Modulo Unidad 2 Repruccion Animal

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MODULO REPRODUCCION ANIMAL AVANZADA UNIDAD 2. INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES CAPITULO 3. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

EDWIN MANUEL PAEZ BARON Médico Veterinario Zootecnista Esp. en Sanidad Animal Master en Educación Superior Estudiante Doctorado en Desarrollo Sostenible

Universidad Nacional Abierta y a Distancia Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente CEAD TUNJA 2013

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UNIDAD 2. INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES CAPITULO 3. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

La transferencia de embriones es una biotecnología que ha crecido a un ritmo constante durante los últimos años, en Colombia se ha intensificado su uso, especialmente en el ganado bovino durante los últimos 18 años (Bolívar y Maldonado, 2008). Este es un método de reproducción artificial que consiste en la producción de varios embriones generados por una hembra donante y que serán posteriormente transferidos a hembras receptoras.

Lección 26. Selección y manejo de donantes y receptoras Quizá uno de los aspectos más importantes dentro de la transferencia de embriones es la adecuada selección de las donantes y receptoras. En la selección de donantes, es necesario tener en cuenta dos criterios fundamentales:  Animales de alta genética, superiores a los otros.  Excelente estado reproductivo

Donantes: La selección de donantes debe hacerse de manera estricta, las donantes deben estar reproductivamente sanas y en un balance nutricional adecuado, de lo contario el programa podría fracasar, las vacas demasiado flacas o muy gordas (condición corporal menor de 2.5 o mayor de 4.5 en escala 0 a 5).

Las vacas no deben estar con ternero, si en el momento del inicio del programa tiene ternero, el mismo debe ser separado. De igual manera no es aconsejable

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utilizar vacas con menos de 60 días posparto, ya que estas pueden presentar ciclo irregulares (Albeiro, 2001).

Receptoras: La selección de unas buenas receptoras es otro de los puntos críticos dentro del programa e T.E. Las receptoras deben estar clínicamente sanas, libres de cualquier enfermedad, y con un tracto reproductivo en óptimas condiciones, se requieres que tengan buena habilidad materna y capacidad productora láctea. Estas receptoras serán las encargadas de mantener el embrión desde el día 7 hasta su nacimiento y posterior amamantamiento. Por lo anterior deberá ser una hembra que no sea propensa a partos distócicos y que tenga una buena producción láctea.

El tamaño de la receptora depende del tipo de embrión que se transferirá. En cuanto a la edad, se difiere aún en lo recomendable, algunos autores piensan que es mejor novillas y otros en vacas que ya hayan parido al menos una vez. Las novillas permiten obtener tasas de preñez mayores a las vacas, sin embargo pueden presentar problemas durante la gestación, el parto y la lactancia. Mientras que el uso de vacas con historia de parto permitirá conocer el comportamiento que tendrá la receptora durante y después de la gestación y el parto (Albeiro, 2001).

Programa de Sincronización del celo entre la donante y la receptora y superovulación de la donante

En condiciones normales, las vacas tienen una

ovulación por ciclo, aunque

algunas pueden alcanzar hasta dos ovulaciones (hasta un 8% según la raza). Lo que se busca con esta biotecnología es incrementar el número de ovulaciones consideradas fisiológicas para la especie, a través de la aplicación de hormonas

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exógenas que estimulen el desarrollo y la ovulación de un numero amplio de folículos (Cyagra, 2008).

Para los programas de superovulación en bovinos se puede hacer uso de dos hormonas que ejercen este efecto: la Hormona foliculoestimulante (FSH, la cual viene en combinación con LH) y la Gonadotropina Coriónica equina (eCG, o PMSG).

