parte de la historia de la bioquímica es la historia de la investigación de las enzimas. El nombre “enzima” (en levadura) no se empleó hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biológicos intervenían en la fermentación del azúcar para formar alcohol, de aquí en nombre inicial de “fermentos”. Aunque Louis Pasteur reconoció que la fermentación es catalizada por enzimas, postuló en 1860 que estas se hallaban ligadas de manera inexplicable con la estructura y la vida de las levaduras. En 1897, los hermanos Buchner consiguieron extraer las enzimas que catalizan la fermentación alcohólica de las levaduras. Este hecho demostró claramente que las enzimas que catalizan una ruta metabólica principal productora de energía, pueden actuar independientemente de la estructura celular. Fue hasta 1926 que J. B. Summer aisló y cristalizó por primera vez una enzima, la ureasa. Con este hecho se demostró que los cristales se hallaban constituidos por proteína y se llegó a la conclusión de que las enzimas son proteínas, A partir de este descubrimiento, los investigadores se enfocaron al aislamiento, purificación y caracterización de los cientos de enzimas que participan en el metabolismo intermediario. Aunque en la actualidad ya se han identificado la mayor parte de las enzimas que participan en el metabolismo básico de una célula quedan por resolver muchos problemas importantes, entre ellos el control genético de la síntesis enzimática, los mecanismos moleculares mediante los cuales se regula la actividad enzimática, y el papel de las formas múltiples de algunas enzimas en el desarrollo y en la diferenciación pero, sobre todo, todavía no se conoce en términos moleculares, cómo catalizan las enzimas las reacciones químicas con tal eficacia, precisión y especificidad.

2.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS. Las enzimas se clasifican de acuerdo a la reacción química que catalizan. Se reconocen seis clases de enzimas (tabla 2.5)

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Tabla 2.5. Clasificación internacional de las enzimas.(8) 1.Óxido-reductasas: Son aquellas que catalizan reacciones de óxido-reducción. 2.Transferasas: Son aquellas que catalizan reacciones de transferencia de grupos funcionales. 3.Hidrolasas: Son aquellas que catalizan reacciones de hidrólisis de enlaces Covalentes cos adición de una molécula de agua. 4.Liasas: Son aquellas que catalizan reacciones con formación de enlaces covalentes con adición de grupos funcionales a dobles enlaces. 5. Isomerasas. Son aquellas que catalizan reacciones de isomerización o racemización. 6.Ligasas. Son aquellas que catalizan reacciones de formación de enlaces covalentes con participación del ATP como donados de energía. Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo –asa al nombre del sustrato. El sustrato es la molécula sobre la cual la enzima ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo, la ureasa es la enzima que hidroliza a la urea para producir amoniaco y CO2. UREA + H2O ===== 2NH3 + CO2 La arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina a ornitina y urea. La fosfatasa cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos. En otros casos, se ha designado a las enzimas con nombres que dan poca información del sustrato o de la reacción que catalizan. Por ejemplo: pepsina, tripsina, catalasa. Por tal razón y, debido a que el número de enzimas que se descubren ha aumentado rápidamente, se ha adoptado una clasificación sistemática de las enzimas recomendada por la comisión internacional de las enzimas, que se basa en el tipos de reacción que catalizan. Bajo este esquema, cada enzima se designa por: -un nombre recomendado, de uso frecuente y, generalmente corto y apropiado al tipo de reacción, -un nombre sistemático, que se relaciona son los sustratos y productos de la reacción que cataliza, -número de clasificación, que se emplea cuando se precisa la identificación exacta de la enzima y que se aplica en revistas internacionales, libros científicos y resúmenes de congresos y otro tipo de foros de expresión científica. Por ejemplo, para la siguiente reacción:

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ATP + creatina == ADP + fosfocreatina El nombre recomendado para esta enzima es creatina quinasa, debido a que eltérmino quinasa es de uso frecuente y se refiere a las enzimas que participan en la transferencia de grupos fosfato, muy común en el metabolismo energético. El nombre sistemático sería ATP-creatin-fosfotransferasa, el cual tiene que ver con los sustratos y la reacción que cataliza. El número de clasificación es EC 2.7.3.2, done EC se refiere a la comisión de las enzimas, la primera cifra (2) se refiere a la clase (transferasas), según la clasificación antes mencionada (tabla 2.5), la segunda cifra (7) representa las subclases (fosfotransferasas), la tercera cifra (3) representa la sub-subclase (fosfotransferasas con grupo nitrógeno cómo aceptor), y la cuarta cifra (2) designa a la creatina-quinasa. 2.4. COENZIMAS Y COFACTORES. Cómo se mencionó en el capítulo de las proteínas, algunas de ellas pertenecen a la clasificación de proteínas conjugadas, es decir, requieren de un compuesto orgánico o inorgánico adicional para desempeñar su actividad biológica llamado grupo prostético. Las enzimas, al ser proteínas no escapan de esta condición y existen una gran cantidad de ellas que requieren de dicho grupo prostético para realizar su actividad catalítica. Cuando el grupo prostético es un ión metálico o un grupo inorgánico se denomina cofactor. Por otra parte, cuando se trata de algún compuesto orgánico se denomina coenzima. Las principales coenzimas son vitaminas o complejos vitamínicos.En algunos casos, algunas enzimas requieren de ambos, tanto cofactores como coenzimas. Algunos de los principales cofactores son: Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu+,K+ y Na+. Algunas de las principales coenzimas y sus reacciones estás descritas en la tabla 2.6. Tabla 2.6. Principales coenzimas de reacciones de transferencia de grupos.(6) Nicotinamida adenin dinucleótido (NAD+) Transferencia de electrones Flavin mononucleótido (FMN). Transferencia de electrones Flavin adenin dinucleótido. (FAD) Transferencia de electrones Coenzima Q (CoQ) Transferencia de electrones Pirofosfato de tiamina (PPT) Transferencia de aldehídos Coenzima A (CoA) Transferencia de grupos acilo Fosfato de piridoxal Transferencia de grupos amino Biocitina Transferencia de CO2 Lipoamida Transferencia de grupos acilo ________________________________________________________________________________

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En la figura 2.8 se ilustran algunas de las coenzimas más importantes y frecuentes del metabolismo.

Figura 2.8. Estructura de algunas de las coenzimas más frecuentes del metabolismo celular.(1)

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2.5. FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. La velocidad de una reacción enzimática está fuertemente afectada por varios factores como lo son la concentración de la enzima total, la concentración de sustrato, el pH y la temperatura. A continuación se describirá el efecto que tienen los catalizadores en las reacciones químicas y, posteriormente, se describiirá el efecto de los diferentes parámetros en las reacciones enzimáticas. Energía libre de activación y efecto de los catalizadores. Una reacción química dada, A ------- B, tiene lugar porque cierta fracción de las moléculas de A, en un momento determinado, tiene la suficiente energía como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transición, en el que es muy elevada la probabilidad de que se forme o se rompa un enlace químico para formar el producto B. Este estado de transición reside en la cima de la barrera de energía que separa a los reactantes y los productos (Figura 2.9). La velocidad de una reacción química dada es proporcional a la concentración de los reactantes activados en el estado de transición. La energía libre de activación (Ea), es la cantidad de energía necesaria para llevar todas las molécuas de 1.0 mol se sustancia, a una temperatura dada, al estado de transición.

Figura 2.9. Diagrama de energía para una reacción química.(1)

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Existen dos formas generales para incrementar la velocidad de una reacción química. Una de ellas es incrementando la temperatura ya que esto provoca un incremento térmico y de la energía, esto aumenta el número de moléculas capaces de alcanzar el estado de transición, y acelera, de este modo, la velocidad de las reacciones químicas. La adición de un catalizador es otra forma de incrementar la velocidad de una reacción química; este se combina con los reactantes de modo transitorio y se produce un estado de transición de menor energía de activación quee el correspondinte a la reacción no catalizada. De esta manera, los catalizadores aceleran las reacciones química porque disminuyen la energía de activación. Cuando la reacción termina, se regenera el catalizador libre.

Efecto de la concentración de enzima total en la velocidad de una reacción enzimática a una concentración fija de sustrato. La velocidad de una reación química es directamente proporcional a la concentración de enzima total. Para una reacción enzimática de un sustrato y un producto: [E] + [S]= [ES]= [E] + [P] A una concentraciòn alta de sustrato fija, la velocidad de la reacción se acelera proporcionalmente al incerementar la concentración de enzima total. 1X [E] --------1X V1 2X [E] --------2X V2 3X [E] --------3X V3

Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de una reacción enzimática a una concentración fija de enzima total. En la figura 2.10 se puede ver que cuando la concentración de sustrato es baja, la velocidad de reacción es casi directamente proporcional a la concentración de sustrato. Se dice que la reacción es de primer orden. Sin embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reacción tiende a disminuir y deja de ser proporcional a la concentración de sustrato. En esta zona, el orden de la reacción es mixto. A concentraciones muy altas de sustrato, la velocidad de reacción se hace independiente de la concentración de sustrato y se aproxima asintóticamente a una velocidad constante, conocida como velocidad máxima de reacción. A partir de este momento la reacción es esencialmnte de orden cero con respecto al sustrato.

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Figura 2.10. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción química catalizada por enzimas.(5)

La explicación de este fenómeno se debe a que todas las enzimas muestran un punto de saturación cuando la concentración de sustrato es alta, pero varían ampliamente con respecto a la concentración de sustrato que se necesita para que se manifiente. En 1913, L. Michaelis y L. M. Menten desarrollaron una teoría general aceca de la acción y cinética de las enzimas. Esta teoría se basa en algunas suposiciones que deben considerarse respecto a una reacción química dada. Estas son: -Se trata de una reacción que considera un solo sustrato. -La concentración de sustrato es >>> que la concentración de la enzima total. -La reacción es reversible. -El análisis se realiza al inicio de la reacción donde la concentración de producto es prácticamente cero. -La [E]t = [E] + [ES]

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Para la reacción: K+1

K+2

[E] + [S]====== [ES]====== [E] + [P] K-1 K-2 La velocidad de formación del complejo (ES) = velocidad de descomposición. Es decir: d[ES]/dt = -d[ES]/dt. Por tanto: K+1[E][S] + K-2 [E][P] = K-1[ES] + K+2[ES] En la figura 2.11.a se ilustra la variación a lo largo del tiempo de los diversos participantes.

Figura 2.11.a. Formación el complejo enzima-sustrato en función del tiempo e inicio del estado estacionario.(1) En la figura 2.11.b se ilustra de manera ampliada la porción sombreada de la figura anterior. Cómo se puede apreciar, existe una concentración fija constante del complejo enzima-sustrato a lo largo de toda la reacción.

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Figura 2.11.b. Ampliación de la porción sombreada de la figura 2.11.a. (1)

Al ser la (P) casi igual a cero, se desprecia. Al reordenar la ecuación. K+1[E][S] = (K-1 + K+2) [ES] Considerando que (K-1 + K+2)/K+1 = Km Haciendo los arreglos correspondientes. sustituyendo Km y considerando que: V α [ES] y que Vmáx α [E]t, el resultado final es : V = Vmáx [S]/Km + [S] Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, es la ecuación de velocidad para una reacción de un solo sustrato, catalizada enzimáticamente. Relaciona la velocidad inicial, la velocidad máxima y la concentración inicial de sustrato a través de la constante de Michaelis-Mentten (Fig. 2.10). El término Km, es la constante de Michaelis-Menten, se define como la concentración de sustrato cuando la velocidad de reacción alcanza la mitad de la velocidad máxima. Es una medida inversa de la afinidad que tiene la enzima por el sustrato. Es decir, a mayor Km menor afinidad de la enzima por el sustrato. A menor Km, mayor afinidad.

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Ecuación de Lineweaver-Burk. La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son más útiles para la expresión de datos experimentales. Una de ellas es la ecuación de Linewever-Burk, que se obtiene simplemente tomando los inversos de ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten: 1/V = Km/Vmáx[S] + 1/Vmáx Lo que se obtiene es la ecuación de una línea recta. Tal representación doble recíproca tiene la ventaja que permite una determinación mucho más exacta del valor de Vmáx, ya que en la representación sencilla V frente a (S), sólo se obtiene su valor aproximado. En la figura 2.12 se ilustra la representación gáfica de la ecuación de Lineweaver-Burk.

Figura 2.12. Representación gráfica de la ecuación de Lineweaver-Burk.(1)

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Efecto del pH sobre la actividad enzimática. La mayoría de las enzimas poseen un pH caractrístico en el cual su actividad es máxima. En valores mayores o menores de ese pH su actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de la actividad en función del pH de la mayoría de las enzimas tiene forma de campana, estos pueden variar considerablemente de forma. En la figura 2.13, se ilustran algunas curvas de actividad enzimática en función del pH. Es importante mencionar que para la mayoría de las enzimas del metabolismo intermediario, el pH óptimo oscila alrededor de 7.0, que es el pH intracelular.

Figura 2.13 Curvas de actividad catalítica para algunas enzimas en función del pH.(1) La relación entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende del comportamiento ácido-base de la enzima y del sustrato, así cómo de otros factores difíciles de cuantificar. El pH óptimo de una enzima no necesariamente es idéntico al de su entorno intracelular por lo que esto puede constituir un factor en el control intraceluar de su actividad.

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Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas. Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa en general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. Cuando la temperatura es baja, por lo general, la velocidad de reacción se duplica cada 10 oC. Sin embargo, este valor puede variar de una enzima a otra, dependiendo de las condiciones de la reacción y de la energía de activación de la reacción catalizada. En la figura 2.14, se ilustra el efecto de la temperatura sobre la actividad de las enzimas.

Figura 2.14. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. Las enzimas varían respecto a su estabilidad térmica. La caída drástica de la curva inmediatamente después de su máxima actividad se debe a la desnaturalización de la proteína. (1) En la figura 2.14, se puede ver que a temperaturas bajas, la velocidad de reacción se eleva proporcionalmente al incremento de la temperatura pero, al llegar a su máxima actividad, ésta cae drásticamente unos grados arriba de este punto. Esto se debe a que la aparente temperatura óptima es la resultante de dos procesos: 1) el incremento normal de la velocidad de reacción con la temperatura, y 2) el incremento en la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar la temperatura crítica con la consecuente pérdida de su actividad catalítica.

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La mayoría de las enzimas del metabolismo básico tiene una temperatura óptima cercana a los 40oC, considerando la temperatura intracelular, y se inactivan a temperaturas comprendidas entre los 55 y 60oC. Sin embargo, existen enzimas que conservan su actividad catalítica a temperaturas muy superiores, cómo es el caso de las enzimas de las bacterias termofíicas, que resisten una temperatura de hasta 85oC. 2.6. ENZIMAS REGULADAS Y NO REGULADAS. PROPIEDADES GENERALES. A partir del estudio de los inhibiidores de las enzimas se ha obtenido información de imprtancia sobre el mecanismo de la catálisis enzimática, la especificidad del sustrato, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y la participación de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformación activa de la molécula de la enzima. Además, de la importancia que tienen los inhibidores en la regulacuión del metabolismo intermediario. Existen dos categorías de inhibición de las enzimas: la reversible y la no reversible. Los tres principales tipos de inhibición reversible son: competitiva, acompetitiva y no competitiva, los cuales pueden distinguirse experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor sobre la cinética de reacción de la enzima, la cual puede analizarse mediante la ecuación básica de velocidad propuesta por Michaelis-Menten o por la pripuesta por Lineweaver-Burk. Mientras que el otro mecanismo de regulación de la actividad de las enzimas puede tratarse como la inhibición retronutritiva por actividad de las enzimas reguladoras alostéricas.

Inhibición competitiva. La característica principal de este tipo de inhibición es que el inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo o sitio catalítico de la enzima libre. Si el inhibidor interacciona con la enzima se forma un complejo reversible enzima-inhibidor el cual es catalíticamente inactivo. [E] + [I] ==== [EI]

En este tipo de inhibición el sustrato y el inhibidor son móléculas químicamente muy parecidas, tanto que compiten por el mismo sitio activo de la enzima. Por ejemplo, en la reacción catalizada por la succinato deshidrogenasa: SUCCINATO + FAD ====== FUMARATO + FADH2 El malonato, que es químicamente parecido al sustrato de la enzima succinato, actúa como inhibidor competitivo de la enzima ocasionando la la reacción original no se realice.

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Este es el tipo de inhibición reversible más común en el metabolismo intermediario. En el análisis cinético mediante el tratamiento de Michaelis-Menten, el efecto sobre la reacción original es un incremento en el Km del sustrato, pero la velocidad máxima no se ve afectada al incrementar la concentración de sustrato a niveles mayores del inhibidor. La ecuación general representada por Lineweaber-Burk sería: 1/V = (Km/Vmáx)(1 + ([I]/Ki) (1/[S]) + 1/Vmáx En la figura 2.15 se ilustra la gráfica para la inhibición competitiva mediante el tratamiento de Lineweaver-Burk.

Inhibición acompetitiva. En este tipo de inhibición, la molécula inhibidora no se combina con la enzima libre ni afecta la afinidad de la enzima por el sustrato normal, sino que se combina con el complejo enzima-sustrato para formar un complejo enzima-sustrato-inhbidor que es inactivo por lo que no sufre la transformación habitual al producto de la reacción. [ES] + [I] ===== [ESI] En esta ocasión no se ve afectado el Km de la reacción original pero si se ve disminuída su velocidad máxima.

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Figura .2.15. Representación gráfica de la inhibición competitiva.(1) La ecuación general para para inhibición acompetitiva representada por Lineweaver-Burk sería: 1/V = (Km/Vmáx)(1/[S]) + 1/Vmáx)(1 + ([I]/Ki) En la figura 2.16 se ilustra la gráfica para la inhibición acompetitiva mediante el tratamiento de Lineweaver-Burk. El grado de inhibición acompetitiva puede aumentar cuando la concentración de sustrato se incrementa. Lo característico de la inhibición acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al aumentar la concentración del inhibidor, pero Vmáx decrece (Fig. 2.16). La inhibición acompetitiva es poco frecuente en reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reacciones de dos susratos.

Inhibición no competitiva. En este tipo de inhibición, el inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre cómo con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo la acción de ambos. Sus efectos no se anulan al aumentar la concentración de sustrato. El inhibidor no competitivo produce dos formas inactivas: [EI] y [ESI]. [E] + [I] ===== [EI] [ES] + [I] === [ESI]

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Figura 2.16. Representación gráfica de la inhibición acompetitiva.(1) En la figura 2.17 se ilustra la gráfica para la inhibición no competitiva mediante el tratamiento de Lineweaver-Burk.

Figura 2.17. Representación gráfica de la inhibición no competitiva.(1) El tipo más corriente de inhibición no competitiva es producida por los reactivos que pueden combinarse reversiblemente con algún tipo de grupo funcional de la enzima que sea esencial para mantener la conformación catalíticamente activa de la enzima.

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Inhibición irreversible. Algunas enzimas experimentan inactivación irreversible cuando se tratan con agentes capaces de unirse covalentemente y que modifican de modo permanente a un grupo funcional necesario para la catálisis, con lo que se inactiva la molécula de enzima. Este tipo de inhibición no puede ser tratada con los principios de Michaelis-Menten ni de Lineweaver-Burk que suponen la reacción reversible de los complejos EI y ESI. Este tipo de inhibición irreversible se conoce también como modificación química de la enzima y es considerada como uno de los mecanismos de regulación de la actividad de las enzimas.

Regulación de la actividad de las enzimas. El genoma controla cualitativamente la composición enzimática de un organismo en cuanto a que solamente puede sintetizar las enzimas para las que posee los genes apropiados. Sin embargo, si un organismo tiene que responder rápidamente a los cambios de las propiedades físicas y químicas del ambiente, es evidentemente esencial para él poseer unos mecanismos por medio de los cuales pueden regular las actividades de las enzimas de tal manera que las reacciones que estas catalizan produzcan la cantidad justa de los distintos productos finales del metabolismo. Existen dos niveles de regulación de la acción enzimática: 1) Mecanismos de regulación de la actividad de las enzimas: -Control de la velocidad de acceso de los sustratos a las enzimas. -Inhibición retronutritiva (inhibición feedback) -Modificación de la estructura de las enzimas. -Degradación de las enzimas. 2) Mecanismos de regulación de la síntesis de las enzimas: -Inducción. -Represión. Mecanismos de regulación de la actividad de las enzimas.

Control del acceso del sustrato a las enzimas. El control del acceso del sustrato a la enzima apropiada puede realizarse de varias formas que van desde la regulación de la velocidad de transporte de un sustrato al interior de una célula, hasta la formación de membranas en los distintos organelos.

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Inhibición retronutritiva. Es un proceso que utilizan las células para impedir un exceso de producción de intermediarios de bajo peso molecular cómo aminoácidos y nucleótidos. Si un producto metabólico E es sintetizado por una serie de reacciones en las que A se convierte en B, B en C, C en D y D en E, el producto final E puede, mediante un proceso de inhibición retronutritiva, inhibir la acción de las enzimas que catalizan una o más de las primeras reacciones de la sucesión y, por consiguiente, inhibir la producción de un exceso de E. El modo de interactuar del inhibidor es muy diferente al estudiado en el tema de la inhibición reversible, ya que por lo regular, la molécula efectora que inhibe la actividad de la enzima, es completamente diferente al sustrato de la misma, lo cual sugiere que el inhibidor interacciona con la enzima en un sitio diferente al sitio activo o sitio catalítico de la enzima, llamado sitio alostérico. Es por esto que a este tipo de enzimas reguladoras del metabolismo se les denomina enzimas alostéricas.

Modificación de la estructura de las enzimas. La modificación de la estructura de las enzimas puede realizarse de dos maneras: -modificación física, que es cuando los efectores se unen de modo no covalente a la enzima, determinando un cambio en la conformación con alteración de la actividad catalítica, y -modificación química, es cuando, por medio de enlaces covalentes, se unen unos grupos específicos a la molécula enzimática, determinando una alteración de las propiedades catalíticas de la proteína. Degradación de las enzimas. Es aquel por el cual unas enzimas proteolíticas sumamente específicas degradan las enzimas que ya no se necesitan para el metabolismo del organismo. A estas enzimas degradativas se les conoce como proteasas.

Mecanismos de regulación de la síntesis de las enzimas. Inducción de la síntesis de las enzimas. Las células de cualquier organismo sintetizan algunas enzimas independientemente de la composición química o las condiciones del medio. Estas enzimas se denominan enzimas constitutivas, para distinguirlas de las enzimas inducidas, que son sintetizadas por el

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organismo solamente en respuesta a la presencia en el medio ambiente de un inductor, elcual suele ser el sustrato de la enzima o un compuesto estructuralmente semejante a él. La inducción de la síntesis de las enzimas se define como un incremento en la tasa de síntesis de una enzima como resultado a la presencia en el medio de un inductor. El ejemplo más significativo de este mecanismo lo tiene la enzima β-galactosidasa, comúnmente llamada lactasa, que hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa. La presencia de lactosa induce la síntesis de lactasa. En ausencia de la lactosa, la β-galactosidasa no es sintetizada.

Represión de la síntesis de las enzimas. La represión de la síntesis de las enzimas puede definirse cómo la disminución en la tasa de síntesis de una enzima como resultado de la presencia en el medio de una molécula represora que puede ser un inhibidor o un efector. En el mismo ejemplo de la enzima β-galactosidasa, la presencia en el medio de glucosa, reprime la síntesis de la enzima, aún con la presencia de lactosa en el medio. Una vez agotadas las reservas de glucosa, la lactosa actúa como inductor de la síntesis de la lactasa.

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UNIDAD III. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS. 3.1. GENERALIDADES DE LOS CARBOHIDRATOS. Los carbohidratos, también llamados hidratos de carbono, sacáridos o glúcidos, se definen químicamente como polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas y sus derivados. Muchos tienen la fórmula empírica (CH2O)n de aquí el nombre de hidratos de carbono. Se clasifican de acuerdo al tamaño de la molécula en: monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos (Figura 3.1)

Figura 3.1. Estructura general de los polihidroxialdehídos y polihidroxicetonas.(7) Los monosacáridos, también llamados azúcares sencillos, están formados por una sola unidad de polihidroxialdehído (aldosas) o polihidroxicetona (cetosas). El monosacárido más abundante es la aldosa D-glucosa, tiene 6 átomos de carbono. Es el monosacárido originario del que se derivan muchos más. Es el combustible principal para la mayor parte de los organismos, y es también la unidad estructural básica de los polisacáridos más abundantes tales como el almidón y la celulosa (Figuras 3.2 y 3.3) Los oligosacáridos, contienen de dos a diez unidades de monosacáridos unidos mediante enlace glucosídico. Se clasifican en disacáridos, trisacáridos, tetrasacáridos, etcétera, dependiendo del número de unidades de monosacáridos que los formen. Por mucho, los disacáridos son los más abundantes en la naturaleza.

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Fi gura 3.2.Familia de las D-aldosas con tres a seis átomos de carbono.(1) Los polisacáridos, contienen muchas unidades de monosacáridos unidas por enlace glucosídico, formando cadenas lineales o ramificadas. Si están formadas por el mismo tipo de monosacáridos se llaman homopolisacáridos. Si están formados por dos o más tipos diferentes de monosacáridos se denominan heteropolisacáridos. Los polisacáridos desempeñan dos funciones biológicas principales: una como almacenadores de combustible y otra como elementos estructurales.. En la biósfera hay, probablemente, una mayor cantidad de carbohidratos que de toda la demás materia orgánica junta, lo cual es debido, en gran medida a la abundancia en el mundo de las plantas de dos polímeros de la D-glucosa: el almidón y la celulosa. El almidón es la principal forma de almacenamiento de combustible en la mayor parte de los vegetales, mientras que la celulosa es el principal componente extracelular de las paredes celulares rígidas y de los tejidos fibrosos de los mismos.

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Figura 3.3. Familia de las D-cetosas en cadena abierta.(1)

El glucógeno, que se parece químicamente al almidón estructuralmente, es el principal glúcido de reserva en los animales. Otros polisacáridos desempeñan el papel de componentes principales de las paredes celulares de las bacterias y de las cubiertas celulares blandas de los tejidos animales. Debido a que los carbohidratos tienen en su estructura uno ´más carbonos quirales o asimétricos, existen las dos familias D- y L-. Los carbohidratos que tienen importancia bioquímica pertenecen a la serie D-. Una propiedad que tienen los monosacáridos que es determinante para su estructura es que espacialmente los átomos de carbono carbonilo 1 ó 2, tienen cercanía con los átomos de oxígeno de los grupos hidroxilo de los carbonos 4 ó 5 por lo que estos tienden a reaccionar y formar estructuras cíclicas tal como se ilustra en la figura 3.4.

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Figura 3.4. Formación de las estructuras cíclicas de los monosacáridos mediante la reacción de formación de hemiacetales en las aldosas y hemicetales en las cetosas.(1) Si la estructura es de seis átomos se denominan piranosas. Si es de cinco átomos se denominan furanosas. En la figura 3.5 se ilustran las estructuras cíclicas de la D.glucopiranosa (seis átomos) y de la D-fructofuranosa (cinco átomos.) Debido a que el átomo de carbono carbonilo en ambas estructuras al reaccionar se transforma en carbono asimétrico, este puede existir en dos formas estereoisómeras. Si el grupo hidroxilo que se forma en la reacción se orienta hacia abajo se denomina α- y si se orienta hacia arriba se denomina β- (Figura 3.5)

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Figura 3.5. Formación de D-glucopiransas y D-fructofuranosas.(1)

3.2. METABOLISMO (anabolismo y catabolismo) El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que se producen en el interior de las células y que conducen a la transformación de unas biomoléculas en otras. Las distintas reacciones químicas del metabolismo se denominan vías metabólicas y las moléculas que en ellas intervienen se  llaman metabolitos. Todas las reacciones del metabolismo están reguladas por enzimas, que son específicas para cada metabolito inicial o sustrato y para cada tipo de transformación. Las sustancias finales de una vía metabólica se denominan productos. Las conexiones existentes entre diferentes vías metabólicas reciben el nombre de metabolismo intermediario. El metabolismo presenta cuatro características fundamentales: 1) son sistemas multienzimáticos interrelacionados, 2) altamente coordinados, 3) que intercambia materia y energía entre la célula y el medio ambiente y 4) se regula de manera independiente. Se pueden considerar dos fases en el metabolismo: una de degradación de materia orgánica o catabolismo y otra de construcción de materia orgánica o anabolismo. En la figura 3.6 se ilustran las dos fases del metabolismo: anabolismo y catabolismo. El metabolismo tiene cuatro funciones fundamentales: 

La transformación de la energía química, almacenada en las moléculas combustibles (carbohidratos, lípidos y proteínas);transfiriéndola y utilizándola de diferentes formas y con distintos fines.

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  

La conversión de los nutrientes, en sillares de construcción (moléculas sencillas), los que son precursores de las macromoléculas celulares (más complejas). Ensamblaje de los distintos componentes químicos para la formación de proteínas. Formación y transformación de las distintas biomoléculas, de acuerdo a las funciones especializadas que son requeridas por las células

Figura 3.6. Fases del metabolismo.(3)

3.2.1. CATEGORÍAS DEL METABOLISMO. El metabolismo se divide en dos fases principales: catabolismo y anabolismo. El catabolismo es la fase degradativa del metabolismo, en el cual las moléculas nutritivas complejas y relativamente grandes (polisacáridos, grasas y proteínas) que provienen del entorno o de sus propios depósitos de reserva, se degradan para producir moléculas más sencillas como lactato, acetato, urea, amoniaco o CO 2. El catabolismo va acompañado de la liberación de la energía química inherente a la estructura de las moléculas orgánicas nutritivas y a su conservación en forma de ATP, la moneda energética del metabolismo. En general, el catabolismo se puede definir como el conjunto de los sistemas multienzimáticos conducentes a reducir la complejidad molecular con producción de energía química.

