Resume Rekayasa Genetika

RESUME GENETIKA REKAYASA GENETIKA

Mirza Yanuar Rizky (130342615308) Yheni Sapitri (130342603478)

Rekayasa genetika adalah manipulasi atas mareri genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu. Pada teknologi ini dimanfaatkan vektor ataupun sarana lainuntuk memindahkan materi genetik, antara lain: injeksi ikro, fusi protoplas, elektroporasi dan proyektil mikro. Berikut adalah pengertian rekayasa genetika (genetic engineering) dari 3 sumber:   

Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetik suatu organisme dengan cara mengintroduksi atau mengeliminasi gen-gen tertentu (Miclos, dkk, 1990). Rekayasa genetika adalah manipulasi genetic dalam sel untuk menghasilkan suatu sifat yang dikehendaki yang biasanya disebut teknologi rekombinan DNA (Rasmussen, dkk, 1990). Rekayasa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetik sel atau individu dengan cara pemindahan selektif, insersi atau dengan modifikasi gen balik yang individual maupun yang berupa perangkat gen (Klug, dkk, 1994).

Kesimpulan dari 3 sumber tersebut adalah pada rekayasa genetika terdapat manipulasi atas materi genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu. Berbagai fenomena genetik alami jika dicermati dapat menjadi model alami dari teknik rekayasa genetika contohnya crossing over, gene pick up, transduksi, dan lain sebagainya. Pada beberapa fenomena ini terjadi pemutusan, penyambungan, serta perpindahan bagian materi genetik yang dapat mengakibatkan penambahan atau perpindahan suatu gen atau beberapa gen. PROSES REKAYASA GENETIKA Teknik-teknik Rekayasa Genetika Menurut Smith dan Byars (1990) terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam teknik rekayasa genetika meliputi teknik vektor, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektoporasi. Selain itu klug menambahkan juga teknik kopresipitassi kalsium pospat dan endositosis dan dikenal pula teknik proyektil mikro. Transfer Vektor Transfer vektor merupakan cara memasukan suatu gen ke sel baru dengan menggunakan pembawa (carrier) khusus yang memanfaatkan proses alami seperti pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektor yang digunakan adalah plasmid, bakteriofage dan cosmid (russel, 1992). Secara kimiawi vektor-vektor tersebut adalah molekul DNA. Sebagai vektor suatu molekul DNA harus memiliki sifat-sifat yang harus dimiliki DNA seperti di bawah ini (Klug, dkk.,1994)  Molekul DNA mampu melekukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membuahi suatu “ori”  Molekul DNA harus mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim retrisi khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA.  Molekul DNA harus membuhai suatu penenda yang dapat dimanfaatkan.  Molekul DNA harus mudah terbebas kembali ari sel inang.

 

Selain sifat-sifat itu ada pula sifat lain yang diharapkan (Old dan Primrose, 1989) Berat molekul rendah Adanya kemampuan untuk memberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada sel inang.

a. Plasmid Plasmid terbentuk secara alami invitro. Plasmid terdapat pada E. coli (plasmid RSF 2124 merupakan derifat dari plasmid ColE1). Plasmid-plasmid itu terdapat pada E.coli (plasmid RSF2124 merupakan derivat dari plasmid CoE1). Contoh lainnya adalah pBR322 (gambar 1) dan derivatnya yaitu pUC19 (gambar 2).