Protocolo mediante el uso de Hormona foliculoestimulante (FSH). La hormona foliculoestimulante ha sido la hormona de predilección en los programas de superovulación en bovinos. La dosis de aplicación varía de acuerdo con la raza, algunas son más susceptibles a la acción de la hormona y responden a su acción con menos dosis. Los productos disponibles comercialmente son hormonales de origen porcino u ovino, los cuales contienen FSH en combinación con LH. La presencia de LH se explica de acuerdo a lo expresado por Calier (2008) en lo siguiente: a grandes dosis la LH provoca la ovulación; a pequeñas dosis, actúa en sinergia con la FSH en el desarrollo folicular. Los folículos menores de 9 mm de diámetro son FSH-dependientes, lo que se evidencia por la presencia de receptores FSH en las células de la granulosa, pero cuando superan los 9 mm, adquieren receptores de LH, y el crecimiento folicular pasa a depender de la LH. Por lo tanto, la LH es necesaria para los estadios finales del desarrollo folicular. Las dosis comúnmente empleadas en la superovulación de vas varia de acuerdo a la siguiente relación:  Ganadería Bos taurus (Razas lecheras):

800-1000 UI

 Ganadería Bos taurus (Razas cárnicas):

600-800 UI

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 Ganadería Bos taurus (Novillas):

500 UI

 Ganadería Bos indicus:

250 UI

En dosis decrecientes, cada 12 horas, durante 4 días, aplicando una PG al 3º o 4º día por la mañana. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (vacas) Tabla 11. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (vacas).

DIA

HORA

DIA 0

08:00 horas

DOSIS

DONANTE

RECEPTORA

Dispositivo intravaginal

1ª Dosis PGF2α

o auricular + progesterona + benzoato de estradiol DIA 4

DIA 5

DIA 6

08:00 horas

3.0 ml

150 UI

20:00 horas

3.0 ml

150 UI

08:00 horas

2.5 ml

125 UI

20:00 horas

2.5 ml

125 UI

08:00 horas

1.5 ml

75 UI + PGF2α +

2ª Dosis PGF2α

Retiro del dispositivo

DIA 7

DIA 8

20:00 horas

1.5 ml

75 UI

08:00 horas

1 ml

50 UI

20:00 horas

1 ml

50 UI

Detección de celo

Inseminación artificial

Detección de celo

08:00 horas

(I.A) + GnRH

DIA 15

20:00 horas

I.A

08:00 horas

Colecta de embriones

Transferencia de embriones

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Protocolo de superovulación y sincronización del celo (novillas) Tabla 12. Protocolo de superovulación y sincronización del celo (Novillas).

DIA

HORA

DIA 0

08:00 horas

DOSIS

DONANTE

RECEPTORA

Dispositivo intravaginal

1ª Dosis PGF2α

o auricular + progesterona + benzoato de estradiol DIA 4

DIA 5

DIA 6

08:00 horas

2.0 ml

100 UI

20:00 horas

2.0 ml

100 UI

08:00 horas

1.5 ml

75 UI

20:00 horas

1.5 ml

75 UI

08:00 horas

1 ml

50 UI + PGF2α +

2ª Dosis PGF2α

Retiro del dispositivo

DIA 7

DIA 8

20:00 horas

1 ml

50 UI

08:00 horas

0.5 ml

25 UI

20:00 horas

0.5 ml

25 UI

Detección de celo

Inseminación artificial

Detección de celo

08:00 horas

(I.A) + GnRH

DIA 15

20:00 horas

I.A

08:00 horas

Colecta de embriones

Transferencia de embriones

Protocolo mediante el uso de Gonadotropina Coriónica equina (eCG, o PMSG). La eCG (Folligon®, Novormon®) es una hormona producida en las copas

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endometriales de la yegua durante los días 42 a 150 de la gestación. Esta hormona tiene una acción FSH y LH, con una vida media larga de aproximadamente 5 días. Debido a su vida media larga, puede desencadenar una sobreestimulación ovárica la formación de quistes foliculares. La dosis empleada para inducir la superovulación es de 2000 UI en novillas y de 3000 UI en vacas.

Tabla 13. Protocolo de superovulación con eCG.

DIA

HORA

DIA 1

08:00 horas

DOSIS

OBSERVACION Dispositivo intravaginal o auricular + progesterona + benzoato de estradiol

DIA 7

2000 UI

Aplicación IM de eCG Retiro dispositivo + aplicación de PGF2α

DIA 9 1000 μG

DIA 10

I.A + Aplicación de anti-PMSG (anti-eCG)

Progesterona: 50mg, benzoato de estradiol: 2.5μ

Fuente: www.avparagon.com/.../anatomia_aplicada_inseminacion_artificial.pdf

Fig. 29. Ovarios superovulados.