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Por otra parte, el anabolismo constituye la fase constructiva o biosintética del metabolismo, en la cual tiene lugar la biosíntesis enzimática de los componentes moleculares de las células tales como los ácidos nucleicos, las proteínas, los polisacáridos y los lípidos a partir de precursores sencillos. La biosíntesis de moléculas orgánicas a partir de estos necesita del consumo de energía química aportada por el ATP generado durante el catabolismo. En general, el anabolismo se puede definir como el conjunto de sistemas multienzimáticos conducentes a incrementar la complejidad molecular con el consumo de energía química. El catabolismo y el anabolismo se desarrollan de manera simultánea y de modo concurrente en las células, pero son regulados de manera independiente. Debido a que el metabolismo procede de modo escalonado a través de muchos intermediarios, con frecuencia se emplea el término metabolismo intermediario para designar a las rutas químicas del metabolismo. Los productos intermedios del metabolismo se denominan metabolitos.

3.2.2. LAS TRES ETAPAS DEL METABOLISMO. Las tres etapas del metabolismo son: la absorción, transformación y excreción. En la fase I (Absorción): las grandes moléculas nutritivas (proteínas, carbohidratos y lípidos) que provienen ya sea del entorno en forma de alimentos o de sus depósitos de reserva, se degradan en sillares de construcción más sencillos. En la fase II (Transformación): Los productos obtenidos en la fase anterior se transforman en lo que se ha dado en llamar metabolitos intermediarios (más sencillos), como el piruvato, lactato, citrato y el acetilCoA. En la fase III (Excreción): Los productos de la fase II resultan ser oxidados a sustancias aún más sencillas y finales (CO2, H2O y NH3), los cuales son eliminados de la célula. En la figura 3.7 se ilustran las tres etapas del metabolismo.

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Figura 3.7 Las tres etapas del metabolismo.(7)

3.2.3. PRINCIPALES PASOS METABÓLICOS. En la figura 3.8 se ilustran los principales pasos metabólicos que forman parte del metabolismo intermediario celular; también se muestran de manera más clara las tres etapas del metabolismo. En la primera fase las rutas catabólicas se indican con flechas descendentes: la degradación de proteínas (proteólisis), polisacáridos (amilólisis) y lípidos (lipólisis). En esta primera fase no hay producción de energía química a pesar de ser una fase degradativa. Los productos de esta fase son degradados por etapas que convergen en los productos finales: la degradación oxidativa de aminoácidos, la glucólisis y la β-oxidación, que rinden piruvato, acetil-CoA, e intermediarios del ciclo de Krebs, así como pares de electrones ricos en energía química, que son llevados a la tercera fase del metabolismo en forma de NADH y FADH2, la fase oxidativa con producción de energía química en forma de ATP.

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Figura 3.8. Principales pasos metabólicos. Las tres fases del metabolismo.(1)

En esta tercera etapa se realizan los procesos de oxidación como el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, los cuales liberan la mayor cantidad de la energía química contenida en

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los combustibles orgánicos. Una buena parte de esta energía es recuperada en forma de ATP por el proceso de la fosforilación oxidativa. Las rutas anabólicas se indican con las flechas ascendentes. Son las etapas biosintéticas que parten de unos pocos precursores de la fase III y emplean la energía del ATP para rendir los diferentes componentes celulares diversos: aminoácidos y proteínas (síntesis de proteínas), monosacáridos y polisacáridos (gluconeogénesis), y la síntesis de triacilglicéridos y otros lípidos (lipogénesis).

3.3. GLUCÓLISIS. La glucólisis es la degradación anaerobia de los carbohidratos. Es una de las varias rutas metabólicas llamadas genéricamente como fermentaciones anaerobias. Pocas especies son estrictamente anaerobias. Hay una gran cantidad de organismos que pueden vivir en ausencia y presencia de oxígeno, entre ellos algunos microorganismos y ciertos tejidos del organismo humano. Son células facultativas. En ausencia de oxígeno extraen la energía de la glucosa mediante el mecanismo de fermentación anaerobia (glucólisis), generando productos de bajo pero molecular como piruvato, lactato, acetato, etc. En presencia de oxígeno prefieren oxidar completamente los combustibles orgánicos hasta CO2 H2O. Al parecer, en el curso de la evolución biológica, los primeros organismos fueron células anaerobias simples capaces de vivir solamente mediante la fermentación. Al aparecer el oxígeno producto de la fotosíntesis, algunas células adquirieron la capacidad de utilizarlo como oxidante. En los organismos facultativos se conserva la capacidad de vivir sin oxígeno permitiéndole flexibilidad metabólica. Condiciones anaerobias: GLUCOSA --- 2 LACTATOCitoplasma celular. Los productos finales son característicos de cada especie. Condiciones aerobias: GLUCOSA ---- 2 LACTATO ----- 6CO2 + 6H2O +6O2 respiración.

Proceso de fermentación y

La glucólisis es la descomposición de la glucosa en dos moléculas de piruvato, aunque en el proceso de fermentación completa termina siempre en productos finales de fermentación tales como: lactato, acetato, etanol, propionato, etcétera, dependiendo de la especie.

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De todos los procesos anaerobios, la glucólisis es el más extendido y el que más se conoce, además de ser el más sencillo de todos los mecanismos para obtener energía. También es el tipo de descomposición de la glucosa que se presenta en las células de los animales superiores, incluyendo al ser humano.

3.3.1. VÍA GLICOLÍTICA La glucólisis es un proceso de degradación de la glucosa que consiste en diez reacciones enzimáticas. En la figura 3.9 se ilustra el proceso completo de las diez reacciones de la glucólisis. Como se puede apreciar, la glucólisis se divide en dos fases o etapas: Fase I, es la congregación de azúcares sencillos y su conversión en glicerahdehído-3-fosfato. Esta fase no produce energía, por el contario, tiene la incorporación de dos moléculas de ATP que actúan como cebadores. Fase II, es la conversión del gliceraldehído-3-fosfato en lactato y la conservación de la energía en forma de ATP. Debido a que en la fase I se incorporan moléculas de seis átomos de carbono (hexosas) y concluye en dos moléculas de 3 átomos de carbono (gliceraldehído-3-fosfato), la segunda fase se realiza por duplicado. A continuación se describen las reacciones de la ruta glucolítica:

FASE I 1) ATP + D-GLUCOSA ====== ADP + D-GLUCOSA-6-FOSFATO 2) D-GLUCOSA-6-FOSFATO ==== FRUCTOSA-6-FOSFATO 3) ATP + FRUCTOSA-6-FOSFATO ==== ADP + FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO 4) FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO = DHAP + GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO 5) DHAP==== GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO FASE II 6) GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO + NAD+ + Pi === 1,3-DIFOSFOGLICERATO + NADH + H+ 7) 1,3-DIFOSFOGLICERATO + ADP == 3-FOSFOGLCERATO + ATP 8) 3-FOSFOGLICERATO === 2-FOSFOGLICERATO 9) 2-FOSFOGLICERATO === FOSFOENOLPIRUVATO + H2O 10) FOSFOENOLPIRUVATO + ADP === PIRUVATO + ATP

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Figura 3.9. Las dos fases de la glucólisis. Las incorporaciones al sistema aparecen en la parte superior con flechas convergentes. Los productos salientes aparecen en los recuadros.(1) El producto final piruvato tiene diferentes rutas de aplicación dependiendo de las condiciones y necesidades del organismo. Puede reducirse para formar los productos finales de la fermentación, puede descarboxilarse para formar Acetil-CoA y continuar con el proceso de respiración para la producción de una mayor cantidad de energía puede retornar

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por reacciones reversibles y formar nueva glucosa por el proceso de gluconeogénesis o bien puede ser precursor para la síntesis de algunos aminoácidos. En condiciones anaerobias el proceso de fermentación concluye con la reducción del piruvato para formar lactato mediante la siguiente reacción: PIRUVATO + NADH + H+===== LACTATO + NAD+ Enzimas y cambios de energía libre de la reacciones de la glucólisis. En la tabla 3.1 se muestran las 10 enzimas participantes en las dos fases de la glucólisis así como sus respectivos cambios de energía libre de cada una de las reacciones. Es importante recordar que las reacciones de la fase II se realizan por duplicado. Tabla 3.1. Enzimas y cambios de energía libre de las reacciones de la glucólisis.(5) __________________________________________________________________ Etapa

Enzima

Tipo de reacción

∆Go’ (Kcal/mol)

1 Hexoquinasa Transferencia de fosfato - 4.0 2 Glucofosfoisomerasa Isomerización + 0.4 3 Fosfofructoquinasa Transferencia de fosfato - 3.4 4 Fructofosfato aldolasa Condensación aldólica+ 5.73 5 Triosafosfoisomerasa Isomerización + 1.83 6 Gliceraldehídofosfato deshidrogenasa Deshidrogenación + 1.5 7 Fosfogliceratoquinasa Transferencia de fosfato 8 Fosfogliceromutasa Isomerización 9 Enolasa Deshidratación 10 Piruvatoquinasa Transferencia de fosfato

- 4.5 + 1.06 + 0.44 - 7.5

3.3.2. BALANCE GLOBAL DE LA VÍA GLUCOLÍTICA. Haciendo el balance global de las diez reacciones de la secuencia glucolítica, en condiciones anaerobias, considerando el destino de los seis átomos de la glucosa, las reacciones de óxido-reducción y la incorporación y salida de los grupos fosfato tanto de ADP como del ATP tenemos: GLUCOSA + 2 ATP + 2 NAD++ 2Pi + 4 ADP  2 PIRUVATO + 4 ATP + 2 ADP + 2 NADH + 2H+ + 2 H2O Al eliminar los términos comunes en ambos lados tenemos: GLUCOSA + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ ===== 2 PIRUVATO + 2 ATP + 2 H2O + 2 NADH + 2H+

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En condiciones aerobias el piruvato se descarboxila para formar Acetil-CoA y y continuar con el proceso de respiración. La etapa final de la fermentación láctica, es decir, del proceso anaerobio, el piruvato se reduce a lactato por medio de la enzima lactato deshidrogenasa, y con un ∆Go’= - 6.0 Kcal/mol. PIRUVATO + NADH + H+==== LACTATO + 2 NAD+ quedando el balance global para la fermentación láctica de la siguiente manera: GLUCOSA + 2 ADP + 2 Pi ======= 2 LACTATO + 2 ATP + 2 H2O Desglosando la ecuación anterior en sus componentes exergónico y endergónico : Fase exergónica:

GLUCOSA ======= 2 LACTATO

∆Go’= - 47 Kcal/mol

Fase endergónica: 2 ADP + 2 Pi === 2 ATP + 2 H2O ∆Go’= + 14.6 Kcal/mol Por lo que el ∆Go’ de la reacción global de la fermentación láctica es de: ∆Go’= - 32.4 Kcal/mol.. Es decir, en términos de eficiencia, la fermentación láctica recupera apenas el 31 % de la energía liberada de la degradación anaerobia de los carbohidratos. (14.6/47)x 100= 31%, donde la ganancia neta es de 2 ATP. Por otra parte, las levaduras tienen la capacidad de reducir el piruvato a etanol y CO 2 mediante las enzimas piruvato descarboxilasa y alcohol dehidrogenasa: PIRUVATO == ACETALDEHÍDO + CO2 ACETALDEHIDO + NADH + H+=== ETANOL + NAD+ Al incluir estas dos reacciones al proceso, el balance global de la fermentación alcohólica queda de la siguiente manera.

GLUCOSA + 2 ADP + 2 Pi ==== 2 ETANOL + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

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3.3.3. REGULACIÓN DE LA GLUCÓLISIS. El control del flujo de la vía glucolitica se ajusta como respuesta a las condiciones que debe haber tanto dentro como fuera de la célula. La velocidad de transformación de la glucosa en piruvato se regula para cubrir las necesidades importantes de la célula: tanto como para producir ATP, como todos los precursores para las reacciones de síntesis. Uno de los factores más importantes que regula la actividad de las enzimas que participan en el metabolismo energético es la carga de energía de la célula, la cual está definida por la cantidad de enlaces fosfato de alta energía, ATP. Por otra parte, los puntos de regulación en las vías metabólicas, incluyendo la glucólisis, involucran enzimas alostéricas, en reacciones irreversibles. La ruta glucolitica no es la excepción. Está regulada por tres enzimas alostéricas que participan en las reacciones 1, 3 y 10 (Tabla 3.1). A saber: Reacción 1: GLUCOSA + ATP ----- GLUCOSA-6-FOSFATO + ADP Enzima: Hexoquinasa o Glucoquinasa. Inhibidores: ATP, CITRATO, NADH Estimuladores: ADP, AMP, Mg+2, Mn+2 Reacción 3: FRUCTOSA-6-FOSFATO + ATP ----- FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO + ADP Enzima: Fosfofructoquinasa. Inhibidores: ATP, CITRATO, ÁCIDOS GRASOS DE CADENA LARGA Estimuladores: ADP, AMP, Mg+2, Mn+2 Reacción 10: FOSFOENOLPIRUVATO + ADP ------ PIRUVATO + ATP Enzima: Piruvato quinasa. Inhibidores: ATP, AMP, CITRATO, ALANINA, ÁCIDOS GRASOS Y ACETIL-CoA Estimuladores: Mg+2, Mn+2, K+

3.3.4. ENTRADA DE OTROS AZÚCARES EN LA VÍA GLICOLÍTICA. En la figura 3.10 se ilustran las rutas convergentes para la incorporación de otros carbohidratos a la secuencia glucolítica. Monosacáridos como la fructosa, manosa y galactosa; disacáridos como la lactosa, maltosa y sacarosa entre los más importantes y, los polisacáridos de reserva almidón y glucógeno. Todos son canalizados a la primera fase de la glucólisis a través de rutas alimentadoras catalizadas por enzimas auxiliares.

Incorporación de otros monosacáridos distintos a la glucosa. A continuación se describen la rutas alimentadoras que incorporan otros monosacáridos a la secuencia glucolítica.

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Figura 3.10. Rutas alimentadoras para la incorporación de otros azúcares a la secuencia glucolítica.(1) D-FRUCTOSA + ATP ===== D-FRUCTOSA-1-FOSFATO + ADP D-FRUCTOSA-1-FOSFATO ==== D-GLCERALDEHÍDO + DHAP D-GLICERALDEHÍDO + ATP ==== D-GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO DHAP ====== D-GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO D-GALACTOSA + ATP ====== D-GALACTOSA-1-FOSFATO + ADP D-GALACTOSA-1-FOSFATO ===== D-GLUCOSA-1-FOSFATO D-GLUCOSA-1-FOSFATO ====== D-GLUCOSA-6-FOSFATO D-MANOSA + ATP ======= D-MANOSA-6-FOSFATO + ADP D-MANOSA-6-FOSFATO ===== D-FRUCTOSA-6-FOSFATO Las pentosas pueden incorporarse a la secuencia glucolítica después de su fosforilación y conversión en hexosa y triosa-fosfatos mediante otros mecanismos.

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Incorporación de disacáridos. Por lo general, los disacáridos ingeridos en los alimentos son hidrolizados previamente en sus componentes monosacáridos y absorbidos a través del intestino para ser introducidos a la secuencia glucolítica por las reacciones antes descritas. Las reacciones más importantes son: SACAROSA + H2O ===== D-GLUCOSA + D-FRUCTOSA MALTOSA

+ H2O ===== 2 D-GLUCOSA

LACTOSA almidón

+ H2O ===== D-GLUCOSA + D-GALACTOSA

del glucógeno y del

Las enzimas que participan en estas reacciones son la sacarasa, α-glucosidasa,y la βgalactosidasa respectivamente. La pérdida de la capacidad de síntesis de la β-galactosidasa hace que los individuos sean incapaces de absorber la lactosa, alteración conocida con el nombre de intolerancia a la lactosa.

Incorporación de polisacáridos. Las unidades de D-Glucosa del glucógeno y del almidón son incorporadas a la secuencia glucolítica a través de la acción consecutiva de dos enzimas: la glocógeno-fosforilasa (o almidón-fosforilasa en los vegetales) y la fosfogluco-mutasa. Las reacciones mediante las cuales se lleva a cabo la liberación de la D-glucosa de los polímeros e introducida a la secuencia glucolítica son: (D-GLUCOSA)n + HPO4-2=== (D-GLUCOSA)n-1 + D-GLUCOSA-1-FOSFATO D-GLUCOSA-1-FOSFATO == D-GLUCOSA-6-FOSFATO

3.4. GLUCONEOGÉNESIS. La biosíntesis de la glucosa y de otros carbohidratos a partir de precursores sencillos, constituye el proceso biosintético más sobresaliente de cuantos tienen lugar en la biósfera. En el dominio de los organismos fotosintéticos, las hexosas producidas a partir del CO 2 y H2O se convierten en almidón y celulosa y otros polisacáridos que se encuentran en cantidades enormes en el mundo vegetal. En los organismos heterótrofos, la conversión del piruvato, lactato, aminoácidos y otros precursores sencillos, primero en glucosa y, después en glucógeno, constituye también una ruta biosintética fundamental.

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Los mamíferos pueden sintetizar glucosa a partir de una gama de precursores tales como piruvato, lactato, glicerol, aminoácidos glucogénicos e intermediarios del ciclo de Krebs, la vía ocurre principalmente en hígado y riñón. Muchos de estos precursores son convertidos a oxaloacetato el cual a su vez es transformado en fosfoenolpiruvato y de ahí, a glucosa (muchas de las reacciones son inversas a las de la glucólisis). Las reacciones irreversibles de la glucólisis (etapas 1, 3 y 10) son rodeadas por vías alternas catalizadas por enzimas diferentes a la de la ruta glucolítca. Estas enzimas pueden ser al menos parcialmente, activas simultáneamente lo que ocasiona un ciclo de substrato. Este ciclo es importante para regular la velocidad y dirección de flujo entre la glucólisis y la gluconeogénesis. Las enzimas que participan en la vía glucolítica participan también en la gluconeogénesis; ambas rutas se diferencian por tres reacciones irreversibles que utilizan enzimas específicas de este proceso y los dos rodeos metabólicos de esta vía. Estas reacciones son:   

De glucosa a glucosa-6-fosfato. De fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6-difosfato. De fosfoenolpiruvato a piruvato.

En la figura 3.11 se ilustra la ruta central para la síntesis de hexosas, los principales precursores y las rutas convergentes y divergentes para la síntesis de todos los carbohidratos en la naturaleza.

3.4.1. REACCIONES, SUSTRATOS Y REGULACIÓN. De las 10 reacciones que conducen de la glucosa al piruvato en la secuencia glucolítica, siete de ellas emplean las mismas enzimas en el proceso de gluconeogénesis y solo tres de ellas emplean enzimas diferentes. A continuación se describen las tres etapas diferentes del proceso de síntesis. Conversión del piruvato en fosfoenolpiruvato: Esta etapa se realiza por medio de un rodeo que utiliza enzimas tanto del citosol como de la mitocondria.

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Figura 3.11. Ruta central para la biosíntesis de hexosas, rutas convergentes y divergentes y precursores para la biosíntesis de carbohidratos.(1) La primera etapa es catalizada por la piruvatocarboxilasa de las mitocondrias. P á g i n a | 77

El piruvato producido en el citosol se introduce a la mitocondria y sufre una carboxilación mediante la siguiente reacción: PIRUVATO + CO2 + ATP ==== OXALOACETATO + ADP + Pi La malato deshidrogenasa intramitocondrial reduce el oxaloacetato a malato: NADH + H+ + OXALOACETATO === NAD+ + MALATO Entonces el malato formado sale de la mitocondria y vuelve a ser oxidado a oxaloacetato por la enzima malato deshidrogenasa extramitocondrial: MALATO + NAD+ ===== OXALOACETATO + NADH + H+ En la última de las reacciones de esta primera etapa, la enzima fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa descarboxila el oxaloacetato para rendir fosfoenolpiruvato y CO 2, a expensas de GTP: OXALOACETATO + GTP ==== FOSFOENOLPIRUVATO + CO2 + GDP La reacción global de esta primera etapa es: PIRUVATO + ATP + GTP == FOSFOENOLPIRUVATO + ADP + GDP + Pi La reacción global es termodinámicamente reversible por su pequeña variación de energía libre estándar que es de ∆Go’ = + 0.5 Kcal/mol. Siempre que la relación ATP/ADP sea elevada y se presente un exceso de piruvato la reacción tenderá hacia la derecha.

Conversión del fosfoenolpiruvato en fructosa-1,6-difosfato. Por medio de las enzimas de la secuencia glucolítica antes indicadas, el fosfoenolpiruvato se transforma en fructosa-1,6-difosfato por inversión de las reacciones:

FOFOENOLPIRUVATO + H2O = 2-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO ====== 3-FOSFOGLICERATO 3-FOSFOGLICERATO + ATP = 1,3-DIFOSFOGLICERATO + ADP 1,3-DIFOSFOGLICERATO + NADH + H+= GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO + NAD+ + Pi GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO ==== DHAP GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO + DHAP == FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO

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Conversión de la fructosa-1,6-difosfato en fructosa-6-fosfato. FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO + H2O == FRUCTOSA-6-FOSFATO + Pi En la gluconeogénesis esta reacción es catalizada por la enzima fructosa-difosfatasa. La penúltima reacción en el proceso de síntesis de la glucosa es la isomerización de la fructosa-6-fosfato en glucosa-6-fosdato por la glucosa-fosfato-isomerasa, misma enzima de la glucólisis. FRUCTOSA-6-FOSFATO === GLUCOSA-6-FOSFATO Al sumar las reacciones de la gluconeogénesis hasta este punto tenemos la ecuación global¨ 2 PIRUVATO + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 2H+ + 6 H2O ----- GLUCOSA-6-FOSFATO + 4 ADP + 2 GDP + 2 NAD+ + 5 Pi Por cada molécula de glucosa-6-fosfato formada se consumen 6 enlaces de alta energía y se requieren dos moléculas de NADH como agente reductor. La glucosa-6-fosfatasa cataliza la última etapa de la gluconeogénesis para la formación de nueva glucosa. Este paso es la tercera reacción irreversible y punto de regulación del proceso: GLUCOSA-6-FOSFATO + H2O ----- GLUCOSA + Pi

Sustratos para la biosíntesis de carbohidratos. Como se puede ver en la figura 3.11, los principales sustratos para la síntesis de nuevos carbohidratos en los organismos heterótrofos son: el piruvato producto de la misma glucólisis y de la degradación oxidativa de algunos aminoácidos glucogénicos, el lactato producido durante la fermentación láctica y de la participación de los intermediarios del ciclo de Krebs. Mientras que en los organismos fotosintéticos, la fuente primaria de carbono para la formación de nueva glucosa es el dióxido de carbono (CO2).

Regulación de la gluconeogénesis. En la figura 3.12 se ilustra la regulación alostérica de las rutas opuestas de la glucólisis y de la gluconeogénesis

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Figura 3.12. Regulación alostérica de la glucólisis y gluconeogénesis.(1) Las flechas descendentes representan a la de degradación. Las flechas ascendentes a la síntesis. Como se puede apreciar existen tres puntos de regulación que coinciden en ambos

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procesos. En la primera etapa de la glucólisis el ATP actúa como un inhibidor potente de esta enzima. En la segunda etapa de regulación de la glucólisis el ATP, NADH y el citrato actúan como inhibidores de la reacción, mientras que el AMP y el ADP actúan como moduladores positivos, es decir, acelerando la reacción. Para la misma reacción en la gluconeogénesis, el AMP es el inhibidor de la reacción mientras que el citratro y el 3-fosfoglicerato actúan como estimuladores o moduladores positivos. Para la tercera reacción de regulación de la glucólisis, del fosfoenolpiruvato al piruvato, nuevamente el ATP, NADH y también la alanina actúan como inhibidores. En el proceso de síntesis, la Acetil-CoA es el modulador positivo. En resumen, se puede decir que el factor más relevante en la regulación de estos dos procesos es el contenido energético representado por la relación ATP/ADP,AMP. A mayor contenido de ATP se estimula la gluconeogénesis i se inhibe la glucólisis. Por el contrario, un bajo contenido de ATP acelera la ruta glucolítica e inhibe la ruta biosintética.

3.5. METABOLISMO DEL GLUCÓGENO. Para que la vida de los mamíferos pueda llevarse a cabo adecuadamente, es necesario un aporte constante de glucosa al torrente sanguíneo. La glucosa es la fuente de energía preferida por el cerebro y por células que carecen de mitocondrias o tienen muy pocas como los eritrocitos maduros. La glucosa es también esencial como fuente de energía para el músculo en actividad física intensa, en donde es el sustrato de la glucólisis en el citoplasma anaerobio. La glucosa sanguínea puede ser obtenida a través de tres fuentes: la dieta, la degradación del glucógeno y la síntesis de novo de la misma (gluconeogénesis). La ingesta de la glucosa y de sus precursores como el almidón, monosacáridos (fructosa)  y disacáridos (lactosa, maltosa y sacarosa), es esporádica y no siempre es un aporte directo de glucosa a la sangre. Por otra parte, la gluconeogénesis puede proveer una síntesis continua de glucosa, pero tiende a ser lenta en la respuesta a la falta de glucosa sanguínea. Este problema se ha resuelto al almacenar grandes cantidades de glucosaque pueden ser movilizadas de manera muy rápida,a partir del glucógeno. La ausencia de glucosa en la dietaprovoca larápida liberación a partir del glucógeno previamente almacenado en el hígado y tejido muscular. De manera similar, el glucógeno almacenado en el músculo es degradado durante el ejercicio. Cuando disminuye la reserva de glucógeno, algunos tejidos sintetizan nueva glucosa utilizando los esqueletos de los aminoácidos de las proteínas como fuente de carbono para hacer glucosa.

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3.5.1. DEGRADACIÓN, BIOSÍNTESIS Y REGULACIÓN. La vía degradativa que moviliza al glucógeno almacenado en el hígado y el músculo esquelético no es la inversa de las reacciones biosintéticas. De hecho, se necesita un juego independiente de enzimas cuando el glucógeno es degradado. El producto primario es la glucosa-1-fosfato que se obtiene por la fractura de los enlaces α(1-4). Cuando el punto de ramificación α(1-6) se rompe se libera glucosa libre directamente. (GLUCOSA)n + HPO4-2= (GLUCOSA)n-1 + GLUCOSA-1-FOSFATO La glucógeno  fosforilasa rompe los enlaces glucosídicos α(1-4) entre los residuos que están en los extremos no reductores por simple fosforólisis. Esta enzima contiene fosfato de piridoxal unido covalentemente como coenzima. La glucógeno fosforilasa es una fosfotransferasa que degrada secuencialmente las cadenas de glucógeno en sus extremos no reductores hasta que están sólo cuatro residuos de glucosa en la ramificación. La estructura se denomina dextrina límite y la fosforilasa no puede degradarla más. La dextrina límite puede ser degradada posteriormente por la enzima glucógenofisforilasa, después que haya actuado una enzima desramificante, la amilo-1,6-glucosidasa que hidroliza los enlaces α(16) en el punto de ramificación, permitiendo así que otro fragmento de la cadena del polímero sea accesible a la acción de la glucógenofosforilasa. La ruta biosintética para la formación de polímeros de almacenaje como el almidón en los vegetales y el glucógeno en los animales parte de la glucosa-6-fosfato la cual, inicia con la conversión en glucosa-1-fosfato por la enzima fosfoglucomutasa: GLUCOSA-6-FOSFATO ====== GLUCOSA-1-FOSFATO Para la conversión de la glucosa-1-fosfato en glucógeno se emplea una enzima diferente a la de su degradación: la glucosa-1-fosfato-uridilil-transferasa, que emplea a la UDPglucosa como donador de glucosilo: GLUCOSA-1-FOSFATO + UTP ====== UDP-GLUCOSA + PPi En la siguiente etapa de síntesis del glucógeno, el grupo glucosilo de la UDP-glucosa es transferido al resto de la glucosa terminal en el extremo no reductor de una cadena de amilosa para formar un enlace glucosídico α(1-4) entre el átomo de carbono 1 del resto glucosídico incorporado y el hidroxilo 4 del resto de la glucosa terminal de la cadena. La enzima que realiza esta adición es la glucógeno-sintetasa. UDP-GLUCOSA + (GLUCOSA)n ----- UDP + (GLUCOSA)n+1 Glucógeno

El cambio de energía libre de esta reacción es de -3.2 Kcal/mol. Por tanto, el equilibrio global favorece en gran medida la síntesis de glucógeno.