Gambar 1. Plasmid pBR322 b. Bakteriofag Bakteriofag yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E.coli adalah fag ƛ. Seluruh gen fag ƛ sudah diidentifikasi dan dipetakan uruturutan genom secara keseluruhan sudah diketahui. Seluruh derivat fag ƛ yang digunakan sebagai vektor transfer sudah direkayasa sehingga hanya siklus titik saja. Derivat-derivat fag ƛ lebih dari 100 derivat yang dimanfaatkan sebagai vektor dibuat dengan cara membuang berbagai bagian kelompok gen di daerah tengah. Gambar 2. Plasmid pUC19 Selain bakteriofag yang digunakan sebagai vektor, salah satunya adalah M 13. Materi genetik pada M 13 berupa DNA unit tunggal. Jika M 13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting tunggal bereplikasi menghasilkan suatu model DNA unting ganda yang disebut RF (Replikasi Form). Molekul RF setara dengan plasmid dan DNA asing

dapat diinsersikan ke tapak-tapak pemutusan enzim retriksi tunggal yang ada pada genom. Susunan dari molekul RF terdiri dari suatu unting tunggal (+) yang mengandung satu unting segmen DNA yang diinsersikan. Klon DNA unting tunggal yang di hasilkan oleh M 13 dapat digunakan untuk pengurutan DNA atau sebagai templet untuk perubahan urut-urutan klon akibat mutasi. c. Kosmid (cosmid) Kosmid adalah vektor yang dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-urutan cos dan fag ƛ yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid dan fag ƛ, contoh plasmid yang digunakan Pbr322. d. Vektor ulang-alik (Shuttle vectors) Selain vektor-vektor transfer seperti plasmid, bakterio fag ƛ, dan kosmid yang digunakan untuk pengklonan DNA, vektor lain yang dimanfaatkkan untuk memanfaatkan untuk memasukkan molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel prokariotik maupun eukariotik. Vektor-vektor semacam itu disebut vektor ulang alik atau shuttlr vectors. Vektor ulang alik atau shuttlr vectors adalah vektor pengklon yang dapat bereplikasi di dalam dua atau lebih mahkluk hidaup inang. 3. Injeksi Mikro, Fusi Protoplas, Elektroporasi, Kopresipitasi Kalsium Fosfat dan Endositosis, Serta Proyeksi Mikro Pada injeksi mikro menggunakan jarum mikroskopis,untuk memasukkan DNA melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi protoplas terjadi pelarutan dua membran sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat di gabung menjadi satu, misalnya fusi antara sel sel-sel yang di kultur dengan protoplas bakteri yang mengandung DNA eksogen. Fusi protoplas, suatu sistem transformasi yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi yang disebut sebagai lipofeksi (lipofection). Pada teknik eletroporasi menggunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Berkenaan dengan elektroporasi informasi dari Old dan Primrose (1989) menyebutkan bahwa pada pendedahan singkat kejutan listrik berkekuatan antara 4000-8000 V, sel-sel memperoleh DNA eksogen dan larutan sekitar (tampaknya melalui lubanglubang yang terbentuk sesaat pada membran plasma) dengan kejutan listrik akan meningkatkan frekuensi efisien Gambar 4. Vektor ulang alik yEp 24 transformasi (Potter dkk., 1984 dalam pada khamir dan E. coli. Old dan Primrose, 1989).

Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butir-butir kopresipitas kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis (Old dan Primrose, 1989). Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam sel-sel mamalia. Pada teknik proyeksi mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel (Klein dkk., 1987 dalam Old dan Primrose 1989), teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Pada teknik proyeksi mikro membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien. Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan Urutan proses yang menjadi prosedur dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantai vektor akan dikemukakan lebih lanjut (Klug dkk., 1994). 1. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang mengenal dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik 2. Segmen-segmen digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor. Vektor dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan identifikasi molekul DNA yang baru terbentuk. 3. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Molekul DNA rekombinan direplikasi menghasilkan berlusin-lusin yang disebut klon-klon. 4. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang. 5. Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskan kepada seluruh sel turunan, menghasilkan suatu populasi sel-sel identik yang semua membawahi urut-urutan yang di-klon. 6. Secara potensial, DNA diklon dapat ditranskripsikan, RNA-d ditranslasikan serta produk-produk gen diisolasi dan di kaji. Peran Enzim Endonuklease Retriksi Pada urutan pertama proses yang menjadi prosedur dasar teknik DNA rekombinan yang diperantai oleh vektor enzim endonuklease dibutuhkan untuk memotong molekul DNA dalam rangka pembuatan fragmen DNA. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibentuk tanpa abntuan enzim endunuklease restiksi. Penanaman endunuklease restiksi di beri nama berdasarkan macam makhluk hidup tempat enzim tersebut diisolasi secara konvensional digunakan sistem tiga huruf dalam posisi huruf miring yang diikuti dengan suatu angka romawi. Enzim endonuklease retriksi terbagi menjadi dua kelompok atau tipe (Russel, 1992). Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan (Russel,1992). Enzim endonuklease restriksi bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Untuk pengenalan ezim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang melewati titik tengah urutan pengenalan (Russel, 1992). Dalam urutan basa 5’ 3’ pada unting DNA sama dengan urutan basa 5’ 3’ pada komplementernya.