Lección 27. Colecta y evaluación de embriones

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Los embriones bovinos, pueden ser recuperados a través de métodos no quirúrgicos. Inicialmente, la recuperación de embriones se hacía por medios quirúrgicos, y se requería de anestesia general y/o local, para luego realizar una incisión a nivel de la línea media y extraer los cuernos uterinos con los ovarios y se realizaba el lavado de los cuernos para extraer los embriones (Palma, 2001). Sin embargo estas técnicas producían

lesiones con formación de fibrina y

adherencias de los varios y cuernos a las paredes de la cavidad abdominal, produciendo la pérdida reproductiva del animal. Hoy en día es posible realizar la extracción de los embriones, por medio de técnicas no quirúrgicas (método transvaginal). Para la colección no quirúrgica de embriones se han inventado variedades de instrumentos pero los más comunes son los catéteres Foley de 2 vías y el modelo Neustadt/. Las diferencias fundamentales entre ellos redica en el largo y en la consistencia. El modelo Neustadt/Aish es 27 cm. más largo y es más duro que el Foley (Del campo, 2000). La sonda Foley es el elemento utilizado en nuestro país para la recuperación de los embriones.

Técnica En el proceso de lavado y colecta de embriones se debe contar con los siguientes elementos:  Circuito de lavado  Sonda Foley (Con estilete)  Medio de lavado (PBS)  Dilatador de cérvix  Mangas de palpación  Filtro de recolección  Jeringas

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 Lidocaína al 2%, agujas 16G o 18G  Cajas de petri  Microestereoscopio  Medio holding  Pajillas  Congeladora de embriones  Pistola de transferencia Se debe inmovilizar a la donante en un brete o carral, se realiza la palpación rectal o la evaluación ecográfica para determinar el número de cuerpos lúteos presentes en cada ovario. Se limpia y desinfecta la región perineal y vulvar. Se aplica la anestesia epidural baja (5 ml, de lidocaína al 2%). Se introduce un brazo por vía rectal y con el otro se introduce la sonda Foley (con el estilete) vía vaginal, se pasa el cérvix y se infla el balón o globo con 10-15 ml de aire o de solución salina o PBS, esto con el fin de evitar la salida de la sonda y/o líquido de lavado durante el proceso (En algunas vacas será necesario producir una dilatación del cérvix para facilitar el paso de la sonda, esto se realiza con el dilatador de cérvix). La sonda debe ser ubicada de forma tal que no exista perdida de líquido durante el proceso, y se procede a introducir el medio de lavado (Este medio debe introducirse a temperatura corporal, 37°C, en volúmenes de 20 a 100 ml, luego se procede a realizar el masaje por todo el cuerno con el fin de arrastrar los embriones, luego este líquido debe ser colectado y pasa a través de un filtro en donde van a ser colectados los embriones. Este procedimiento se repite entre 3 y 6 veces en cada uno de los cuernos. Una vez se ha terminado de colectar los embriones se deba aplicar una dosis de prostaglandina, con el fin de inducir la luteolisis y así evitar que ocurra una preñez

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de embriones que hayan podido quedar dentro del tracto reproductivo posterior al lavado.

Fuente: Guzmán et al, 2008

Fig. 30. Proceso de colecta de embriones

Los embriones colectados en el filtro son llevados al laboratorio, para allí realizar la búsqueda, evaluación y clasificación de los mismos. A nivel de laboratorio se realiza la búsqueda de embriones (Viables y no viables) y estructuras no fertilizadas en el estereoscopio, para esto se extrae el contenido del filtro en cajas de petri. Los embriones viables son separados en otra caja de petri más pequeña que contiene medio PBS, posteriormente se realiza el lavado de los embriones por medio del pase de los mismos en medio durante 8 a 10 veces.

Evaluación de embriones

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La evaluación morfofológica es un aspecto importante para definir cuáles son aptos para la transferencia y/o crio preservación. Por lo anterior es importante realizar un repaso por los estadios de desarrollo del embrión durante los 9 primeros días. Desarrollo del embrión en los bovinos Tabla 14. Desarrollo del embrión.

TIEMPO

DESARROLLO

36-48 horas

2 células

3 día

4 – 8 células

4 día

8 – 16 células

4-5 día

Mórula temprana

5-6 día

Mórula compacta

6-7 día

Blastocisto temprano

7-8 día

Blastocisto expandido

8-9 día

Blastocisto eclosionado

A nivel del laboratorio se procede a realizar la clasificación de los embriones de acuerdo a su calidad, para esto se establece una escala de clasificación de 1 a 5. Escala de clasificación de la sociedad internación de Transferencia de embriones Tabla 15. Escala de clasificación embrionaria.