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La regulación de la síntesis del glucógeno se da de la siguiente manera. Las enzimas glucógeno sintetasa y glucógeno fosforilasa están sometidas a regulación por modificaciones alostérica y covalente. Se encuentra en dos formas: la forma fosforilada inactiva, pero resulta estimulada por su modulador alostérico glucosa-6-fosfato, y por eso se le denomina forma D o forma dependiente. La enzima se activa por acción de la enzima fosfoproteína-fosfatasa, produciendo la forma defosforilada o activa de la glucógeno sintetasa, la cual no requiere de glucosa-6-fosfato por lo que se le denomina forma I o forma independiente. La misma defosforilación de la glucógeno sintetasa es inhibida por el glucógeno, que actúa como modulador alostérico negativo. La regulación de la síntesis del glucógeno y su utilización está ligada a los mecanismos reguladores de la glucólisis y ciclo de Krebs. Un exceso de glucosa lo cual implica una elevada concentración de glucosa-6-fosfato, que a su vez se refleja en una gran carga energética activa la glucógeno-sintetasa e inactiva la glucógeno-fosforilasa, con lo que se produce un almacenamiento de glucosa en forma de glucógeno en el hígado y en los músculos. Inversamente, a falta de combustibles porque la carga energética es baja o cuando el nivel de glucosa sanguínea es bajo, la glucógeno-fosforilasa resulta estimulada y la glucógeno-sintetasa inhibida. En la figura 3.13 se ilustra el resumen de la regulación alostérica y covalente de la síntesis del glucógeno, así como de su degradación en el hígado y músculo de mamíferos. Se puede apreciar el mecanismo de activación-inactivación de las enzimas glucógeno-fosforilasa y la glucógeno-sintetasa, así como las condiciones de carga energética requeridas para cada caso tanto en el hígado como en el tejido muscular.

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Figura 3.13. Resumen de la regulación alostérica y covalente de la síntesis y degradación del glucógeno en el hígado y en el músculo de los mamíferos.(1)

3.6. CICLO DE CALVIN. En las plantas, el dióxido de carbono entra al interior de las hojas a través de unos poros llamados estomas y se difunde hacia el estroma del cloroplasto, el sitio en el cual se producen las reacciones del ciclo de Calvin, donde se sintetiza el azúcar. Estas reacciones también se llaman reacciones independientes de la luz, porque la luz no las causa directamente. En el ciclo de Calvin, los átomos de carbono se fijan (se incorporan a moléculas orgánicas) y se utilizan para formar azúcares de tres carbonos. Este proceso es estimulado por el ATP y NADPH que provienen de las reacciones luminosas, y depende de ellos. A diferencia de las reacciones dependientes de la luz, que ocurren en la membrana tilacoidal, las reacciones del ciclo de Calvin ocurren en el estroma (espacio interior de los cloroplastos). P á g i n a | 84

Las reacciones del ciclo de Calvin se pueden dividir en tres etapas principales: fijación de carbono, reducción y regeneración de la molécula de partida. Fijación del carbono. Una molécula de CO2 se combina con una molécula aceptora de cinco carbonos, la ribulosa-1,5-difosfato. Este paso produce un compuesto de seis carbonos que se divide para formar dos moléculas de un compuesto de tres carbonos, el 3fosfoglicerato (3-PG). Esta reacción es catalizada por la enzima ribulosadifosfatocarboxilasa.  RIBULOSA-1,5-DIFOSFATO + CO2====== 2 3-FOSFOGLICERATO La primera etapa del ciclo de Calvin incorpora carbono del CO2 en una molécula orgánica, un proceso llamado fijación de carbono. En las plantas, el CO2 de la atmósfera entra en la capa mesófila de las hojas a través de los poros de la superficie de las mismas llamados estomas. Luego, puede difundirse en las células del mesófilo y en el estroma de los cloroplastos, donde ocurre el ciclo de Calvin. En el primer paso del ciclo, la enzima ribulosadifosfato-carboxilasa cataliza la fijación del CO2  a un azúcar de cinco carbonos llamado ribulosa-1,5-difosfato. Sin embargo, la molécula de 6 carbonos resultante es inestable y rápidamente se divide en dos moléculas de un compuesto de tres carbonos llamado 3-fosfoglicerato (3-PG). Así, por cada molécula de CO2  que entra en el ciclo, se producen dos moléculas de 3-PG. Reducción. En la segunda etapa, el ATP y NADPH producidos en la fase luminosa de la fotosíntesis, se utilizan para convertir las moléculas de 3-PG en moléculas de azúcar de tres carbonos, gliceraldehído-3-fosfato (G3P). Esta etapa se llama así, porque NADPH debe donar sus electrones o reducir a un intermediario de tres carbonos para formar el G3P. En primer lugar, cada molécula de 3-PGA recibe un grupo fosfato del ATP y se convierte en 1,3-disfosfoglicerato (y deja al ADP como subproducto). En segundo lugar, las moléculas de 1,3-disfosfoglicerato cada una se reduce recibiendo dos electrones del NADPH y perdiendo uno de sus grupos fosfato para convertirse en un azúcar de tres carbonos llamado gliceraldehído 3-fosfato (G3P). Este paso produce NADP+ y fosfato como subproductos. El ATP y el NADPH utilizados en estos pasos son producto de las reacciones dependientes de la luz (la primera etapa de la fotosíntesis). Es decir, la energía química del ATP y el poder reductor de la NADPH, que se generan con la energía de la luz, mantienen en funcionamiento el ciclo de Calvin. De manera recíproca, el ciclo de Calvin regenera el ADP y el NADP+ lo cual proporciona los substratos necesarios para las reacciones dependientes de la luz. Regeneración. Algunas moléculas de G3P se van para formar glucosa, mientras que otras deben reciclarse para regenerar el aceptor RuDP. La regeneración necesita ATP e implica una compleja serie de reacciones. Para que un G3P salga del ciclo y se dirija a la síntesis de

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glucosa, tres moléculas de CO2 deben entrar en el ciclo, lo que resulta en tres nuevos átomos de carbono fijo. Cuando estas tres moléculas  entran en el ciclo, se producen seis moléculas de G3P. Una sale del ciclo y se utiliza para formar glucosa, mientras que las otras cinco deben reciclarse para regenerar tres moléculas del aceptor RuDP.

3.6.1 OBTENCIÓN DE GLUCOSA. Una parte de la ruta biosintética central que va del piruvato a la glucosa-6-fosfato es también utilizada en la formación de glucosa a partir del CO 2 durante la fotosíntesis. El ATP y el NADPH generados en las reacciones luminosas son utilizados por las células de las plantas para reducir el CO2 y formar glucosa. Los principales productos finales de la fotosíntesis vegetal son el almidón, la celulosa y otros polisacáridos. En la figura 3.14 se resumen las reacciones que conducen a la formación fotosintética de glucosa a partir de CO2 por la vía del ciclo de Calvin. Ahí se indican los compuestos entrantes y salientes del ciclo mediante las flechas respectivas, así como las interacciones que tienen algunos de los intermediarios del ciclo. El 3-fosfoglicerato formado por la ribulosadifosfato-carboxilasa puede convertirse en glucosa-6-fosfato por inversión de las reacciones de la ruta glucolítica ya descritas y de la reacción de la hexosadifosfatasa. Aunque esta secuencia de reacciones muestra cómo uno de los carbonos de la glucosa procede del CO2, no explica el hecho de que los seis átomos de carbono de la hexosa, se incorporen todos finalmente a partir del CO 2 durante la fotosíntesis. Calvin y colaboradores propusieron un mecanismo cíclico para la síntesis de la glucosa.

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Figura 3.14. Formación fotosintética de glucosa a partir del ciclo de Calvin.(7)

3.6.2. REACCIONES Y REGULACIÓN. En la figura 3.14 se ilustra un resumen cíclico de las reacciones propuestas por Calvin y colaboradores. Las reacciones individuales se detallan a continuación. 5

CO2 + 6 RIBULOSA-1,5-DIFOSFATO ----- 12 3-FOSFOGLICERATO

12 3-FOSFOGLICERATO + 12 ATP -- 12 1,3-DIFOSFOGLICERATO + 12 ADP 12 1,3-DIFOSFOGLICERATO + 12 NADPH + 12 H+ --- 12 GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO + 12 NADP+ + 12 Pi 5 GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO = 5 DHAP 3 GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO + 3 DHAP  3-FRUCTOSA-1,6- DIFOSFATO

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3 FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO ==== 3 FRUCTOSA-6-FOSFATO + 3 Pi FRUCTSA-6-FOSFATO ===== GLUCOSA-6-FOSFATO GLUCOSA-6-FOSFATO ====GLUCOSA+ Pi 2 FRUCTOSA-6-FOSFATO + 2 GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO ==== 2 XILULOSA-5-FOSFATO + 2 ERITROSA-4-FOSFATO 2 ERITROSA-4-FOSFATO + 2 DHAP  2 SEPTOHEPTULOSA-1,7-DIFOSFATO 2 SEPTOHEPTULOSA-1,7-DIFOSFATO  2 SEPTOHEPTULOSA- 7FOSFATO + 2 Pi 2 SEPTOHEPTULOSA-7-FOSFATO + 2 GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO  2 RIBOSA-5-FOSFATO + 2 XILULOSA-5-FOSFATO 2 RIBOSA-5-FOSFATO ====== 2 RIBULOSA-5-FOSFATO 4 XILULOSA-5-FOSFATO === 4 RIBULOSA-5-FOSFATO 6 RIBULOSA-5-FOSFATO + 6 ATP === 6 RIBULOSA-1,5-DIFOSFATO + 6 ADP

Una manera de escribir la ecuación global de una vuelta del ciclo de Calvin, expresado en términos de equivalentes de CO2, es la que sigue: RIBULOSA-1,5-DIFOSFATO + CO2 + 3 ATP + 2 NADPH + 2H+ + 2H2O === RIBULOSA-1,5-DIFOSFATO + (CH2O) + 3 Pi + 3 ADP + 2 NADP+ Después de eliminar a la ribulosa-1,5-difosfato que aparece en ambos lados de la ecuación, pues solo se muestra como un componente necesario queda: CO2 + 3 ATP + 2 NADPH + 2H+ + 2H2O ===== (CH2O) + 3 Pi + 3 ADP + 2 NADP+ Sumando las seis reacciones del ciclo de Calvin, resulta la siguiente reacción global: 12 CO2 + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H+ + 12 H2O ==== HEXOSA + 18 Pi + 18 ADP + 12 NAD+ Si por cada molécula de CO2que se introduce al ciclo se requieren 3 ATP, para la síntesis de una hexosa de requieren 18 enlaces de alta energía.

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3.6.3 FOTORRESPIRACIÓN Y CICLO C4. La ruta C4 o de Hatch-Slack para la formación de glucosa. A mediados de la década de los 60, los investigadores D. Hatch y R. Slack descubrieron que existían plantas en donde los primeros productos de la fijación del CO 2 son ácidos dicarboxílicos de cuatro átomos de carbono (oxaloacético, málico y aspártico) y no el 3fosfoglicerato como se estudió en el ciclo de Calvin. A estas plantas se les denominó plantas C4 para diferenciarlas de las primeras a las que se les llamó plantas C3. En las plantas C4, la primera reacción que tiene lugar es la fijación del CO2 por la enzima fosfoenolpirucato-carboxilasa: FOSFOENOLPIRUVATO + CO2 ------- OXALOACETATO + Pi El oxaloacetato formado puede ahora reducirse a malato por la enzima deshidrogenasa NADP-dependiente:

malato-

NADPH + H+ + OXALOACETATO === NADP+ + L-MALATO O convertirse en aspartato por transaminación: OXALOACETATO + GLUTAMATO = ASPARTATO + α-CETOGLUTAMATO Las hojas de las plantas C4 tienen dos tipos de células fotosintéticas, que presentan diferentes organizaciones bioquímica y estructural: las células túnico-vasculares, que rodean las venas, y las céluas mesófilas que están dispuestas libremente alrededor de las primeras. La fijación del CO2 tiene lugar en las células mesófilas. En la figura 3.15 se ilustra la ruta de Hatch-Slack para la fijación de CO 2 en las plantas C4. En algunas plantas C4, el malato formado es transportado a las células túnico-vasculares, donde es descarboxilado por la enzima malato-deshidrogenasa: MALATO `NADP+= PIRUVATO + NADPH + H+ + CO2

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Figura 3.15. Ruta de Hatch-Slack para la fijación de CO2 en las plantas C4. (1) En otras plantas C4 el aspartato formado por transaminación es finalmente descarboxilado en las células túnico-vasculares. Después, el CO2 liberado en estas dos reacciones reacciona con la ribulosa-1,5-difosfato y rinde 3.fosfoglicerato, que es convertido en hexosa por el ciclo de Calvin expuesto anteriormente. El ciclo C4n estas plantas tropicales se denominaruta de Hatch-Slack. El piruvato formado en las células túnico-vasculares retorna a las células mesófilas siendo transformado en fosfoenolpiruvato a expensas de dos enlaces de alta energía, y entonces comenzar un nuevo ciclo.

Fotorrespiración. Estrechamente relacionado con el mecanismo y la regulación de la biosíntesis de hexosa en las plantas fotosintéticas se halla en fenómeno de la fotorrespiración. Las células de las plantas verdes contienen mitocondrias, además de cloroplastos; tales células exhiben una respiración mitocondrial y una fosforilación oxidativa en la oscuridad, a expensas de los sustratos producidos por la fotosíntesis durante períodos previos de iluminación. Mediciones con oxígeno isotópico muestran que la mayoría de las plantas respiran realmente bajo la acción de la luz al mismo tiempo que efectúan la fotosíntesis. Sin embargo, el tipo de respiración que tiene efecto a la luz no es mitocondrial, puesto que no

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es sensible a los inhibidores característicos de tal proceso. Esta respiración bajo la luz que se denomina fotorrespiración desvía el poder reductor fotoinducido de la biosíntesis de la glucosa hacia la reducción del oxígeno. Además, la fotorrespiración no va acompañada de la fosforilación oxidativa e ADP, siendo por tanto una malversación del poder reductor, rico en energía, generado por las reacciones luminosas. La fotorrespiración es muy activa en las plantas C3, de las zonas templadas, pero casi o completamente ausente en la mayoría de las plantas C4 de origen tropical. Es por eso que las plantas C 4 crecen a una velocidad mayor que las plantas C3. En condiciones atmosféricas normales, el ritmo neto de la fotosíntesis en las plantas C3 es muy inferior al máximo, pues se halla limitado por la relativamente alta concentración de oxígeno en el aire y la baja concentración de CO 2. Las Plantas C4 que muestran muy poca o ninguna fotorrespiración, son considerablemente más eficientes porque pueden llevar a cabo la fotosíntesis a concentraciones mucho más bajas de CO2 ya más elevadas tensiones de oxígeno.

3.7 VÍA SE LAS PENTOSAS FOSFATO. La vía de la pentosa fosfato (siglas en Inglés: PPP), es principalmente una vía anabólica que utiliza 6 carbonos de glucosa para generar azúcares de 5 carbonos y equivalentes reducidos. Sin embargo, esta vía sí oxida la glucosa y bajo ciertas condiciones puede oxidar a la glucosa completamente a CO2 y agua. La vía de las pentosas fosfato es una ruta multifuncional especializada para efectuar cuatro actividades principales, en dependencia con el organismo y su estado metabólico. Las cuatro funciones más importantes de esta vía metabólica son: 1. Generar equivalentes reducidos, en la forma de NADPH, para reacciones de biosíntesis de reducción en las células. 2. Convertir hexosas en pentosas, particularmente, en ribosa-5-fosfato, necesaria 3. Degradar las pentosas provenientes de la dieta o de los ácidos nucleicos mediante la conversión en hexosas, las cuales pueden ingresar a la secuencia glucolítica. 4. Una versión modificada de la ruta participa en la formación de la glucosa a partir del CO2, en las reacciones oscuras de la fotosíntesis.

3.7.1. BALANCE ENERGÉTICO. La primera reacción de la ruta es la deshidrogenación enzimática de la glucosa-6-fosfato para formar 6-fosfogluconato por la glucosa-6-fofato deshidrogenasa: GLUCOSA-6-FOSFATO + NADP+6-FOSFOGLUCONOLACTON + NADPH + H+ P á g i n a | 91

En la siguiente reacción, la lactonasa hidroliza la 6-fosfogluconolactona: 6-FOSFOGLUCONOLACTONA + H2O ---- 6-FOSFOGLUCONATO En la siguiente etapa, el 6-fosfogluconato experimenta oxidación y descarboxilación por acción de la 6-fosfogluconato-deshidrogenasa dependiente del Mg+2 para formar ribulosa5-fosfato, reacción que produce una segunda molécula de NADPH: 6-FOSFOGLUCONATO + NADP+ = RIBULOSA-5-FOSFATO + NADPH + H+ + CO2 Finalmente, la ribosa-fosfato-isomerasa convierte reversiblemente la ribulosa-5-fosfato en ribisa-5-fosfato: RIBULOSA-5-FOSFATO ===== RIBOSA-5-FOSFATO Bajo ciertas condiciones metabólicas, con esta reacción concluye la ruta del fosfogluconato dando como balance final: GLUCOSA-6-FOSFATO + 2 NADP+ + H2O == RIBOSA-5-FOSFATO + CO2 + 2 NADPH + 2H+ En otras circunstancias, la via de las pentosas fosfato puede proseguir, ya que las pentosas5-fosfato pueden experimentar otras transformaciones por acción de las enzimas: ribulosafosfato-3-epimerasa, transcetolasa y la transaldolasa. La ruta de las pentosas fosfato puede servir también para efectuar la oxidación completa de la glucosa-6-fosfato a CO2, con reducción simultánea del NADP+ A NADPH. El balance global para este proceso es el siguiente: 5

GLUCOSA-6-FOSFATO + 12 NADP+ + 7 H2O  5 GLUCOSA-6-FOSFATO +

6 CO2 + 12 NADPH + 12H+ + Pi Anulando la glucosa-6-fosfato de ambos lados: GLUCOSA-6-FOSFATO + 12 NADP+ + 7 H2O  6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + Pi

3.7.2. REGULACIÓN. La vía de las pentosas fosfato está determinada, en gran medida, por las necesidades relativas de la célula de NADPH y en ribosa-5-fosfato. Si las necesidades de NADPH son superiores a las de ribosa-5-fosfato, el fosfato de pentosa sobrante puede convertirse de

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nuevo en fosfato de hexosa. Si predominan las necesidades de ribosa-5-fosfato el flujo procederá, a través de las reacciones de la transcetolasa y la transaldolasa desde la fructosa6-fosfato hasta la producción de fosfatos de pentosa.

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UNIDAD IV. METABOLISMO DE LÍPIDOS.

4.1 GENERALIDADES DE LÍPIDOS. Los lípidos son un grupo de biomoléculas orgánicas que tienen en común que son insolubles en agua y soluciones acuosas y solubles en disolventes orgánicos no polares como el éter, cloroformo, benceno, tetracloruro de carbono, hexano, entre otros. Es un grupo muy heterogéneo de sustancias que se clasifican de diversas maneras, pero las propiedades distintivas de todos ellos derivan de la naturaleza hidrocarbonada de la porción principal de su estructura. Tienen diferentes orígenes, estructuras y diversas funciones biológicas importantes desde el punto de vista de la bioquímica cómo: a) componentes estructurales de las membranas celulares, b) formas de transporte y almacenamiento de energía química, c) cubierta protectora de la superficie de muchos organismos, d) componentes de la superficie celular relacionados con el reconocimiento de las células, la especificidad de la especie y la inmunidad de los tejidos. Algunas otras sustancias clasificadas como lípidos tienen una intensa actividad reguladora del metabolismo como las vitaminas liposolubles y cierto tipo de hormonas. Aunque los lípidos constituyen una clase bien definida de biomoléculas, con frecuencia se encuentran formando complejos híbridos mediante enlaces covalentes con otras clases de moléculas orgánicas e inorgánicas formando glicolípidos, fosfolípidos, lipoproteínas o esfingolípidos. Clasificación de lípidos. Los lípidos se pueden clasificar de varias maneras: por su origen, estructura, función biológica, reacción alcalina o desde el punto de vista alimenticio. La manera más utilizada en bioquímica es aquella que los clasifica por su estructura química. Así tenemos: a) Lípidos simples: son aquellos ésteres de ácidos grasos con alcoholes. - Acilglicéridos: ésteres de ácidos grasos con el glicerol (grasas y aceites) - Ceras: ésteres de ácidos grasos con alcoholes monohidroxilados de cadena larga. b) Lípidos complejos: son aquellos acilglicéridos a los cuales se les ha sustituido un ácido graso por un alcohol, un grupo amino, un glúcido, un grupo fosfato o una esfingosina: fosfoglicéridos, glicolípidos, esfingolípidos, cerebrósidos.

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c) Lípidos asociados: sustancias con diversas estructuras y funciones biológicas: ácidos grasos, hormonas, esteroides, esteroles, hidrocarburos, pigmentos vegetales y vitaminas liposolubles.

Los dos primeros grupos son llamados también saponificables debido a que en su estructura presentan ácidos grasos esterificados que, al hidrolizarse en condiciones alcalinas, forman jabón. El tercer grupo, los lípidos asociados excepto los ácidos grasos, son llamados lípidos insaponificables, debido a que no forman jabón. Un grupo de lípidos muy importante a considerar en primer lugar son los ácidos grasos. Estos forman parte de las estructuras de las grasas y aceites, principal reserva energética de plantas y animales. Las propiedades físicas y químicas de los ácidos grasos determinan a su vez, las propiedades y características de las grasas y aceites. Los ácidos grasos son ácidos monocarboxílicos que, esterificados con el glicerol, forman triacilglicéridos, las grasas y aceites. Aunque existen decenas de ácidos monocarboxílicos, sólo un pequeño grupo puede formar los triacilglicéidos De ahí el nombre de ácidos grasos. En la tabla 4.1 se encuentran algunos de los principales ácidos grasos encontrados en la naturaleza. Aunque se han aislado más de 100 diferentes tipos de ácidos grasos de diferentes tejidos animales y vegetales y en microorganismos, muy pocos se encuentran en forma libre, esto puede deberse a que, de esta manera, son altamente reactivos y tóxicos. Por lo regular, se les encuentra esterificados con algún alcohol, de los cuales, el glicerol es el más importante. Su cadena hidrocarbonada puede ser saturada o insaturada. Por esta razón a los ácidos grasos se les clasifica como: saturados, que no presentan dobles ligaduras, monoinsaturados, aquellos que presentan una doble ligadura en su estructura y, poliinsaturados, que son aquellos que presentan dos o más dobles ligaduras, La mayoría de los ácidos grasos encontrados en la naturaleza tienen número par de átomos de carbono. Esto se debe a que su síntesis y su degradación se da por adición o eliminación de un par de átomos de carbono en forma de acetil-CoA, siendo ésta la molécula iniciadora o final. Muy pocos los hay con número non de átomos de carbono, pero esto no quiere decir que no los haya.

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Tabla No. 4.1. Principales ácidos grasos encontrados en la naturaleza. (3) Símbolo

Estructura

Nombre

P. de F. oC

Saturados 12:0 14:0 16:0 18:0 20:0 24:0

CH3(CH2)10COOH CH3(CH2)12COOH CH3(CH2)14COOH CH3(CH2)16COOH CH3(CH2)18COOH CH3(CH2)22COOH

Láurico 44.2 Mirístico Palmítico 63.1 Esteárico Araquídico Lignocérico

53.9 69.6 76.5 86.0

Monoinsaturados 16:1∆9 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH Palmiatoleico 18:1∆9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH Oleico 9 18:1∆ CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH (trans) Elaídico

-0.5 13.4 45.0

Poliinsaturados 18:2∆9,12CH3(CH2)4CH=CH-CH2-CH=CH(CH2)7COOH Linoleico -5.0 18:3∆9,12,15 CH3CH2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH=CH-(CH2)7COOH Linolénico -11.0 20:4∆5,8,11,14 CH3(CH2)4(CH=CH-CH2)3CH=CH(CH2)3COOH Araquidónico -49.5 ________________________________________________________________________________

De los ácidos grasos insaturados mencionados en la tabla 4.1, todos ellos tienen la configuración cis- en sus dobles enlaces, excepto el ácido elaídico, el cual tiene su configuración trans-. Es importante mencionar que los tres ácidos grasos poliinsaturados, linoleico, linolénico y araquidónico, también llamados polienoicos, son considerados ácidos grasos esenciales, debido a que el organismo humano no los puede sintetizar y tienen que consumirse en los alimentos ya que son precursores de otras biomoléculas importante para el metabolismo como las prostaglandinas. Las propiedades físicas de los ácidos grasos determinan las propiedades fisicoquímicas de los ésteres que los conforman como las grasas y aceites. Cómo se puede observar en la tabla 4.1, en el caso de los ácidos grasos saturados, el punto de fusión es directamente proporcional al número de átomos de carbono de la molécula: a mayor número mayor es su punto de fusión. Por tanto, los ácidos grasos saturados mayores de 12 átomos de carbono son sólidos a temperatura ambiente (25oC). Otro factor que afecta el punto de fusión de los ácidos grasos son las insaturaciones o dobles enlaces. Las dobles ligaduras disminuyen drásticamente el punto de fusión de los ácidos grasos del mismo número de átomos de

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carbono. Por otra parte, el punto de fusión de los ácidos grasos insaturados es inversamente proporcional al número de dobles enlaces: a mayor número de dobles ligaduras el punto de fusión será menor. Aunque el ácido elaídico no es un ácido común encontrado en la naturaleza, este se puede formar en cantidades importantes en la hidrogenación de los aceites vegetales y manufactura de grasas saturadas hidrogenadas empleadas en la elaboración de aderezos y de la margarina. Los ácidos grasos de configuración trans- son mucho más difíciles de digerir y absorber en el tracto digestivo que los de configuración cis-, de ahí que no sea saludable su presencia en los alimentos. Es importante mencionar que, los ácidos monocarboxílicos saturados 4C butírico, 6C caproico, 8C capríico y 10C cáprico no se consideran lípidos porque en forma libre muestran un cierto grado de solubilidad en agua. Sin embargo, debido a que forman parte importante de algunas grasas y aceites, muchas veces también se les considera como ácidos grasos. Por ejemplo, el ácido butírico de 4 átomos de carbono en forma libre es muy soluble en agua, pero es parte importante de la estructura de la grasa de la leche, razón por la cual a esta grasa se le denomina grasa butírica. En la actualidad ha cobrado importancia el consumo de ácidos grasos insaturados llamados omega 3, 6 y 9. Por un lado, son más fáciles de digerir y absorber en el tracto digestivo y, por otro lado, ayudan a disminuir el efecto de las grasas saturadas y del colesterol. Para nombrarlos se toma en cuenta el número de átomos de carbono que hay entre el último doble enlace y el carbono final, es decir, el carbono metílico. Así, el ácido oleico es omega 9, los ácidos linoleico y araquidónico son omega 6 y, el más importante de todos el ácido linolénico es omega 3.

C18

C15

C12 C9 C1

CH3CH2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH=CH-(CH2)7COOH 18:3∆9,12,15Ácido linolénico (omega 3)

Triacilglicéridos. Otro grupo muy importante de lípidos son los Acilglicéridos: mono, di y triacilglicéridos. Son ésteres de ácidos grasos con el glicerol. En la figura 4.2 se muestra la estructura del triacilglicérido: 1-estearil, 2-linoleil, 3-palmitilglicerol.

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Figura 4.1. Estructura del triacilglicérido: 1-estearil, 2-linoleil, 3-palmitilglicerol.(1)

Los triacilglicéridos pueden tener esterificados 2 ácidos grasos saturados y uno insaturado como el de la figura 4.2, o dos insaturados y uno saturado. Rara vez se pueden encontrar en la naturales triacilglicéridos con tres ácidos grasos saturados o tres insaturados. Debido a que los ácidos grasos saturados tienen puntos de fusión por arriba de la temperatura ambiente, cuando estos se encuentran en mayor proporción en el triacilglicérido se denominan grasas. Por esta razón las grasas son sólidas a temperatura ambiente y, por lo regular, son de origen animal. Cuando la mayor proporción son de ácidos grasos insaturados se denominan aceites. Debido a que los ácidos grasos insaturados

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tienen puntos de fusión muy por debajo de la temperatura ambiente, los aceites son líquidos y por lo regular son te origen vegetal. Las grasas y aceites son la reserva energética de la mayoría de los organismos en este planeta. En los animales superiores, la grasa se deposita y almacena en el tejido adiposo, el cual tiene varias funciones vitales para el organismo. Además de almacenar la energía química disponible (9 Kcal/g), es un aislante efectivo contra los cambios bruscos de temperatura ambiente y actúa también cómo un eficiente amortiguador que protege los diferentes órganos de cualquier golpe o caída que pudiera afectarlos.