Enzim endonuklease restriksi sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang berbeda (Russel, 1992). Oleh karena itu setiap enzim memotong DNA pada suatu pasangan nukleotida yang spesifik untuk enzim yang bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat enzim pada suatu molekul DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan pengenalan ditemukan pada DNA. Enzim endonuklease restriksi tipe II menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki nilai khusus pada pengklonal fragmenfragmen DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk pasangan basa yang sempurna. Seleksi Klon Rekombinasi Southern mengembangkan suatu metode untuk mendeteksi fragmen-fragmen di dalam sel agarose yang komplementer dengan urutan rna dan dna tertentu. Metode ini dikenal sebagai southern blotting yang kemudian dikembangkan untuk menganalisis rna dan protein yang dikenal dengan nothern and western blotting. Bagan southern blotting ditunjukkan pada gambar berikut: Pada teknik blotting ini intinya adalah mentransfer makro molekul dari gel, berarti mereka dipisahkan secara elektroforesis ke perekaman suatu membran.

MANFAAT DAN RESIKO REKAYASA GENETIKA Manfaat Rekayasa Genetika Manfaat analisis reayasa genetika dapat dilihat dalam kiatannya dengan analisis genetik, diagnosis molekuler atas penyakit manusia, terapi gen, sidik jari dna, serta bioteknologi (klug dkk 1994). Uraian tersebut antara lain: Analisis Genetik Selama teknik-teknik dna rekombinasi untuk kepentingan analisis genetik. Teknik-teknik itu memungkinkan penggandaan suatu kumpulan klon yang meliputi keseluruhan klon demikian pula memungkinkan pemetaan genetik maupun fisik yang lengkap, serta memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseleuruhan kromosom. Dari analisis tersebut salah satunya telah ditemukan ukuran genome beberapa makhluk hidup. Proyek genome manusia mulai dirintis sejak tahun 1986 dan sejak 1988 dilaksanakan suatu rencana royek genome manusia berjangak 5 tahun. Negara-negara yang juga sudah melaksanakan proyek genome manusia adalah perancis,inggris, dan jepang. Analisis genetik manusia ini sudah memungkinkan untuk membuat peta kelamin genetik manusia natara lain dengan bantuan penanda rflp (retriction fragment lenght polymerphism).