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Curso Reproducción Avanzada-201502 Fuente: Evangelista et al, 2007.

Los embriones aptos para criopreservación son los tipo 1, los aptos para la transferencia en fresco son los tipo 1, 2 y 3. Y los demás no son viables. Si se va a realizar la criopreservación son empajillados en medio de Etilenglicol, si van a ser transferidos en fresco se empajillan en medio PBS.

Fuente: http://artbreeding.com/Graphics/BovineFlush.jpg

Fig. 31. Embriones en diferentes etapas de desarrollo.

Fuente: http://www.hamiltonthorne.com/products/lasers/xyclone/images/hatched-bovine-embryos.JPG

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Curso Reproducción Avanzada-201502 Fig. 32. Embriones colectados.

Lección 28. Transferencia de embriones La transferencia es no quirúrgica. Las pajuelas conteniendo al embrión son cargadas en un pistolete de transferencia, el cual es cubierta con una camisa sanitaria de plástico. La receptora es ubicada en un brete, encepada y anestesiada con una inyección epidural. Luego de ser palpada en búsqueda del cuerpo lúteo, el pistolete es insertado hasta la mitad del cuerno uterino (lo más profundo posible) y el embrión es depositado allí. Los porcentajes de preñez esperados son de un 60 al 65 %, cuando se transfieren embriones en fresco, y del 50 al 55%, cuando los embriones transferidos son congelados (Cyagra, 2008). Tomar una pajilla de 0,25 ml y cargar en ella el embrión en el siguiente orden: 1. 1ra. columna de PBS con suero fetal al 10%. 2. 2da. columna, pequeña burbuja de aire. 3. 3ra. columna de PBS con medio de congelación. 4. 4ta. columna, pequeña burbuja de aire. 5. 5ta. columna, cargar el embrión en su medio. 6. 6ta. columna, pequeña burbuja de aire. 7. completar el resto de la pajuela con medio de congelación. La pajilla se carga en la pistola de transferencia de embriones y ésta dentro de la pipeta plástica estéril. Introducir una mano vía y sujetar el cérvix a través de la pared del recto. La pistola se introduce vía vaginal en el canal cervical y su extremo se ubica, con ayuda de la mano izquierda, en el cuerno ipsilateral al Cuerpo lúteo. Una vez en la posición deseada (un poco más allá del cuerpo del útero) el embrión es depositado suavemente y la pistola se retira lentamente. Todo este procedimiento debe realizarse lo más rápido y delicadamente posible. El exceso de manipulación producirá daño a la mucosa del útero, que se traducirá en una baja en los resultados (Del campo, 2000).

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Lección 29. Criopreservación de embriones

De acuerdo a lo expresado por Celestinos y Gatica (2002), el empleo de embriones congelados posibilita la utilización eficiente de las donantes y receptoras; permite la incorporación de alta genético a bajo costo (comparando los valores del embrión y el de su transporte frente a los animales en pie), permite la transferencia de algunos embriones y la conservación del resto hasta poder analizar los registros de producción de la descendencia; facilita el control de enfermedades exóticas (reemplazando la importación de animales en pie por la de embriones congelados libres de ellas), y permite la creación

de bancos de

embriones de valor pecuario, entre otras ventajas. Los registros de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones revelan que más del 50% de 500.000 embriones de bovino transferidos en los últimos años han sido usados después de ser congelados y descongelados (Thiber, 1997). La conservación de los embriones a temperaturas extremadamente bajas (-196 °C en nitrógeno líquido) permite detener casi por completo la actividad enzimática intercelular, respiración celular,

metabolismo,

crecimiento,

multiplicación,

etc.;

es decir,

reducen

drásticamente la actividad fisiológica de la célula, así es posible almacenar embriones durante un largo período sin afectar su viabilidad y sin causarles cambios genéticos.