4.2. OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS. Los ácidos grasos son los combustibles orgánicos con mayor contenido energético que pueden almacenarse en grandes cantidades en forma de triacilglicéridos en las células. Liberan poco más de 9 Kcal/g, a diferencia de los carbohidratos y las proteínas, que sólo producen 4 Kcal/g durante su oxidación. Bajo una dieta balanceada, los ácidos grasos cubren hasta un 40% de las necesidades energéticas del ser humano, y, en ayuno prolongado o bajo invernación, constituyen la única fuente de energía. Los ácidos grasos libres proceden de las grasas de la dieta o del tejido adiposo que han sido hidrolizadas por acción de las lipasas controladas hormonalmente. Posteriormente, se unen a la seroalbúmina que los transporta a otros tejidos a través de la sangre dónde son oxidados. Primeramente, son liberados en el citoplasma celular en dónde son enzimáticamente para después penetrar al interior de la mitocondria para su total oxidación. Los ácidos grasos se oxidan hasta CO2 y H2O en casi todos los tejidos excepto en el cerebro. El músculo cardíaco obtiene la mayor cantidad de energía de la oxidación de los ácidos grasos. 4.2.1. EXPERIMENTOS PRELIMINARES. A finales del siglo XIX se sospechaba que la oxidación y la síntesis de los ácidos grasos se realizaban en las células por sustracción o adición de unidades de dos átomos de carbono puesto que, como se mencionó anteriormente, la mayoría de los ácidos grasos conocidos naturales tienen número par de átomos de carbono. Según los experimentos realizados por el bioquímico alemán F. Knoop en 1904, en conejos de laboratorio a los que se les administraba un ácido graso con número par de átomos de carbono marcado con un grupo fenilo en el carbono metilo terminal, se producía excreción en la orina de ácido fenilacético, independientemente de la longitud de la cadena del ácido graso administrado. Por otra parte, al administrarse derivados ὠ-fenílicos de ácidos grasos con número impar de átomos de carbono, se excretaba ácido benzoico. Estos resultados dan a entender que los ácidos grasos ὠ-fenílicos se degradan por eliminación oxidativa de fragmentos sucesivos de dos átomos de carbono a partir del extremo carboxílico. Debido a estos resultados, Knoop

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postuló que los ácidos grasos se degradan por β-oxidación. Es decir, que se oxidan en el átomo de carbono β, para dar un β-cetoácido el cual se hidroliza para dar ácido acético y un ácido graso con dos átomos de carbono menos. En 1943, L. F. Leloir y J. M. Muñoz consiguieron demostrar que la oxidación de los ácidos grasos tenía lugar en un lugar exento de células. Tiempo después, A.L. Lehninger demostró que se requería ATP para la oxidación de los ácidos grasos. En 1948, E.P. Kennedy y Lehninger demostraron que la oxidación de los ácidos grasos tiene lugar exclusivamente en las mitocondrias. Posteriormente F. Lynen y colaboradores descubrieron que la activación dependiente del ATP de los ácidos grasos implica la esterificación con el grupo tiol de la Coenzima A, para rendir un derivado acil-CoA, el cual se mantiene en todas las etapas subsiguientes de la oxidación. 4.2.2. ACTIVACIÓN Y TRANSPORTE EN MITOCONDRIA. La activación y transporte de los ácidos grasos al interior de la mitocondria consta de cuatro etapas: 1) la esterificación enzimática del ácido graso libre con la CoA-SH extramitocondrial impulsada por el ATP para dar el correspondiente acil-CoA graso, 2) la transferencia del radical acilo del acil-CoA graso a la molécula transportadora carnitina (figura 4.2), 3) transporte del complejo acil-carnitina al interior de la mitocondria a través de la membrana mitocondrial y, 4) la transferencia del radical acilo del complejo acilcarnitina a la CoA-SH intramitocondrial. A continuación las reacciones antes descritas: 1.-

RCOOH + ATP + CoA-SH ========= RCOO-S-CoA + AMP + PPi

Ácido grasoEnzima: Acil-CoA-sintetasaAcil-CoA graso

2.-

RCOO-S-CoA + Carnitina

Acil-CoA graso

========= ROO-O-Carnitina + CoA-SH

Enzima carnitin-acil.transferasa Acil-O-Carnitina

3.-

Paso del Acil-O-Carnitina al interior de la mitocondria.

4.-

ROO-O-Carnitina + CoA-SH======== RCOO-S-CoA + Carnitina Acil-O-Carnitina

Enzima carnitin-acil.transferasaAcil-CoA graso (activado)

Para obtener el balance global de todas las reacciones de la activación del ácido graso es necesario realizar la hidrólisis del grupo pirofosfato producto de la primera reacción: PPi + H2O ====== 2 Pi

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AMP + H2O ====== 2 ADP Ahora sí, incluyendo estas dos últimas reacciones en el balance global tenemos: ROOH + CoA-SH + 2 ATP + H2O ========== ROO-S-CoA + 2 ADP + 2 Pi Esta reacción es el balance global de la activación y transporte del ácido graso del citoplasma celular al interior de la mitocondria. Solo se realiza una vez para la oxidación completa del ácido graso.

FIGURA 4.2. Estructura química de la carnitina.(2)

4.2.3. LA VÍA DE LA BETA-OXIDACIÓN. Una vez activado el ácido graso ya en el interior de la mitocondria, todas las subsiguientes reacciones se realizan en el compartimiento interno de la matriz mitocondrial. La betaoxidación consiste en cuatro etapas para cada ciclo de oxidación en dónde es liberado un fragmento de dos átomos de carbono en forma de acetil-S-CoA. Este ciclo se repite hasta agotar los átomos de carbono correspondientes a la longitud de la cadena del ácido graso. En la figura 4.3 se resumen las reacciones con estructuras y enzimas de un ciclo de betaoxidación para el ácido palmítico. Al final de la oxidación completa se realiza la suma de todas las reacciones, tanto de reactantes como productos de todos los ciclos para obtener el balance global. A continuación se describirán las cuatro reacciones de un ciclo de betaoxidación.

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Figura 4.3. Las cuatro reacciones de un ciclo de la beta-oxidación.(1)

1.- Primera etapa de deshidrogenación. R-CH2-CH2-CO-S-CoA + FAD Acil-S-CoA

========== R-CH=CH-CO-S-CoA + FADH2

Enzima: Acil-CoA-deshidrogenas

∆2-trans-enoil-CoA

2.- Etapa de hidratación. R-CH=CH-CO-S-CoA + H2O ∆2-trans-enoil-CoA

=========R-CHOH-CH2-CO-S-CoA

Enzima: enoil-coenzimaA-hidratasa

D-3-hidroxi-acil.CoA

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3.- Segunda etapa de deshidrogenación. R-CHOH-CH2-CO-S-CoA + NAD+ ==== R-CO-CH2-CO-S-CoA + NADH + H+ D-3-hidroxi-acil-CoA

Enzima: 3-hidroxiacil.CoA-deshidrogenasa 3-cetoacil-CoA

4.- Etapa de rompimiento. R-CO-CH2-CO-S-CoA + CoA-SH =======R-CO-SCoA + CH3-CO-S-CoA 3-cetoacil-CoA

Enzima: acetli-CoA-acetiltransferasa Acil-S-CoA

Acetil-S-CoA

4.2.4. OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS. Oxidación de ácidos grasos saturados. Balance global de un ciclo de oxidación para el Estearil-S-CoA: Estearil-S-CoA + FAD + H2O + NAD+ + CoA-SH===== Palmitil-S-CoA + FADH2 + NADH + H+ + Acetil-S-CoA Ahora podemos escribir la ecuación global para los ocho ciclos de la oxidación necesarios para convertir una molécula de Estearil-S-CoA, que tiene 18 átomos de carbono, en nueve moléculas de acetil-S-CoA: Estearil-S-CoA + 8 FAD + 8 H2O + 8 NAD+ + 8 CoA-SH ======== 9Acetil-S-CoA + 8 FADH2 + 8 NADH + 8H+ Podemos concluir que el número de ciclos de beta-oxidación que se requiere para la oxidación completa de un ácido graso saturado es igual a: el número de carbonos del ácido graso dividido entre dos y, al resultado, restarle 1. No. de ciclos = (No. C/2)-1 Para el número de moléculas de acetil-S-CoA que produce un ácido graso saturado de número par de átomos de carbono es igual a: el número de átomos de carbono del ácido graso dividido entre dos. No. de moléculas de acetil-S-CoA = No. de C/2

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Cada molécula de acetil-S-CoA que se produce en cada ciclo de oxidación puede ser oxidada de manera completa por ciclo de Krebs y sus electrones liberados pasar después a la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular para liberar su energía y producir ATP mediante la fosforilación oxidativa, misma que se verá en detalle más adelante. Cada molécula de acetil-S-CoA que sigue esta ruta de degradación produce 12 ATP. Por otra parte, cada par de electrones que se produce en cada ciclo de oxidación en forma de FADH2 que es transportado por la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular produce dos ATP, mientras que los que se ingresan cómo NADH * H+ producen tres ATP. Al acoplar estos procesos a la reacción global de la beta-oxidación del Estearil-S-CoA, tenemos: Estearil-S-CoA + 26 O2 * 148 ADP + 148 Pi === 18 CO2 + 148 ATP + 166 H2O Al acoplar la reacción global de la activación del ácido esteárico tenemos: Ác. Esteárico + 26 O2 + 146 ADP + 146 Pi === 18 CO2 + 146 ATP + 164 H2O

Oxidación de grasos insaturados. Los ácidos grasos insaturados se oxidan por la misma ruta general de los ácidos grasos saturados, pero con dos cambios importantes. La configuración de los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados encontrados en la naturaleza es cis-, mientras que los intermediarios acíicos ∆2-insaturados del CoA de la oxidación de los ácidos grasos saturados tienen configuración trans-. Por otro lado, La degradación sucesiva por oxidación de los ácidos grasos insaturados produce derivados acílicos grasos ∆ 3-insaturados del CoA, en lugar de los acilos grasos insaturados ∆2- del CoA , que funcionan como intermediarios nnormales de la oxidación de los ácidos grasos saturados. Estos dos problemas quedan resueltos por la participación de dos enzimas exclusivas para la degradación de los ácidos grasos insaturados: la primera,enoil.CoA-isomerasa, que cataliza el desplazamiento reversible del doble enlace de la configuración ∆3-cis a la ∆2trans. Así, el acil-graso resultante es el sustrato normal de la siguiente enzima en la secuencia de oxidación, la enoil-CoA-hidratasa. La oxidación completa del ácido graso insaturado produce las unidades de acetil-S-CoA correspondientes a su estructura. Los ácidos grasos poliinsaturados necesitan de una segunda enzima auxiliar para completar su oxidación, ya que contienen dos o más dobles enlaces en posición cis-. Con la intervención de la enzima enoil-CoA-hidratasa se resuelven las primeras etapas de la oxidación pero, el último doble enlace que tiene configuración cis-, produciría el isómero D- del 3-hidroxiacil-CoA y no el L-estereoisómero que se forma normalmente en la P á g i n a | 104

oxidación de los ácidos grasos saturados. Una segunda enzima auxiliar, la 3-hidroxiacilCoA-epimerasa que cataliza la epimerización de la posición D- a la L- del carbono 3 del acil graso resuelve este problema. El producto de esta reacción reversible es oxidado después por la 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, específica del isómero L- completando el ciclo con el rompimiento del productopor la tiolasa. Con la participación de estas dos enzimas auxiliares del ciclo de oxidación del ácido graso hacen posible la oxidación completa de todos los ácidos grasos insaturados, mono y poliinsaturados, corrientes encontrados en los lípidos que existen en la naturaleza. Por cada doble enlace que tiene el ácido graso insaturado se producen dos moléculas de ATP menos que los correspondientes saturados, debido a que la primera etapa de deshidrogenación realizada por el FAD no se lleva a cabo en el ciclo de beta-oxidación.

4.2.5. OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS IMPARES. Los ácidos grasos con número impar de átomos de carbono son muy escasos en la naturaleza, pero se presentan en algunos organismos marinos. Estos también pueden ser oxidados por el ciclo de beta-oxidación anteriormente descrito. Se van separando fragmentos de acetil-CoA hasta llegar al propionil-CoA terminal, de tres átomos de carbono. El propionol-CoA experimenta la carboxilación enzimática en un proceso dependiente del ATP, formando Ds-metilmalonil-CoA, reacción que es catalizada por la enzima propionil-CoA-carboxilasa. Este último compuesto sufre una serie de transformaciones catalizadas por las enzimas: metil-malonil-CoA-racemasa y metilmalonil-CoA-mutasa convirtiéndose en succinil-CoA, que sufre desacilación por inversión de la reacción de la succinil-CoA-sintetasa, para rendir succinato libre, uno de los intermediarios de Krebs.

4.2.6. REGULACIÓN DE LA OXIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS. Uno de los factores más importantes en la regulación de los procesos catabólicos, dentro de los cuales está la oxidación de los ácidos grasos, es el nivel energético del organismo, el cual se mide por la carga de adenilato. La carga de adenilato nos indica la cantidad de enlaces de alta energía en forma de ATP que tiene un organismo y sa calcula con la siguiente reacción: C.A. = ½ ( [ADP] + 2[ATP]/ [AMP] +[ADP] +[ATP]) Cuando la carga de adenilato es menor a 0.8, quiere decir que el nivel energético de la célula es bajo y, por tanto, se activan todos los procesos catabólicos productores de energía. Por el contrario, cuando la carga de adenilato es mayor de 0.8, el nivel energético de la

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célula es alto, es decir, contiene una alta concentración de enlaces de alta energía en forma de ATP por lo que los procesos catabólicos productores de energía se ven inhibidos.. Al igual que sucede en la glucólisis, lo mismo pasa con la oxidación de los ácidos grasos. Altas concentraciones de [ATP] inhiben las enzimas alostéricas que participan en los puntos de regulación de la β-oxidación. Por el contrario, altas concentraciones de [ADP] y [AMP] aceleran la actividad de estas enzimas con el fin de producir energía química necesaria para las actividades vitales del organismo. Otro factor importante en la regulación de la oxidación de los ácidos grasos es la presencia de cierto tipo de hormonas que participa en la regulación de la actividad de las lipasas. Desde luego que, la síntesis y la liberación de estas hormonas depende, en gran medida, de las necesidades energéticas del organismo. Altas concentraciones de acetil-CoA y citrato también inhiben a oxidación de ácidos grasos. Su presencia indica que existe suficiente sustrato para la oxidación vía ciclo de Krebs para la para la producción de energía por medio de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa.

4.2.7. BETA-OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN PEROXISOMAS. Las mitocondrias no son los únicos orgánulos en los que puede tener lugar la oxidación de los ácidos grasos. Los peroxisomas animales (de hígado, riñón y otros tejidos) y vegetales y los glioxisomas de las semillas en germinación (que, en realidad, son peroxisomas especializados) son otras localizaciones posibles de la β-oxidación. A diferencia de las enzimas de la β-oxidación mitocondrial, las enzimas correspondientes de peroxisomas y glioxisomas forman un complejo multienzimáticoen el que, además, la enoil-CoAhidratasa y la hidroxiacil-CoA deshidrogenasa constituyen una enzima bifuncional. La oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (por encima de 20-22 carbonos), ramificados o ácidos dicarboxílicos, tiene lugar en los peroxisomas. En estos orgánulos, el proceso oxidativo de los ácidos grasos no va encaminado a producir energía debido a que carecen de cadena de transporte electrónico. La activación de los ácidos grasos para su oxidación peroxisomal tiene lugar en el propio peroxisoma. Luego, el proceso de oxidación es similar al de la β-oxidación mitocondríal con la salvedad de que la primera oxidación no tiene al FAD como aceptor de electrones sino directamente al oxígeno, por lo que genera H2O2en lugar de FADH2 y la energía (ATP) que derivaría de la cesión posterior de electrones del FADH2 a la cadena de transporte electrónico se disipa en forma de calor. Como la tiolasa peroxisomal no es activa con

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ácidos grasos de menos de ocho carbonos, los ácidos grasos acortados en el peroxisoma continuarán su oxidación en la mitocondria.

Figura 4.4. Diagrama de la oxidación de los ácidos grasos en los peroxisomas.(13)

El peróxido de hidrógeno (H2O2) generado es un oxidante fuerte y potencialmente dañino por lo que la célula lo elimina mediante la catalasa: H2O2 → H2O + ½O2  El acetil-CoA se exporta al citosol; desde ahí puede entrar a la mitocondria para ser oxidado. Los ácidos grasos acortados en su longitud mediante la oxidación peroxisomal se pueden conjugar con carnitina para pasar del peroxisoma a la mitocondria y continuar ahí con la β-oxidación. La acumulación de ácidos grasos de cadena larga en los peroxisomas por fallos en la β-oxidación peroxisomal es el origen de la adrenoleucodistrofia. En las semillas de plantas en germinación, se produce una ruta especial para la oxidación del ácido graso llamada ὠ-oxidación, en la que el carbono carboxílico del ácido graso se pierde en forma de CO2 , y el átomo de carbono α se oxida a grupo aldehído a expensas del peróxido de hidrógeno. Esta reacción es catalizada por la peroxidasa del ácido graso. El peróxido de hidrógeno necesario es aportado gracias a la oxidación directa de las

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flavoproteínas reducidas por el oxígeno molecular. El aldehído graso formado es oxidado al correspondiente ácido carboxílico. Cómo la peroxidasa del ácido graso actúa solamente sobre los ácidos grasos con más de 12 carbonos, esta ruta no puede conducir a la oxidación completa de los ácidos grasos con más de 18 átomos de carbono. Los aldehídos producidos por la α-oxidación pueden experimentar alternativamente una reducción para dar alcoholes grasos de cadena larga , que se producen en grandes cantidades en las ceras vegetales.

4.2.8. CUERPOS CETÓNICOS. El hígado de muchos vertebrados posee la capacidad enzimática de desviar parte de la acetil-S-CoA procedente de la β-oxidación o del piruvato hacia la producción de acetoacetato libre y de D-β-hidroxibutirato, los cuales son transportados por la sangre a los tejidos periféricos, donde pueden ser oxidados por medio del ciclo de Krebs. Estos compuestos, junto con la acetona, reciben colectivamente el nombre de cuerpos cetónicos. El acetoacetato libre se forma a partir del acetoacetil-S-CoA; cierta cantidad de este procede de los cuatro últimos átomos de carbono de un ácido graso de cadena larga después de la eliminación oxidativa de sucesivos restos de acetil-S-CoA en la matriz mitocondrial. Sin embargo, la mayor parte del acetoacetil-S-CoA formado en el hígado procede de la condensación cabeza-cola de dos moléculas de acetil-S-CoA derevadas de la oxidación del ácido graso por acción de la acetil-S-CoA acetil transferasa: Acetil-S-CoA + acetil-S-CoA ======== acetoacetil–S-CoA + CoA-SH El acetoacetil-S-CoA formado en esta reacción sufre después la pérdida de la CoA-SH por medio de la desacilación para dar acetoacetato libre en la matriz mitocondrial: Acetoacetil-S-CoA + H2O ======= acetoacetato + CoA-SH

Normalmente, la concentración de cuerpos cetónicos en la sangre es muy baja, pero, en el ayuno o en la enfermedad de la diabetes mellitus, puede alcanzar niveles muy altos. Este estado, conocido cómo cetosis, aparece cuando la velocidad de formación de los cuerpos cetónicos en el hígado, rebasa la capacidad de los tejidos periféricos para utilizarlos, provocando su acumulación en la sangre. Normalmente, el cerebro, emplea exclusivamente glucosa cómo combustible; sin embargo, en períodos de ayuno prolongado, cuando la glucosa está limitada, el cerebro puede utilizar el β-hidroxibutirato producido a partir de los ácidos grasos en el hígado cómo combustible de oxidación principal. Acetoacetato * NADH + H+ ===== D- β-hidroxibutirato + NAD+

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4.3 BIOSÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS. .La biosíntesis de lípidos constituye un importante suceso metabólico en la mayoría de los organismos. Debido a la capacidad limitada de los animales superiores para almacenar polisacáridos, la glucosa de la dieta ingerida en exceso para las necesidades energéticas inmediatas y para su capacidad de almacenaje, se convierte por medio de la glucólisis en piruvato, y después en acetil-S-CoA, a partir del cual se sintetizan los ácidos grasos. Estos a su vez, se convierten en triacilglicéridos, que poseen un contenido energético muy superior al de los polisacáridos, y pueden almacenarse en grandes cantidades en el tejido adiposo. 4.3.1. RELACIÓN CON EL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS. La inmensa mayoría del combustible almacenado en las células de los tejidos animales se encuentra en forma de triacilglicéridos. Sin embargo, una gran parte del consumo calórico en animales superiores es en forma de carbohidratos. Las reservas de almacenamiento de carbohidratos están estrictamente limitadas por su alta afinidad por el agua, por lo que deben existir mecanismos eficaces para la conversión de carbohidratos en grasas. La degradación de glucosa por medio de la glucólisis produce piruvato que, por una descarboxilación, produce acetil-S-CoA, que es el principal precursor para la síntesis de ácidos grasos. La acetil-S-CoA producida por esta vía y por la β-oxidación no puede experimentar una conversión neta en glucosa en tejidos animales. Esto se debe a que la reacción de descarboxilación del piruvato para producir acetil-S-CoA, la cual es catalizada por el complejo piruvato descarboxilasa es irreversible. PIRUVATO + CoA-SH + NAD+ ======= Acetil-S-CoA + CO2 + NADH + H+ En plantas y algunos microorganismos el ciclo del glioxalato permite la conversión neta de acetil-S-CoA en precursores directos para la síntesis de carbohidratos vía gluconeogénesis. 2 Acetil-S-CoA + NAD+ + 2 H2O ====== succinato + 2 CoA-SH + NADH + H+ El succinato, producto del ciclo del glioxalato es un intermediario del ciclo dee Krebs que puede experimentar la conversión directa en piruvato y, este a su vez, ser convertido en glucosa por medio de la gluconeogénesis.

4.3.2. EXPERIMENTOS PRELIMINARES. A comienzos del siglo XX, cuando se demostró que la mayoría de los ácidos grasos tenían cadenas de número par de átomos de carbono, se consideró que era razonable prever que el proceso de su biosíntesis requiriera la adición escalonada de fragmentos activados de dos

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átomos de carbono de la misma manera que la oxidación se realizaba por la eliminación de dos átomos de carbono. El descubrimiento clave que estableció el mecanismo de síntesis de ácidos grasos como una ruta diferente a la oxidación se debió a las investigaciones de S. J. Wakil a finales de los años 50’s, de que la biosíntesis de ácidos grasos tenía una necesidad absoluta de bicarbonato. Sin embargo, el carbono el bicarbonato no se incorporaba al producto final. Estas observaciones llevaron al descubrimiento de que un compuesto de tres átomos de carbono, el malonil-S-CoA, como primer intermediario de la biosíntesis de los ácidos grasos. Actualmente se sabe que la síntesis y degradación de los ácidos grasos son procesos similares y que las rutas difieren en el grupo se enzimas que intervienen en ellas, así como los transportadores del grupo acilo, la estereoquímica de los intermediarios, los transportadores electrónicos la localización intracelular y su regulación. F. Lynen, S.J. Wakil, P.R. Vagelos y colaboradores, en sus respectivos laboratorios, descubrieron que la única molécula de acetil-S-CoA requerida en el proceso de síntesis sirve cómo cebador o iniciador, los dos átomos de su grupo acetilo se convierten en los átomos de carbono terminales de la cadena de ácido graso formado. Así, el crecimiento de la cadena durante la síntesis del ácido graso comienza con el grupo carboxilo de la acetil-SCoA y continúa por la adición sucesiva de restos acetilo al extremo carboxilo de la cadena en crecimiento. Cada resto acetilo sucesivo procede de dos de los tres átomos de carbono de un resto de ácido malónico que penetra en el sistema en forma de malonil-S-CoA. El tercer carbono se pierde en forma de CO2. 4.3.3. BIOSÍNTESIS DE PALMITATO A PARTIR DE ACETIL-S-CoA. La biosíntesis del palmitato y de todos los ácidos grasos saturados a partir de la acetil-SCoA tiene efecto en todos los organismos, pero es especialmente importante en el hígado, en el tejido adiposo y en las glándulas mamarias de los animales superiores. Se realiza por un proceso que difiere significativamente del proceso opuesto de la oxidación de los ácidos grasos. En la reacción global de la síntesis de ácidos grasos, la cual es catalizada por un complejo de siete proteínas en el citoplasma celular, complejo ácido graso- sintetasa, el acetil-S-CoA es el precursor de todos los átomos de carbono del ácido graso. Sin embargo, de las ocho unidades de acetilo requeridas para la biosíntesis del ácido palmítico, solamente una es aportada por la acetil-S-CoA, mientras que las otras siete llegan en forma de malonil-SCoA formado a partir de acetil-S-CoA y HCO3- .Un resto de acetilo y siete de malonilo experimentan etapas sucesivas de condensación, con liberación de siete moléculas de CO 2, para formar el ácido palmítico. El poder reductor lo proporciona el NADPH. Acetil-S-CoA + 7 malonil-S-CoA + 14 NADPH + 14 H+ ====== CH3(CH2)14COOH + 7 CO2 + 8 CoA-SH + 14 NADP+ + 6 H2O

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Fuente de carbono para la síntesis del ácido graso. La fuente principal de todos los átomos de carbono de los ácidos grasos es la acetil-S-CoA formado en las mitocondrias por descarboxilación oxidativa del piruvato, por degradación oxidativa de algunos aminoácidos o por la oxidación de los ácidos grasos de cadena larga. Aunque la acetil-S-CoA no puede atravesar la membrana mitocondrial al citosol, su grupo acetilo se transfiere en otras formas químicas. Una es por medio del citrato formado en la primera reacción del ciclo de Krebs que pasa al citosol gracias al sistema transportador de tricarboxilatos. Ya en el citosol, la acetil-S-CoA se regenera a partir del citrato por la ATPcitrato-liasa: Citrato + ATP + CoA-SH ========= acetil-S-CoA + oxaloacetato + ADP `+ Pi Otra forma es cuando el grupo acetilo de la acetil-S-CoA es transferido a la carnitina, la cual actúa como portadora de ácidos grasos a las mitocondrias, previo a su oxidación. La acetil-carnitina pasa de la matriz mitocondrial al citosol y, entonces se regenera por transferencia del radical acetilo a la CoA-SH del citosol. En el citosol, el malonil-S-CoA se forma a partir del acetil-S-CoA y el bicarbonato por acción de la acetil-CoA-carboxilasa por la siguiente reacción: Acetil-S-CoA + HCO3- + H+ + ATP ===== malonil-S-CoA + ADP + Pi Reacción cebadora. La enzima ACP-acil-transferasa cataliza la siguiente reacción: Acetil-S-CoA + ACP-SH == acetil-S-ACP + CoA-SH Posteriormente, el radical acetilo es transferido a otra enzima del complejo ácido grasosintetasa, la β-cetoacil-ACP-sintetasa mediante la siguiente reacción: Acetil-S-ACP + β-cetoacil-ACP-sintetasa== ACP-SH + acetil- β-cetoacil-ACP-sintetasa Con esta reacción, el complejo ácido graso-sintetasa queda cebado y listo para llevar a cabo la secuencia de reacciones requeridas para adicionar una unidad de dos átomos de carbono en el proceso de elongación de la cadena. Etapa de transferencia del malonilo. La siguiente reacción es catalizada por la enzima malonil-ACP-transferasa. El radical malonilo es transferido de la CoA-SH a la proteína acarreadora de acilos (ACP):

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Malonil-S-CoA + ACP-SH ==== malonil-S-ACP + CoA-SH Reacción de condensación. En la siguiente reacción, la cual es catalizada por la β-cetoacil-ACP-sintetasa, el grupo acetilo es transferido al carbono 2 del grupo malonilo de la ACP, con la liberación del carbono libre en forma de CO2: Acetil- β-cetoacil-ACP-sintetasa + malonil-S-ACP ====== Acetoacetil-S-ACP + CO2 + β-cetoacil-ACP-sintetasa Primera reacción de reducción. La siguiente reacción es catalizada por la enzima β-cetoacil.ACP-reductasa. Acetoacetil-S-ACP + NADPH + H+ ===== β-D-hidroxibutiril-S-ACP + NADP+ Es importante mencionar que el isómero formado en la síntesis es de configuración D-, mientras que el que se forma en la oxidación de los ácidos grasos posee la configuración L-

Etapa de deshidratación. El β-D-hidroxibutiril-S-ACP formado es deshidratado en la siguiente reacción por la enzima enoil-ACP hidratasa : β-D-hidroxibutiril-S-ACP===== crotonil-S-ACP + H2O Es importante mencionar que el producto de esta reacción, el crotonil, es el correspondiente α-β-trans insaturado, a diferencia de la oxidación dónde el intermediario insaturado correspondiente tiene configuración cis- en su doble enlace. Segunda reacción de reducción. La enzima enoil-S-ACP-reductasa(NADP) reduce el crotonil-S-ACP a butiril-S-ACP empleando el NADPH cómo donador de electrones: Crotonil-S-ACP + NADPH + H+==== butiril-S-ACP + NAPD+ Otra diferencia importante entre la síntesis y la oxidación de los ácidos grasos es que mientras en la síntesis se emplea el nucleótido fosfatado del NADP+ cómo transportador de electrones, en la oxidación es el NAD+.

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La formación del butiril-S-ACP completa el primero de los siete ciclos que conducen al palmitoil-S-ACP. Para inicial el siguiente ciclo el grupo butirilo es transferido de la ACP a la β-cetoacil-ACP-sintetasa, permitiendo así que la ACP acepte otro grupo malonilo de la malonil-S-CoA. Entonces se repite el ciclo. Después de siete ciclos completos, el producto final es el palmitil-S-ACP. Este grupo entonces, puede separarse por medio de una tioestearasa para formar ácido palmítico libre. Ahora podemos escribir la ecuación global de la síntesis del ácido palmítico a partir de la acetoil.-S-CoA: 8 Acetil-S-CoA + 14 NADPH + 14 H+ + 7 ATP + H2O ==== Ácido palmítico + 8 CoA-SH + 14 NADP+ + 7 ADP + 7 Pi Las 14 moléculas de NADPH requeridas proceden en gran medida de la oxidación NADPdependiente de la glucosa-6-fosfato por la ruta del fosfogluconato.