Diagnosis Molekuler atas Penyakit Manusia Pemanfaatan urutan dna yang di klon memungkinkan pengamatan langsung terhadap genotip dari pada pengamatan atas suatu produk gen yang belum dikenal atau tidak terekspresi. Sebagai contoh deteksi molekuler dapat diinduksikan atas thelessemia dan sickle cell anemia. Terapi Gen Pada mulanya kemampuan mengklon dan mengisolasi gen-gen spesifik manusia yang dikembangkan sebagai suatu kegiatan penelitian, sekarang sedang b digunakan dalam bidang kedokteran secara operasional untuk mengani kelainan-kelainan menurun dan cara yang ditempuh adalah mengganti gen cacat dengan salinan gen normal (klug dkk, 1994). Yang mana prosesnya dikenal sebagai terapi gen. Sudah banyak metode yang diterapkan dalam memasukkan gen ke dalam sel manusia termasuk pemanfaatan vektor virus maupun fusi sel dengan vesikula buatan yang mengandung urutan dna yang diklon, transfer kimiawi yang mendorong pengangkutan gen melewati membran sel jika sudah dilakukan. Panduan terapi yang sudah ditemukan seduah ditemukan berdasarkan prasyarat berikut (klug,dkk 1994) : a. Gen harus diisolasi dan ditransfer b. Cara transfer gen yang efektif harus ada c. Jaringan target harus dapat tercapai sebagai contoh, percobaan terapi gen yang pertama menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekusornya sebgai jaringan target. d. Terapi gen tidak boleh menyakiti pasien dan sudah tidak ada cara terapi lain yang efektif. Sidik Jari DNA RFLP sudah digunakan untuk membedakan salinan gen yang normal dari yang mutan dan dapat digunakan sebagai penanda genetik , karena polimorfisme tersebut diwariskan dalam pola kodominan (klug dkk,1994). Fenotip dari penanda-pennda ini berupa susunan atau deretan fragmen dna berbagai ukuran yang ada pada southern blout, sesudah dna dipotong dengan suatu enzim endonuklease restriksi. Suatu tipe rflp kedua muncul dari variasi jumlah urutan berulang tandem. Dna yang ada diantara dua tapak enzim edonuklease restriksi. Urutan tersebut berasal dari dua hingga dua puluh nukleotida. Pola pita yang dihasilkan ketika urutan vnrt dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi dan divisualisasikan dengan southern blotting itulah yang dikenal sebgai sidik jari dna. Rflp tersebut ekuivalen dengan sidik jari konvensional karena pola pita yang dihasilkan berbeda beda dari orang per orang. Bioteknologi Saat ini rekayasa genetika dalam pertanian menjanjikan tetapi ada keterbatasan dalam teknologi. Menurut micklos dan freyer (1990) kesulitan analitis genetis tanaman disebabkan oleh : 1) Pertumbuhan tanaman yang lambat dan umur pergantian generasi yang lama 2) Besarnya genome tanaman, termasuk banyaknya kromosom poliploid 3) Dimilikinya “kotak kayu” yaitu dinding sel berupa selulose yang mengelilingi tanaman.

Dalam rekayasa genetika sifat yang dikendalikan oleh banyak gen sangat sulit untuk di rekayasa dan dikendalikan. Misalnya, tumbuhan memerlukan nitrogen untuk membuat protein tetapi tidak dapat langsung memanfaatkannya secara langsung dari udara bebas. Perakaran kacang tanah, kedelai, dan semanggi mengandung bakteri bintil akar yang dapat mengubah nitrogen diudara bebas menjadi bentuk yang dapat dimanfaakan, tatapi perakaran tanaman lain seperti jagung dan padi harus memperoleh nitrogen dari pupuk atau dari produk samping organisme lain yang meninggalkan nitrogen yang tersedia dari dalam tanah. Apabila dapat di ciptakan jagung yang dapat membuat nitrogen tentulah dapat mengurangi biaya pemupukan, termasu mengurangi pencemaran sistem perairan karena masukknya sisa-sisa pemupukan nitrat dan fosfat dari tanah pertanian. Fiksasi nitrogen dikendalikan oleh lebih dari 15 gen yang berbeda dalam sistem bakteri/tanaman. Serta menggunakan gen yang sekarang belum berhasil diisolasi dan kebingungan dalam penataan ulangnya. Pertanyaan: 1. Apakah perbedaan antara enzim endonukelase retriksi I dan II ? Jawaban: Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan. Enzim endonuklease restriksi bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. 2. Bla bla bla Jawaban: Bla bla bla