En la actualidad, la crioconservación de embriones de mamíferos ha llegado a ser un procedimiento rutinario en biología, ganadería y medicina, pudiendo lograrse por procedimientos de congelación estándar y por vitrificación. La principal diferencia que tiene la vitrificación con el método estándar es que en este último la concentración de crioprotectores es menor y el descenso de temperatura se realiza de manera controlada mediante equipos programables (Fahning y García, 1992, citado por Celestinos y Gatica, 2002).

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Crioprotectores

Durante el proceso de criopreservación, los embriones deben ser deshidratados parcialmente a fin de evitar la formación de cristales que lesionan las estructuras citoplasmáticas. Esta deshidratación se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelación. Existen dos clases de Crioprotectores: intracelulares o permebales y extracelulares o impermeables.

Permeables o intracelulares: presentan bajo peso molecular, estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma. Entre estos se encuentran:

Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2

propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes.

Impermeables

o

extracelulares:

Presentan

alto

peso

molecular,

estos

compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el crioprotector las células de los embriones. Entre estos se encuentran: polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares.

Los crioprotectores previenen la deshidratación total y la degeneración proteica, causada por la congelación del agua intra y extracelular durante el proceso. La etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación en etilenglicol es la mórula compacta y blastocisto temprano de embriones producidos in vivo o in vitro (Celestinos y Gatica, 2002).

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Técnica de criopreservación

El método de congelación estándar fue desarrollado por Wilmut y Rowson en 1973, en este método la exposición de los embriones al medio de congelación (PBS + G) debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 °C), en un solo paso, de 10 a 30 minutos de duración. Este período incluye el envasado de los embriones en pajillas plásticas. Esto permite realizar más rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o “seeding”. Las pajillas deben ser colocadas en un equipo de congelación a -7 °C durante 5 minutos para equilibrar la temperatura de las pajillas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la pajilla con una placa metálica enfriada con nitrógeno líquido (NL2); el agente refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido alcohol o etanol enfriado por medio de un compresor (El no inducir la cristalización conduce a la formación de cristales de hielo bajo un estado de superenfriamiento y a una elevación repentina de temperatura (se genera calor latente de –10º a –15 ºC), resultando un severo trauma físico que puede dañar las células (Niemann, 1995, citado por Celestinos y Gatica, 2002). Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de estabilización) y luego se desciende a una velocidad de entre 0.1 y 0.5 °C hasta -30 ó -35 °C para establecer un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular, en este momento las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en nitrógeno líquido. La descongelación se realiza de manera rápida, sumergiendo las pajillas en baño María a 30 ó 35 °C durante 20– 30 segundos (Celestinos y Gatica, 2002).

Existe otro método de congelación rápida que fue desarrollado por Chupin (1986). Los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el método estándar, luego se les deshidrata nuevamente colocándolos en una solución mixta de glicerol y sucrosa. Esta segunda deshidratación deja a los embriones en

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condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del termo de nitrógeno, durante 5 minutos, posteriormente son sumergidas al NL.

Por último, existe un proceso denominado vitrificación, el cual consiste en un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos, tejidos y embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriada no cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar al vidrio, tomando de ahí su nombre. Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en NL no requiere más de 10 minutos.

Por otro lado De Luca (2007) describe la técnica de criopreservación de embriones bovinos de una manera más detallada:  Selección del embrión. Separar mórulas de blastocistos.  Lavar 10 veces con una solución de Dulbecco® modificado, con 10% de suero fetal bovino (Mórulas: sumergir durante 10 minutos el embrión en una solución de Dulbecco®, con 1,5 molar de glicerol, más 0,1 molar de sucrosa. Blastocistos: sumergir durante 10 minutos el embrión en una solución de Dulbecco®, con 1,5 molar de glicerol, más 0,2 molar de sucrosa).  Tomar una pajilla de 0,25cc y cargar en ella el embrión en el siguiente orden: 8. 1ra. columna de Dulbecco® con suero fetal al 10%. 9. 2da. columna, pequeña burbuja de aire. 10. 3ra. columna de Dulbecco® con medio de congelación. 11. 4ta. columna, pequeña burbuja de aire. 12. 5ta. columna, cargar el embrión en su medio. 13. 6ta. columna, pequeña burbuja de aire. 14. completar el resto de la pajuela con medio de congelación.