4.3.4 ELONGACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS. El ácido palmítico es el precursor, en la mayoría de los organismos, de los otros ácidos grasos de cadena larga, saturados e insaturados. La prolongación del ácido palmítico tiene efecto por las acciones de distintos tipos de sistemas enzimáticos, uno de los cuales funciona en las mitocondrias mientras que otro lo hace en el retículo endoplasmático. En las mitocondrias, el ácido palmítico y otros ácidos grasos saturados son prolongados mediante adiciones sucesivas al extremo carboxilo terminal de unidades acetilo en forma de acetil-S-CoA, en este caso, el malonil-ACP no puede sustituir al acetil-S-CoA. La ruta mitocondrial de prolongación transcurre mediante reacciones similares a las de la oxidación del ácido graso. La condensación del palmitil-S-CoA con el acetil-S-CoA rinde β-cetoestearil-S-CoA que es reducido por el NADPH a β-hidroxiestearil-S-CoA. Este último es deshidratado a estearil-S-CoA ∆2-insaturado, el cual es entonces reducido a estearil-S-CoA por medio del NADPH. Este sistema también es capaz de realizar la elongación de ácidos grasos insaturados.

4.3.5. DESATURACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS. Los ácidos grasos saturados palmítico y esteárico son los precursores de los ácidos grasos monoinsaturados más comunes en los tejidos animales. Aunque la mayoría de los organismos pueden sintetizar los ácidos palmitoleico y oleico , las rutas seguidas y las enzimas empleadas difieren en los organismos aerobios de los anaerobios. En la mayoría de

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los organismos aerobios el doble enlace ∆9- es introducido por el sistema específico de una monooxigenasa el cual se encuentra situado en el retículo endoplasmático del hígado y del tejido adiposo. El oxígeno molecular se emplea como aceptor de dos pares de electrones, uno de ellos procedente del palmitil-S-CoA o estearil-S-CoA como sustrato, y eo otro, del NADPH, que es el agente coreductor rn la reacción. La reacción global para el palmitoil-S-CoA es: Palmitil-S-CoA + NADPH + H+ + O2 ====== Palmitoleil-S-CoA + NADP + 2 H2O Ciertos organismos no emplean el oxígeno molecular como aceptor de los electrones, lo hacen por deshidratación de un β-hidroxiacil-S-ACP saturado específico de cadena intermedia en longitud, en lugar de la desaturación oxidativa del acil-S-CoA graso. Las bacterias no contienen ácidos poliinsaturados; sin embargo, estos ácidos son muy abundantes tanto en los animales como en las plantas superiores. Los mamíferos contienen cuatro familias distintas de ácidos poliinsaturados, que difieren entre sí en el número de átomos de carbono que hay entre el grupo metilo terminal y el doble enlace más próximo. En la tabla 4.2 se muestran estas familias. Tabla 4.2 Familias de ácidos grasos poliinsaturados.(2) Familia Ácido Palmitoleico Oleico linoleico linolénico

Estructura de la cadena

CH3-(CH2)5-CH=CHCH3-(CH2)7-CH=CHCH3-(CH2)4-CH=CHCH3-(CH2)2-CH=CH-

Todos los ácidos grasos poliinsaturados encontrados en los mamíferos se forman a partir de los cuatro precursores mencionados en la tabla 4.2, mediante reacciones de elongación y/o desaturación. Los ácidos linoleico y linolénico no pueden ser sintetizados por los mamíferos por lo que tienen que obtenerlos de los vegetales. Por esta razón se les denomina ácidos grasos esenciales, junto con el ácido araquidónico. Los ácidos poliinsaturados más importantes de origen animal derivados de los ácidos palmitoleico y oleico se muestran en la figura 4.5, junto con su ruta de formación. En la figura 4.6 se muestran las rutas de formación de los ácidos grasos poliinsaturados a partir de los ácidos grasos esenciales.

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Los ácidos grasos esenciales y algunos de sus derivados son los precursores directos de las hormonas prostaglandinas. En los vegetales, los ácidos linoleico y linolénico son sintetizados a partir del ácido oleico mediante las reacciones de desaturación catalizadas por sistemas de oxigenasas específicos que requieren NADPH como correductor. Los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados encontrados en la naturaleza no experimentan, en general, hidrogenación para formar ácidos grasos saturados; pocos organismos pueden llevar a cabo este proceso. Sin embargo, los ácidos grasos insaturados son completamente oxidados por el sistema oxidatovo del ácido graso.

Figura 4.5 Formación de ácidos grasos poliinsaturados a partir del ácido palmítico. Estas transformaciones tienen efecto con los ésteres de la CoA-SH de los ácidos grasos que se indican.(1)

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Figura 4.6. Rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados a partir de los ácidos grasos esenciales.(1) 4.3.6. REGULACIÓN. En la mayoría de los organismos, la conversión de los ácidos grasos saturados en insaturados es regulada por la temperatura ambiente: la bajas temperaturas inducen la conversión. Se trata de una adaptación para mantener el punto de fusión de los lípidos celulares totales por debajo de la temperatura ambiente; los ácidos grasos insaturados tienen puntos de fusión más bajos que los correspondientes saturados. En algunos organismos, las enzimas implicadas en la desaturación de los ácidos grasos aumentan de concentración como respuesta a las bajas temperaturas. Otra forma de regular la síntesis de los ácidos grasos es por medio del citrato. Una elevación en la concentración de citrato en el citosol promueve la polimerización de la enzima acetil-S-CoA-carboxilasa con lo cual se promueve su activación y, por tanto, la síntesis de los ácidos grasos. Por otra parte, una elevación en la concentración de palmitil-S-CoA despolimerización de la enzima y, por tanto, su inactivación.

promueve la

Otro mecanismo de regulación es el hormonal. Durante el ayuno prolongado o la actividad física (ejercicio), el glucagón o la adrenalina promueven la fosforilación de la acetil-SCoA-carboxilasa, lo que genera la despolimerización de la enzima y su inactivación, bloqueando la síntesis. Por otra parte, la insulina genera la desfosforilación de la enzima provocando con ello su activación y, por tanto, la síntesis. Además, la misma insulina

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activa lacitrato liasa en el citosol lo que produce una cantidad elevada de acetil-S-CoA, sustrato precursor para la síntesis de ácidos grasos. Al igual que la regulación de la síntesis de los carbohidratos, la síntesis de los ácidos grasos está fuertemente regulada por la carga de adenilato; es decir, por el contenido de enlaces de alta energía en forma de ATP en el organismo. Una carga de adenilato mayor de 0.8 indica un alto contenido de [ATP], lo cual estimula a las enzimas reguladoras alostéricas que participan en el proceso de síntesis. Una carga adenilato menor a 0.8 inhibe a las enzimas de la síntesis y activa a las enzimas de la oxidación. Esto quiere decir que una concentración alta de [ADP] y [AMP] inhiben a las enzimas del proceso de síntesis y activan a las enzimas de la oxidación. Por tanto, podemos concluir que, el contenido energético del organismo determina y regula los procesos de degradación o de síntesis según sea el caso. Un contenido energético alto activa los procesos de síntesis (anabolismo) e inactiva los procesos de degradación (catabolismo), y viceversa. 4.4. TRIACILGLICEROLES. Cómo se mencionó al principio de este capítulo, los triacilgliceroles o triacilglicéridos, son la forma de almacenar las grasas en el tejido adiposo. Son ésteres de ácidos grasos con el glicerol. En la figura 4.7 se muestra la estructura del tripalmitina, un triacilglicérido que contiene tres radicales del ácido palmítico esterificados al glicerol.

Figura 4.7. Estructura genérica del tripalmitina o tripalmitilglicérido.(2) Los triacilglicéridos más comunes encontrados en la naturaleza pueden contener esterificados dos ácidos grasos saturados y uno insaturado, o bien, dos insaturados y uno saturado. Si la mayor proporción son ácidos grasos saturados entonces son sólidos a temperatura ambiente y se les denomina grasas. Por otra parte, si la mayor proporción la constituyen los ácidos grasos insaturados entonces son líquidos a temperatura ambiente y se les denomina aceites. Por lo regular, las grasas son de origen animal, mientras que los

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aceites son de origen vegetal, con algunas excepciones. Sin embargo, los hay que contienen una sola clase de ácido graso los cuales son llamados triacilglicéridos simples (Fig. 4.7). Los triacilglicéridos funcionan como grasas de almacenamiento, son activamente sintetizados por las células de los vertebrados, especialmente, las hepáticas y las adiposas, así como en las plantas superiores. Los microorganismos contienen cantidades relativamente pequeñas de triacilglicéridos.

4.4.1. DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN. Los lípidos de la dieta, principalmente los triglicéridos y, en menor proporción, el colesterol, son digeridos inicialmente y de forma parcial en el tracto gastrointestinal por la acción de las enzimas lipasas, bucal y gástrica. A continuación, las sales biliares emulsionan los lípidos facilitando la acción de la lipasa pancreática y su posterior absorción en forma de micelas mixtas en el intestinodelgado. El intestino absorbe el 100% de los triglicéridos, mientras que el colesterol que proveniente de la dieta se absorbe en un 40%, aproximadamente. En la mucosa intestinal del duodeno, los triacilglicéridos y el colesterol de la dieta, se ensamblan con las apoproteínas apo-A y apo-B48 constituyendo los quilomicrones que pasan a la circulación linfática y son las lipoproteínas responsables de transportar en sangre los triglicéridos de origen exógeno. En la figura 4.8 se ilustra este proceso de digestión.

El 90% de los lípidos ingeridos en la dieta son triglicéridos y su función predominante es la de reserva energética. Los lípidos son más reducidos que los carbohidratos, por lo que pueden someterse a más procesos de oxidación y, en consecuencia, obtenerse más energía de ellos; al ser hidrofóbicos, ocupan menos espacio y por lo tanto su empaquetamiento es mayor. Ahora bien, también encontramos inconvenientes en los lípidos: al ser tan hidrófobos son muy insolubles y por ello, los lípidos deben ser emulsionados para poder ser hidrolizados por las enzimas. La obtención de lípidos se realiza por la dieta o por la producción endógena (síntesis de colesterol sobre todo). El 90% de los lípidos ingeridos en la dieta son triglicéridos y su función predominante es la de reserva energética. Los lípidos son más reducidos que los carbohidratos, por lo que pueden someterse a más

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procesos de oxidación y, en consecuencia, obtenerse más energía de ellos; al ser hidrofóbicos, ocupan menos espacio y por lo tanto su empaquetamiento es mayor. Ahora bien, también encontramos inconvenientes en los lípidos: al ser tan hidrófobos son muy insolubles y por ello, los lípidos deben ser emulsionados para poder ser hidrolizados por las enzimas. La obtención de lípidos se realiza por la dieta o por la producción endógena (síntesis de colesterol sobre todo). El 90% de los lípidos ingeridos en la dieta son triglicéridos y su función predominante es la de reserva energética. Los lípidos son más reducidos que los carbohidratos, por lo que pueden someterse a más procesos de oxidación y, en consecuencia, obtenerse más energía de ellos; al ser hidrofóbicos, ocupan menos espacio y por lo tanto su empaquetamiento es mayor. Ahora bien, también encontramos inconvenientes en los lípidos: al ser tan hidrófobos son muy insolubles y por ello, los lípidos deben ser emulsionados para poder ser hidrolizados por las enzimas. La obtención de lípidos se realiza por la dieta o por la producción endógena (síntesis de colesterol sobre todo). Los lípidos de la dieta , principalmente los triglicéridos y, en menor proporción, el colesterol, son digeridos inicialmente y de forma parcial en el tracto gastrointestinal por la acción de las enzimas lipasas, bucal y gástrica. A continuación, las sales biliares emulsionan los lípidos facilitando la acción de la lipasa pancreática y su posterior absorción en forma de micelas mixtas en el intestino delgado. El intestino absorbe el 100% de los triglicéridos, mientras que el colesterol que proveniente de la dieta se absorbe en un 40%, aproximadamente. En la mucosa intestinal del duodeno, los triglicéridos y el colesterol de la dieta, se ensamblan con las apoproteínas apo-A y apo-B48 constituyendo los quilomicrones que pasan a la circulación linfática y son las lipoproteínas responsables de transportar en sangre los triglicéridos de origen exógeno (figura 1).Los lípidos de la dieta , principalmente los triglicéridos y, en menor proporción, el colesterol, son digeridos inicialmente y de forma parcial en el tracto gastrointestinal por la acción de las enzimas lipasas, bucal y gástrica. A continuación, las sales biliares emulsionan los lípidos facilitando la acción de la lipasa pancreática y su posterior absorción en forma de micelas mixtas en el intestino delgado. El intestino absorbe el 100% de los triglicéridos, mientras que el colesterol que proveniente de la dieta se absorbe en un 40%, aproximadamente. En la mucosa intestinal del duodeno, los triglicéridos y el colesterol de la dieta, se ensamblan con las apoproteínas apo-A y apo-B48 constituyendo los quilomicrones que pasan a la circulación linfática y son las lipoproteínas responsables de transportar en sangre los triglicéridos de origen exógeno (figura 1). El 90% de los lípidos ingeridos en la dieta son triglicéridos y su función predominante es la de reserva energética. Los lípidos son más reducidos que los carbohidratos, por lo que pueden someterse a más

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procesos de oxidación y, en consecuencia, obtenerse más energía de ellos; al ser hidrofóbicos, ocupan menos espacio y por lo tanto su empaquetamiento es mayor. Ahora bien, también encontramos inconvenientes en los lípidos: al ser tan hidrófobos son muy insolubles y por ello, los lípidos deben ser emulsionados para poder ser hidrolizados por las enzimas. La obtención de lípidos se realiza por la dieta o por la producción endógena (síntesis de colesterol sobre todo)

El 90% de los lípidos ingeridos en la dieta son triglicéridos y su función predominante es la de reserva energética. Los lípidos son más reducidos que los carbohidratos, por lo que pueden someterse a más P á g i n a | 120

procesos de oxidación y, en consecuencia, obtenerse más energía de ellos; al ser hidrofóbicos, ocupan menos espacio y por lo tanto su empaquetamiento es mayor. Ahora bien, también encontramos inconvenientes en los lípidos: al ser tan hidrófobos son muy insolubles y por ello, los lípidos deben ser emulsionados para poder ser hidrolizados por las enzimas. La obtención de lípidos se realiza por la dieta o por la producción endógena (síntesis de colesterol sobre todo). Figura 4.8. Proceso de digestión y absorción de los triacilglicéridos provenientes de la dieta.(2)

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4.4.2. TRANSPORTE: LIPOPROTEÍNAS. Los lípidos son insolubles en el plasma sanguíneo, por lo que circulan en la sangre en forma de complejos hidrosolubles conocidos como lipoproteínas. Las lipoproteínas están constituidas por un núcleo apolar de triacilglicéridos y colesterol esterificado y una cubierta soluble de fosfolípidos, colesterol y proteínas (apoproteínas), como se ilustra en la figura 4.9. La densidad de las lipoproteínas se debe a la proporción relativa de lípidos y proteínas cuya composición varía por el intercambio de lípidos y apoproteínas que sufren. Los principales tipos de lipoproteínas, clasificadas según su densidad y contenido lipídico se resumen en la tabla 4.3.

Figura 4.9. Composición de una lipoproteína.(8)

Los quilomicrones son las lipoproteínas más ricas en lípidos y son las responsables de transportar en la sangre los triacilglicéridos de origen dietético. La lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) transporta los triglicéridos endógenos sintetizados en el hígado. El aumento en sangre de los quilomicrones y las VLDL, elevan las concentraciones circulantes de triacilglicéridos después de las comidas grasas (hipertrigliceridemia posprandial) o en ayunas. Ambas presentan en su superficie la apoproteína C por la que son reconocidas por la enzima lipoproteína lipasa (LPL), que hidroliza los triglicéridos en ácidos grasos y glicerol. Esta enzima está presente en el endotelio celular de adipocitos donde los ácidos grasos libres son almacenados, y en células musculares, donde el aporte de ácidos grasos se emplea para la producción de energía. Los restos de VLDL, se convierten en las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), de las cuales un 50% son retiradas del plasma a través de apo E al igual que los quilomicrones remanentes. La otra parte de las P á g i n a | 122

IDL se transforma en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) al perder la apo E, convirtiéndose en las lipoproteínas responsables de transportar el colesterol a las células. Este proceso se ilustra en la figura 4.10.

Tabla 4.3. Tipos de lipoproteías y su función biológica.(8)

Por otro lado, las lipoproteínas de alta densidad (HDL), sintetizadas en el hígado, se encargan del transporte inverso del colesterol, desde los tejidos hasta el hígado donde se elimina. Las HDL, reconocidas por las células por la apoproteína apo A1, captan el colesterol libre de la célula y mediante la enzima lecitina colesterol acil transferasa (LCAT), lo esterifica con los ácidos grasos, situándolos en el núcleo de la lipoproteína y produciéndose así las HDL de mayor densidad. Estas HDL maduras son retiradas del torrente sanguíneo en el hígado. El colesterol unido a las lipoproteínas LDL, es el conocido como “malo”, puesto que sus niveles elevados promueven la formación de placas ateroscleróticas. Por otro lado, las lipoproteínas HDL, cuyo colesterol reciben el indicativo de “bueno”, tienen más afinidad por el colesterol que las LDL, lo que favorece su captación en los tejidos y su transporte al hígado para su eliminación.

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Figura 4.10. Función de las lipoproteínas en el transporte a través del torrente sanguíneo de los lípidos endógenos y exógenos.(8)

4.4.3. MOVILIZACIÓN DE LA GRASA ALMACENADA. LIPÓLISIS. Mediante la lipólisis, los triglicéridos son hidrolizados en ácidos grasos y glicerol por la acción de las lipasas en el tejido adiposo. Estas enzimas se activan en presencia de ciertas hormonas como la adrenalina y el glucagon, y se inhiben en presencia de la insulina. Los ácidos grasos libres son transportados por la albúmina al músculo para la obtención de energía a partir de ellos. Una vez en el interior celular, los ácidos grasos son activados formando acil-S-CoA. A continuación, son transportados al interior de la mitocondria con la ayuda de la L-carnitina donde tiene lugar la β-oxidación. En este proceso oxidativo, los ácidos grasos se convierten en acetil-S-CoA, sustrato del ciclo de Krebs que posteriormente generará energía en forma de ATP (adenosin trifosfato). La β-oxidación consiste en 4 reacciones de oxidación y se genera también las coenzimas reducidas NADH (forma reducida de nicotinamida adenina dinucleótido) y FADH2 (forma reducida de flavín adenín dinucleótido) que participan en la cadena respiratoria. En la figura 4.11 se ilustra este

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proceso de degradación de los triacilglicéridos y su relación con el metabolismo de otros lípidos.

Figura 4.11. Metabolismo de los triacilglicéridos: lipólisis y lipogénesis.(3)

4.4.4. BIOSÍNTESIS. Ante un exceso de energía procedente de la dieta, el organismo genera una cantidad de ATP superior a la demanda del organismo. Este exceso de ATP se aprovecha para sintetizar ácidos grasos mediante la lipogénesis de novo. El sustrato inmediato es el acetil-S-CoA, suministrado principalmente por la degradación de la glucosa proveniente de la dieta. Posteriormente los ácidos grasos formados se esterifican con el glicerol para formar los triglicéridos que se acumulan en el tejido adiposo. Los triglicéridos son una forma de reserva más eficiente que los carbohidratos por su mayor densidad energética. El tejido adiposo está compuesto por dos tipos, el tejido adiposo blanco y el tejido adiposo pardo. El tejido adiposo blanco es el principal reservorio energético y sus adipocitos contienen una única gota lipídica que ocupa el 90% del volumen. En el ser humano se diferencian dos depósitos principales de tejido adiposo blanco: subcutáneo y abdominal. Los adipocitos del tejido adiposo abdominal son metabólicamente más activos y presentan una mayor sensibilidad a la lipólisis y una mayor resistencia a la insulina debido

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a una menor densidad de receptores de insulina en comparación con el tejido adiposo subcutáneo. Para la síntesis de triacilglicéridos en animales superiores y en las plantas, se requieren dos precursores principales: el L-gliceril-3-fosfato y los acil-S-CoA graso. El L-gliceril-3-fosfato se puede obtener de dos formas: la primera es por reducción directa de la dihidroxiacetona-fosfato formada por la aldolasa en la glucólisis. Reacción catalizada por la gliceril-3-fosfato deshidrogenasa ligada al NAD del citosol: Dihidroxiacetona-fosfato + NADH + H+====== L-gliceril-3-fosfato + NAD+ La segunda manera de obtenerla es por medio de la fosforilación del glicerol libre procedente de la degradación de los triacilglicéridos, por acción de la glicerina-quinasa, empleando Mg+2 como cofactor: ATP + Glicerol ====== L-gliceril-3-fosfato + ADP La primera etapa para la síntesis de los triacilglicéridos es la acilación de los hidroxilos libres del L-3-gliceril-fosfato por dos moléculas de acil-S-CoA graso para formar primeramente un ácido lisofosfatídico y, después un ácido fosfatídico por acción de la glicerilfosfato-acil-transferasa:. L-3-gliceril-fosfato + acil-S-CoA graso === ácido lisofosfatídico + CoA-SH Ácido lisofosfatídico + acil-S-CoA

===== ácido fosfatídico + CoA-SH

En la siguiente reacción, el ácido fosfatídico experimenta hidrólisis por acción de la fosfatidato-fosfatasa: Ácido fosfatídico + H2O ====== diacilglicérido + Pi El diacilglicérido formado reacciona después con una tercera molécula de acil-S-CoA graso para rendir un triacilglicérido por acción de la diacil-glicerina-acil-transferasa: Acil-S-CoA graso + diacilglicérido ====== triacilglicérido + CoA-SH En la mucosa intestinal de los animales superiores, que sintetiza activamente triacilglicéridos durante la absorción de los ácidos grasos del intestino, los monoacilglicéridos formados pueden ser directamente acilados por acción de la acilgliceril-palmitil-transferasa, por lo que el ácido fosfatítico no es intermediario: Monoacilglicérido + palmitoil-S-CoA === diacilglicérido + CoA-SH

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4.5 METABOLISMO DE LÍPIDOS DE MEMBRANA. Dentro de los principales lípidos de membrana se encuentran los fosfoglicéridos de los cuales destacan la fosfatidil-etanolamina, la fosfatidil-colina, la fosfatidil-serina, el fosfatidil-inositol y la fosfatidil-glicerina. En la figura 4.12 se ilustran los principales fosfoglicéridos de membrana.

, Figura 4.12. Estructura de los principales fosfoglicéridos.(5) Otros importantes lípidos de membrana son los esfingolípidos de los cuales las esfingomielinas son los más abundantes. Las esfingomielinas son los lípidos protectores de

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las células nerviosas. En la figura 4.13 se encuentran las estructuras de los principales esfingolípidos.

Figura 4.13. Estructura de los principales esfingolípidos.(7)

4.5.1. METABOLISMO DE FOSFOGLICÉRIDOS. Los principales fosfoglicéridos, que sirven como componentes de las membranas y de las lipoproteínas de transporte, se forman a partir del ácido fosfatídico (Fig. 4.14) por dos rutas diferentes, una de las cuales predomina en los animales y plantas superiores, mientras que la otra tiene lugar en algunos microorganismos. En ambas rutas, los nucleótidos de la citidina, se utilizan como portadores, tanto de los grupos alcohol de la –cabeza- , como del ácido fosfatídico. Fosfatidil-etanolamina. Primeramente se fosforila la etanolamina por acción de la etanolamina-quinasa. Etanolamina + ATP ===== fosfoetanolamina + ADP

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Figura 4.14. Estructura genérica del ácido fosfatídico.(7)

En la siguiente etapa, la fosfoetanolamina reacciona con el CTP para producir citidindifosfatoetanolamina, por acción de la fosfoetanolamina-citidin-transferasa: CTP + fosfoetanolamina ===== CDP-etanolamina + PPi En la última etapa, el CMP de la CDP-etanolamina se elimina y la porción de fosfoetanolamina es transferida al diacilglicérido para rendir fosfatidil-etanolamina, por acción de la fosfoetanolamina-transferasa: CDP-etanolamina + diacilglicérido ===== fosfatidiletanolamina + CMP Las enzimas que catalizan estas reacciones se encuentran en la membraba del retículo esdoplasmático.

Fosfatidil-colina. En los tejidos animales, la fosfatidil-colina puede formarse por dos rutas diferentes. Una de ellas es consiste en la metilación directa del grupo amino de la fosfatidiletanolamina por un donador de metilos, la S-adenoosil-metionina, reacción que se da en tres etapas y es catalizada por la enzima fosfatidil-etanolamina-metil-transferasa. La reacción global es la siguiente: Fosfatidiletanolamina + 3 S-adenosil-metionina ===== Fosfatidil-colina + 3 S-adenosil-homocisteína La segunda ruta se inicia con la colina de la dieta o la recuperada de la degradación enzimática de la fosfatidil-colina. Las reacciones son las siguientes: Colina + ATP ====== fosfocolina + ADP P á g i n a | 129

Fosfocolina + CTP ======== CDP-colina + PPi CDP-colina + diacilglicérido ======== fosfatidil-colina + CMP Las enzimas son la colina-quinasa, fosfocolina-citidin-transferasa y la fosfocolinatransferasa, respectivamente.

Fosfatidil-serina En los tejidos animales, la fosfatidil-serina se forma mediante el intercambio enzimático del alcohol de la fosfatidil-etanolamina por la L-serina: Fosfatidil-etanolamina + L-serina ==== fosfatidil-serina + etanolamina

Fosfatidil-inositol y fosfatidil-glicerina. El CDP-diacilglicérido es utilizado como precursor, tanto de la biosíntesis del fosfatidilinositol como de la fosfatidil-glicerina: CDP-diacilglicérido + inositol ======== fosfatidil-inositol + CMP La enzima que realiza esta reacción es la CDP-diacilgliceril-inositol-fosfatidil-transferasa. La fosfatidil-glicerina se forma a partir del CDP-diacilglicérido por las siguientes reacciones: CDP-diacilglicérido + gliceril-3-fosfato ======= 3-fosfatidil-1’-gliceril-3’-fosfato + CMP 3-fosfatidil-1’-gliceril-3’-fosfato + H2O ====== 3-fosfatidil-1’-glicerina + Pi La fosfatidil-glicerina resultante es la precursora de la fosfatidil-glicerina, comúnmente llamada cardiolipina, que representa hasta el 20% de los lípidos de la membrana mitocondrial interna. En tejidos animales la reacción es la siguiente: Fosfatidil-glicerina + CDP-diacilglicérido ===== cardiolipina +CMP En microorganismos, la cardiolipina se forma por la siguiente reacción: 2 Fosfatidil-glicerina ======== cardiolipina + glicerina

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4.5.2. METBOLISMO DE ESFINGOLÍPIDOS. Los esfingolípidos son lípidos complejos cuyo esqueleto está constituido por la esfingosina o una base relacionada (Fig. 4.15). Son componentes importantes de las membranas de las céluas vegetales y animales.

Figura 4.15. Estructura de la esfingosina y derivados.(7)

Se hallan en cantidades especialmente grandes en los tejidos nervioso y cerebral. Todos los esfingolípidos contienen tres componentes básicos: una molécula de un ácido graso, una molécula de esfingosina o un de sus derivados y un grupo de cabeza polar grande y complejo. La esfingosina es uno de los 30 o más diferentes aminoalcoholes de cadena larga hallados en los esfingolípidos de diversas especies. La esfingosina se encuentra unida mediante enlace amida a un ácido graso de cadena larga. El compuesto resultante se llama ceramida, la cual es la estructura que da origen a todos los esfingolípidos. Los esfingolípidos más abundantes en los tejidos de los animales superiores son las esfingomielinas, que contienen fosforil-etanolamina o fosforil-colina, como grupos de cabeza polares esterificados a grupo hidroxilo 1 de la ceramida.

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Biosíntesis de esfingomielina y de otros esfingolípidos. La esfingosina, estructura central de todos los esfingolípidos, se forma a partir del palmitoil-S-CoA por la secuencia de reacciones enzimáticas: Palmitoil-S-CoA + L-serina ====== 3-Dehidroesfinganina + CoA-SH + CO2 3-Dehidroesfinganina + NADPH + H+ ==== esfinganina + NADP+ Esfinganina + FAD ====== esfingosina + FADH2 En la siguiente etapa, la esfingosina es acilada por un acil-S-CoA graso de cadena larga para formar la ceramida: Esfingosina + acil-S-CoA graso ===== ceramida + CoA-SH La esfingomielina se forma por la reacción de una ceramida con la CDP-colina: Ceramida + CDP-colina ======= esfingomielina + CMP Estas dos últimas reacciones son catalizadas por las enzimas; esfingosina-aciltransferasa y la ceramida-colina-fosfotransferasa, respectivamente. Loa cerebrósidos, se forman por una reacción similar entre una ceramida y la UDP-glucosa o UDP-galactosa: Ceramida + UDP-D-glucosa ======= glucocerebrósido + UDP Ceramida + UDP-galactosa ======== galactocerebrósido + UDP En la figura 4.16 se ilustran estas reacciones.