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 Llevar los embriones a la congeladora con una temperatura de entre -6°C a -7°C, donde permanecerán 10 minutos en stand by, hasta alcanzar los 35°C.  A su término tocar la pajuela a la altura de la 3ra. columna con una pinza hemostática, previamente sumergida en nitrógeno líquido para que alcance en su extremo los -196°C. Este método (Seeding) evitará la muerte del embrión por sobrefusión.  La corrida de temperatura será de 0,5°C por minuto hasta alcanzar los 35°C, momento en que se introducirá la pajuela en nitrógeno líquido (Plunging).

Proceso de descongelación de las pajillas  Tomar la pajilla con una pinza y exponerla a temperatura ambiente durante 1 segundo.  Sumergir la pajuela en agua a 35°C durante 1 minuto.  Sacar la pajilla del agua y secarla sin agitarla.  Cortar el extremo con un cortador especial evitando agitarla.  Cargar la pajilla en la pipeta de transferencia e implantar el embrión sobre el cuerno en que se presenta el cuerpo lúteo.

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Lección 30. Transferencia de embriones en equinos

La técnica de transferencia de embriones en equinos es el procedimiento por el cual se recolecta uno o más embriones a través de un lavaje uterino transcervical de una yegua donante inseminada o servida por monta natural, 6 a 10 días postovulación, y se transfiere de manera no quirúrgica al útero de otra yegua receptora sincronizada previamente (Losinno 2007). La primera transferencia de embriones en

equinos realizada con éxito fue

comunicada por Oguri y Tsutsumi en 1972, pero no fue aceptado como procedimiento en la industria equina hasta comienzos de los años 80. En 1984 se realiza el 1° Simposio Internacional Equino en la Universidad de Cornell (U.S.A.), el 2° en Canadá en el año 1989, y el 3° en Argentina en 1992. Actualmente, a 11 años de este evento, en nuestro país se realiza con éxito el trasplante de embriones y cada día se acrecenta más la utilización de este método en la reproducción equina. Hoy día esta técnica es considerada a nivel mundial, como una de las técnicas de reproducción asistida más utilizada. Indicaciones de la T.E en equinos La T.E es una técnica que presenta mucho potencial en la explotación equina, en aras del mejoramiento de la eficiencia reproductiva, algunas de las indicaciones para la implementación de esta biotecnología son:  Disminuir el intervalo generacional.  Obtención de crías de hembras en exposición o competencia deportiva  Obtención de crías de hembras con problemas o lesiones de tipo no reproductivo.

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 Obtención de crías de hembras de avanzada edad o hembras muy jóvenes (entre dos y tres años de edad).  Incrementar la producción de crías por hembra, lo cual permite la rápida multiplicación de crías por hembra.  Disminuir los riesgos de la gestión y el parto en yeguas de alto valor.

Fuente: http://www.transbio.com/images/trans0.jpg

Fig. 33. T.E en equinos.

Sin embargo la transferencia embrionaria en el equino no ha tenido el mismo éxito que en el bovino, ya que no existe un método seguro de superovulación en la yegua, esto implica que solo se puede obtener un embrión por ciclo si la yegua es preñada. (Losinno 2007). Sin embargo, esta técnica permite la obtención de 6 a 8 crías por año, pero aquí existe una limitante, y es que algunas asociaciones criadores restringen el número máximo de crías por año. Técnica Selección de Yeguas Receptoras. La selección de receptoras es uno de los factores que inciden en mayor proporción en el éxito de la técnica. Se debe

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seleccionar yeguas con una edad entre los 3 y 10 años, con buna condición corporal y conformación, deben tener un peso y tamaño igual o superior al de las yeguas donantes para poder llevar a buen término la gestación. Usualmente se eligen yeguas de razas pesadas o sus cruzas para aprovechar rusticidad, tamaño, temperamento y aptitudes maternas que facilitaran la cría del potro.

Las

receptoras seleccionadas son sometidas a un examen reproductivo en el cual se examina la integridad de los órganos sexuales, asimismo se realiza un seguimiento ecográfico de al menos dos ciclos para determinar la ciclicidad (actividad folicular, ovulación) y se someten a un régimen alimentario que les permita ganar peso después de la gestación.

Selección de Yeguas donantes. Las yeguas donantes son yeguas seleccionadas por su alta genética, las mismas son sometidas a un completo examen reproductivo que incluye tamaño, tono y forma del útero. El cervix, se examina por vía vaginal y se realiza un cultivo cervical para obtener información del estado del mismo, si se identifican anormalidades deben ser tratadas antes de su introducción al programa de transferencia (Losinno 2007, Campos, 2007).

Sincronización de celo (Donante – receptora) Es importante realizar un adecuado proceso de sincronización del celo entre la yegua donante y las receptoras. Una buena alternativa es la utilización de un progestágeno de suministro oral o alguno de los métodos alternativos, tal como se explicó en el capítulo de sincronización. Durante el celo de la yegua donante se la observa por ecografía para conocer el momento óptimo del servicio o inseminación artificial. Luego de éste se procede a la selección, también mediante ecografía, de 2 o más yeguas receptoras (de acuerdo a la disponibilidad de las mismas), y de éstas se elige una, que de acuerdo al crecimiento folicular y

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ovulación se encuentre mas sincronizada con la donante (Losinno 2007, Campos, 2007).

Colecta y transferencia de embriones Al séptimo u octavo día post inseminación de la donante se realiza la colecta del embrión o embriones mediante lavado uterino transcervical. Para esto se debe seguir los siguientes pasos (Losinno 2007, Campos, 2007):  Se coloca la yegua donante en un brete se venda la cola y se lava la región perineal con abundante agua y un detergente suave, se enjuaga y seca.  El operador se coloca un guante de tacto estéril, con gel lubricante estéril, y procede a la introducción de un catéter (sonda Foley) de 80 cm de longitud, con un balón inflable de 30-60 cm³ a través del cervix, ubicando en el cuerpo del útero el balón del catéter, que una vez allí es inflado con aire o suero.  Se comprueba que esté en el sitio adecuado traccionando hacia atrás para que no haya reflujo de líquido.  Se lava el útero introduciendo por el catéter 3 litros de PBS (phosphate buffer saline) o PBS modificado tibio a 30 a 35 °C. Luego se permite al líquido salir y pasar a través de un filtro para embriones.  Mediante masajeo del útero vía rectal se logra obtener el 80% del total del líquido prefundido el cual si la yegua no tiene problemas uterinos debería ser claro, libre de restos celulares y sangre. La recuperación de líquido turbio indica endometritis.  Al finalizar el lavado el contenido del filtro se vacía en una placa de petri para buscar el embrión bajo lupa estereoscópica con un aumento de 15X.  Luego de localizado el embrión se lava 3 o 4 veces con líquido de enriquecimiento y se observa a mayor aumento para clasificarlo de acuerdo

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a una escala que va de 1 (excelente) a 4 (pobre) de acuerdo a las características de viabilidad embrionaria.  Se introduce en una pajuela 0.5 o 0.25, (mediante aspiración a través de una pipeta dosificadora para embriones o una pajuela adosada a una jeringa) con medio de enriquecimiento y se mantiene a temperatura de 37 °C hasta el momento de la transferencia, preferentemente antes de 2 horas de su recolección.  Se coloca la pajuela dentro de un inyector de Inseminación Artificial descartable, se protege éste con una camisa sanitaria estéril para evitar la contaminación durante el pasaje de la misma por la vagina.  El operador, con un guante de tacto estéril, con lubricante también estéril, previo lavado y secado de los genitales de la yegua receptora, introduce la mano en la vagina con la punta del inyector protegida en la palma de la mano, rompe la camisa sanitaria y lo introduce a través del cervix en el cuerpo uterino. Se deposita el embrión lentamente.  Es imprescindible siempre administrarle a la yegua donante Prostaglandina F2a para que esta retorne al estro, y asegurarnos que no se establezca la preñez en aquellas yeguas en la que no se pudo recolectar embrión.  A los 7 días de realizada la transferencia, se realizan ecografías en las receptoras para diagnosticar preñez, que se repiten a los 20, 35, 50 y 60 días.

La tasa de recuperación de embriones por cada intento de colecta varía entre un 20% a un 160%. La variabilidad de estas obtenciones se debe, entre otros factores, a la cantidad y calidad del semen utilizado, la edad y estado reproductivo de la donante, el día post-ovulación en el que se intente obtenerlo, el número de ovulaciones, la técnica de lavaje utilizada y el entrenamiento del operador (Lossino, 2007).

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