4.5.3. METABOLISMO DE ESTEROIDES. Los esteroides son derivados del hidrocarburo tetracíclico saturado perhidrociclopentanofenantreno. Los esteroides difieren en número y en la posición de sus dobles enlaces, en el tipo, localización y número de sus grupos funcionales sustituyentes, en la configuración de los enlaces entre sus grupos sustituyentes y el núcleo, y en la configuración que adoptan los anillos entre sí, ya que el hidrocarburo originario posee seis centros de asimetría

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Figura 4.16. Reacciones para la síntesis de una esfingomielina y un glicocerebrósido a partir de la ceramida.(1)

Todos los esteroides se originan a partir del escualeno, Al ciclarse este triterpeno forma el primer esteroide importante, el lanosterol que es el precursor directo del colesterol en los tejidos animales. El lanosterol y el colesterol son importantes miembros de un subgrupo de esteroides llamado esteroles. En los tejidos animales el colesterol es el precursor de otros esteroides entre los que destacan: los ácidos biliares, los esteroles fecales, los andrógenos u hormonas sexuales masculinas, los estrógenos u hormonas sexuales femeninas, la progesterona y las hormonas adrenocorticales. En las figuras 4.17 y 4.18 se ilustran algunas de las estructuras de los esteroides producidos a partir del colesterol.

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Figura 4.17. Estructura de algunos de los esteroides obtenidos a partir del colesterol en tejidos animales.(1)

Figura 4.18. Estructura de dos esteroles fecales producidos a partir del colesterol.(1)

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4.5.3.1. BIOSINTESIS DEL COLESTEROL. La biosíntesis de colesterol en tejidos animales se divide en tres grandes etapas: 1) la conversión de ácido acético en ácido mevalónico, 2) la transformación del ácido mevalónico en escualeno y 3) la conversión del escualeno en colesterol. La fuente de carbono primaria para la síntesis del colesterol es el ácido acético. En la primera etapa, tres moléculas de ácido acético se transforman en ácido mevalónico, siendo el β-hidroxi-β-metilglutaril-S-CoA, un intermediario clave. Acetil-S-CoA + acetoacetil-S-CoA === β-hidroxi-β-metilglutaril-S-CoA + CoA-SH La enzima que cataliza esta reacción es la hidroxi-metil-glutaril-S-CoA sintetasa. El β-hidroxi-β-metilglutaril-S-CoA entonces experimenta una reducción irreversible por acción de la enzima hidroxi-metil-glutaril-S-CoA reductasa, para rendir mevalonato por la siguiente reacción: β-hidroxi-β-metilglutaril-S-CoA + 2 NADPH+ 2 H+ ====== mevalonato + 2 NADP+ + CoA-SH La segunda etapa comienza con la fosforilación del mevalonato por el ATP para formar 3isopentil-pirofosfato, el cual isomeriza a 3,3-dimetil-alil-pirofosfato. Estos dos isopentilpirofosfatos se condensan entre sí con eliminación de pirofosfato para rendir pirofosfato de geranilo. Posteriormente, reacciona otra molécula de isopentil-pirofosfato para rendir farnesil-pirofosfato. Dos moléculas de este compuesto experimentan condensación para producir preescualeno-pirofosfato, el cual es reducido por el NADPH para liberar escualeno y pirofosfato. Ácido mevalónico + ATP ====== ácido 5-fosfomevalónico + ADP Ácido 5-fosfomevalónico + ATP ====ácido 5-pirofosfomevalónico +ADP Ácido 5-pirofosfomevalónico + ATP ====== ácido 3-isopentil-pirofosfórico + ADP + Pi + CO2 Ácido 3-isopentil-pirofosfórico ==== ácido 3,3-dimetil-alil-pirofosfórico Ácido 3,3-dimetil-alil-pirofosfórico + isopentil-pirofosfato ===== ácido geranil-fosfórico Ácido geranil-fosfórico + isopentil-pirofosfato ==== ácido farnesil-pirofosfórico

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2 Ácido farnesil-pirofosfórico ==== preescualeno-pirofosfato + PPi Preescualeno-pirofosfato + NADPH + H+ ==== Escualeno + NADP+ + PPi La tercera etapa en la síntesis de colesterol, el escualeno experimenta un ataque por el oxígeno molecular formando el escualeno-2,3-epòxido, reacción catalizada por la escualeno-monooxigenasa. Este último compuesto experimenta su ciclación para formar lanosterol, el cual, es el primer esteroide que se produce. La conversión en colesterol implica la eliminación de tres grupos metilo, la saturación del doble enlace de la cadena lateral y el desplazamiento del doble enlace de la posición 8-9 a la 5-6 del anillo B. En la figura 4.19 se ilustran las dos rutas de conversión del lanosterol a colesterol.

Figura 4.19. Rutas de conversión del lanosterol en colesterol.(1)

En la figura 4.20 se ilustra la estructura del colesterol. En ella se muestra la cabeza polar del grupo hidroxilo, el núcleo esteroidal de los cuatro anillos y su cadena lateral. En total son 27 átomos de carbono. Los esteroles en los hongos y las plantas, tales como el ergosterol y el estigmasterol son sintetizados por mecanismos similares a los antes mencionados.

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Figura 4.20. Estructura del colesterol.(1)

4.5.3.2. TRANSPORTE Y UTILIZACIÓN. El transporte y el depósito de colesterol en los mamíferos están sometidos a varios mecanismos reguladores desconocidos aún. Los defectos de estos mecanismos conducen a anormalidades patológicas. Frecuentemente, el colesterol se deposita en las paredes internas de los vasos sanguíneos, junto con otros lípidos, constituyendo un estado patológico conocido como arterioesclerosis, que a menudo provoca la obstrucción de los vasos sanguíneos del corazón y del cerebro, provocando ataques al corazón y de apoplejía respectivamente. En los tejidos animales el colesterol es el precursor de otros esteroides entre los que destacan: los ácidos biliares, los esteroles fecales, los andrógenos u hormonas sexuales masculinas, los estrógenos u hormonas sexuales femeninas, la progesterona y las hormonas adrenocorticales.

4.5.3.3. ÄCIDOS BILIARES. Los ácidos biliares son compuestos que se producen por la principal ruta de degradación del colesterol y, entre los cuales destacan, el ácido cólico, el desoxicólico.y el taurocólico. En la figura 4.21 se muestra la estructura de este último.

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Figura 4.21. Estructura del ácido taurocólico. Un ácido biliar.(1)

Los ácidos biliares son compuestos de carácter detergente que ayudan a la emulsión de los lípidos de la dieta y facilitan su absorción intestinal. La ruta principal de degradación del colesterol en los animales es su conversión en ácidos biliares, cuya estructura varía con las especies de un modo característico. Los ácidos biliares se forman en el hígado, en la vesícula biliar específicamente, y son secretados al intestino delgado, donde ayudan a la digestión y absorción de los lípidos de la dieta, formando los quilomicrones, que son pequeñas gotitas de triacilglicéridos estabilizados por pequeñas cantidades de proteína. Los ácidos biliares son reabsorbidos en gran parte durante la absorción de los lípidos. El ciclo de secreción y reabsorción de los ácidos biliares se denomina circulación entero hepática.

4.5.3.4. HORMONAS ESTEROIDALES. Las hormonas esteroidales son los andrógenos u hormonas sexuales masculinas, los estrógenos u hormonas sexuales femeninas, la progesterona, que es la hormona progestativa de la placenta y del cuerpo lúteo, así como los corticosteroides adrenales. La producción de hormonas esteroides a partir del colesterol se realiza con una formación intermedia de pregnenolona, que contiene el núcleo del colesterol, pero una cadena lateral de sólo dos átomos de carbono. En las figura 4.17 y 4.22 se ilustran las estructuras de algunas de las principales hormonas esteroides.

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Figura 4.22. Estructura de algunas hormonas esteroides.(7)

La pregnenolona, es el precursor de la progesterona que, a su vez, es precursora de los andrógenos, tales como la androsterona y la testosterona, de los estrógenos, como la estrona y el estradiol, así como de los corticosteroides adrenales corticosterona y aldosterona. En la figura 4.23 se ilustra un esquema general para la síntesis de la mayoría de los lípidos. Como se puede apreciar, la molécula de acetil-S-CoA proveniente de la degradación de carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos, es la precursora clave para la biosíntesis de todos ellos.

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Figura 4.23. Esquema general para la biosíntesis de algunos lípidos a partir de acetil-SCoA como precursora común.(1)

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UNIDAD V. CICLO DE KREBS. 5.1. INTRODUCCIÓN AL CICLO DE KREBS. El ciclo de Krebs, llamado también ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos, debe su nombre al bioquímico alemán de origen inglés Hans Adolf Krebs, quien lo postuló en 1937. Fue la culminación de un brillante trabajo experimental que figura entre las investigaciones clásicas de la biología moderna.En ella intervinieron investigadores de diferentes países entre los que destacan los trabajos de T. Thunberg, de F. Battelli, L.S. Stern, Szent-Gôrgyi, C. Martius y F. Knoop. A partir de todos los experimentos realizados por estos investigadores, Krebs postuló lo que denominó ciclo del ácido cítrico como la principal ruta de oxidación de los glúcidos. El ácido cítrico es el primer ácido tricarboxílico formado por la condensación de la acetil-S-CoA y el oxaloacetato. En la actualidad se emplea de manera indistinta los nombres de ciclo del ácido cítrico, ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs. Los trabajos de E.P. Kennedy y de A.L. Lehninger en 1948, condujeron a identificar la localización de las enzimas del ciclo. Todas las reacciones del ciclo tienen lugar dentro del compartimiento interno de la mitocondria, comúnmente llamada matriz mitocondrial. Algunas enzimas se encuentran libremente en la fracción soluble de la matriz mitocondrial mientras que otras se encuentran ligadas a la membrana interna de la mitocondria. Algunas de ellas, incluso, se les ha encontrado en el citoplasma celular. El ciclo de Krebs es la ruta central común para la degradación oxidativa de todos los radicales acetilo provenientes del catabolismo de los carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos. Es una secuencia de reacciones que tiene efecto de manera universal en todos los organismos aerobios. Esta catalizada por un sistema multienzimático que acepta el grupo acetilo de la acetil-S-CoA como combustible, degradándolo hasta CO 2 y átomos de hidrógeno. Estos últimos son conducidos por las coenzimas FAD y NAD hasta una secuencia de enzimas transportadoras de electrones, las oxidorreductasas, hasta el oxígeno molecular, el cual se reduce para formar H2O. En la figura 5.1 se muestra el esquema general de la respiración. En él se puede ver que el proceso global de la degradación oxidativa de los carbohidratos, las grasas y las proteínas está constituido de tres fases: fase I, obtención y movilización de acetil-S-CoA, fase II, ciclo de Krebs y, fase III, cadena respiratoria y fosforilación oxidativa.

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Figura 5.1. Esquema general de la degradación oxidativa completa de carbohidratos, grasas y proteínas. Se ilustran las tres fases de la respiración.(1)

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5.1.1. CONVERSIÓN DE PIRUVATO A Acetil-S-CoA. SISTEMA PIRUVATO . DESHIDROGENASA. Aunque esta reacción no pertenece al ciclo de Krebs, es una reacción preparatoria para la oxidación de las moléculas de piruvato provenientes de la degradación de los carbohidratos, vía glucólisis y de la degradación oxidativa de algunos aminoácidos. La oxidación del piruvato a acetil-S-CoA está catalizada por el complejo de lapiruvato dehidrogenasa. Fue descrita por L.J. Reed y colaboradores. Es irreversible en tejidos animales. El complejo está formado por tres enzimas diferentes: E1 piruvato deshidrogenasa, E2 dihidrolipoil transacetilasa y E3 dihidrolipoil deshidrogenasa-FAD; y cinco coenzimasdistintos: FAD, NAD, CoA-SH, pirofosfato de tiamina y ácido lipoico. La reacción global es: Piruvato + NAD+ + CoA-SH ==== acetil-S-CoA + CO2 + NADH * H+. La reacción está dividida en cinco etapas: 1) la condensación del radical acetilo a la enzima piruvato deshidrogenasa con liberación de CO2 Piruvato + E1- TPP ====== Acetil-TPP-E1 + CO2 2) la transferencia del radical acetilo a la enzima dihidrolipoil transacetilasa Acetil-TPP-E1 + E2S-S ========= TPP-E1 + Acetil-S-SH-E2 3) la transferencia del radical acetilo a la CoA-SH Acetil-S-SH-E2 + CoA-SH =====Acetil-S-CoA + E2S-S 4) la transferencia de electrones de la enzima dihidrolipoil transacetilasaa la enzima dihidrolipoil deshidrogenasa-FAD E2-SHSH + dihidrolipoil deshidrogenasa-FAD ==== E2S-S + dihidrolipoil deshidrogenasa-FADH2 5) la transferencia de electrones de la dihidrolipoil deshidrogenasa-FADH2 al NAD+ dihidrolipoil deshidrogenasa-FADH2 + NAD+ ======= dihidrolipoil deshidrogenasa-FAD + NADH + H+ La actividad del complejo piruvato deshidrogenasa está regulada por el nivel de ATP y Ca+2. Cuando el nivel de ATP es elevado, el complejo se fosforila por una quinasa y se inactiva, haciendo más lenta la velocidad de formación de acetil-S-CoA. Sin embargo,

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cuando los niveles de ATP son bajos y se dispone de suficiente piruvato, el complejo se activa, al desfosforilarse la deshidrogenasa inactiva.

5.2. REACCIONES DEL CICLO DE KREBS. En la figura 5.2 se ilustra el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs. Ahí aparecen la estructuras de todos los intermediarios del ciclo así como reactantes, productos y enzimas que participan en las reacciones. Reacción 1.Enzima: citrato-sintetasa. Acetil-S-CoA + oxaloacetato + H2O ======= citrato + CoA-SH El ∆Go’ = - 7.7 Kcal/mol. Esta reacción constituye la primera etapa condicionante del ciclo. Esta reacción es fuertemente inhibida por altas concentraciones del succinil-S-CoA ya que compite con el acetil-S-CoA por el sitio activo de la enzima. También resulta inhibida por el ATP, NADH y ésteres de la CoA-SH y ácidos grasos de cadena larga. Reacción 2.Enzima: aconitasa o aconitato-hidratasa. Citrato – H2O ======= [cis-aconitato] + H2O ======= isocitrato El ∆Go’ = + 3.18 Kcal/mol Aunque el equilibrio de la reacción está orientado a la formación del citrato por el cambio de energía libre positivo, el isocitrato se oxida rápidamente impulsando, de esta manera, la reacción en sentido para la formación del isocitrato. La enzima contiene Fe(II) y requiere de un tiol reducido como la cistina o glutatión. Reacción 3. Enzima: isocitrato-deshidrogenasa. Isocitrato + NAD+== α-cetoglutarato + CO2 + NADH + H+ El ∆Go’ = - 5.0 Kcal/mol La enzima requiere de Mg+2 para su actividad y es fuertemente estimulada por el ADP. Sin embargo, es inhibida por NADH y por el ATP. Es la primera reacción de descarboxilación de las dos que tiene el ciclo.

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Figura 5.2. Esquema general del ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs.(3) Reacción 4. Enzima: complejo α-cetoglutarato-deshidrogenasa. α-cetoglutarato + NAD+ + CoA-SH === succinil-S-CoA + CO2 + NADH + H+ El ∆Go’ = - 8.0 Kcal/mol Esta reacción es similar a la oxidación del piruvato para dar acetil-S-CoA y se produce por el mismo mecanismo de reacción. Participan las coenzimas pirofosfato de timina, ácido lipoico, CoA-SH, FAD y el NAD+. El producto de esta reacción es un tioéster del ácido succínico, con un elevado contenido energético de hidrólisis. Esta es la segunda descarboxilación del ciclo. Reacción 5. Enzima: succinil-S-CoA-sintetasa. Succinil-S-CoA + ADP + Pi ====== succinato + CoA-SH + GTP El ∆Go’ = - 0.7 Kcal/mol P á g i n a | 145

En esta reacción el succinil-S-CoA sufre la pérdida del grupo CoA-SH por un mecanismo de conservación de energía, en el que participa el GDP, único nucleótido reconocido por la enzima en tejidos animales. La formación de GTP o ATP acoplada a la desacilación de algún tioéster, como en este caso, recibe el nombre de fosforilación a nivel de sustrato, para diferenciarla de la fosforilación de la cadena respiratoria. Reacción 6. Enzima: succinato-deshidrogenasa. Succinato + FAD ===== fumarato + FADH2 El ∆Go’ = 0.0 Kcal/mol La enzima es una flavoproteína alostérica que tiene FAD unido covalentemente. Se encuentra unida fuertemente a la membrana interna de la mitocondria por lo que ha sido muy difícil su aislamiento y purificación. Es activada por el succinato, ATP, fosfato y por la CoQ reducida. Y es inhibida por bajas concentraciones de oxaloacetato. Reacción 7. Enzima: fumarato-hidratasa o fumarasa. Fumarato + H2O ====== L-malato El ∆Go’ = 0.0 Kcal/mol Lo más relevante de esta reacción es que la enzima fumarasa solo produce el Lestereoisómero debido a la configuración trans- del doble enlace del fumarato. No precisa de ninguna coenzima y el ATP reduce su afinidad por el fumarato. Reacción 8. Enzima: L-malato-deshidrogenasa. L-malato + NAD+ ===== oxaloacetato + NADH + H+ El ∆Go’ = + 7.1 Kcal/mol Última reacción del ciclo. Aunque es fuertemente endergónica, la reacción se realiza en el sentido en que está escrita debido a la rápida eliminación de los productos. La enzima es altamente específica al L-estereoisómero.

5.2.1 ENZIMAS PARTICIPANTES. Todas las enzimas que participan en el ciclo de Krebs están plenamente identificadas. En la tabla 5.1 se muestran cada una de ellas y se indica la reacción que catalizan.

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Tabla 5.1. Enzimas que participan en el ciclo de Krebs.(3) Enzima

Reacción que cataliza

citrato-sintetasa. Condensación del acetil-S-CoA con el oxaloacetato aconitasaConversión de citrato en isocitrato isocitrato-deshidrogenasa Oxidación del isocitrato a α-cetoglutarato α-cetoglutarato-deshidrogenasa Oxidación de α-cetoglutarato a succinil-S-CoA succinil-S-CoA-sintetasa Desacilación del succinil-S-CoA succinato-deshidrogenasa Oxidación del succinato a fumarato fumarato-hidratasa Hidratación del fumarato L-malato-deshidrogenasa Oxidación del L-malato a oxaloacetato

En cada una de las reacciones que se describieron en el apartado 5.2 se dan las características de cada una de ellas. 5.2.2. MARCAJE ISOTÓPICO DEL CICLO. Se ha comprobado, mediante ensayos isotópicos estrictos que emplean precursores e intermediarios del ciclo, marcados con uno de los isótopos C13 ó C14, que este se lleva a cabo íntegramente en las células aerobias intactas. Dichos experimentos permitieron interpretar cuantitativamente la oxidación de carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos. Sin embargo, en los primeros experimentos con isótopos marcados se encontró algo inesperado. Al incubar acetato marcado con carbono isotópico, con una suspensión de tejido que llevaba a cabo oxidación del ciclo, era de esperarse que, al condensarse con el oxaloacetato no marcado, el citrato resultante estuviera marcado en un grupo carboxilo. Sin embargo, el análisis isotópico del α-cetoglutarato marcado de la suspensión del tejido mostraba que el isótopo introducido originalmente como carbono carboxílico del acetato, se encontraba solamente, en el grupo ‫ץ‬-carboxilo del α-cetoglutarato. Por tanto, se concluyó que el citrato no podía ser intermediario en la ruta de la transformación del acetato en αcetoglutarato. Esto condujo a postular que un ácido asimétrico tricarboxílico como el cisaconitato o isocitrato debía ser el primer producto de condensación formado entre el acetato y el oxaloacetato. Se ha demostrado con trazadores isotópicos que las dos mitades del citrato en el ciclo no son equivalentes. Sin embargo, el modo preciso y la geometría por el cual el centro activo de la aconitasa reconoce y se une de modo específico una de las dos mitades de la molécula de citrato no se conocen aún. Experimentos efectuados en el ciclo de Krebs con otros precursores marcados como el CH 3COOH, CH3COCOOH y HCO3H-, mostraron que se formaban intermediarios del ciclo marcados con los isótopos en posiciones que eran compatibles no solamente con la ruta postulada para las reacciones del ciclo, sino también, con las reacciones asimétricas mediante las que se forma el citrato y se convierte en α-cetoglutarato. Cuando se incorpora una molécula de ácido acético al ciclo, las dos moléculas de dióxido de carbono que se desprenden en una vuelta del ciclo no proceden de los mismos dos átomos de carbono introducidos en forma de acetato; estos dos últimos carbonos permanecen en los ácidos dicarboxílicos de cuatro átomos de carbono.

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5.2.3. BALANCE ENERGÉTICO. Después de que un radical acetilo proveniente del acetil-S-CoA ha sido oxidado por completo por las ocho enzimas del ciclo de Krebs, ahora podemos escribir la ecuación global de la siguiente manera: Acetil-S-CoA + 2 H2O + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi ======= 2 CO2 + 3 NADH `+ 3 H+ + FADH2 + GTP + CoA-SH El GTP puede transferir un Pi al ADP para formar ATP: GTP + ADP ===== GDP + ATP De modo que en la ecuación global final aparece el ATP en lugar del GTP. Acetil-S-CoA + 2 H2O + 3 NAD+ + FAD + ADP + Pi ======= 2 CO2 + 3 NADH `+ 3 H+ + FADH2 + ATP + CoA-SH Esta ecuación global se obtiene al acoplar las ocho reacciones del ciclo, eliminando los conceptos que aparezcan en ambos la de la reacción. El ∆Go’global se obtiene al sumar algebraicamente los cambios de energía libre de las ocho reacciones. Así tenemos: El ∆Go’=-7.7 +3.18 –5.0 –8.0 0.7 +0 +0 +7.1= -21.4 + 10.28 = -11.12 Kcal/mol El cambio de energía global de un ciclo es de ∆Go’ = - 11.12 Kcal/mol. Sin embargo, como se indicó en el capítulo anterior, los pares de electrones que se producen durante el ciclo en forma de NADH y FADH 2 son conducidos y transportados por las enzimas de la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular para producir H2O. Durante este transporte se libera energía suficiente para producir ATP mediante la fosforilación oxidativa. Cada par de electrones que se transporta por la cadena respiratoria desde el NADH rinde 3 ATP, mientras que los que ingresan a partir del FADH 2 rinden solo 2 ATP. De modo que el balance energético final incluyendo la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa es: Acetil-S-CoA + 12 ADP + 12 Pi ===== 2 CO2 +12 ATP `13 H2O + CoA-SH 5.2.4 NATURALEZA ANFIBÓLICA DEL CICLO. Cuando el nivel energético del organismo es alto, es decir, cuando la concentración de ATP y las necesidades energéticas del organismo han sido cubiertas, los intermediarios del ciclo de Krebs se convierten en precursores para la síntesis de otros compuestos importantes como carbohidratos, ácidos grasos o aminoácidos. El ciclo pasa de ser un proceso P á g i n a | 148

catabólico a ser un proceso anabólico. Es por eso que se dice que el ciclo de Krebs es de naturaleza anfibólica. El ATP es un fuerte inhibidor de los procesos catabólicos y un importante activados de los procesos anabólicos. En la figura 5.3 se ilustra la manera en que los intermediarios del ciclo se transforman en importantes precursores de otros compuestos. Por ejemplo, el α-cetoglutarato y el oxaloacetato sirven de precursores para la síntesis de algunos aminoácidos: α-cetoglutarato + alanina == glutamato + piruvato Oxaloacetato + alanina ==== aspartato + piruvato El citrato también puede ser un precursor de acetil-S-CoA el cual se destina para la síntesis de ácidos grasos: Citrato + ATP + CoA-SH ====== acetil-S-CoA + oxaloacetato `ADP + Pi Otros intermediarios como el succinil-S-CoA sirve como precursor del grupo hemo y de las porfirinas. El oxaloacetato es precursor para la síntesis de carbohidratos, otros aminoácidos y pirimidinas. En fin, en la figura 5.3 se resumen los procesos de síntesis a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs. 5.2.5. REACCIONES ANAPLERÓTICAS. Debido a que las reacciones anabólicas consumen grandes cantidades de energía, los niveles de ATP disminuyen a tal grado que la concentración de ADP se convierte en un factor de inhibición de las reacciones de síntesis, activándose nuevamente los procesos catabólicos proveedores de energía. Los intermediarios del ciclo pueden reponerse por, medio de reacciones enzimáticas especiales llamadas reacciones anapleróticas, que significa<de relleno>.

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Figura 5.3. Esquema general donde se muestra la participación de los intermediarios del ciclo de Krebs como precursores de otros compuestos.(1)

Una de las reacciones anapleróticas más importantes es la carboxilación enzimática del piruvato para dar oxaloacetato por medio de la acción de la enzima mitocondrial piruvatocarboxilasa, Mn+2 como cofactor. Piruvato + CO2 + ATP + H2O ===== oxaloacetato + ADP + Pi En ciertos tejidos animales, el piruvato puede convertirse en oxaloacetato siempre y cuando los intermediarios de ciclo y el ATP estén en déficit. La piruvato-carboxilasa en una enzima alostérica. Su modulador positivo es la acetil-S-CoA. De tal manera que, cuando se acumula acetil-S-CoA, se estimula esta reacción para producir más oxaloacetato permitiendo con esto que el ciclo oxide una mayor cantidad de acetil-S-CoA. Otra reacción anaplerótica no menos importante es la catalizada por la enzima malatodeshidrogenasa: Piruvato + CO2 + NADPH + H+====== L-malato + NADP+

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Algunos aminoácidos también pueden actuar como precursores de intermediarios del ciclo por medio de enzimas transaminasas. Glutamato + piruvato ==== α-cetoglutarato + alanina Aspartato + piruvato ==== oxaloacetato + alanina Otras reacciones anapleróticas son: Fosfoenolpiruvato + CO2 + GDP ===== oxaloacetato + GTP Fosfoenolpiruvato + HCO3- ====== oxaloacetato + Pi Catalizadas por la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa y la fosfoenolpiruvato carboxilasa respectivamente. En las plantas y muchos microorganismos, el ciclo del glioxalato se convierte en un medio importante para la reposición de los intermediarios del ciclo de Krebs.

5.2.6. REGULACIÓN DEL CICLO DE KREBS. En la figura 5.4 se ilustra en resumen los mecanismos de regulación del ciclo de Krebs. La actividad del complejo piruvato-deshidrogenasa se ve inhibida por la fosforilación ATP-dependiente y activada por una desfosforilación de una fosfoenzima. La condensación del acetil-S-CoA con el oxaloacetato es el punto de control primario del ciclo de Krebs en la mayoría de los tejidos. Sin embargo, existen otras reacciones del ciclo que se hallan bajo regulación alostérica. Una de ellas es la reacción de la isocitrato-deshidrogensa dependiente del NAD, que requiere ADP como modulador alostérico estimulante. En algunos tejidos, el Ca+2 actúa también como modulador positivo de esta reacción. Otra reacción regulada es la catalizada por la enzima succinato-deshidrogenasa, la cual es inducida por altas concentraciones de succinato, fosfato, ATP y de ubiquinona reducida y, es potentemente inhibida por el oxaloacetato.

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Figura 5.4 Regulación de la oxidación de la acetil-S-CoA por la vía del ciclo de Krebs.(1) El ciclo de Krebs se halla también regulado por la concentración de algunos intermediarios mediante una red compleja de controles específicos, debido a que también participa en procesos anabólicos.

5.3. CICLO DEL GLIOXALATO. El ciclo del glioxalato es una forma modificada del ciclo de Krebs que tiene lugar en la mayoría de las plantas y microorganismos, pero no se presenta en tejidos animales. Su principal función es permitir a los vegetales y microorganismos el empleo del acetato de la acetil-S-CoA y de los ácidos grasos como fuente carbonada para la síntesis de carbohidratos. En la figura 5.5 se ilustra el esquema general del ciclo del glioxalato.

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Figura 5.5. Esquema general del ciclo del glioxalato.(1)

La diferencia que tiene este ciclo con el de Krebs es que las dos reacciones de descarboxilación que eliminan los átomos de carbono que ingresan como radical acetilo de la CoA-SH son evitadas mediante un rodeo de reacciones catalizadas por dos enzimas específicas y exclusivas de plantas y microorganismos, lo que se traduce en la síntesis de succinato. En las plantas y microorganismos ambos ciclos pueden actuar simultáneamente, el de Krebs para proporcionar energía mediante la fosforilación oxidativa y, el segundo, para proporcionar succinato destinado a la síntesis de carbohidratos a partir de los ácidos grasos. Las enzimas exclusivas del ciclo del glioxalato se encuentran en los glioxisomas. Estas son: la isocitrato-liasa y la malato-sintetasa.

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5.3.1. REACCIONES DEL CICLO DEL GLIOXALATO. Las primeras reacciones del ciclo del glioxalato son similares a las del ciclo de Krebs: Acetil-S-CoA + oxaloacetato + H2O ======= citrato + CoA-SH Citrato – H2O ====== [cis-aconitato] + H2O ====== isocitrato La siguiente reacción es catalizada por la isocitrato-liasa Isocitrato ===== succinato + glioxalato En la siguiente reacción, la malato-sintetasa realiza la condensación del glioxalato con una segunda molécula de acetil-S-CoA para rendir L-malato. Glioxalato + acetil-S-CoA + H2O ====== L-malato + CoA-SH En la última reacción del ciclo, el L-malato se oxida a oxaloacetato por acción de la malato-dehidrogenasa. L-malato + NAD+ ======= oxaloacetato + NADH + H+ De esta manera se concluye un ciclo rindiendo como producto una molécula de succinato de cuatro átomos de carbono a partir de dos moléculas de acetil-S-CoA. La reacción global del ciclo del glioxalato es la siguiente: 2 Acetil-S-CoA + NAD+ + 2 H2O ===== succinato + 2 CoA-SH + NADH + H+

5.3.2. RELACIÓN CON LA SÍNTESIS DE GLUCOSA. El ciclo del glioxalato tiene especial importancia en las semillas de las plantas, las cuales pueden convertir los restos de acetilo provenientes de la oxidación de las grasas en carbohidratos, por medio del succinato, el cual se convierte fácilmente en oxaloacetato vía ciclo de Krebs. Este último sale de la mitocondria al citosol donde es descarboxilado en piruvato el cual, por algunas reacciones reversibles de la glucólisis puede convertirse en nueva glucosa vía gluconeogénesis.

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UNIDAD VI. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Y FOTOFOSFORILACIÓN. 6.1.

FOSFORILACIÓN OXIDATIVA.

La fosforilación oxidativa es el principal mecanismo de recuperación de la energía química que se libera en la cadena respiratoria La fosforilación oxidativa es fundamental para todos los aspectos de la vida celular en los organismos aerobios ya que constituye su principal fuente de energía útil. Constituye también un importante problema de investigación en la bioquímica moderna, cuya resolución final dependerá de la comprensión detallada de la organización molecular de la membrana interna mitocondrial, que es el núcleo de este importante sistema de transducción de energía. Debido a que la energía recuperada en forma de ATP en la fosforilación oxidativa proviene de la transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria, es prioritario estudiar y comprender en detalle, primeramente cómo está constituido este sistema de transporte de electrones, cómo funciona, cómo se regula y la cantidad de energía liberada cuando un par de electrones viaja hasta el oxígeno molecular.

6.1.1. CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES. La cadena de transporte de electrones, también llamada cadena respiratoria, es un sistema integrado por ocho enzimas oxido-reductasas, encargadas de transportar los electrones provenientes de los combustibles orgánicos, intermediarios del ciclo de Krebs y de otros sustratos hasta el oxígeno molecular. Este proceso es la fuente principal ara las actividades vitales de la célula, ya que libera una gran cantidad de energía libre, gran parte de la cual se recupera en forma de energía de enlace fosfato del ATP mediante la fosforilación oxidativa. En la figura 6.1 se muestra un esquema general del sistema de transporte de electrones también llamado cadena respiratoria. En él se indican los tres puntos en los cuales se libera suficiente energía para la síntesis de ATP mediante el mecanismo de la fosforilación oxidativa. La cadena respiratoria está localizada en la membrana interna de la mitocondria. Está constituida por ocho enzimas óxido-reductasas, cada una de ellas con un potencial estándar de reducción, Eo’, el cual puede medirse por técnicas analíticas y puede emplearse para determinar el cambio de energía libre de cada una de las transferencias de electrones.

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Figura 6.1. Esquema general del sistema de transporte de electrones o cadena respiratoria. En él se indican los puntos de recuperación de energía en forma de ATP por medio de la fosforilación oxidativa.(2)

En la tabla 6.1 se muestran los componentes de la cadena respiratoria, así como sus potenciales estándar de reducción de cada uno de ellos. Tabla 6.1. Potenciales estándar de reducción de los componentes de la cadena respiratoria, expresados sobre la base de transferencias de dos electrones, a pH de 7.0 a 25oC.(1) Reacción NAD+ + 2 H+ + 2 e-== NADH + H+ - 0.32 FAD + 2 H+ + 2 e- == FADH2 - 0.06 CoQ + 2 H+ + 2 e- == CoQH2 2 citocromo b(ox) + 2 e-=== 2 citocromo b (red) + 0.03 2 citocromo c1(ox) + 2 e-=== 2 citocromo c1(red) 2 citocromo c(ox) + 2 e-=== 2 citocromo c (red) + 0.235 2 citocromo a(ox) + 2 e-=== 2 citocromo a (red) 2 citocromo a3(ox) + 2 e-=== 2 citocromo a3(red) ½ O2 + 2 H+ + 2 e- ===== H2O

Eo’ (Volt)

+ 0.10 + 0.225 + 0.210 + 0.385 + 0.816

6.1.2. SISTEMA MITOCONDRIAL. El número de mitocondrias por molécula es relativamente constante y característico para

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característico para cada tipo de célula. Se hallan localizadas con frecuencia en las proximidades de las estructuras que necesitan ATP, o cerca de una fuente de combustible. Pueden llegar a representar una fracción relativamente grande del volumen citoplasmático total, el cual puede ir de un 20 hasta un 50 % del total. Básicamente, una mitocondria tiene definidas cuatro secciones o partes en que se dividen los sistemas multienzimáticos: membrana externa, membrana interna, crestas mitocondriales y la matriz mitocondrial, generalmente llamada mitoplasto. La membrana interior contiene las enzimas de la cadena respiratoria como son los citocromos b, c1, c, a y a3, la ATPasa F1, asociada al mecanismo de fosforilación oxidativa, así como ciertas deshidrogenasas como la del NADH y FADH2. La membrana externa no contiene ninguno de los componentes antes mencionados, pero posee varias enzimas ausentes en la membrana interior. La matriz mitocondrial contiene la mayoría de las enzimas del ciclo de Krebs. En la figura 6.2 se ilustra la estructura genérica de una mitocondria.

Figura 6.2. Representación de una mitocondria en la que se muestra la representación tridimensional de las membranas.(9)

6.1.3. BALANCES ENERGÉTICOS. Como se estudió en el capítulo 1, los cambios de energía libre de las reacciones químicas pueden determinarse por la siguiente ecuación: P á g i n a | 157

∆Go’ = - RT ln Keq Sin embargo, para calcular los cambios de energía libre en las reacciones de transferencia de electrones de la cadena respiratoria, se debe aplicar otra ecuación, en la que se involucra el cambio de potenciales estándar de reducción de cada par redox conjugados. La ecuación es la siguiente: ∆Go’ = - nF ∆Eo’ Dónde: nes el número de electrones transferidos (2) F es la constante de Faraday que equivale a 23.062 Kcal/molV ∆Eo’ es la diferencia entre los potenciales estándar de reducción de los reactantes Considerando los potenciales estándar de reducción mostrados en la tabla 6.1 y aplicando la ecuación anterior, se obtienen los cambios de energía libre para cada una de las reacciones de la cadena respiratoria. Cómo ejemplo haremos el cálculo para la primera reacción: NADH + H+ + FAD ===== NAD+ + FADH2 ∆Go’= - (2) (23.062 Kcal/molV) (-0.06 – (-0.32) V) = - 11.99 Kcal/mol Si consideramos las ocho reacciones de la cadena respiratoria tenemos: ∆Go’ = - (2) (23.062 Kcal/molV) (+ 0.816 – (-0.32) V) = - 52.4 Kcal/mol Esto quiere decir que, cada vez que un par de electrones se transporta a través de la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular, hay un descenso de energía libre de – 52.4 Kcal/mol, lo cual permitiría la síntesis, no de una, sino de varias moléculas de ATP. ADP + Pi==== ATP + H2O

∆Go’ = `+ 7.3 Kcal/mol.

Haciendo el cálculo para cada una de las ocho reacciones de la cadena respiratoria y, cómo se puede apreciar en la figura 6.1, existen tres puntos en los cuales se libera suficiente energía libre para la síntesis de ATP, a saber: la primera, la cuarta y la última reacción. Ahora podemos escribir las ecuaciones globales, con sus respectivos cambios de energía libre, cuando los electrones ingresan a la cadena respiratoria como NADH y FADH2. NADH + H+ + ½ O2 ========= NAD+ + H2O ∆Go’ = - 52.4 Kcal/mol 3 ADP + 3 Pi

======== 3 ATP + 3 H2O ∆Go’ = + 21.9 Kcal/mol

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Al acoplar estas reacciones tenemos: NADH + H+ + ½ O2 +3 ADP + 3 Pi ===== NAD+ + 3 ATP + 4 H2O ∆Go’ = - 30.5 Kcal/mol Y, FADH2 + ½ O2 ========= FAD+ H2O ∆Go’ = - 40.41 Kcal/mol 2 ADP + 2 Pi

======== 2 ATP + 2 H2O ∆Go’ = + 14.6 Kcal/mol

Al acoplar estas reacciones tenemos: FADH2 + ½ O2 +2 ADP + 2 Pi ===== FAD + 2 ATP + 3 H2O ∆Go’ = - 37.8 Kcal/mol 6.1.4. AGENTES DESACOPLANTES E INHIBIDORES. Se han encontrado una serie de sustancias que bloquean o inhiben el sistema de transporte de electrones de manera específica en diferentes sitios, que han proporcionado importantes datos sobre la secuencia de las enzimas transportadoras de la cadena respiratoria. En la figura 6.3 se indican estos inhibidores y los sitios específicos de acción. Se han identificado tres sitios de acción: el primero es en la reacción del complejo NADFAD. En esta etapa participan activamente la rotenona, sustancia vegetal sumamente tóxica que emplean los indios sudamericanos como veneno para cazar y, actualmente, empleado como insecticida; el barbitúrico amital, y el antibiótico piericidina. Estos tres compuestos actúan sobre la NAD-deshidrogenasa. El segundo punto de bloqueo es la reacción entre los citocromos b y el c. En esta etapa el inhibidor característico es la actimicinaA. Una tercera clase de inhibidores bloquea la transferencia de electrones del citocromo aa3 al oxigeno molecular. En este grupo de bloqueadores están el cianuro, el sulfuro de hidrógeno y el monóxido de carbono los cuales actúas sobre la citocromooxidasa. La fosforilación oxidativa resulta inhibida por cierto número de agentes químicos llamados agentes desacopladores que pueden agruparse en dos grupos principales: los agentes desacoplantes 2,4-dinitrofenol, dicumarol, fenilhidrazonas del cianuro de carbonilo, salicilanilidas y el arsianato; y los inhibidores de la formación de ATP oligomicina, rutamicina, aurovertina y la trietiltina.

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Figura 6.3. Principales inhibidores y desacoplantes de la cadena de transporte de electrones y los sitios de acción.(3)

6.1.5. MODELOS PARA EXPLICAR LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. Se han propuesto varias hipótesis para explicar la forma en que la energía libre liberada durante el transporte de electrones se convierte en energía del enlace fosfato del ATP. Tres son los modelos que han llamado más la atención: la hipótesis del acoplamiento químico, la del acoplamiento conformacional y la del acoplamiento quimiosmótico. Todas ellas poseen una amplia aceptación en la biología celular ya que son aplicables también a la fosforilación fotosintética. La hipótesis del acoplamiento químico postula que la reacción de transferencia electrónica productora de energía se acopla a la reacción consumidora de energía en la que se forma ATP a partir del ADP y Pi, a través de un intermediario común, compuesto de elevada energía, empleado como reactivo en una segunda reacción. Una reacción muy similar a la de la 3-fosfogliceraldehído.deshidrogenasa de la glucólisis. Esta hipótesis tiene dos grandes limitaciones: la primera es que tal intermediario de energía elevada no ha sido identificado aún en las mitocondrias por lo que, la creencia de muchos investigadores, es que dicho intermediario no existe y, la segunda limitación es que esta hipótesis no proporciona una explicación satisfactoria del hecho de que la membrana mitocondrial interna debe permanecer intacta y contínua para que tenga lugar la fosforilación oxidativa. La hipótesis del acoplamiento conformacional postulada por P.D. Boyer dice que la energía producida en el transporte de electrones se conserva en forma de un cambio conformacional provocado en una proteína transportadora de electrones (ATPasa F 1). Se ha propuesto que la energía inherente a esta conformación energizada es empleada para provocar la formación de ATP a partir del ADP y Pi, al mismo tiempo que la proteína transportadora de la energía experimenta una reversión a su estado nativo, de bajo contenido energético. Un modelo similar a esta hipótesis se produce cuando el sistema de la actinomiosina del músculo esquelético produce ATP y se hidroliza para liberar ADP. Un hecho que favorece esta hipótesis es la observación que la membrana mitocondrial interna P á g i n a | 160

experimenta cambios fisicoquímicos muy rápidos a medida que los electrones circulan a través de la cadena respiratoria.

6.1.5.1 LA TEORÍA QUIMIOSMÓTICA. Esta hipótesis fue propuesta por el bioquímico británico P. Mitchell en 1961 y la cual niega la existencia de cualquier intermediario químico común que acople las reacciones productoras con las consumidoras de energía en la fosforilación oxidativa. Él propuso que las reacciones están acopladas por un estado intermedio de energía elevada en el que, existe un gradiente electroquímico de iones H+ a través de la membrana mitocondrial interna que sirve para acoplar el flujo de energía del transporte electrónico para la formación del ATP. La membrana interna constituye una parte integral del mecanismo de acoplamiento y debe hallarse intacta para que verifique la fosforilación oxidativa. Se ha considerado que este gradiente electroquímico es el que impulsa la síntesis de ATP, provocando la deshidratación del ADP y el Pi por acción del complejo ATPasa F 1-F0 de la membrana interna. La reacción de síntesis del ATP es la siguiente: ADP + Pi ==== ATP + H2O

∆Go’ = + 7.3 Kcal/mol

6.1.5.2. ATP Sintasas. La membrana interna mitocondrial aporta .las enzimas del transporte electrónico, mientras que la fracción proteica soluble, representa el complejo enzimático para la producción de ATP. Las proteínas solubles que se necesitan para restaurar la actividad acoplante de energía en la membrana mitocondrial se llaman factores acoplantes. El factor acoplante soluble se llama F1 (Factor 1), debido a que también cataliza la hidrólisis del ATP también es conocido como ATPasa F1. En presencia de Mg+2 , el F1 cataliza la hidrólisis lenta del ATP a ADP y Pi, reacción que no es inhibida por la oligomicina. Esta actividad ATPásica, representa la inversión de la función normal del F1 en las mitocondrias intactas, a saber, la síntesis del ATP a partir del ADP y Pi. El Factor F1 debería llamarse ATP-sintasa, con más propiedad que la ATPasa. El factor F1 es inestable a 0oC, pero es relativamente estable a la temperatura ambiente. La molécula de F1 se liga fuertemente al ADP pero no al fosfato. El antibiótico aurovertina, inhibe la unión ADP-F1. Otra proteína específica que interviene en el acoplamiento de la síntesis del ATP al transportador electrónico es el factor que confiere sensibilidad frente a la oligomicina (OSCF o F0). Al añadir el factor F0 al factor F,la actividad de la ATPasa de las vesículas es

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inhibida por la oligomicina. El factorF0 confiere, por ello, sensibilidad frente a la oligomicina al factor F1.

6.1.6. CONTROL DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. El transporte de electrones se efectúa a velocidad máxima en las mitocondrias intactas solo cuando hay suficiente ADP y Pi en el medio de suspensión. Cuando solo falta ADP, la velocidad de la respiración es muy baja y no se produce fosforilación debido a la inexistencia de aceptor de fosfato. Esta situación, que se conoce cómo estado 4 de la respiración, es el estado lento o de reposo de la respiración. Al añadir una cantidad conocida de ADP a este sistema, el consumo de oxígeno experimenta un brusco incremento hasta un valor máximo. Al mismo tiempo se observa que el ADP añadido se fosforila y rinde ATP. Este estado recibe el nombre de respiración activa o estado 3. Cuando se ha fosforilado todo el ADP añadido, la velocidad del consumo del oxígeno desciende drásticamente, y vuelve la velocidad del estado 4 o de reposo. Este fenómeno, en el que la velocidad de transporte se halla controlada por la concentración de ATP, se llama control por el aceptor o control respiratorio. Las mitocondrias intactas poseen una afinidad muy elevada para el ADP, y continuarán fosforilándolo siempre que estén presentes todos los demás todos los demás componentes necesarios hasta que la concentración de ADP sea muy baja. La relación o índice controlaceptor, es la relación entre la velocidad de respiración de la mitocondria en presencia de abundante ADP y la velocidad de respiración en ausencia de ADP. Esta relación es generalmente muy elevada, puede ser igual o mayor a 10 en mitocondrias intactas, y aún más elevada en la célula intacta., Sin embargo, cuando las mitocondrias estás lastimadas o envejecidas, pierden su capacidad para fosforilar el ADP y la relación desciende hasta 1.0. En tales mitocondrias dañadas se produce transporte electrónico a una velocidad máxima en ausencia del ADP. La relación control-aceptor, constituye una medida útil, de la integridad de las mitocondrias aisladas: cuanto más elevada es la relación, menos alteradas se hallan las mitocondrias. Además, la cantidad suplementaria de oxígeno consumido, inducida por una cantidad conocida de ADP, puede proporcionarnos la relación ADO/O, que es igual a la relación P/O.

6.1.7. LA OXIDACIÓN COMPLETA DE LA GLUCOSA. La ecuación global para la oxidación completa de la glucosa es la siguiente: C6H12O6 + 6 O2 + 36 ADP + 36 Pi ====== 6 CO2 + 36 ATP + 42 H2O

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El cambio de energía libre de esta reacción es de ∆Go’ = - 423.2 Kcal/mol La reacción global `puede dividirse en sus dos elementos energéticos: La reacción exergónica: C6H12O6 + 6 O2 ======= 6 CO2 + 6 H2O ∆Go’ = - 686 Kcal/mol Y la reacción endergónica: 36 ADP + 36 Pi ===== 36 ATP + 36 H2O ∆Go’ = + 262.8 Kcal/mol Esto quiere decir que de la energía libre total que se libera en la oxidación completa de la glucosa hasta CO2 y H2O, que es de 686 Kcal/mol, se recuperan 262.8 Kcal en forma de enlace fosfato de 36 ATP, lo que representa una eficiencia de 38 %. (262.8/686) (100) = 38 % El resto de la energía, el 62 %, se pierde en forma de calor.

6.1.8. LA OXIDACIÓN COMPLETA DE UN ÁCIDO GRASO. La ecuación global para la oxidación completa del ácido palmítico hasta CO 2 y H2O es la siguiente: CH3(CH2)14COOH + 23 O2 +129 ADP + 129 Pi == 16 CO2 + 129 ATP + 145 H2O El cambio de energía libre de esta reacción es de ∆Go’ = - 1396.3 Kcal/mol La reacción global `puede dividirse en sus dos elementos energéticos: La reacción exergónica: CH3(CH2)14COOH + 23 O2 ====== 16 CO2 + 16 H2O ∆Go’ = - 2338 Kcal/mol Y la reacción endergónica: 129 ADP + 129 Pi ===== 129 ATP + 129 H2O ∆Go’ = + 941.7 Kcal/mol

Esto quiere decir que de la energía libre total que se libera en la oxidación completa del ácido palmítico hasta CO2 y H2O, que es de 2338 Kcal/mol, se recuperan 94.7 Kcal en forma de enlace fosfato de 129 ATP, lo que representa una eficiencia de 38 %. (941.7/2338) (100) = 40 %

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El resto de la energía, el 60 %, se pierde en forma de calor.

6.1.9. ESTRÉS OXIDATIVO. El 20% del aire que se inhala en la respiración es oxígeno y éste es indispensable para la vida y correcto funcionamiento de todas y cada una de las células del organismo, a las que llega con la sangre tras pasar de los pulmones al torrente sanguíneo. Una pequeña parte de este oxígeno se transforma en la propia célula en una especia reactiva que se caracteriza por tener una actividad oxidativa. Son los llamados radicales libres y su existencia, como la del proceso de oxidación que generan, es fundamental para el equilibrio del organismo; y una vez cumplida su función son eliminados por sustancias antioxidantes, restableciéndose así el equilibrio. Sin embargo, cuando los antioxidantes no son suficientes para contrarrestar los radicales libres y se produce un aumento de la presencia de los mismos en la célula, se produce lo que se denomina como estrés oxidativo y que se caracteriza porque se incrementa la actividad oxidativa en el interior de la célula, originando un cambio estructural y funcional de la misma que acelera su envejecimiento y favorece la apoptosis (muerte celular). La consecuencia de todo ello es que se produce un deterioro de los tejidos y por tanto se favorece la aparición de diferentes patologías graves, entre las que cabe destacar las enfermedades cardiovasculares o incluso el cáncer, además del envejecimiento prematuro de la piel o la aparición de diferentes trastornos neurológicos, y numerosas enfermedades relacionadas con el envejecimiento.

En términos generales, el estrés oxidativo condiciona el metabolismo celular al oxidar los lípidos, las proteínas, los azúcares y los ácidos nucleicos que regulan su funcionamiento normal, causando la rotura o la mutación del ADN. La única manera de contrarrestar la acción de los radicales libres es oponiendo la cantidad necesaria de antioxidantes, como se denomina a las diferentes vitaminas, minerales y enzimas que se sintetizan en el organismo a partir de determinados alimentos y cuya función es la de evitar que se produzca el daño celular. Una alimentación pobre en antioxidantes es, por tanto, una de las causas del estrés oxidativo. Pero también hay otros factores que contribuyen de forma notable a su desarrollo. La contaminación ambiental, el tabaquismo activo y pasivo, la excesiva exposición a luz solar, el consumo excesivo de alcohol, la acción de ciertos medicamentos, la exposición a sustancias tóxicas o una actividad física desequilibrada son tan sólo alguno de esos factores que favorecen la proliferación de radicales libres y, por tanto, el estrés oxidativo. P á g i n a | 164

Pero, al igual que importantes estudios epidemiológicos han demostrado la relación entre el estrés oxidativo y numerosas enfermedades hay otros que demuestran que el porte de antioxidantes a través de la dieta o de suplementos nutricionales propician una reducción de la incidencia de esas mismas enfermedades. En consecuencia, la alimentación es un factor clave en la prevención y el tratamiento del estrés oxidativo. El vino (una copa al día), los frutos rojos, las verduras y legumbres o los cereales integrales son algunos de los alimentos ricos en antioxidantes. El estrés oxidativo  es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de decodificar rápidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. Todas las formas de vida mantienen un entorno reductor dentro de sus células. Este entorno reductor es preservado por las enzimas que mantienen el estado reducido a través de un constante aporte de energía metabólica. Desbalances en este estado normal redox pueden causar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libres que dañan a todos los componentes de la célula, incluyendo las proteínas, los lípidos y el ADN. En el ser humano, el estrés oxidativo y por ende las denominadas especies reactivas del oxígeno (ERO) participan en los mecanismos etiopatogénicos primarios o en sus consecuencias en más de cien enfermedades de gran importancia clínica y social, como la aterosclerosis, la enfermedad de Parkinson,encefalopatía miálgica, sensibilidad química múltiple, periodontitis, varicocele y la enfermedad de Alzheimer y también puede ser importante en el envejecimiento. Sin embargo, las especies reactivas de oxígeno pueden resultar beneficiosas ya que son utilizadas por el sistema inmunitario como un medio para atacar y matar a los patógenos. Las especies reactivas del oxígeno son también utilizadas en la señalización celular. Esta es denominada señalización redox. 6.1.9.1.

ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ERO).

En los seres vivos se producen continuamente, durante su metabolismo fisiológico, reacciones bioquímicas con producción de radicales libres. Procesos oxidativos que si no controlamos, pueden poner en peligro la integridad celular. El conjunto de radicales libres que tienen la capacidad de producir daños oxidativos se les denomina Especies Reactivas del Oxígeno (ROS, según las siglas inglesas de reactive oxygen species ). Estos tienen orígenes distintos, desde mitocondrial hasta factores exógenos (ionización, contaminación, estrés) Las especies reactivas del oxígeno (ROS) incluyen iones  de oxígeno, radicales libres y peróxidos, tanto inorgánicos como orgánicos. Son generalmente moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a la presencia de una capa de electrones de valencia no apareada. Estas especies se forman de manera natural como subproducto del metabolismo normal del oxígeno y tienen un importante papel en la señalización celular. Sin embargo, en épocas de estrés ambiental sus niveles pueden aumentar en

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Se ha venido observando que la correcta modulación de estos radicales libres por parte de los Antioxidantes reduce sensiblemente la aparición de muchos procesos patológicos y mejora la calidad de las producciones (carne, huevos, leche,…) La clave de todo ello es el oxígeno porque aunque la mayoría de los seres vivos dependemos del oxígeno para respirar. A su vez, este elemento es el causante de la oxidación celular, al producir radicales libres. Esto ocurre cuando el organismo metaboliza naturalmente el oxígeno, iniciándose procesos destructivos convertido en radical libre, combinándose con otras moléculas y transformándolas en peligrosas. En un principio todos los radicales libres deberían ser clasificados como nocivos aunque se generan como consecuencia fisiológica del metabolismo porque lo que los hace patogénicos es su aumento incontrolado.Los efectos de las especies reactivas del oxígeno sobre el metabolismo celular han sido bien documentadas en una gran variedad de especies. Estos incluyen no sólo los roles en la muerte celular programada y la necrosis si no también efectos positivos, tales como la inducción de genes de defensa y la movilización de los sistemas de transporte de iones. También se lo implica con frecuencia en funciones de señalización redox o señalización oxidativa. En particular, las plaquetas que participan en la reparación de heridas y homeostasis de la sangre liberan especies reactivas del oxígeno para reclutar más plaquetas en los sitios de lesión. Estas también proporcionan un enlace a la adaptación del [sistema inmune] a través del reclutamiento de glóbulos blancos. El sistema que se ve más rápidamente afectado es el sistema inmunitario, especialmente sensible a los ROS. Cuadros patológicos e ineficacia de los planes vacunales son sus principales consecuencias. La presencia y actividad de antioxidantes contrarresta la acción de los radicales libres, ya que colabora en mantener o restablecer el equilibrio que proporcionará un mayor nivel de salud, protegiendo el sistema inmunitario, restaurando la eficacia de las vacunaciones y favoreciendo el funcionamiento orgánico.

6.1.9.2.

FORMACIÓN DE ERO.

El oxígeno molecular (O2) es uno de los gases más importantes de la Tierra, constituye el 21% de la atmósfera, 89% del peso del agua de mar y al menos 47% de la corteza terrestre. Por lo mismo, la mayor parte de los seres vivos utilizan el oxígeno para respirar y obtener energía. Sin embargo, a partir de esta molécula se forman moléculas más reactivas conocidas como especies reactivas de oxígeno (EROs), como el superóxido (O 2-), el hidroxilo (-OH) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), así como los oxiradicales (O2 singulete y doblete). Debido a su función primordial de producción de energía química, la mitocondria es considerada la mayor productora de EROs.

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Las EROs regulan varios procesos celulares, en el caso de mamíferos son la secreción y acción de la insulina, la producción de hormonas de crecimiento, citosinas (comunicación entre células), la unión de las proteínas G a sus receptores, factores de transcripción, regulación de los transportadores y canales de iones, por citar algunos. Sin embargo, las EROs también resultan nocivas para los organismos cuando se producen en grandes cantidades dañando los constituyentes celulares e induciendo la muerte celular. Así, el estrés oxidativo generado por la sobreproducción de EROs está asociado al envejecimiento y patologías como la obesidad y la diabetes tipo 2, entre otras. La molécula de oxígeno es un birradical libre, es decir, posee dos electrones no apareados, cada uno localizado en un orbital π de antiunión. En la molécula de oxígeno, los electrones no apareados poseen giros paralelos, de tal manera que para que el O2 oxide otro átomo o molécula, éste tendría que aceptar un par de electrones con giro contrario o aceptar un solo electrón a la vez (limitación del giro o "spin"). Si un solo electrón se adiciona al O2, éste se localizará en uno de los orbitales π de antiunión y el producto será el radical superóxido (O 2-). De la adición de un electrón más, resultará el ión peróxido, el cual se protona rápidamente en el ambiente celular para producir el peróxido de hidrógeno (H2O2). El H2O2, producto de la dismutación del superóxido, puede cruzar las membranas biológicas y aunque es relativamente poco reactivo, a partir de éste y en presencia de metales de transición reducidos, la reducción parcial del peróxido genera el radical hidroxilo (• OH), uno de los oxidantes más fuertes de la naturaleza. Cuando el metal involucrado es el Fe 2+, la reacción es conocida como reacción de Fenton. En los sistemas vivos la reacción que genera radicales hidroxilos además de la reacción de Fenton, es conocida como la reacción de Haber-Weiss, en la cual en presencia de superóxido y peróxido de hidrógeno se generan más radicales hidroxilo.

Es importante notar que las EROs son un término amplio usado para describir todos los intermediarios reactivos del oxígeno que incluyen oxiradicales (singuletes y dobletes) y no radicales (H2O2). Los oxiradicales son dañinos cuando se producen en grandes cantidades porque indiscriminadamente pueden reaccionar con biomoléculas. Los principales objetivos para la oxidación por EROs son los dobles enlaces en los lípidos, los residuos de cisteína y metionina en las proteínas y la posición C8 en la desoxiguanosina (existen muchos otros objetivos, pero estos parecen ser los más comunes).

6.1.9.3.

SISTEMAS DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES.

Las enzimas antioxidantes son esenciales para las células aeróbicas, puesto que mantienen dentro de niveles aceptables las concentraciones de especies químicas conocidas como radicales libres, que se caracterizan por presentar un electrón desapareado y por ser muy reactivas. De todos los radicales, resultan de gran interés las especies reactivas de oxígeno (EROs), debido a la estructura birradical de esta molécula y al gran número de procesos que las generan y en los que pueden verse involucradas, en los diversos procesos celulares. El hecho de que la célula disponga en tanta abundancia del dispositivo defensivo

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constituido por las enzimas antioxidantes, pone en evidencia el importante grado de toxicidad que poseen los radicales libres. Durante el metabolismo aerobio se generan pequeñas cantidades de especies reactivas de oxígeno (EROs), incluyendo radicales hidroxilo (-OH), aniones superóxido (O2-), y peróxido de hidrógeno (H2O2), como respuesta a estímulos externos e internos. Estas mínimas concentraciones de EROs pueden ser indispensables en muchos procesos, como el sistema de señales intracelulares (que está relacionado con otros procesos como la proliferación celular y la apoptosis), la inmunidad, y la defensa contra microorganismos. Sin embargo, altas dosis o una eliminación inadecuada de EROs dan lugar a estrés oxidativo, que puede causar graves disfunciones metabólicas y daño a macromoléculas biológicas. Va a existir, por tanto, una relación entre los niveles de las enzimas antioxidantes y los tres tipos de moléculas mensajeras (factores de crecimiento, prostaglandinas y óxido nítrico) implicadas en la homeostasis celular, es decir, un equilibrio entre el mantenimiento de las condiciones estáticas o constantes en el medio interno celular y el nivel de ROS. En síntesis se le está dando la importancia de toxicidad que conllevan los radicales libres, durante los procesos biológicos donde una de las consecuencias del estrés oxidativo es la peroxidación lipídica, cuya prevención es esencial en todos los organismos aerobios, ya que los productos derivados de este proceso pueden interactuar con el ADN y son potencialmente mutágenos. Los epóxidos formados pueden reaccionar espontáneamente con centros nucleofílicos en la célula o unirse a los ácidos nucleicos (ADN y ARN). Esta reacción puede dar lugar a citotoxicidad, alergia, mutagénesis o carcinogénesis, dependiendo de las propiedades del epóxido en cuestión. En los organismos aerobios existen una gran variedad de sistemas de defensa antioxidante tanto enzimáticos como no enzimáticos, que se coordinan cooperativamente y protegen al organismo de los riesgos que conlleva el estrés oxidativo. Entre ellos destacan las actividades enzimáticas superóxido dismutasa(SOD), glutatión peroxidasa (GPX) y catalasa (CAT); glutatión (GSH),además del ácido ascórbico (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E),), beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos. Por otro lado, también existe una relación entre los niveles de EROs celulares y el incremento o descenso de las actividades de las enzimas antioxidantes. La adición de H2O2 causa un incremento, dosis dependiente, del ARNm de CAT en células que se encuentran en crecimiento exponencial. Además, también se detecta un incremento de los niveles estacionarios del ARNm de GPX y SOD, cuando hay una sobreexpresión de alguna de las enzimas antioxidantes da lugar a un menor daño oxidativo. Cuando el ADN resulta dañado por radicales hidroxilo se produce la especie 8-oxo-2´-desoxiguanosina. La sobreexpresión de Cu/Zn-SOD y CAT causa un retardo en la acumulación de esta especie durante el crecimiento. El descontrol de todas estas especies reactivas de oxígeno puede, por tanto, afectar a diferentes procesos esenciales del organismo, siendo una de las piedras angulares en la génesis de distintas patologías. Las enzimas antioxidantes son: super-óxido.desmutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPX).

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6.1.9.4.

MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES.

Un antioxidante puede ser definido, en el sentido más amplio de la palabra, como cualquier molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación (pérdida de uno o más electrones) de otras moléculas, generalmente sustratos biológicos como lípidos, proteínas o ácidos nucleicos. La oxidación de tales sustratos podrá ser iniciada por dos tipos de especies reactivas: los radicales libres, y aquellas especies que sin ser radicales libres, son suficientemente reactivas para inducir la oxidación de sustratos como los mencionados. La protección de los sustratos biológicos promovida por la mayor parte de los antioxidantes involucra su interacción directa con especies reactivas. Sin embargo, es posible distinguir también otros mecanismos a través de los cuales los antioxidantes activamente contribuyen a prevenir o retardar la oxidación de un sustrato biológico. Con el fin de revisar dichos mecanismos, es preciso previamente realizar una clasificación de aquellos antioxidantes que normalmente están presentes en el organismo humano. Si bien existen diversas formas para clasificar a los antioxidantes, desde una perspectiva de su origen y presencia en el organismo, es posible distinguir entre aquellos antioxidantes que son normalmente bio-sintetizados por el organismo, y aquellos que ingresan a éste a través de la dieta. Entre los primeros se encuentran los antioxidantes enzimáticos, como superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, glutatión S-transferasas, tioredoxina-reductasas y sulfoxi-metionina-reductasas, y los antioxidantes no-enzimáticos, como glutatión, ácido úrico, ácido dihidro-lipóico, metalotioneína, ubiquinol (o Co-enzima Q) y melatonina ácido ascórbico (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E), beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos. Si bien, el primer grupo de antioxidantes son bio-sintetizados por el organismo humano, la dieta puede también contener dichos antioxidantes. Sin embargo, debe aclararse que el aporte que podría suponer para el organismo la ingesta de alimentos con dichos antioxidantes no es muy significativa pues estos experimentan una degradación/biotransformación importante a lo largo del tracto gastro-intestinal. Respecto a los antioxidantes que ingresan al organismo solo a través de la dieta, estos se clasifican, esencialmente, en:vitaminas antioxidantes , como ácido ascórbico, alfa-tocoferol (vitamina E) y beta-caroteno (o pro-vitamina A),carotenoides (como luteína, zeaxantina y licopeno), polifenoles, en sus categorías de flavonoides y no-flavonoides, y compuestos que no caen en las tres categorías anteriores, como son algunos glucosinolatos (ej. isotiocianatos) y ciertos compuestos organo-azufrados (ej. dialil-disúlfido).

6.2.

FOTOFOSFORILACIÓN.

La fotofosforilación es la forma por la cual los organismos fotosintéticos captan la energía de la luz solar, produciendo ATP. Ese fenómeno incluye innumerables reacciones las cuales ocurren en los cloroplastos. En la fotofosforilación acíclica, cuando los pigmentos (clorofila) y las moléculas de agua son alcanzados por fotones (partículas de luz), existe liberación de electrones. Los electrones liberados por la clorofila son capturados por

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hidrógenos que, por su parte, son capturados por moléculas de NAD. Luego de formado el NADH, es responsable por la formación de ATP. La clorofila entonces, queda con deficiencia de electrones. Los electrones liberados por la escisión del agua, substituyen los perdidos por la clorofila. El rompimiento de la molécula de agua libera el oxígeno producido por la fotosíntesis. En la fotofosforilación cíclica los electrones liberados por la acción de los fotones vuelven a los pigmentos iniciales, luego de haber sido utilizados en la producción de ATP. En la figura 6.4 se ilustra el proceso de fotofosforilación acíclica.

Figura 6.4. Esquema general de la fotofosforilación acíclica.(9) Fotofosforilación Acíclica y Cíclica En los cloroplastos de las células vegetales ocurre la conversión de energía luminosa en energía química. Las reacciones directamente dependientes de la luz, tienen lugar a nivel de la membrana de los tilacoides. Este proceso se inicia con la captación de energía luminosa en el fotosistema. Existen dos tipos de fotosistemas, I y II. (Fig. 6.4) El centro de reacción del Fotosistema I es designado P700, pues absorbe luz con longitud de ondas próximas a los 700 nm, en tanto que el centro de reacción del fotosistema II es designado P 680 por absorber luz con longitudes de onda próximas a los 680 nm.

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Cuando la clorofila, la de los centros de reacción se excita por los fotones, libera electrones, oxidándose. Estos electrones son captados por moléculas aceptores de electrones que quedan reducidas. La síntesis de ATP y de NADPH depende de este flujo de electrones, que se inicia en el centro de reacción de los fotosistemas. Este flujo puede ocurrir de dos formas diferentes: de forma acíclica fotofosforilación acíclica (Fig. 6.4), y de forma cíclica fotofosforilación cíclica (Fig. 6.5) La fotofosforilación acíclica produce cantidades idénticas de ATP y de NADPH + H +. Con todo, la planta necesita de mayor cantidad de ATP que de NADPH. Entonces las plantas, a veces, realizan una forma adicional de fotofosforilación en la cual no se genera NADPH + H+. El proceso que produce solamente ATP involucra apenas el fotosistema I y se designa fotofosforilación cíclica. En la figura 6.5 se ilustra el proceso de fotofosforilación cíclica. Se llama cíclica porque los electrones son re-utilizados por la clorofila. Es una forma alternativa de producción de ATP. La fotofosforilación acíclica es la más utilizada por las células.

Figura 6.5. Esquema general de la fotofosforilación cíclica.(9) Los pigmentos del fotosistema captan la energía luminosa que es transferida a la clorofila la del centro de reacción. La clorofila excitada transfiere sus electrones hacia un aceptor, la ferredoxina. Los electrones recorren una cadena transportadora, sucediendo un conjunto de reacciones de oxidación-reducción que conducen a la liberación de energía, parte de la cual es utilizada para fosforilar el ADP, formando ATP. Al final de la cadena, los electrones vuelven al  centro de reacción del fotosistema I, siendo por ello un flujo cíclico de electrones.

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6.2.1. COROFILA Y CLOROPLASTOS. Todas las células fotosintéticas contienen uno o más de los pigmentos vegetales conocidos como clorofilas, la mayor parte de las cuales son verdes. En la figura 6.6 se ilustra la imagen de la estructura genérica de una clorofila.

Figura 6.6. Estructura general de una clorofila.(11)

Sin embargo, no todas las células fotosintéticas son verdes. Algunas pueden ser pardas, rojas o púrpuras, como las algas fotosintéticas y cierto grupo de bacterias. Las clorofilas se hallan normalmente asociadas a proteínas específicas, pueden extraerse de las hojas con etanol o acetona y purificarse por cromatografía. La función de las clorofilas es la absorción de energía luminosa en la variante de la fotosíntesis que llamamos fotosíntesis oxigénica, la que es característica de los organismos fotosintéticos. El principal papel de las clorofilas en la fotosíntesis es la absorción de fotones de luz con la consiguiente excitación de un electrón. Ese electrón excitado cede su energía, volviendo al estado normal, a algún pigmento auxiliar (a veces a otras clorofilas), donde se repite el fenómeno. Al final el electrón excitado facilita la reducción de una molécula, quedando así completada la conversión de una pequeña cantidad de energía luminosa en energía química, una de las funciones esenciales de la fotosíntesis.Además del papel citado, el de pigmento primario de la antena fotosintética, las clorofilas abundan en los fotosistemas como pigmentos auxiliares, los que se van transfiriendo la energía de excitación de la manera mencionada en el párrafo anterior. La estructura de la molécula de la clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina (sustituida con pequeños grupos enlazados, sustituyentes) y una cadena larga llamada fitol. (Fig. 6.6.) El anillo de porfirina es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados para formar un anillo mayor que es la porfirina. La

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hemoglobina de la sangre y otras proteínas contienen también una porfirina, que en ese otro caso constituye lo principal de un grupo hemo; y también se encuentra porfirina en la estructura de la vitamina B12. El grupo hemo contiene un átomo de hierro (Fe+2); la porfirina de la clorofila lleva en lugarequivalente un átomo de magnesio (Mg+ 2). La absorción de determinados picos del espectro de radiación, es una propiedad de aquellas moléculas orgánicas que contienen dobles enlaces conjugados (dobles enlaces alternando con enlaces simples); puede verse en las fórmulas desarrolladas contiguas que el anillo porfirínico es rico en tales enlaces. El fitilo (o resto de fitol; llamamos resto o residuo a la parte de una molécula incorporada a la estructura de otra mayor) es una cadena hidrocarbonada con restos de metilo (-CH 3) a lo largo. Tiene, como todas las cadenas orgánicas basadas sólo en C e H, un carácter “hidrófobo”; es decir, que repele al agua. La cadena del fitilo sirve para anclar la molécula de clorofila en la estructura anfipática de los complejos moleculares en que residen las clorofilas. Las clorofilas se encuentran en las membranas de los tilacoides, que en las cianobacterias son invaginaciones de la membrana plasmática, y en los plastos de las células eucarióticas, son vesículas distribuidas por su interior. Las clorofilas aparecen insertas en la membrana, a las que se anclan por la cadena lateral constituida por un resto de fitol, asociadas a proteínas y otros pigmentos, con los que forman los fotosistemas. Cada fotosistema contiene alrededor de 200 moléculas de clorofila, además de pigmentos auxiliares, con los que constituye la llamada antena. La antena está formada por conjuntos ordenados de moléculas de clorofila, otros pigmentos y proteínas, que se llaman complejos colectores de la luz. Sólo una molécula de clorofila a en cada fotosistema convierte propiamente la energía radiante (luz) en energía química, cuando recibe un fotón con energía suficiente desde las moléculas de la antena, que se la van pasando. Las plantas superiores contienen dos clases o formas de clorofila, designadas clorofila a y clorofila b. Las plantas fotosintéticas productoras de oxígeno contienen dos clases de clorofila, una de las cuales siempre es la clorofila a. Mientras que en las plantas verdes, la segunda clorofila es la b, y en las algas pardas, diatomeas y dinoflagelados, es la clorofila c. Las células fotosintéticas procarióticas no productoras de oxígeno no contienen clorofila a. Contienen bacterioclorofila a o b. Además, las bacterias verdes contienen clorofila de chlorobium. Todas las clorofilas absorben eficientemente luz en la zona visible del espectro, debido a sus muchos enlaces conjugados. Además, la energía luminosa de los fotones absorbidos por una molécula de clorofila pueden deslocalizarse y difundirse a través de toda la estructura electrónica de la molécula excitada. La clorofila a es el principal pigmento absorbente de la luz en la mayoría de las plantas verdes. Las clorofilas tienen típicamente dos picos de absorción en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm de longitud de onda), y otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo, reflejan la parte media del espectro, la más nutrida y correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta es la razón porla que las clorofilas tienen

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color verde y se lo confieren a los organismos, o a aquellos tejidos, que tienen cloroplastos activos en sus células, así como a los paisajes que forman. Fuera de las plantas verdes, que son de este color, las clorofilas van acompañadas de grandes cantidades de pigmentos auxiliares, principalmente carotenoides y ficobilinas, que son de distinto color y dominan el conjunto, tiñendo al organismo de colores como el amarillo dorado típico de los cromófitos, o el rojo púrpura de las algas rojas. En la tabla 6.1 se muestran las diferentes características estructurales de las clorofilas, Tabla 6.1 Diferentes formas de clorofilas.(11)

Clorofila a

Clorofila b

C55H72O5N4Mg

C55H70O6N4Mg

C35H30O5N4Mg C35H28O5N4Mg C54H70O6N4Mg

-CH=CH2 -CH3 -CH2CH3 -CH2CH2COOGrupo C17 Fitil Enlace C17-C18 Simple

-CH=CH2 -CHO -CH2CH3 -CH2CH2COOFitil Simple

-CH=CH2 -CH3 -CH2CH3

Fórmula empírica Grupo C3 Grupo C7 Grupo C8

Clorofila c1

Clorofila c2

Clorofila d

-CH=CH2 -CH3 -CH=CH2

-CHO -CH3 -CH2CH3 -CH2CH2COO-CH=CHCOOH -CH=CHCOOH Phytyl Doble Doble Simple

1. La clorofila a se encuentra en todos los casos, vinculada al centro activo de los complejos moleculares, llamados fotosistemas, que absorben la luz durante la fotosíntesis, difiere de la clorofila b en que el radical de la posición 3 del grupo tetrapirrólico es CH3 (alquilo) en lugar de -CHO (carbonilo). 2. La clorofila b caracteriza a los plastos de las algas verdes y de sus descendientes las plantas terrestres (reino Plantae). Esos plastos, y los organismos que los portan, son de color verde. También se encuentran plastos verdes en algunos grupos de protistas que han asimilado algas verdes unicelulares endosimbiontes adquiriendo así plastos secundarios. Podemos citar a las euglenas, a los cloraracniófitos y, a algunos dinoflagelados, como Gymnodinium viride. También se encuentra en algunas cianobacterias (las cloroxibacterias), que por ello son de color verde en vez de azuladas; hace algún tiempo se les atribuyó por este rasgo el carácter de antepasados de los plastos verdes, pero luego se ha comprobado que es un carácter adquirido independientemente en varias líneas separadas. 3. Las clorofilas c1 y c2 son características de un extenso y diverso grupo de protistas que coincide más o menos con el superfilo Chromista y que incluye grupos tan importantes como las algas pardas, las diatomeas o los haptófitos. 4. La clorofila d sólo se ha conocido durante decenios por una observación aislada y no repetida en un alga roja. Luego se ha encontrado en una cianobacteria (Acaryochloris marina), que parece especialmente apta para explotar luz roja cuando crece bajo ciertas P á g i n a | 174

ascidias. No debe en todo caso interpretarse de la tabla que su presencia es una característica común de las algas rojas. Los cloroplastos son orgánulos aún mayores y se encuentran en las células de plantas y algas, pero no en las de animales y hongos. Su estructura es aún más compleja que la mitocondrial: además de las dos membranas de la envoltura, tienen numerosos sacos internos formados por membrana que encierran el pigmento verde llamado clorofila. Desde el punto de vista de la vida terrestre, los cloroplastos desempeñan una función aún más esencial que la de lasmitocondrias: en ellos ocurre la fotosíntesis; esta función consiste en utilizar la energía de la luz solar para activar la síntesis de moléculas de carbono pequeñas y ricas en energía, y va acompañado de liberación de oxígeno. Los cloroplastos producen tanto las moléculas nutritivas como el oxígeno que utilizan las mitocondrias. En la figura 6.7 se ilustra la estructura de un cloroplasto.

Figura 6.7. Estructura general de un cloroplasto.(10)

Los cloroplastos son orgánulos con forma de disco, de entre 4 y 6 m de diámetro y 10 m o más de longitud. Aparecen en mayor cantidad en las células de las hojas, lugar en el cual parece que pueden orientarse hacia la luz. Es posible que en una célula haya entre cuarenta y cincuenta cloroplastos, y en cada milímetro cuadrado de la superficie de la hoja hay 500.000 cloroplastos. Cada cloroplasto está recubierto por una membrana doble. El cloroplasto contiene en su interior una sustancia básica denominada estroma, la cual está atravesada por una red compleja de discos conectados entre sí, llamados lamelas. Muchas de las lamelas se encuentran apiladas como si fueran platillos; a estas pilas se les llama grana.

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Las moléculas de clorofila, que absorben luz para llevar a cabo la fotosíntesis, están unidas a las lamelas. La energía luminosa capturada por la clorofila es convertida en adenosintrifosfato (ATP) y moléculas reductoras (NADPH) mediante una serie de reacciones químicas que tienen lugar en los grana. Los cloroplastos también contienen gránulos pequeños de almidón donde se almacenan los productos de la fotosíntesis de forma temporal. En las plantas, los cloroplastos se desarrollan en presencia de luz, a partir de unos orgánulos pequeños e incoloros que se llaman proplastos. A medida que las células se dividen en las zonas en que la planta está creciendo, los proplastos que están en su interior también se dividen por fisión. De este modo, las células hijas tienen la capacidad de producir cloroplastos. En las algas, los cloroplastos se dividen directamente, sin necesidad dedesarrollarse a partir de proplastos. La capacidad que tienen los cloroplastos para reproducirse a sí mismos, y su estrecha similitud, con independencia del tipo de célula en que se encuentren, sugieren que estos orgánulos fueron alguna vez organismos autónomos que establecieron una simbiosis en la que la célula vegetal era el huésped.

6.2.1.2. LUZ. Las plantas y otros organismos fotosintéticos son expertos en absorber la energía solar, gracias a las moléculas de pigmento que absorben la luz en sus hojas. Pero, ¿qué sucede con la energía de la luz que se absorbe? No vemos hojas brillantes como focos, pero también sabemos que la energía no puede simplemente desaparecer. Resulta que parte de la energía de la luz que absorben los pigmentos en las hojas se convierte en una forma diferente, en energía química. Esto sucede durante la primera etapa de la fotosíntesis, que consiste en una serie de reacciones químicas conocidas como reacciones dependientes de la luz. Las reacciones dependientes de la luz usan la energía lumínica para formar dos moléculas necesarias para la siguiente etapa de la fotosíntesis: la molécula de almacenamiento de energía ATP y el portador de electrones reducido NADPH. En las plantas, las reacciones de la luz ocurren en la membrana de los tilacoides de organelos llamados cloroplastos. Los fotosistemas, grandes complejos de proteínas y pigmentos (moléculas que absorben la luz) que son óptimos para recolectar luz, son clave en las reacciones luminosas. Hay dos tipos de fotosistemas: fotosistema I (PSI) y fotosistema II (PSII). Ambos fotosistemas contienen muchos pigmentos que ayudan a recolectar la energía de la luz, así como un par especial de moléculas de clorofila en el corazón (centro de reacción) del fotosistema. El par especial del fotosistema I se llama P700, mientras que el del fotosistema II se llama P680. En la figura 6.8 se muestran las longitudes de onda de los diferentes tipos de radiación y, en el cual se encuentra la luz visible.

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Figura 6.8. Longitudes de onda de los diferentes tipos de radiación.(9) En un proceso llamado fotofosforilación no cíclica (la forma "estándar" de las reacciones dependientes de la luz), se toman electrones del agua y pasan a través del PSII y PSI antes de terminar en NADPH. Este proceso requiere que se absorba luz dos veces, una vez en cada fotosistema, y crea ATP. De hecho, se llama fotofosforilación porque implica el uso de energía de la luz (foto) para crear ATP a partir de ADP (fosforilación). Es importante tener en cuenta que la transferencia de electrones de las reacciones dependientes de la luz se produce por la absorción de la energía luminosa y, en realidad, es posible debido a ella. Es decir, la transferencia de electrones del PSII a PSI y del PSI a NADPH solo se produce "cuesta abajo" desde el punto de vista energético (libera energía y, por lo tanto, es espontánea), porque la absorción de energía luminosa lleva a los electrones de P680 y P700 a niveles de energía muy altos. 6.2.1.2. CADENA DE TRANSPORTE REACCIONES LUMINOSAS.

DE

ELECTRONES

FOTOSINTÉTICA,

Cuando un electrón abandona el PSII, primero se transfiere a una pequeña molécula orgánica (plastoquinona, Pq), luego a un complejo de citocromos (Cyt) y, finalmente, a una proteína que contiene cobre llamada plastocianina (Pc). Conforme el electrón se mueve por esta cadena de transporte, pasa de un mayor nivel de energía a uno menor y libera energía. Parte de la energía se utiliza para bombear protones desde el estroma (fuera de los tilacoides) hacia el interior de los tilacoides. Esta transferencia de H+ junto con la liberación de la división de agua, forma un gradiente de protones que se utilizará para hacer ATP. En la figura 6.9 se ilustran las reacciones dependientes de la luz de la fotosíntesis.

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Figura 6.9. Esquema de las reacciones dependientes de la luz de la fotosíntesis.(10) Una vez que un electrón ha pasado por el primer tramo de la cadena de transporte de electrones, llega al PSI, donde se une con el par especial de clorofila a llamado P700. Dado que los electrones han perdido energía antes de llegar al PSI, deben recibir más energía mediante la absorción de otro fotón. El P700 excitado es un donante de electrones muy bueno y envía su electrón a una cadena de transporte de electrones corta. En esta serie dereacciones, el electrón primero pasa a una proteína llamada ferredoxina (Fd) y después se transfiere a una enzima llamada NADP reductasa, la cual transfiere electrones al transportador de electrones NADPpara crear NADPH. NADPH viaja al ciclo de Calvin, donde sus electrones se utilizan para crear azúcares a partir de dióxido de carbono. El otro ingrediente necesario para el ciclo de Calvin es ATP, el cual también proporcionan las reacciones de la luz. Como vimos anteriormente, los iones H+ se acumulan en el interior de los tilacoides y crean un gradiente de concentración. Los protones "quieren" difundirse a favor del gradiente hacia el estroma, y su única vía de paso es la enzima ATP sintasa. Esta aprovecha el flujo de protones para formar ATP a partir de ADP y fosfato. El proceso de formación de ATP con energía almacenada en un gradiente químico se llama quimiosmosis. En la figura 6.10 se ilustra el esquema energético de la cadena de transporte de electrones fotosintético, por la vía de los fotosistemas I y II. P á g i n a | 178

Figura 6.10. Esquema energético de la cadena de transporte de electrones fotosintética por la vía de los fotosistemas I y II, en función de los potenciales estándar de óxidoreduccción E’o, de los pares redox interactuantes.(1) Para explicar la función de los dos fotosistemas I y II, y cómo se realiza el sistema de transporte de electrones fotosintético, podemos basarnos en las figuras 6.10 y 6.11. Los fotosistemas I y II son los componentes que liberan energía en una cadena de transporte de electrones continuo, que se extiende desde el agua, el donador electrónico, al NADP +, el aceptor electrónico, mostrado en forma lineal en la figura 6.11. Lo primero que hay que resaltar es que, el flujo de electrones del agua al NADP+ se verifica en sentido opuesto al transporte electrónico mitocondrial. En segundo lugar, la cadena de transporte electrónico fotosintético contiene un número muy elevado de transportadores electrónicos al igual que el mitocondrial, sin embargo, la diferencia principal entre los dos sistemas, es la presencia de los fotosistemas I y II, que actúan cómo impulsores de electrones utilizando la energía luminosa para lanzar los electrones a lo largo de una serie de transportadores electrónicos desde el H2O hasta el NADP+.

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Figura 6.11. Esquema del sistema de transporte de electrones fotosintético.(1) Cómo se puede apreciar en la figura 6.11, el sistema de transporte electrónico fotosintético se puede dividir en tres segmentos: uno que va del agua al fotosistema II, una cadena central que va del fotosistema II al I y, el tercer segmento que va del fotosistema I al NADP+. Al absorberse fotones por las moléculas del pigmento del fotosistema I, los exitones formados ricos en energía, son capturados por el P700, perdiendo, este último electrones que son transferidos a su aceptor electrónico primario, un pigmento designado P430. Estos electrones fluyen por la vía de una cadena de transportadores electrónicos hasta el NADP+. A la par, durante el transporte de electrones descrito, también se lleva a cabo la fosforilación del ADP a ATP. Se desconoce a ciencia cierta, cuantos ATP’s se forman pero, suponiendo que sólo se de una fosforilación, podemos representar la ecuación global del flujo electrónico fotosintético desde el agua hasta el NADP+ de la siguiente manera: H2O + NADP+ + ADP + Pi ==== ½ O2 + NADPH + H+ + ATP + H2O La molécula de agua del lado izquierdo de la ecuación es la que cede los dos electrones necesarios para reducir el NADP+ y el átomo de ½ de O 2. La molécula de agua del lado derecho es la que se produce por la síntesis del ATP a partir del ADP y Pi. Aunque podrían eliminarse de la ecuación, se dejan en ella para identificar las entradas y salidas del transporte de electrones fotosintético. Existen dos conjuntos de reacciones luminosas en la fotosíntesis vegetal que desprenden oxígeno. Esta conclusión se basa en los estudios del espectro de la acción fotoquímica en la fotosíntesis de algunas plantas. La eficiencia de la luz absorbida en la durante la fotosíntesis de algunos vegetales coincide con el espectro de absorción de los pigmentos celulares en la mayor parte del espectro visible.

6.2.2. REGULACIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS. La fotosíntesis está regulada por diversos factores químicos, enzimáticos y ambientales.

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Desde el punto de vista químico, la fotosíntesis responde a varios compuestos químicos llamados agentes desacoplantes o inhibidores, así como agentes que la estimulan o la favorecen. La fosforilación del ADP que acompaña al transporte de electrones fotoinducido en los cloroplastos durante la fotosíntesis, se parece mucho al de las mitocondrias. Por ejemplo, el transporte de electrones electrónico no cíclico, inducido por la luz, se ve fuertemente estimulado por la adición de ADP, aceptor de fosfato, a los cloroplastos, el cual muestra, de este modo, el fenómeno de control por el aceptor del transporte fotoinducido, semejante a la necesidad de ADP para alcanzar las velocidades máximas de transporte de electrones en las mitocondrias. La fosforilación fotosintética puede resultar también, ser desacoplada por ciertos agentes químicos, de modo que el transporte electrónico continúa pero no tiene lugar fosforilación alguna. Entre los agentes desacoplantes que resultan eficaces por su acción sobre la fosforilación fotosintética, se encuentran los iones amonio y la fenilhidrazona del cianuro de carbonilo; esta última resulta eficaz tanto frente a la fosforilación oxidativa como frente a la fotosintética. Los ionóforos, tales como la gramicidina, impiden también la fotofoforilación. Tanto la florricina, como el compuesto sintético Dio-9, inhiben la fotofosforilación por una acción semejante a la de la oligomicina sobre la fosforilación mitocondrial.Los cloroplastos no muestran actividad ATPàsica, pero después de un tratamiento con compuestos sulfhidrílicos, como el ditiotreitol se provoca una actividad ATPàsica dependiente de la luz, similar a las de las mitocondrias inducida por agentes desacoplantes como el 2,4-dinitrofenol. Desde el punto de vista enzimático, la fotosíntesis tiene un mecanismo de regulación alostérica que controla su velocidad dependiendo de la presencia de ciertos compuestos reguladores de la actividad enzimática. Algunos compuestos como el Ca +2 y el Fe+2, determinan la actividad de algunas enzimas. Su ausencia puede inhibir totalmente su actividad. Uno de los mecanismos más importantes de control alostérico de la fotosíntesis lo determina la relación ATP/ADP. La fotosíntesis también está regulada, desde un punto de vista ambiental, por varios factores entre los que destacan: la intensidad de luz y radiación, la concentración de dióxido de carbono en el ambiente así como de la temperatura.

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